專利名稱：：分析動(dòng)物產(chǎn)品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分析動(dòng)物及其產(chǎn)品的方法。具體地，本發(fā)明涉及以品種來(lái)源為基礎(chǔ)鑒別動(dòng)物產(chǎn)品、測(cè)定或測(cè)試動(dòng)物產(chǎn)品的品種來(lái)源和鑒定動(dòng)物產(chǎn)品的方法以及實(shí)現(xiàn)這些方法的試劑盒。此外，本發(fā)明提供測(cè)定與皮毛顏色有關(guān)的豬基因型的方法。引言動(dòng)物品種數(shù)千年來(lái)，人類在動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)用選擇壓力來(lái)產(chǎn)生表現(xiàn)某些有利特征的家畜。選擇這些特征以滿足審美、技術(shù)、宗教儀式、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的需要。結(jié)果是產(chǎn)生大量不同的動(dòng)物品種。術(shù)語(yǔ)“品種”是用于定義家畜的同型、亞種群體的專業(yè)術(shù)語(yǔ)，群體內(nèi)家畜具有可定義和可鑒定的外部特征使其能夠通過(guò)視覺評(píng)估與相同物種中其它相似定義群體區(qū)分開。因此，此術(shù)語(yǔ)定義一群動(dòng)物，人類對(duì)它們應(yīng)用選擇壓力而得到可遺傳的并且可區(qū)分于該物種的其它成員的相同外部特征。隨著品種的確立，其完整性通過(guò)品種群落、家畜血統(tǒng)書和系譜記錄得以維持。品種選擇傳統(tǒng)的品種選擇方法是基于對(duì)動(dòng)物和/或其親緣動(dòng)物表型的直接測(cè)定。因此，完成育種策略需要保持廣泛的表型記錄。例如，美國(guó)和西歐的產(chǎn)奶家畜改進(jìn)計(jì)劃部分依賴于以月為基礎(chǔ)進(jìn)行的數(shù)百萬(wàn)頭奶牛個(gè)體記錄(奶產(chǎn)量和成分，種類性狀、健康性狀等)的收集。同樣，育種公司細(xì)心地監(jiān)測(cè)他們的豬和家禽育種原種進(jìn)行完整的表型測(cè)定。然而，一些重要特征不馬上在存活動(dòng)物水平表現(xiàn)。例如，一些肉質(zhì)參數(shù)是由細(xì)微的生理或生化特征決定的，這些特征不容易觀察到，且因此不能用作有效人工選擇的基礎(chǔ)。這種質(zhì)量育種部分依賴于在一定程度上與所需特征共遺傳(連鎖或相關(guān))的其它(更容易觀察的特征)。例如，在豬工業(yè)中，過(guò)去耳垂與生育能力相關(guān)并因此用作此性狀的標(biāo)記。傳統(tǒng)的育種選擇方法由于有些表型僅在一種性別中或特定發(fā)育時(shí)期表達(dá)而受到限制。此外，有些表型難以測(cè)定并且測(cè)試費(fèi)用昂貴。因此，借助以DNA為基礎(chǔ)的診斷(用于標(biāo)記輔助的篩選或MAS)間接測(cè)定這些表型特征被看作是直接測(cè)定表型參數(shù)的理想替代方案[參見Georges和Andersson(1996)，家畜基因組時(shí)代的到來(lái)，基因組研究，第6卷907-921]。然而，決定許多所需特征的基因結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系經(jīng)常是高度復(fù)雜的并且還沒有得到足以使這種方法在實(shí)踐中簡(jiǎn)單易行的充分了解。品種鑒定動(dòng)物品種的鑒定目前正處于分水嶺時(shí)期。以前它們通過(guò)外在身特征和系譜記錄得以鑒定，而在將來(lái)，隨著從特定育種品系形成新品種，它們將通過(guò)一套DNA標(biāo)記加以鑒定。這里所述的工作不僅允許目前在一定范圍產(chǎn)品中可能的最精確的品種測(cè)定方法，而且允許以普通方式將通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明獲得的品種因子信息與將來(lái)使用本發(fā)明獲得的信息結(jié)合。因此，本發(fā)明不僅允許在目前環(huán)境下測(cè)定來(lái)源品種，而且允許將本發(fā)明與未來(lái)品種的形成及其獨(dú)特鑒定聯(lián)系起來(lái)。一般認(rèn)為鑒定作為給定品種代表的特定動(dòng)物的唯一權(quán)威性方法是通過(guò)其系譜。因此，盡管外在表型特征在育種過(guò)程中和維持品種純度時(shí)有根本的重要性，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員一般認(rèn)為品種一致性不能僅根據(jù)這些性狀的視覺觀察作決定性鑒定。例如，豬引起有條帶表型的遺傳因子對(duì)于無(wú)條帶形式是顯性的。因此，有條帶的動(dòng)物可能來(lái)自有條帶品種物如Hampshire與無(wú)條帶品種動(dòng)物的雜交。正如豬世界育種手冊(cè)，V.porter，HelmInf.Ltd，ISBN1-873403-17-8，1993，第16頁(yè)中所述，“什么是品種？”外部特征可能是欺騙性的永遠(yuǎn)不要通過(guò)其皮毛判斷一頭豬！然而，在許多情況中，根據(jù)系譜的直接證據(jù)進(jìn)行品種鑒定是困難或不可能的。因此，實(shí)際上，所謂的“品種標(biāo)記”可用于測(cè)定品種的一致性。術(shù)語(yǔ)“品種標(biāo)記”是定義根據(jù)經(jīng)驗(yàn)性數(shù)據(jù)似乎是品種特異性的可測(cè)定特征的專業(yè)術(shù)語(yǔ)。品種標(biāo)記包括基因型特征如DNA多態(tài)性、化學(xué)特征如肉的蛋白和水分含量、外遺傳/生化特征(如蛋白多態(tài)性)、染色體結(jié)構(gòu)、基因拷貝數(shù)、DNA指紋、微衛(wèi)星分析和RAPDDNA標(biāo)記。其它有用的標(biāo)記包括品種因子(breeddeterminant)。術(shù)語(yǔ)“品種因子”在此用來(lái)指在育種計(jì)劃中(至少部分)用作人工選擇基礎(chǔ)的外在表型特征。相對(duì)于術(shù)語(yǔ)“品種標(biāo)記”使用該術(shù)語(yǔ)，(正如上面所解釋的)品種標(biāo)記在此用來(lái)定義根據(jù)經(jīng)驗(yàn)性數(shù)據(jù)似乎是品種特異性的其它特征。術(shù)語(yǔ)“品種因子基因”用來(lái)指(至少部分)參與相應(yīng)外在表型特征表達(dá)的基因。有些品種因子(如皮毛顏色)在傳統(tǒng)上用作品種“商標(biāo)”，并且因此長(zhǎng)期用作系譜(和品種一致性)的指標(biāo)。同樣被選擇用于品種開發(fā)的其它品種因子包括諸如耳姿、面部形狀和一般解剖結(jié)構(gòu)的特征。品種因子相對(duì)于簡(jiǎn)單品種標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)在于它是品種特征與因子之間不可分割的紐帶。品種一致性的生化和遺傳測(cè)試上述許多品種標(biāo)記可用生化或遺傳測(cè)試進(jìn)行特征分析。這些標(biāo)記包括基因型特征(如DNA多態(tài)性)、生化特征(如蛋白多態(tài)性)、染色體結(jié)構(gòu)、基因拷貝數(shù)、DNA指紋、微衛(wèi)星模式和RAPDDNA標(biāo)記。然而，如下所述，還存在許多與這些測(cè)試有關(guān)的顯著問(wèn)題以動(dòng)物產(chǎn)品(如肉或精漿)的化學(xué)組成為基礎(chǔ)的測(cè)試可能由于化學(xué)組成在動(dòng)物不同部位(即不同肌肉)之間不同并受飲食、年齡、性別和樣品貯存條件影響這一事實(shí)而受到干擾。此外，得到的結(jié)果在自然條件下一般是定量的，從而引起不同測(cè)試部位間解釋與比較的問(wèn)題。由于任何給定蛋白的分布很可能不均一，使目的蛋白在某些組織中缺乏，所以基于蛋白多態(tài)性的測(cè)試受到限制。因此，可能需要多種不同多態(tài)性標(biāo)記來(lái)檢測(cè)所有目的產(chǎn)品的品種來(lái)源。此外，這些測(cè)試以抗體分析為基礎(chǔ)，并且也需要高投資以開發(fā)特異性抗體測(cè)試所需的試劑。由于進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)操作和解釋需要高技術(shù)水平并且樣品保存需要高度小心和細(xì)致，所以染色體結(jié)構(gòu)分析受到制約。這些標(biāo)記難以用于除了來(lái)自存活或新近死亡動(dòng)物的材料之外其它任何材料。經(jīng)典的DNA指紋是以重復(fù)DNA序列區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)，這是由于它們的結(jié)構(gòu)在種群內(nèi)表現(xiàn)高度長(zhǎng)度變異性。這些區(qū)域經(jīng)常以許多拷貝存在于個(gè)體DNA中，因此增加了個(gè)體差異的可能性。通過(guò)根據(jù)大小分離總DNA片段并且然后用特異性探針確定高度可變區(qū)域的位置(和因此得到的大小)，可獲得特定個(gè)體的一系列條帶指紋。在豬中已經(jīng)檢測(cè)到許多DNA高度可變區(qū)的探針(包括M13病毒序列和人微衛(wèi)星探針)并且據(jù)稱在每個(gè)品種中發(fā)現(xiàn)了特異性條帶。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)標(biāo)記是基于用隨機(jī)序列引物對(duì)DNA片段的PCR擴(kuò)增。這種反應(yīng)一般產(chǎn)生許多DNA片段，可通過(guò)凝膠電泳根據(jù)大小對(duì)其進(jìn)行特征分析。如果檢測(cè)以來(lái)自不同品種DNA為基礎(chǔ)的反應(yīng)產(chǎn)物，則可能發(fā)現(xiàn)一些品種特異性DNA條帶。然而，在大多數(shù)情況下，在存在這種重復(fù)系列等位基因與決定品種的真實(shí)性質(zhì)的特征之間沒有直接的聯(lián)系。這與這些DNA區(qū)域的高度可變性一起導(dǎo)致其很少是品種特異性的(相似的等位基因存在于許多不同品種中)。由于與品種的表型無(wú)關(guān)聯(lián)，故存在交叉特異性等位基因可能存在或出現(xiàn)于品種中的更大風(fēng)險(xiǎn)，而這對(duì)于品種因子來(lái)說(shuō)是不大可能的，因?yàn)樗鼈兌x表型本身。如果是存在大量特異品種的動(dòng)物種群，則不得不進(jìn)行深入研究以從品種排除不是據(jù)稱與其相關(guān)聯(lián)的DNA標(biāo)記。然而，此方法的主要缺陷在于RAPD標(biāo)記被認(rèn)為是不可靠的并且發(fā)現(xiàn)在不同實(shí)驗(yàn)室間有差異。當(dāng)必須分析和比較不同類型和歷史的樣品時(shí)，這些問(wèn)題更加嚴(yán)重。因此，需要可靠的品種標(biāo)記，它可用作快速而廉價(jià)鑒定各種動(dòng)物產(chǎn)品品種來(lái)源和鑒定動(dòng)物產(chǎn)品(如飼料和用于育種計(jì)劃的精液)方法的基礎(chǔ)?，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)到此前所定義的品種因子(如皮毛顏色)作為品種標(biāo)識(shí)或品種特異性標(biāo)記有預(yù)想不到的優(yōu)勢(shì)。特別地，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)在較長(zhǎng)時(shí)間中使用外在表型特征作為選擇基礎(chǔ)得到了在大多數(shù)品種中固定的特定等位基因。這些品種標(biāo)記可用于提供特定品種的工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)模式，用于來(lái)自特定種的所有材料。因此，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)實(shí)際上許多品種在品種因子基因方面(如此前所定義的)是遺傳上同型的，從而這些基因可用作可靠品種特異性標(biāo)記的基礎(chǔ)(與本領(lǐng)域中較早提出的有關(guān)在品種鑒定中利用品種因子本身如皮毛顏色的偏見相反)。此外，令人吃驚地發(fā)現(xiàn)決定任何一種品種因子(如皮毛顏色)的品種因子基因(或其等位基因)的性質(zhì)可能是高度多態(tài)性的。因此，不同品種之間品種因子基因和/或等位基因的差異可能存在，盡管不同品種因子基因/等位基因可能導(dǎo)致相同外在表型特征的表達(dá)。在本發(fā)明之前，認(rèn)為相應(yīng)遺傳因子的多態(tài)性不足以提供鑒別不同品種的有用基礎(chǔ)。例如，已知皮毛顏色在豬不同品種之間是相同的并且因此(如上面所述)不被看作是品種特異性標(biāo)記的良好侯選標(biāo)記。然而，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在這些品種中決定皮毛表型的等位基因?qū)嶋H上是高度多態(tài)性的并且經(jīng)常是特征性的(并且因此可用作品種鑒定的基礎(chǔ))。相似的考慮適用于其它外在身體特征(品種因子)，因此這些因子可能在不同品種中都有，但與每種品種中不同的基因/等位基因相關(guān)。這樣的實(shí)例可在表現(xiàn)兩種肌肉(doublemuscled)表型的牛中見到。Kambadur等(1997，基因組研究7，910-915)和Grobet等(1997，自然遺傳學(xué)17，71-74)的工作說(shuō)明牛的兩種肌肉表型是由肌抑制素(myostatin)基因中的突變所致。而且，在BelgianBlue和Asturiana品種中，該基因含有11bp的缺失而在Piedmontese品種中存在G到A的轉(zhuǎn)換。因此，正如豬皮毛顏色的情況，單一選擇的特征是由許多潛在多態(tài)性引起。然而，這種外在身體特征的發(fā)生性質(zhì)和選擇歷史導(dǎo)致特定等位基因在這些品種內(nèi)的固定，產(chǎn)生因子的品種特異性模式。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已認(rèn)識(shí)到品種因子(如皮毛顏色)的遺傳分析提供鑒定動(dòng)物產(chǎn)品(如飼料)的有效方法并且可有利地加入到動(dòng)物產(chǎn)品(如食品)的加工生產(chǎn)線中以檢測(cè)和維持產(chǎn)品質(zhì)量并且可加入到食品工業(yè)中的質(zhì)量控制過(guò)程中。皮毛顏色豬品種表現(xiàn)出各種皮毛顏色，并且這些顏色與特定產(chǎn)品特征相關(guān)。例如，在歐洲商業(yè)品種如LargeWhite和Landrace中白色是顯性的皮毛顏色，并且這些品種與較大的產(chǎn)仔和良好的生育能力相關(guān)。然而，有大量商業(yè)上重要的有色品種，它們表現(xiàn)多種顏色及其組合。與肉質(zhì)鮮嫩有關(guān)的Duroc是紅色的，形成瘦骨架、肌肉發(fā)達(dá)的動(dòng)物Pietrain是有斑點(diǎn)的，并且肌肉同樣肌肉發(fā)達(dá)的Hampshire是黑色的并且在其肩上有白色鞍狀物。此外，可能還有其它有用的地方品種，它們具有有潛在商業(yè)利益的性狀并且是有色的。例如，中國(guó)Meishan品種由于其很大的產(chǎn)仔大小已進(jìn)口到歐洲和美國(guó)。歐洲WildBoar在成年時(shí)是棕色的而在幼年時(shí)是帶條紋的，并且此品種用于滿足傳統(tǒng)肉產(chǎn)品的消費(fèi)需求。同時(shí)據(jù)稱其它地方品種或當(dāng)?shù)仄贩N由于其適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境如溫度、地方病和當(dāng)?shù)仫暳弦彩侵匾摹Ｆっ伾捎诜N種原因?qū)τ谪i加工業(yè)是重要的。首先，在豬生產(chǎn)商腦海中，認(rèn)為與除皮毛顏色以外的性狀遺傳學(xué)上一致的豬外表(即皮毛顏色的范圍)的大體差異可能導(dǎo)致有關(guān)動(dòng)物一致性和質(zhì)量的問(wèn)題。因此，豬的皮毛顏色經(jīng)常用作品種的商標(biāo)，并且育種者希望確保其動(dòng)物品種的顏色正確。例如，在多個(gè)市場(chǎng)上，地方的、傳統(tǒng)的和有色的品種根據(jù)其肉質(zhì)或飼養(yǎng)它們所用的生產(chǎn)系統(tǒng)進(jìn)行交易。然而，這不是簡(jiǎn)單的任務(wù)因?yàn)槠っ伾芏鄠€(gè)基因控制。遺傳也因?yàn)轱@性的存在和基因間的相互作用而變得復(fù)雜。也可用于評(píng)估用作現(xiàn)代合成品系基礎(chǔ)的傳統(tǒng)品種的遺傳學(xué)純度并確認(rèn)現(xiàn)代合成品系的來(lái)源。其次，在多個(gè)市場(chǎng)中存在對(duì)白皮豬肉的偏好。這是由于豬肉經(jīng)常連著肉皮一起出售，并且有色豬的皮膚即使去毛仍可能有顏色，這可能導(dǎo)致部分消費(fèi)者的不好感覺，因?yàn)槿獗砻嫠坪蹼s有霉點(diǎn)。因此，在這些市場(chǎng)中從這樣的畜體除去皮膚是必需的，從而導(dǎo)致額外的成本。例如，在美國(guó)，有色畜體與約1％需要去毛和去皮以去除色素的肉皮缺陷有關(guān)。結(jié)果，有色豬畜體一般要打折扣。這種問(wèn)題的一個(gè)實(shí)例涉及在白色和有色素品系之間雜交制備動(dòng)物時(shí)出現(xiàn)的黑色色素斑點(diǎn)的存在。這種情況可能發(fā)生，因?yàn)閺陌咨贩N遺傳的顯性白色基因在此雜交中出現(xiàn)的雜合情況中不總是完全顯性。此問(wèn)題的可能解決辦法將是確保生產(chǎn)動(dòng)物對(duì)于存在于品種如Duroc中的隱性紅色等位基因是純合的。在此情況下，有色素形成的斑點(diǎn)將是紅色而不是黑色的并且不那么顯眼。為了達(dá)到此目的，人們需要在用于雜交育種的白色和有色素品系中將隱性紅色等位基因培育成純合體。然而，用表型選擇方法將是十分困難的，因?yàn)樵诎咨废抵羞x擇紅色背景顏色只能用很昂貴的子代測(cè)試策略才能實(shí)現(xiàn)。此外，豬育種者希望處于能確保育種種群一致性的狀況。育種者可能希望確保由育種雜交產(chǎn)生的子代總是白色的。選擇性地，Duroc或Hampshire豬的育種者可能希望確保育種雜交總是產(chǎn)生特征性的Duroc或Hampshire顏色。在過(guò)去，試圖用傳統(tǒng)的動(dòng)物育種方法從豬品系去除非典型顏色。例如，純種育種者必須對(duì)可能的公豬進(jìn)行子代測(cè)試以證實(shí)它們適于包括進(jìn)育種群體中。此方法導(dǎo)致重大開支，包括確定足夠交配的實(shí)際耽擱并且在可商業(yè)上使用動(dòng)物之前已經(jīng)產(chǎn)生了后代。因此，與表型選擇相比，基于診斷DNA測(cè)試對(duì)皮毛顏色基因突變的選擇將是重要的進(jìn)步。皮毛顏色是由多個(gè)不同基因基因座的作用決定的。例如，將決定豬是白色或有色的基因命名為I(抑制皮毛顏色)。阻止任何顏色表達(dá)的基因模式(I)對(duì)于允許顏色形成的基因模型(i)是顯性的。對(duì)白色動(dòng)物的傳統(tǒng)選擇降低了i的頻率，但其仍然存在于白色雜合攜帶者動(dòng)物的種群中。最近，鑒定到KIT基因的等位基因中的許多結(jié)構(gòu)差異并且發(fā)現(xiàn)其涉及皮毛顏色決定的方面，從而允許開發(fā)鑒別此基因座不同等位基因的方法。然而，在此基因座攜帶兩拷貝隱性等位基因i的動(dòng)物具有非白色皮毛顏色[Johansson-Moller等，哺乳動(dòng)物基因組，7822-830(1996)，WO-A-97/05278，在此引入其公開內(nèi)容作為參考)。這種豬可能完全為一種顏色如Duroc(紅色)或具有幾種顏色的組合(特別是斑點(diǎn)狀或條紋狀或條帶狀圖案，分別例如Pietrain和Hampshire)。多種其它組合也是可能的并且已經(jīng)觀察到(參見下表)基因型顏色I(xiàn)/I白色I(xiàn)/i白色i/i有色I(xiàn)p/Ip雜有有色斑點(diǎn)的白色I(xiàn)p/I白色I(xiàn)p/i雜有有色斑點(diǎn)的白色這些動(dòng)物中的非白色可能是不同深淺的紅色或黑色。表達(dá)的這種顏色是由命名為E(皮毛顏色的延伸)的第2種基因的作用所決定。根據(jù)文獻(xiàn)，含有E基因模式的動(dòng)物完全為黑色，并且該基因模式對(duì)于導(dǎo)致紅色皮毛顏色的基因模式(e)為顯性。有斑塊或有斑點(diǎn)的動(dòng)物如Pietrain品種含有稱為Ep的第3種基因模式。此基因模式對(duì)于e是顯性而對(duì)于E不是顯性。例如，黑色動(dòng)物可能具有基因型iiEe，iiEEp或iiEE。在E基因座均為雜合并且基因型為iiEe的黑色母豬和黑色公豬以3∶1比例產(chǎn)生黑色和紅色小豬。黑色小豬將為iiEE或iiEe并且紅色小豬將為iiee。皮毛顏色的密度和面積以及白色條帶的位置由其它基因座決定，其中之一即條帶基因座在本申請(qǐng)中隨后討論。例如，Hampshire品種為背景黑色，有一白色條帶穿過(guò)其肩部，此條帶的寬度可以不同，然而其毛色應(yīng)該為黑色。存在這樣的證據(jù)，即一些Hampshire動(dòng)物源自以前已與紅色品種如Duroc雜交的畜群。在這種情況下，該基因的紅色模式可在雜合狀態(tài)下以沉默方式維持。當(dāng)兩個(gè)雜合子雜交時(shí)，25％的子代將含有紅色。在有些情況下這些豬將具有Duroc品種的外部特征，為純紅色，然而在其它情況下這些動(dòng)物將具有從Hampshire遺傳的白色條帶并且具有紅色Hampshire的外部特征。在此情況下重要的是除了圖案還存在非典型的皮毛顏色。已知延伸基因座存在于其它家養(yǎng)動(dòng)物品種中，例如馬，其中e與栗色有關(guān)[Adalsteinsson，J.Hered.6515-20(1974)]，牛[Klungland等，哺乳動(dòng)物基因組6636-639(1995)]，狐貍[Adalsteinsson，J.Hered.7815-20(1987)]和小鼠[Jackson，遺傳學(xué)年鑒28189-217(1994)]。延伸基因座編碼α促黑素受體(αMSHR)。現(xiàn)已表明在此基因座的隱性等位基因不表達(dá)有功能的αMSHR受體[Robbins等，細(xì)胞6636-639(1995)]，并且這些研究者已在與不同皮毛顏色有關(guān)的這些種中鑒定到αMSHR基因序列內(nèi)的突變。經(jīng)典的分離分析在豬延伸基因座中鑒定到至少3個(gè)等位基因，E為均一黑色，Ep為黑色斑點(diǎn)和e為均一紅色[Ollivier和Sellier，Ann.Genet.Sel.Anim.，14481-544，(1982)]。3個(gè)等位基因的顯性關(guān)系為E＞Ep＞e。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)皮毛顏色變化與豬αMSHR基因中的序列多態(tài)性有關(guān)。我們已用來(lái)自有不同皮毛顏色的以下品種的樣品分析此基因的DNA序列野生型顏色的WildBoar，帶有均一黑色等位基因(E)的Meishan和Hampshire，帶有黑色斑點(diǎn)等位基因(Ep)的Pietrain和LargeWhite以及均一紅色(e)的Duroc。在LargeWhite中由于Ep等位基因的存在而預(yù)期的色塊或色斑被隱藏，因?yàn)榇似贩N也攜帶阻止任何顏色表達(dá)的顯性白色基因。獲取5種不同的αMSHR基因，一種來(lái)自WildBoar，一種來(lái)自Meishan，一種來(lái)自Duroc，一種來(lái)自Hampshire并且一種發(fā)現(xiàn)于Pietrain和LargeWhite中。我們將發(fā)現(xiàn)于WildBoar中的等位基因稱為E+并且認(rèn)為此等位基因的存在對(duì)野生型顏色的表達(dá)是必需的。由Meishan和Hampshire豬攜帶的均一黑色E等位基因與不同的αMSHR序列相關(guān)。我們將這兩個(gè)等位基因分別稱為Em和Eh。與Pietrain中發(fā)現(xiàn)的與黑色斑點(diǎn)等位基因有關(guān)的DNA序列稱為Ep。Ep和Eh等位基因的相似性表明它們來(lái)自共同起源。此處說(shuō)明的序列差異可用作測(cè)定豬皮毛顏色方面基因型的方法和試劑盒的基礎(chǔ)。選擇性地，連鎖標(biāo)記的等位基因如發(fā)現(xiàn)與這些等位基因不平衡連鎖的微衛(wèi)星或AFLP標(biāo)記可用于預(yù)測(cè)顏色基因型?？傊?，我們已發(fā)現(xiàn)與5種不同的延伸等位基因即E+、Em、Eh、Ep和e相關(guān)的5種不同αMSHR序列。除了在等位基因Ep5’末端的2個(gè)堿基對(duì)插入和在等位基因Em3’非翻譯區(qū)中的1個(gè)堿基對(duì)的缺失以外，在αMSHR基因中鑒定到的DNA序列差異為單個(gè)堿基對(duì)變化。這些變化中有些是沉默的，然而許多變化引起αMSHR蛋白氨基酸序列的變化。例如，e和其它等位基因之間的差異是αMSHR基因編碼序列中的2個(gè)錯(cuò)義突變。重要的是，豬基因中的差異不同于在其它物種中發(fā)現(xiàn)的差異。牛和小鼠的e突變是一個(gè)堿基對(duì)的缺失[Robbins等，細(xì)胞，72827-834(1993)；Klungland等，哺乳動(dòng)物基因組6636-639(1995)，Joerg等，基因組7317-318(1996)]，而這里鑒定到的突變包括在人、小鼠、牛和馬基因序列中保守的區(qū)域中的錯(cuò)義突變(G727變?yōu)锳)[Wikberg等，WO94/04674(1994)，Valverde等，自然遺傳學(xué)11328-330(1995)，Robbins等，細(xì)胞72827-834(1993)，Klungland等，哺乳動(dòng)物基因組6636-639(1995)，Joerg等，基因組7317-318(1996)，Marklund等，哺乳動(dòng)物基因組7895-899(1996)]。Ep組在基因5’末端WildBoar序列核苷酸位66后有雙核苷酸插入，這導(dǎo)致基因中產(chǎn)生另一個(gè)終止密碼子，得到僅54個(gè)氨基酸的推測(cè)的突變多肽。最后，Meishan等位基因(Em)在蛋白中表現(xiàn)4個(gè)氨基酸變化。這些差異中的兩個(gè)位于在牛中變化的基因的相同區(qū)域中。一系列豬品種的顏色、典型的I和E基因型以及根據(jù)序列測(cè)定和測(cè)試研究測(cè)定的E基因型在下表中表示品種I基因座E基因座顏色Hampshirei/iEh/Eh黑色帶有白色條帶LargeWhiteI/IEp/Ep白色LandraceI/IEp/Ep白色Pietraini/iEp/Ep白色帶有黑色斑塊Berkshirei/iEp/Ep黑色帶有白點(diǎn)Meishani/iEm/Em黑色或黑色帶有白點(diǎn)Duroci/ie/e紅色WildBoari/iE+/E+棕色(帶狀毛)因此，有可能鑒別等位基因E+、Em、Eh、Ep和e并由此測(cè)定豬個(gè)體非白色皮毛顏色的基因型(或其產(chǎn)物的遺傳起源)。有趣的是，已經(jīng)檢測(cè)的白色品種看來(lái)等位基因Ep都固定在E基因座處。認(rèn)為E基因座對(duì)I基因座賦予的表型可能有一定的修飾效應(yīng)。雖然此效應(yīng)的機(jī)制還沒有確定，但是Ep在這些品系中的固定說(shuō)明了在品種特征選擇方面對(duì)涉及皮毛顏色基因座的敏銳影響，由此在這些基因座之間提供比可能預(yù)期的更多的因子。延伸基因座基因型與連鎖標(biāo)記如與該基因連鎖的微衛(wèi)星序列之間的關(guān)聯(lián)可以得到測(cè)定。許多微衛(wèi)星標(biāo)記位于豬6號(hào)染色體已定位αMSHR基因的區(qū)域。許多豬品種特征性地表現(xiàn)條帶表型，其由肩部上的連續(xù)白色條帶和白色前腿組成。表現(xiàn)此特征的品種實(shí)例有在黑色背部背景中表現(xiàn)白色條帶的BritishSaddleback(來(lái)自Wessex和Essex品種)和Hampsphire以及特征為紅色背景上白色條帶的BavarianLandschwein。該特征由稱為Be的顯性作用基因座Belt控制，該基因座認(rèn)為是兩個(gè)等位基因(Legault1977，于豬遺傳學(xué)，RothschildM.F.和RuvinskyA編，CAB國(guó)際出版社中)[Ollivier和Sellier，Ann.Genet.Sel.Anim.，14481-544，(1982)]。Be產(chǎn)生條帶而純合形式的be導(dǎo)致條帶的缺乏。雜合動(dòng)物Be/be帶有條帶，但是在此基因型中條帶一般在特征上更窄。為了鑒定有條帶和無(wú)條帶表型的真實(shí)遺傳基礎(chǔ)，用來(lái)自PietrainX(PietrainXHampshire)雜交的動(dòng)物進(jìn)行研究。Pietrain是be/be而Hampshire是Be/Be。因此F1代均具有基因型Be/be。將F1進(jìn)一步與Pietrain(be/be)回交導(dǎo)致Be等位基因在子代間的分離，得到表現(xiàn)條帶的Be/be動(dòng)物和無(wú)條帶的be/be子代。然后建立這些系譜內(nèi)部條帶性狀的遺傳與某些微衛(wèi)星標(biāo)記之間的相關(guān)性。此工作令人吃驚地鑒定出實(shí)際參與的基因?yàn)樯鲜鰠⑴c顯性白色的KIT基因。進(jìn)一步分析表明此系譜中的表型與KIT核苷酸2678位存在的C或T多態(tài)性相關(guān)。C的存在產(chǎn)生AciI限制性位點(diǎn)，當(dāng)T存在時(shí)沒有此位點(diǎn)。根據(jù)這些意外的發(fā)現(xiàn)，可用多種方法測(cè)定動(dòng)物在條帶基因座的基因型，這些方法使用單核苷酸多態(tài)性或連鎖標(biāo)記包括微衛(wèi)星或其它單核苷酸多態(tài)性。因此，可通過(guò)多種方法測(cè)定動(dòng)物的基因型從而測(cè)定它們此特定外在特征的遺傳狀況。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供以品種來(lái)源為基礎(chǔ)鑒別動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品、測(cè)定或測(cè)試動(dòng)物產(chǎn)品的品種來(lái)源或鑒定動(dòng)物產(chǎn)品的方法，其中此方法包括以下步驟(i)提供動(dòng)物產(chǎn)品的樣品；并且(ii)分析存在于樣品中一種或多種品種因子基因的等位基因。如上所解釋的，品種因子是外在表型性狀。如此處所用的，外在表型性狀是可通過(guò)視覺識(shí)別的性狀。以品種來(lái)源為基礎(chǔ)鑒別動(dòng)物產(chǎn)品包括將一組不同動(dòng)物產(chǎn)品成員分成許多具有相同品種來(lái)源的不同產(chǎn)品。這不一定意味著鑒定品種來(lái)源的性質(zhì)。在動(dòng)物產(chǎn)品來(lái)源的一致性必須得到監(jiān)測(cè)(但其實(shí)際品種來(lái)源并不重要)的情況下，在這種基礎(chǔ)上的動(dòng)物產(chǎn)品鑒別可能是足夠的。相反，動(dòng)物產(chǎn)品品種來(lái)源的測(cè)定意味著鑒定品種來(lái)源，而測(cè)試品種來(lái)源意味著足以測(cè)定是否使用了除所需來(lái)源以外的品種來(lái)源的分析(當(dāng)其已經(jīng)注明時(shí)不一定鑒定這樣的其它品種來(lái)源)。鑒定動(dòng)物產(chǎn)品意味著鑒定其達(dá)到規(guī)定的品種來(lái)源要求。這樣的鑒定根據(jù)進(jìn)行分析的環(huán)境和可以得到的輔助數(shù)據(jù)的性質(zhì)和程度可能包括鑒別、測(cè)定和/或測(cè)試。用于本發(fā)明的樣品可以是任何方便的形式。在許多情況下，樣品將是食物樣品(如肉產(chǎn)品)。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，樣品經(jīng)預(yù)處理(如提取、純化和/或分級(jí)分離)以便可以對(duì)品種因子基因的等位基因進(jìn)行[核酸(如RNA或DNA)和/或蛋白水平]分析。樣品優(yōu)選地是核酸樣品，有這種情況下分析步驟(ii)包括DNA或RNA分析。選擇性地，樣品可以是蛋白樣品(其中蛋白性質(zhì)反映品種因子等位基因)，在這種情況下分析步驟(ii)包括蛋白分析。本發(fā)明的品種因子可以是單基因或多基因性狀。單基因性狀是優(yōu)選的，因?yàn)橘x予這樣的性狀的基因一般容易鑒定和分析。然而，在有些情況下分析多基因性狀(即由多個(gè)基因控制的性狀)的等位基因可能是有用的，因?yàn)樵谶@種情況下潛在的等位基因多態(tài)性更多(因此增加了品種鑒別的可能性)。一般地，外在表型特征是那些在育種計(jì)劃中用作人工選擇基礎(chǔ)的性狀。外在表型性狀優(yōu)選地是行為或形態(tài)學(xué)性狀、生理學(xué)或行為性狀。外在表型性狀在品種間可能有量或質(zhì)的差異。優(yōu)選的是在品種間有數(shù)量上差異的性狀，因?yàn)檫@樣的性狀經(jīng)常是相應(yīng)品種因子基因的等位基因中數(shù)量上差異的反映。在這些情況下，分析得到相對(duì)可靠的陽(yáng)性-陰性結(jié)果，這些結(jié)果在不同測(cè)試站/實(shí)驗(yàn)室之間容易進(jìn)行解釋和比較。在步驟(ii)中分析的品種因子基因可以是任何適合的品種因子基因。這些基因可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的方法用常規(guī)試驗(yàn)和誤差加以鑒定和分析。優(yōu)選地，它們選自皮毛顏色、圖案、質(zhì)地、密度或長(zhǎng)度基因；耳朵方面的基因；兩種肌肉形成基因；角形態(tài)基因；獠牙形態(tài)基因；眼顏色基因；羽毛基因；喙顏色/形態(tài)基因；發(fā)聲(如吠叫)基因；雞冠或肉垂基因和/或控制炫耀行為基因。在優(yōu)選實(shí)施方案中，品種因子基因是KIT或αMSHR皮毛顏色基因(例如豬KIT和/或αMSHR基因)。分析步驟(ii)可以包括任何廣泛的已知核酸/蛋白分析技術(shù)。所選分析技術(shù)的性質(zhì)對(duì)于本發(fā)明的實(shí)施不是關(guān)鍵，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)進(jìn)行分析的情況和需要數(shù)據(jù)的類型容易地決定適當(dāng)技術(shù)。優(yōu)選地，分析步驟(ii)包括選擇性地?cái)U(kuò)增特定核酸片段(例如通過(guò)PCR)、測(cè)定品種因子基因內(nèi)一個(gè)或多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的存在[例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析]、測(cè)定品種因子基因的部分或全部核苷酸序列、用等位基因特異性的DNA或RNA探針檢測(cè)核酸、或者用至少一對(duì)適當(dāng)引物對(duì)核酸樣品進(jìn)行一輪或多輪PCR擴(kuò)增并且然后對(duì)這樣得到的擴(kuò)增核酸進(jìn)行RFLP分析。選擇性地，分析步驟(ii)包括用對(duì)等位基因特異性表位特異的抗體(如單克隆抗體)檢測(cè)蛋白樣品、電泳分析、層析分析、氨基酸序列分析、蛋白水解分析或表位作圖。例如Ep等位基因可以通過(guò)任何可以檢測(cè)編碼蛋白大小變化的方法加以鑒別。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析步驟(ii)包括測(cè)定KIT和/或αMSHR基因的核苷酸序列或KIT和/或αMSHR蛋白的氨基酸序列。在這里，分析可以包括確定KIT和/或αMSHR基因中至少一個(gè)突變的存在與否。任何鑒定特異性序列改變存在的方法均可使用，包括例如單鏈構(gòu)型多態(tài)性(SSCP)分析、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、誘變分離的PCR、RFLP分析、異源雙鏈分析、變性梯度凝膠電泳、溫度梯度電泳、DNA序列分析和非凝膠系統(tǒng)如TaqManTM(Perkin-Elmer)。在TaqManTM系統(tǒng)中，設(shè)計(jì)在待研究突變側(cè)翼并允許該區(qū)域PCR擴(kuò)增的寡核苷酸PCR引物。然后設(shè)計(jì)第3個(gè)寡核苷酸探針以與在基因的不同等位基因之間含有發(fā)生變化堿基的區(qū)域雜交。探針在5’和3’末端用熒光染料標(biāo)記。選擇這些染料使得當(dāng)它們彼此接近時(shí)它們中的一種熒光被另一種萃滅并且不能檢測(cè)到。用TaqDNA聚合酶從相對(duì)于探針來(lái)說(shuō)位于模板5’的PCR引物的延伸通過(guò)TaqDNA聚合酶5’核酸酶活性而切除結(jié)合在退火探針5’末端上的染料。這去除了萃滅效應(yīng)，允許檢測(cè)來(lái)自探針3’末端上染料的熒光。不同DNA序列之間的辨別基于下面的事實(shí)進(jìn)行，即如果探針與模板分子之間的雜交不完全(即存在一些形式的錯(cuò)配)，那么染料的切除就不會(huì)發(fā)生。因此只有在寡核苷酸探針的核苷酸序列完全與其結(jié)合的模板分子互補(bǔ)時(shí)萃滅才會(huì)去除。反應(yīng)混合物可含有2種不同的探針序列，每種探針針對(duì)可能存在的不同等位基因而設(shè)計(jì)，由此允許在一個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)兩種等位基因。雖然TaqManTM系統(tǒng)目前僅能辨別兩種等位基因，但是可開發(fā)出一些探針引物系列，其中一些目的等位基因的探針用非目的等位基因的不同熒光染料標(biāo)記。例如，如果人們希望證實(shí)一組Duroc品種豬只帶有等位基因e，他可以有以一種熒光染料標(biāo)記的能檢測(cè)此等位基因的探針和以第兩種染料標(biāo)記能檢測(cè)所有其它等位基因的探針。由此人們可檢測(cè)此基因座任何非Duroc型等位基因的存在?？稍O(shè)計(jì)這樣的探針系列并根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要加以標(biāo)記。分析步驟(ii)可進(jìn)一步包括測(cè)定與KIT和/或αMSHR基因連鎖的一種或多種微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因與KIT和/或αMSHR基因的特定等位基因之間的關(guān)聯(lián)。選擇性地，分析步驟(ii)可基于存在于核酸樣品中微衛(wèi)星標(biāo)記的鑒定。分析步驟(ii)優(yōu)選地包括(a)檢測(cè)與KIT和/或αMSHR基因連鎖的一種或多種微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因與KIT和/或αMSHR基因的特定等位基因之間的關(guān)聯(lián)；測(cè)定哪些微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因存在于核酸樣品中。分析步驟(ii)優(yōu)選地進(jìn)一步包括測(cè)定至少一個(gè)額外基因座如額外的品種因子(如皮毛顏色)基因座基因型的步驟。尤為優(yōu)選的額外基因座是KIT基因基因座(如豬KIT基因基因座)。分析步驟(ii)優(yōu)選地包括使用至少一對(duì)適當(dāng)引物的PCR。在基因是豬αMSHR基因的情況下，至少一對(duì)適當(dāng)引物是αMSHR正向引物1(5′-TGTAAAACGACGGCCAGTRGTGCCTGGAGGTGT-3′)αMSHR反向引物5(5′-CGCCCAGATGGCCGCGATGGACCG-3′)；或αMSHR正向引物2(5′-CGGCCATCTGGGCGGGCACCGTGC-3′)αMSHR反向引物2(5′-GGAAGGCGTAGATGAGGGGGTCCA-3′)；或αMSHR正向引物3(5′-GCACATCGCCCGGCTCCACAAGAC-3′)αMSHR反向引物3(5′-GGGGCAGAGGACGACGAGGGAGAG-3′)分析步驟(ii)也可包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，例如包括用一種或多種限制性酶BstUI、HhaI和/或BspHI消化豬的核酸。在基因是豬αMSHR基因時(shí)，此分析可包括鑒定豬αMSHR基因中任何表現(xiàn)多態(tài)性的核苷酸位的多態(tài)性包括283、305、363、370、491、727、729、1162位或核苷酸位60與70之間或者核苷酸位1005與1010之間的多態(tài)性。分析步驟(ii)可包括用至少一對(duì)適當(dāng)引物對(duì)核酸樣品進(jìn)行一輪或多輪PCR擴(kuò)增循環(huán)并且然后對(duì)這樣得到的擴(kuò)增核酸進(jìn)行RFLP分析以測(cè)定豬的KIT或αMSHR基因型。在這里，當(dāng)基因是豬αMSHR基因時(shí)，至少一對(duì)適當(dāng)引物是上述的引物。動(dòng)物產(chǎn)品優(yōu)選包括肉(如加工和/或罐裝的肉)、禽蛋、禽蛋擦拭物或洗滌物、精液、血液、血清、唾液、絨毛、活檢樣品或皮革或由它們組成。它可包括基因組DNA、RNA或線粒體DNA。動(dòng)物優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物(如豬、牛、狗、貓、馬、綿羊、嚙齒動(dòng)物或兔)、魚類(如鱒魚或鮭魚)或鳥類(如雞或火雞)。本發(fā)明可以應(yīng)用于極少量的樣品并且可用于快速而廉價(jià)地篩選大量樣品。本發(fā)明可適于給出絕對(duì)結(jié)果，并且定量不是必需的。此外，只需要核酸的小片段，并且相同的測(cè)試可用于大多數(shù)動(dòng)物產(chǎn)品。應(yīng)用本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在眾多領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，認(rèn)為有些品種產(chǎn)出具有更高食用品質(zhì)的肉，并且許多零售商現(xiàn)在出售聲稱來(lái)自特定或傳統(tǒng)品種(如WildBoar雜交種)的產(chǎn)品。本發(fā)明使消費(fèi)者組織能證實(shí)這些允諾并使零售商能監(jiān)測(cè)供應(yīng)他們的產(chǎn)品質(zhì)量(如進(jìn)行產(chǎn)品鑒定)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在由零售商進(jìn)行并使用以支持消費(fèi)者信心的鑒定研究中有特別的用途，因?yàn)檫z傳標(biāo)記與外在身體特征之間的連鎖比品種特異性標(biāo)記概念更容易被外行人理解。這使得采用這些品種因子有吸引力并且也給零售商提供了加強(qiáng)鑒定方案的機(jī)會(huì)。同時(shí)也有許多品種對(duì)由不同肉加工技術(shù)生產(chǎn)的火腿質(zhì)量的影響的報(bào)道。例如，在一則報(bào)道中根據(jù)對(duì)硬度、咸度和干燥腌制味道的感官描述將來(lái)自三個(gè)不同豬品種的火腿可靠地加以分類。本發(fā)明的品種鑒定方法使生產(chǎn)商能將原材料作為質(zhì)量控制的一部分。加強(qiáng)和鑒定原材料來(lái)源一致性的能力也導(dǎo)致改進(jìn)的加工控制、更低的成本和更高的產(chǎn)品一致性，因?yàn)楝F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)來(lái)自不同品種的產(chǎn)品的化學(xué)組成的異質(zhì)性是口味不同的重要因素并且品種間其它肉成分的功能活性也可能不同。本發(fā)明也發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物(如豬)育種者保持原種純度中的應(yīng)用。小規(guī)模的傳統(tǒng)品種種群意味著維持足夠大小的基因庫(kù)以避免近親交配的影響，這需要在分離的種群之間進(jìn)行原種的引進(jìn)和遷移。遺傳污染的風(fēng)險(xiǎn)與這種遷移有關(guān)，本發(fā)明可用于減少或排除這些風(fēng)險(xiǎn)。生物多樣性和提供此多樣性庫(kù)的稀有品種的維持產(chǎn)生對(duì)品種鑒定者增加的需求。例如BritishSaddleback育種者的問(wèn)題。此品種的某些血統(tǒng)攜帶更高頻率的條帶基因座be等位基因，這可能導(dǎo)致達(dá)不到所需品種標(biāo)準(zhǔn)的無(wú)條帶動(dòng)物的產(chǎn)生并且不僅降低單個(gè)動(dòng)物的價(jià)值而且降低所有產(chǎn)仔的價(jià)值。當(dāng)新血統(tǒng)導(dǎo)入現(xiàn)存種群中時(shí)對(duì)此等位基因進(jìn)行選擇的能力將使育種者能夠增加遺傳多樣性而無(wú)降低特定種群相對(duì)于一般品種相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明也可用作育種計(jì)劃的一部分以證實(shí)特定的雜交。這在建立金字塔育種計(jì)劃中有重大價(jià)值。特定品種特征如皮毛顏色、體型和耳姿在這樣的雜交種經(jīng)常變化，但是仍然存在能夠證實(shí)所需母本基因存在的必要。這種用于視覺鑒定雜交品種的可見品種特征在使用人工授精時(shí)也是缺乏的，其中精液可能來(lái)自遙遠(yuǎn)地理位置的豬。此外，技術(shù)人員將理解根據(jù)此處所述的信息，有可能提供測(cè)定豬皮毛顏色基因型的測(cè)試。因此，本發(fā)明也提供了測(cè)定豬皮毛顏色基因型的方法，此方法包括(i)獲取豬核酸樣品；并且(ii)分析在(i)中獲取的核酸樣品以測(cè)定哪些αMSHR基因的等位基因存在。在本發(fā)明這方面的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(ii)中的測(cè)定通過(guò)測(cè)定αMSHR基因的核苷酸序列來(lái)實(shí)現(xiàn)，并且具體地是基于測(cè)定哪個(gè)錯(cuò)義、插入或缺失突變存在于基因編碼區(qū)域中。在另一實(shí)施方案中，人們可以首先測(cè)定與αMSHR基因連鎖的微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因與αMSHR基因的特定等位基因之間的關(guān)聯(lián)。因此，步驟(ii)中的測(cè)定將基于存在于核酸樣品中微衛(wèi)星標(biāo)記等位基因的鑒定。因此在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了測(cè)定豬皮毛顏色基因型的方法，此方法包括(i)測(cè)定與αMSHR基因連鎖的一種或多種微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因與αMSHR基因的特定等位基因之間的關(guān)聯(lián)；(ii)獲取豬核酸樣品；并且(iii)分析在(ii)中獲取的核酸樣品以測(cè)定哪些微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因存在。延伸基因座的等位基因的測(cè)定將表明動(dòng)物的背景顏色以及某些情況下混合成色的圖案即斑點(diǎn)，但不必測(cè)定得到子代的皮毛顏色。這將依賴于其它基因座如顯性白色基因座I的基因型。I基因座的基因型可分別按WO-A-97/05278中所述加以測(cè)定。因此，在適當(dāng)情況下，上述的方法可以進(jìn)一步包括以下步驟(iii)/(iv)測(cè)定其它皮毛顏色基因座的基因型。這樣的其它皮毛顏色基因座的實(shí)例是條帶基因座。在優(yōu)選的方法中，用擴(kuò)增含有核苷酸2678的KIT基因區(qū)域的引物進(jìn)行PCR。合適引物對(duì)的實(shí)例是正向引物L(fēng)A935’-GAGCAGCCCCTACCCCGGAATGCCAGTTGA-3’和反向引物KIT565’CTTTAAAACAGAACATAAAAGCGGAAACATCATGCGAAGG-3’.分析方法能測(cè)定2678位C或T的存在。在適當(dāng)情況可以使用限制性酶AciI，因?yàn)镃的存在產(chǎn)生了限制性位點(diǎn)，該位點(diǎn)在T存在時(shí)缺乏。在系譜內(nèi)的類似檢測(cè)將允許子代基因型的測(cè)定。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種測(cè)定豬皮毛顏色基因型的方法，此方法包括(i)獲取豬核酸樣品；并且(ii)分析在(i)中獲取的核酸樣品以測(cè)定KIT基因是否帶有任何與條帶基因型有關(guān)的多態(tài)性。優(yōu)選地，該方法包括對(duì)豬基因組DNA樣品適當(dāng)進(jìn)行的RFLP分析，基因組DNA使用PCR和一對(duì)適當(dāng)引物加以擴(kuò)增。鑒定特異性序列改變存在的優(yōu)選方法是上述有關(guān)品種因子的方法。附圖簡(jiǎn)述圖1從多個(gè)豬品種中測(cè)得的豬αMSH-R基因的部分核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列。核苷酸序列的位置數(shù)基于ATG起始密碼子的A為核苷酸1。氨基酸數(shù)是根據(jù)牛BDF3序列[Vanetti等，F(xiàn)EBS通訊348268-272(1995)]以允許比較。圖2通過(guò)用BstUI或HhaI消化從豬αMSH-R基因擴(kuò)增的DNA片段而獲得的DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳。標(biāo)記為M的泳道含有50、150、300、500、750、1000bp的DNA標(biāo)記。其它樣品來(lái)自1.Pietrain2.Pietrain3.LargeWhite4.LargeWhite5.LargeWhite6.Duroc7.Duroc8.Hampshire9.Meishan10.Berkshire11.Berkshire圖3通過(guò)用BstUI(標(biāo)記為B)或HhaI(標(biāo)記為H)消化從豬αMSH-R基因擴(kuò)增的DNA片段而獲得的DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳。標(biāo)記為M的泳道含有50、150、300、500、750、1000bp的DNA標(biāo)記。其它樣品來(lái)自1.零售商1.皮膚2.零售商1.脂肪3.零售商1.肉4.零售商2.脂肪5.零售商1.肉圖4表示使用引物KIT1F和KIT7R時(shí)KIT外顯子16-19的RT-PCR產(chǎn)物的電泳圖(4％瓊脂糖)。樣品1-3和4-6分別為瑞典LargeWhite和Hampshire豬。424和301bp片段之間大小的差異是由于后者缺乏外顯子17。Yorkshire豬的兩條較上面的條帶解釋為異源雙鏈(HD)。圖5表示包括KIT外顯子17的21bp和KIT內(nèi)含子17的27bp的48bp序列。內(nèi)含子/外顯子邊界的位置用垂直線標(biāo)記并且剪接位點(diǎn)突變(核苷酸1G→A)用垂直箭頭表示。在等位基因Ip和i中的相同堿基用點(diǎn)標(biāo)記。圖6用于檢測(cè)KIT基因內(nèi)含子17中剪接位點(diǎn)突變存在的NlaIIIPCRRFLP測(cè)試。圖6A表示用引物對(duì)KIT21和KIT35擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物內(nèi)兩個(gè)NlaIII識(shí)別位點(diǎn)的位置。所有距離以堿基對(duì)給出。圖6B表示用NlaIII消化正常KIT或剪接突變KIT后得到的片段大小。圖6C說(shuō)明PCRRFLP測(cè)試的使用。泳道1表示未消化的KIT21/KIT35擴(kuò)增的片段。對(duì)從以下泳道中不同克隆擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，泳道2中含有剪接位點(diǎn)突變的克隆；泳道3中含有正常剪接位點(diǎn)序列的克?。挥镜?中來(lái)自有色豬的基因組DNA；泳道5來(lái)自白色豬的基因組DNA。片段大小以堿基對(duì)給出。圖7三類基因型正常KIT比剪接突變KIT比例的比較。圖8兩個(gè)豬品種正常KIT比剪接突變KIT比例的比較。圖9瑞典Landrace(1-8泳道)和WildBoar(9與10泳道)品種中KIT基因的SSCP分析。兩個(gè)多態(tài)性條帶被標(biāo)出。圖10來(lái)自Hampshire品種動(dòng)物的豬KITcDNA的核苷酸序列。序列根據(jù)將N末端甲硫氨酸密碼子的第1個(gè)核苷酸看作1來(lái)計(jì)數(shù)。圖11在許多動(dòng)物中多態(tài)核苷酸2678處KIT基因PCR-RFLP分析的聚丙烯酰胺凝膠電泳。泳道1和2分別為HampshireWildBoar，兩者在2678位的C是純合的。3-7和9與10泳道、無(wú)關(guān)的LargeWhite母豬，在2678位的T都是純合的。泳道11Pietrain在此位的T純合以及泳道8LargeWhite母豬C和T雜合。泳道12含有未消化的PCR產(chǎn)物而泳道M是DNA大小標(biāo)準(zhǔn)。圖12豬αMSHR編碼區(qū)的3’末端和鄰近的3’非翻譯區(qū)的核苷酸序列。TGA終止密碼子以黑體突出表示，EPIG14的引物結(jié)合位點(diǎn)以斜體表示。計(jì)數(shù)是根據(jù)圖1a中所用的系統(tǒng)，其中核苷酸1是WildBoar序列ATG起始密碼子的A。與歐洲WildBoar相同的堿基用破折號(hào)標(biāo)記。缺失的標(biāo)記以標(biāo)記。實(shí)施例實(shí)施例1αMSHR基因序列的測(cè)定豬αMSHR基因DNA序列通過(guò)同時(shí)對(duì)PCR產(chǎn)物和豬DNA的克隆部分進(jìn)行DNA測(cè)序加以測(cè)定。用于PCR的DNA模板的制備可從任何含有細(xì)胞核的組織來(lái)源如白細(xì)胞、毛囊、耳槽(earnotches)和肌肉制備DNA。這里的方法涉及血細(xì)胞制品；其它組織可通過(guò)直接將材料懸浮于K緩沖液中然后進(jìn)行與血液相同的步驟來(lái)進(jìn)行類似的處理。這里列出的方法制備含有適于PCR擴(kuò)增的粗提DNA的細(xì)胞裂解液。然而，任何用于制備純化或粗提DNA的方法應(yīng)該同樣有效。將血液收集于pH7.8的50mMEDTA中以防止凝結(jié)。將50μl血液懸浮于小微量離心管(0.5mlEppendorf或類似物)中。加入450μlTE緩沖液以裂解紅細(xì)胞(血紅素簇抑制PCR)并將混合物旋渦振蕩2秒鐘。然后將完整白細(xì)胞和殘余紅細(xì)胞在微量離心機(jī)中以13,000g離心12秒。通過(guò)使用低壓真空泵系統(tǒng)輕輕抽吸而移出上清液。然后再次加入450μlTE緩沖液以裂解殘余紅細(xì)胞并且按前述通過(guò)離心收集白細(xì)胞。如果沉淀中仍殘留任何紅色，重復(fù)此步驟直至沉淀為白色。從沉淀的白細(xì)胞去除最后一滴上清液后，加入100μl含有蛋白酶K的K緩沖液并將混合物于55攝氏度溫育2小時(shí)。然后將混合物加熱至95-100攝氏度8分鐘并且將DNA裂解物儲(chǔ)存于-20攝氏度直至需要。試劑T.E.緩沖液10mMTRIS-HClpH8.01mMEDTAK緩沖液50mMKCl10mMTRIS-HClpH8.32.5mMMgCl20.5％Tween20PCR以制備DNA測(cè)序模板用3對(duì)引物擴(kuò)增αMSHR基因用于測(cè)序分析。引物MSHR正向引物1(5′-TGTAAAACGACGGCCAGTRGTGCCTGGAGGTGTCCAT-3′)；和MSHR正向引物5(5′-CGCCCAGATGGCCGCGATGGACCG-3′)從基因5’部分?jǐn)U增428bp片段。引物MSHR正向引物2(5′-CGGCCATCTGGGCGGGCAGCGTGC-3′)；和αMSHR反向引物2(5′-GGAAGGCGTAGATGAGGGGGTCCA-3′)從基因3’部分?jǐn)U增405bp片段。因?yàn)檫@2個(gè)片段不重疊，所以使用第3對(duì)引物αMSHR正向引物4(5′-TGCGCTACCACAGCATCGTGACCCTGC-3′)；和αMSHR反向引物4(5′-GTAGTAGGCGATGAAGAGCGTGCT-3′)擴(kuò)增橫跨50bp間隔的98bp片段。PCR于20μl總體積中在DNA熱循環(huán)儀(PerkinElmer9600)上進(jìn)行，20μl體積中含有25ng基因組DNA，1.0mMMgCl2，50mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，200μMdNTPs，0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)和10pmol正向和反向引物。為了活化AmpliTaqGold，起始熱變性在94攝氏度進(jìn)行10分鐘，然后進(jìn)行32輪循環(huán)，每輪循環(huán)由94攝氏度45秒、53攝氏度45秒和72攝氏度45秒組成。最后一次延伸在72攝氏度持續(xù)7分鐘。用SureClone連接試劑盒(Pharmacia)將PCR產(chǎn)物克隆入載體pUC18中。質(zhì)粒DNA的制備用Jetstar質(zhì)粒midi試劑盒50(Genomed)從過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物純化質(zhì)粒DNA并將得到的DNA稀釋至150ng/μl。質(zhì)粒DNA的序列測(cè)定用染料引物化學(xué)法對(duì)克隆的質(zhì)粒插入片段進(jìn)行測(cè)序。按照ABIPrism方法P/N402113(PerkinElmer)中所述用模板和含有熒光標(biāo)記的M13正向或反向引物的備好反應(yīng)混合物制備每輪循環(huán)反應(yīng)。按照儀器用戶指南(文檔號(hào)903877，PerkinElmer)用Catalyst800分子生物學(xué)工作站(ABI)進(jìn)行循環(huán)和樣品收集。根據(jù)儀器說(shuō)明書(PerkinElmer方法P/N402078)中所述用377ABIPrismDNA測(cè)序儀對(duì)得到的延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化、上樣和分析。PCR產(chǎn)物的染料終止測(cè)序染料終止測(cè)序要求將PCR產(chǎn)物純化成不含有過(guò)量dNTP和殘余引物的樣品。在將純化DNA稀釋為15ng/μl之前，通過(guò)使模板DNA流過(guò)QiaQuick離心柱(Qiagen)來(lái)實(shí)現(xiàn)純化。染料終止循環(huán)測(cè)序用AmpliTaqDNA聚合酶FS按照ABIPrism方法P/N402078(PerkinElmer)進(jìn)行。循環(huán)測(cè)序反應(yīng)在10μl總反應(yīng)體積中進(jìn)行。反應(yīng)包含1.6pmole用于從基因組DNA擴(kuò)增靶片段的正向或反向引物之一，20ng純化的模板DNA和含有4種染料終止子的任何一種、dNTPs、Tris-HCl(pH9.0)、MgCl2、熱穩(wěn)定的焦磷酸和AmpliTaqDNA聚合酶FS的終止備好反應(yīng)混合物(PerkinElmer)。循環(huán)測(cè)序用GeneAmp9600儀器(PerkinElmer)進(jìn)行，共25個(gè)循環(huán)，每輪循環(huán)由96攝氏度10秒、50攝氏度5秒和60攝氏度4分鐘組成。用乙醇沉淀純化延伸產(chǎn)物進(jìn)行凝膠分離，按照儀器說(shuō)明書(PerkinElmer方法P/N402078)在377ABIPrismDNA測(cè)序儀中上樣和電泳。結(jié)果來(lái)自許多豬品種的豬αMHSR基因序列的部分編碼區(qū)DNA序列與實(shí)施例22中測(cè)定的序列一起列于圖1a中。推導(dǎo)的氨基酸序列在圖1b中表示。實(shí)施例2根據(jù)PCR-RFLP鑒別E基因座的等位基因用于PCR的DNA制備同實(shí)施例1。PCR反應(yīng)設(shè)在0.25ml薄壁管(PerkinElmer)中的20μl體積中，含有以下成分20μl反應(yīng)體積2μl模板DNA1.5mMMgCl2200μM每種dNTP，3pM正向和反向引物0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)MSHR正向引物3序列5′GCACATCGCCCGGCTCCACAAGAC3′MSHR反向引物3序列5′GGGGCAGAGGACGACGAGGGAGAG3′將反應(yīng)管置于預(yù)熱至94攝氏度的PerkinElmer9600熱循環(huán)儀中并且按照如下方案進(jìn)行PCR起始變性步驟為94攝氏度10分鐘。33輪循環(huán)94攝氏度-45秒55攝氏度-45秒72攝氏度-45秒最后的循環(huán)是72攝氏度最后延伸7分鐘。將樣品保存于4攝氏度直至需要。限制性酶消化和電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)148bp。為測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，將反應(yīng)產(chǎn)物分成每份10μl的2等份，用HhaI(GIBCO-BRL)或BstUI(NewEnglandBiolabs)對(duì)其進(jìn)行消化。反應(yīng)如下設(shè)置并溫育BstUI消化HhaI消化10μl擴(kuò)增的DNA10μl擴(kuò)增的DNA2.5μBstUI2.5μHhaI60攝氏度60分鐘0.5μl10XReact2緩沖液(GIBCO-BRL)37攝氏度60分鐘消化后，將2μl上樣染料加入每個(gè)反應(yīng)(100mMTrispH8.0，100mM硼酸，1mMEDTA，50％(v/v)甘油，0.02％(w/v)OrangeG)中并將混合物上樣至0.5XTBE(44.5mMTrispH8.0，44.5mM硼酸和0.5mMEDTA)中4％瓊脂糖凝膠(3％NuSieve/1％Seakem，F(xiàn)MCBioproducts)上，并且于150v電泳1小時(shí)。通過(guò)溴化乙錠染色觀察產(chǎn)物。結(jié)果BstUI和HhaI消化各得到61和87bp條帶。消化與可能的等位基因之間的關(guān)系在下表中表示限制性消化模式與E基因座單個(gè)等位基因之間的關(guān)系如果將未切開的等位基因稱為等位基因1并且將用每種酶消化的等位基因稱為等位基因2，則各種基因型將下表中所示真實(shí)的E基因型和相關(guān)計(jì)數(shù)注攜帶等位基因Eh的動(dòng)物的結(jié)果將與攜帶等位基因Ep的動(dòng)物相同。從多種豬制備樣品并根據(jù)上述方法加以測(cè)定。結(jié)果在下表中表示并且圖2顯示電泳見到的圖形。用BstUI/HhaI消化系統(tǒng)對(duì)多個(gè)品種測(cè)得的E基因型注在此特定測(cè)試中不能區(qū)分此基因型與E+或Eh。如可從上面結(jié)果見到的，測(cè)得的基因型與根據(jù)圖1中列出的Hampshire，LargeWhite，Meishan和Duroc的測(cè)序數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)的基因型相符。在此分型的其它品種表現(xiàn)根據(jù)其表型和發(fā)表文獻(xiàn)中的描述而預(yù)計(jì)的基因型[Ollivier和Sellier，Ann.Genet.Sel.Anim.，14481-544，(1982)]。Pietrain是帶有不同程度黑斑的白色品種并且長(zhǎng)期認(rèn)為是Ep(與這里的結(jié)果一致)。最初有斑點(diǎn)的品種Berkshire現(xiàn)在主要是黑色帶有白色“sock”的動(dòng)物，一般也認(rèn)為是Ep，與這里發(fā)現(xiàn)的一樣。Landrace由于其在I基因座帶有顯性的白色等位基因，故為白色動(dòng)物，然而根據(jù)經(jīng)典的育種研究表明其E基因座的基因型為Ep。這再一次與這里獲得的結(jié)果一致。Bazna是黑色基色帶有白色條帶的羅馬尼亞品種。它從Berkshire和Mangalitza形成，Mangalitza具有眾多顏色變異包括黑色的匈牙利品種[Porter，豬世界品種手冊(cè)，publHelmInformation，ISBN1-873403-17-8(1993)]。基于可能攜帶與Meishan相似的等位基因Em的黑色品種和帶有Ep的Berkshire的Bazna的起源與此工作中發(fā)現(xiàn)存在于品種中的等位基因一致。實(shí)施例3零售肉品種來(lái)源的鑒定DNA制備從來(lái)自兩個(gè)不同零售商的豬排的不同部分制備DNA。用PromegaWizard基因組DNA制備試劑盒根據(jù)制造商說(shuō)明從皮膚(僅一名零售商)、脂肪和肉制備DNA。將約4mm3每種組織切成小片用于提取。PCR和限制性消化分析這完全按照實(shí)施例2進(jìn)行。結(jié)果結(jié)果示于圖3中?？梢砸姷綇亩喾N組織類型提取的DNA可以用于此基于DNA的測(cè)試，在此獲得肉、脂肪和皮膚的結(jié)果。然后可以測(cè)定豬MHSR基因的基因型。在這種情況下來(lái)自2名零售商的材料源自測(cè)試類型BstUI1/2和HhaI1/2(用與實(shí)施例2中一樣的命名法)。這可翻譯成基因型Ep/e或E+/e?；谖覀兡壳皩?duì)商業(yè)豬品種等位基因分布的知識(shí)，可以得出結(jié)論，即這兩種來(lái)源動(dòng)物含有來(lái)自Duroc的遺傳材料。實(shí)施例4加工肉樣品的品種來(lái)源鑒定方法根據(jù)Meyer等方法(AOAC國(guó)際雜志，78，1542-1551)從加熱處理的肉樣品制備DNA。用手術(shù)刀切碎肉樣品并將0.3g樣品轉(zhuǎn)移至含有430μl提取緩沖液(10mMTris-HClpH8.0，150mMNaCl，2mMEDTA和1％w/v的十二烷基磺酸鈉)的1.5ml無(wú)菌eppendorf管中。加入50微升5M的鹽酸胍和20μl20mg/ml的蛋白酶K(Boehringer)并且通過(guò)倒置混合，然后于57℃溫育3小時(shí)。消化后，將樣品以13,000Xg離心10分鐘，并且將450μl水相加入1mlWizardDNA純化樹脂(Promega)中。輕輕倒置混合混合物并且根據(jù)制造商說(shuō)明進(jìn)行WizardDNA純化步驟，純化的DNA以50μl70℃的水洗脫。然后將1μl1∶10稀釋液用作10μlPCR中的模板。PCR按照前面實(shí)施例中所述方法進(jìn)行。結(jié)果于80℃加熱30分鐘的、來(lái)自基于LargeWhite的品系和基于Duroc的品系的肉樣品可根據(jù)其在E基因座的基因型加以鑒別，其中LargeWhite樣品得到Ep等位基因的模式特征而Duroc樣品得到e等位基因的模式特征。實(shí)施例5精液品種來(lái)源的鑒定從豬精液分離DNA。將1ml精液以13,000Xg離心2分鐘并移出上清。加入1ml2XSSC并且渦旋攪拌混合物以懸浮精子。然后按照前述離心混合物并去除上清。加入400μl0.2MNaOAc(pH7.0)并渦旋攪拌混合物，然后加入34μl的β-巰基乙醇。將混合物于40℃溫育30分鐘，然后加入100μl10％w/v的十二烷基磺酸鈉和50μl15mg/ml的蛋白酶K(Boehringer)并于40℃進(jìn)一步溫育3小時(shí)。加入500μl以Tris-HClpH8.0平衡的酚并渦旋攪拌混合物2次然后以13,000Xg離心4分鐘。移出400μl水相并加入800μl乙醇。讓DNA在室溫沉淀5分鐘后以13,000Xg離心5分鐘。用800μl70％乙醇(v/v)洗沉淀并且空氣干燥，然后重新懸浮于200μlWizardDNA重新懸浮緩沖液(Promega)中。將1μl1/10的稀釋液用于10μlPCR中。PCR按照前面實(shí)施例2中所述方法進(jìn)行。結(jié)果來(lái)自基于Hampshire的品系和基于Duroc的品系的精液可根據(jù)其在E基因座的基因型加以鑒別，其中Hampshire樣品得到Ep等位基因模式特征而Duroc樣品得到e等位基因的模式特征。實(shí)施例6等位基因E+與等位基因Ep/Eh的鑒別DNA制備DNA制備按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)設(shè)在0.25ml薄壁管(PerkinElmer)中的20μl體積中，含有以下成分10μl反應(yīng)體積2μl模板DNA2.5mMMgCl2200μM每種dNTP，5pM正向和反向引物0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)正向引物序列5’CTGCCTGGCCGTGTCGGACCTG3’反向引物序列5’CTGTGGTAGCGCAGCGCGTAGAAG3’將反應(yīng)管置于StrategeneRobocycler中并且按照如下方案進(jìn)行PCR起始變性步驟為94攝氏度10分鐘。30輪循環(huán)94攝氏度-60秒61攝氏度-60秒72攝氏度-60秒最后的循環(huán)是72攝氏度最后延伸7分鐘。將樣品保存于6攝氏度直至需要。限制性酶消化和電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)228bp。為測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，用BspHI(NewEnglandBiolabs)消化反應(yīng)產(chǎn)物。反應(yīng)如下設(shè)置并溫育BsphI消化10μl擴(kuò)增的DNA1μl10XReact2(NEBNewEnglandBiolabs)0.5μl去離子水5單位BstUI37攝氏度60分鐘消化后，將2μl上樣染料加入反應(yīng)(100mMTrispH8.0，100mM硼酸，1mMEDTA，50％(v/v)甘油，0.02％(w/v)OrangeG)中并將混合物上樣至0.5XTBE(44.5mMTrispH8.0，44.5mM硼酸和0.5mMEDTA)中4％瓊脂糖凝膠(3％NuSieve/1％Seakem，F(xiàn)MCBioproducts)上，并且于150v電泳1小時(shí)。通過(guò)溴化乙錠染色觀察產(chǎn)物。結(jié)果BsphI消化各得到124和104bp條帶。消化與可能的等位基因之間的關(guān)系在下表中表示限制性消化模式與E基因座單個(gè)等位基因之間的關(guān)系從多種豬制備樣品并按照上述方法加以測(cè)試，并且結(jié)果顯示如下用BspHI消化系統(tǒng)對(duì)多個(gè)品種測(cè)得的E基因注在此特定Eh測(cè)試中，列出Ep基因型的地方，其不能與Eh區(qū)分開。實(shí)施例7鑒別牛產(chǎn)品的品種按照實(shí)施例4中所述從牛肉樣品制備DNA。然后按照Kambadur等，基因組研究7910-915(1997)中所述用500nM濃度的下面引物對(duì)在100μl反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR5’-TGAGGTTAGGAGAGTTTTGGG-3’和5’-TCGAAATTGAGGGGAAGACC-3’其它反應(yīng)成分是2.5mMMgCl2，200μMdNTPs，5mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，5單位AmpliTaqGold(PerkinElmer)。將1μl?；蚪MDNA用作模板。于94攝氏度變性12分鐘后進(jìn)行30輪循環(huán)，每循環(huán)94攝氏度1分鐘，55攝氏度1分鐘，72攝氏度1.5分鐘，最后是72攝氏度7分鐘。PCR后，將2.0μl上樣染料(44.5mMTrispH8.0，44.5mM硼酸，0.5mMEDTA，50％w/v甘油，0.02％w/vOrangeG)加入10μl產(chǎn)物中并通過(guò)在0.5XTBE緩沖液(44.5mMTrispH8.0，44.5mM硼酸和0.5mMEDTA)中的2％瓊脂糖凝膠中于100v電泳1小時(shí)進(jìn)行分析。將剩余的PCR產(chǎn)物按照實(shí)施例1中所述用ABI染料終止化學(xué)法進(jìn)行DNA測(cè)序分析。結(jié)果牛肌抑制素DNA多態(tài)性及相關(guān)表型實(shí)施例8豬KIT外顯子16-19的RT-PCRi.從血液樣品純化mRNA將有色Hampshire和LargeWhite豬的新鮮血液樣品收集于檸檬酸鹽試管中。用Ficoll100(PharmaciaBiotech)從5ml血液分離白細(xì)胞。然后用QuickprepMicromRNA純化試劑盒(PharmaciaBiotech)從白細(xì)胞分離mRNA。在用于反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR之前將mRNA作為沉淀保存于-70攝氏度乙醇中最多一個(gè)月。ii.對(duì)KIT外顯子16-19的RT-PCR用第一鏈cDNA合成試劑盒(PharmaciaBiotech)進(jìn)行第一鏈cDNA合成以在15μl總體積中用0.1μgpd(N6)隨機(jī)擴(kuò)增出約100ngmRNA。然后通過(guò)加入10μlPCR混合物而直接將2μl完成的第一條cDNA鏈反應(yīng)物用于每12μlPCR反應(yīng)中，PCR混合物含有10pmol的每種小鼠/人來(lái)源的引物KIT1F和KIT7R(分別為5’-TCRTACATAGAAAGAGAYGTGACTC和5’-AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG；Moller等，1996，同上)、1.2μl的10XPCR緩沖液(10mMTris-HClpH8.3，50mMKCl)和0.5UAmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer)，將其與等量Taqstart抗體(Clontech)于25攝氏度溫育5分鐘以實(shí)現(xiàn)熱起始PCR。用20μl礦物油覆蓋反應(yīng)物并在HybaidTouchdown儀器(Hybaid)中進(jìn)行40輪熱循環(huán)，每循環(huán)包括94攝氏度1分鐘，55-48攝氏度(頭7個(gè)循環(huán)每循環(huán)降低1度然后在剩余循環(huán)中保持48攝氏度)1分鐘和72攝氏度1分鐘。PCR后，將2μl上樣染料加入每個(gè)樣品中并且然后上樣于于4％瓊脂糖凝膠(Nusieve/Seakem3∶1，F(xiàn)MCBioproducts)中并以100v電泳80分鐘。產(chǎn)物通過(guò)溴化乙錠染色和UV照射加以觀察。iii.RT-PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序通過(guò)用QIAEX凝膠提取試劑盒(QIAGEN)從2％瓊脂糖凝膠中提取來(lái)純化代表KIT外顯子16-19的RT-PCR產(chǎn)物并且用Sureclone連接試劑盒(PharmaciaBiotech)將其克隆入pUC18載體中。用QIAFilter質(zhì)粒Midi試劑盒(QIAGEN)分離質(zhì)粒。用染料引物化學(xué)法對(duì)克隆的質(zhì)粒插入片段進(jìn)行測(cè)序。用質(zhì)粒模板DNA和含有ABIPrism方法P/N402113(PerkinElmer)中所述的熒光標(biāo)記的M13正向或反向引物的備好反應(yīng)混合物制備每次循環(huán)反應(yīng)。用Catalyst800分子生物學(xué)工作站(ABI)按照儀器用戶指南(文檔號(hào)903877，PerkinElmer)進(jìn)行循環(huán)和樣品收集。用377ABIPrism測(cè)序儀按照儀器說(shuō)明書P/N402078(PerkinElmer)對(duì)得到的延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化、上樣與分析。iv.結(jié)果與討論從所有豬擴(kuò)增包含KITcDNA外顯子16-19的424bp片段。Hampshire豬沒有顯示任何額外產(chǎn)物而LargeWhite豬(測(cè)試8頭)均顯示301bp截短的cDNA片段(圖4)。序列分析揭示424bp片段在這2個(gè)品種中相同而301bp片段中缺乏完整的外顯子17(123bp)。不同個(gè)體間這兩種產(chǎn)物相對(duì)量的明顯差異可能由含有不同拷貝數(shù)KIT基因序列的不同基因型或mRNA表達(dá)水平的個(gè)體差異或隨機(jī)RT-PCR效果所致。存在于LargeWhite豬中的兩個(gè)上面的條帶代表301bp和424bp片段之間的異源雙鏈(圖2)。這通過(guò)實(shí)驗(yàn)加以證明，即通過(guò)合并424bp和301bp的同源雙鏈然后對(duì)其加熱變性并冷卻至25攝氏度而得到這些慢遷移率的片段。此外，LargeWhite較低異源雙鏈片段的克隆得到對(duì)應(yīng)于兩個(gè)同源雙鏈中的任意一個(gè)的插入片段長(zhǎng)度。實(shí)施例9KIT外顯子17-內(nèi)含子17(5’前切位點(diǎn))的PCR擴(kuò)增和測(cè)序i.PCR以制備DNA測(cè)序模板用正向引物KIT21(5’-GTATTCACAGAGACTTGGCGGC-3’)和反向引物KIT35(5’-AAACCTGCAAGGAAAATCCTTCACGG-3’)擴(kuò)增包括KIT基因外顯子17和內(nèi)含子17之間邊界的175bp區(qū)域用于序列分析。PCR在DNA熱循環(huán)儀(PerkinElmer9600)上20μl總體積中進(jìn)行，20μl總體積中含有25ng基因組DNA，1.0mMMgCl2，5mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，200μMdNTP，0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)和10pmolKIT21和KIT35引物。為了活化AmpliTaqGold，起始熱變性在942進(jìn)行10分鐘，然后進(jìn)行32輪循環(huán)，每循環(huán)由94℃45秒，55℃45秒和72℃45秒組成。最后一次延伸在72℃持續(xù)7分鐘。用SureClone連接試劑盒(PharmaciaBiotech)將PCR產(chǎn)物克隆入載體pUC18中。ii.質(zhì)粒DNA的制備用Jetstar質(zhì)粒midi試劑盒(Genomed)從過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物純化質(zhì)粒DNA，并且將得到的DNA稀釋至150ng/μl。iii.質(zhì)粒DNA的測(cè)序DNA按照實(shí)施例8進(jìn)行測(cè)序。iv.結(jié)果測(cè)定和比較帶有這三種等位基因之一的動(dòng)物之間KIT基因外顯子17和內(nèi)含子17的DNA序列部分。圖5表示I等位基因在內(nèi)含子17的1位攜帶一個(gè)剪切位點(diǎn)突變。此G到A的堿基置換存在于每條染色體攜帶的兩個(gè)基因拷貝的一個(gè)拷貝中。堿基置換發(fā)生在穩(wěn)定的GT二核苷酸處，此處表征5’外顯子/內(nèi)含子的邊界。Ip等位基因的分析表明剪切位點(diǎn)不存在于正?；?KIT1)或基因的復(fù)制拷貝(KIT2)中。我們發(fā)現(xiàn)剪切位點(diǎn)突變是I等位基因獨(dú)特的，并且因此使得有可能鑒別I-KIT2序列。實(shí)施例10用PCRRFLP檢測(cè)剪切位點(diǎn)突變的存在為了容易地測(cè)定G到A剪切位點(diǎn)突變的存在，用限制性內(nèi)切核酸酶NlaIII(CATG)檢測(cè)在內(nèi)含子171位處鑒定到的點(diǎn)突變(圖5)。在圖6A和圖6B中分別說(shuō)明了從KIT擴(kuò)增的片段中的NlaIII識(shí)別位點(diǎn)及其預(yù)期的限制性產(chǎn)物。i.PCR以制備用于RFLP測(cè)定的DNA完全按照實(shí)施例9中所述進(jìn)行PCR以制備用于RFLP分析的DNA。ii.限制性酶消化和電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)175bp。為了測(cè)試內(nèi)含子17的1位的多態(tài)性，消化反應(yīng)設(shè)定如下30μlPCR擴(kuò)增的DNA1.0μl10XNE緩沖液40.1μlBSA100μg/ml0.1μlNlaIII10U/μl5.8μldH2O[1XNE緩沖液4(NewEnglandBiolabs)含有50mM乙酸鉀、20mMTris乙酸鹽、10mM乙酸鎂和1mMDTT)。37℃溫育90分鐘后，向每10μl反應(yīng)體積加入2μl上樣染料并將混合物上樣到0.5XTBE(44.5mMTrispH8.0，44.5mM硼酸和0.5mMEDTA)中的8％天然聚丙烯酰胺凝膠(Protogel，37.5∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺，NationalDiagnostics，Atlanta)中，并且于200V在垂直板裝置(SE600HoeferScientificInstruments)中電泳3小時(shí)。產(chǎn)物通過(guò)溴化乙錠染色加以觀察。iii.結(jié)果因?yàn)橥蛔儼l(fā)生在限制性內(nèi)切核酸酶NlaIII的識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)，所以設(shè)計(jì)PCRRFLP方法以測(cè)試剪切位點(diǎn)突變的存在。圖6B表示在KIT內(nèi)含子17的1位G到A堿基置換的存在導(dǎo)致175bpDNA片段內(nèi)兩個(gè)NlaIII識(shí)別位點(diǎn)中每個(gè)位點(diǎn)的限制性消化。電泳后，得到了80bp、54bp和41bp大小的片段。然而，當(dāng)剪切位點(diǎn)突變不存在時(shí)，用NlaIII溫育僅在識(shí)別位點(diǎn)1導(dǎo)致消化。電泳后，得到134bp和41bp大小的片段。穩(wěn)定的NlaIII識(shí)別位點(diǎn)1用作內(nèi)部對(duì)照以確保完全消化已經(jīng)發(fā)生。此PCRRFLP分析結(jié)果說(shuō)明于圖6C中。對(duì)從攜帶剪切位點(diǎn)突變(2道)或攜帶正常剪切位點(diǎn)序列(3道)的克隆中擴(kuò)增的片段進(jìn)行分析。4道表示使用從有色動(dòng)物基因組DNA擴(kuò)增的DNA的分析結(jié)果。5道表示測(cè)試白色動(dòng)物得到的條帶。測(cè)定用于分析來(lái)自7個(gè)不同品種豬的121個(gè)個(gè)體。剪切突變僅在具有顯性表型(I/-或I*/i)的97頭動(dòng)物中見到而在24頭有色(Ip或i)動(dòng)物中沒有突變(見下表)。此分析證實(shí)I和I*是獨(dú)特的，因?yàn)樗鼈兪菙y帶剪切位點(diǎn)突變的特有等位基因。不同品種與皮毛表型之間剪切位點(diǎn)突變的分布品種皮毛顏色推測(cè)的基因型測(cè)試的動(dòng)物正常剪切的KIT2剪切突變2LargeWhite白色I(xiàn)/-333333Landrace白色I(xiàn)/-565656Hampshire有色i/i550Duroc有色i/i550Pietrain有色i/i880Meishan有色i/i550WildBoar有色i/i110WildBoarx白色I(xiàn)*/-888LargeWhite總計(jì)白色I(xiàn)/-898989白色I(xiàn)*/-888有色i/i242401白色動(dòng)物對(duì)于I等位基因可能是純合或雜合的2通過(guò)NlaIIIPCRRFLP測(cè)試確定剪切位點(diǎn)突變的存在實(shí)施例11正常KIT和剪切突變KIT(內(nèi)含子17核苷酸1G→A)的定量測(cè)定因?yàn)榧羟形稽c(diǎn)突變僅存在于I復(fù)制區(qū)域(duplicatedregions)中的一個(gè)區(qū)域中而不存在于Ip復(fù)制區(qū)域中，所以可以預(yù)計(jì)各種基因型具有下表中所述的特征基因型正常KIT的拷貝數(shù)含有剪切突變的KIT正常KIT比剪切突拷貝數(shù)變KIT的比例I/I221∶1I/i212∶1i/i202∶0I/Ip313∶1Ip/i303∶0因?yàn)榈任换騃的顯性，所以白色動(dòng)物攜帶表中的三種基因型，并且因此不能通過(guò)表型特征分析加以鑒定。正常KIT基因和剪切突變的KIT基因的相對(duì)量的定量測(cè)定允許計(jì)算兩種基因之間的比例，并且由此預(yù)測(cè)單個(gè)動(dòng)物的基因型。這通過(guò)在NlaIII消化后對(duì)兩種DNA片段的定量測(cè)定來(lái)實(shí)現(xiàn)。電泳后用GeneScan軟件測(cè)定代表正常剪切KIT基因的134bp片段和代表剪切突變的KIT基因的54bp片段的量。i.PCR以制備用于定量測(cè)定的DNA與實(shí)施例9部分i中所述一樣。用ABI熒光染料FAM在5’末端標(biāo)記反向引物KIT35。ii.限制性酶消化與實(shí)施例9部分ii中所述一樣。iii.DNA片段的電泳和定量測(cè)定消化后，將0.5μl反應(yīng)體積與2.5μl去離子甲酰胺、0.5μlGS350DNA標(biāo)準(zhǔn)(ABI)和0.4μl藍(lán)色葡聚糖溶液混合，加熱至90℃2分鐘并于冰上迅速冷卻。將3μl此混合物上樣至377ABIPrism測(cè)序儀中并以700V、40mA、32W在1XTBE緩沖液中的6％聚丙烯酰胺凝膠中分離DNA片段2小時(shí)。用GeneScan(ABI)軟件定量測(cè)定代表正常和剪切突變形式KIT的片段的峰面積。iv.比例計(jì)算為了計(jì)算每種樣品的比值，將134bp片段(正常KIT)的峰面積值除以2倍54bp片段(剪切突變KIT)的峰面積值。v.結(jié)果對(duì)來(lái)自Swedish野生型豬/LargeWhite雜交系譜的動(dòng)物進(jìn)行分析，這些動(dòng)物在I處的基因型已通過(guò)傳統(tǒng)育種實(shí)驗(yàn)用連鎖標(biāo)記加以測(cè)定。圖7和下表表示對(duì)三種基因型中的每種基因型I/I(預(yù)期比例1∶1)、I/i(預(yù)期比例2∶1)和I/Ip(預(yù)期比例3∶1)動(dòng)物計(jì)算的正常比突變KIT的比例。結(jié)果完全與預(yù)期比值完全一致，并且表明這三種基因型類型可以用此方法加以鑒別。WildPig/LargeWhite雜交品種不同顯性白色基因型中兩種KIT形式的比值基因型表型預(yù)期比例觀察到的比例測(cè)試的數(shù)目(正常/突變)(正?！猛蛔?I/I白色1∶11.15±0.07513I/Ip白色3∶13.11±0.08412I/I白色2∶12.23±0.10914圖7說(shuō)明對(duì)兩種基因型I/I和I/Ip計(jì)算的比值范圍沒有重疊。這使得攜帶Ip等位基因的動(dòng)物能夠得到鑒定，并且等位基因在不同豬品種中的頻率可以得到測(cè)定。計(jì)算56頭Landrace和33頭LargeWhite的比值并將結(jié)果表示于圖8中。對(duì)7頭Landrace和3頭LargeWhite個(gè)體觀察到清晰的雙峰分布，具有約3或更高的比值，表明它們是Ip等位基因(基因型I/Ip)的雜合攜帶者。這意味著Ip在Landrace和LargeWhite品種中分別有6.25％(7/112測(cè)試的染色體)和4.5％(3/66測(cè)試的染色體)估計(jì)的基因頻率。實(shí)施例12(i)DNA制備可以從任何含有細(xì)胞核的組織來(lái)源如白細(xì)胞、毛囊、耳槽和肌肉制備DNA。在此列出的方法涉及血細(xì)胞制備；其它組織可進(jìn)行類似地處理，即直接將材料懸浮于K緩沖液中并且然后進(jìn)行與血液處理相同的操作。在此列出的方法制備含有適于PCR擴(kuò)增的粗提DNA的細(xì)胞裂解液。然而，任何制備純化或粗提DNA的方法應(yīng)該同樣有效。將血液收集于50mMpH8.0的EDTA中以防止凝結(jié)。將50μl分裝至小的微量離心管(0.5mlEppendorf或等價(jià)物)中。加入450μlTE緩沖液以裂解血紅細(xì)胞(血團(tuán)抑制PCR)并且渦旋混合2秒鐘。然后將完整白細(xì)胞和殘余紅細(xì)胞在微量離心機(jī)中以13,000g離心12秒。通過(guò)用低壓真空泵系統(tǒng)輕輕抽吸移出上清夜。然后再加入450μlTE緩沖液以裂解殘余紅細(xì)胞并按前述收集白細(xì)胞。如果沉淀中仍有紅色，重復(fù)此過(guò)程直至沉淀為白色。從沉淀的白細(xì)胞中去除最后一滴上清液后，加入100μl含有蛋白酶K的K緩沖液并將混合物于55℃溫育2小時(shí)。然后將混合物加熱至95-100℃8分鐘并且將DNA裂解液保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｔ噭㏕E緩沖液10mMTRIS-HClpH8.01mMEDTAK緩沖液50mMKCl10mMTRIS-HClpH8.32.5mMMgCl20.5％Tween20用于裂解之前，向每1.0mlK緩沖液加入10μl20mg/ml蛋白酶K(分子探針有限公司)。(ii)PCR反應(yīng)在0.25ml薄壁管(PerkinElmer)中如下設(shè)置4.0μl5μMCRC正向引物；4.0μl5μMCRC反向引物；4.0μl5μMKIT1-反向引物；4.0μl5μMKIT1-正向引物；4.0μl2mMdNTPs(Pharmacia)；4.0μl35mMMgCl2。加入蠟珠(PCRGem50，PerkinElmer)并將薄壁管置于PerkinElmer9600熱循環(huán)儀中。然后將管升溫至80℃15秒接著冷卻至4℃。然后按照下述向每管中加入第2套試劑4.0μl10X緩沖液；96μl無(wú)菌去離子水；0.4μl(0.5單位)AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)；2μlDNA裂解液。然后將反應(yīng)薄壁管置于預(yù)熱至94℃的PerkinElmer9600熱循環(huán)儀中并按照下述方案進(jìn)行PCR94℃4分鐘；20輪循環(huán)，每循環(huán)94℃30秒，62℃30秒和72℃30秒；0℃直至需要。循環(huán)數(shù)可依據(jù)用作DNA來(lái)源的組織而變化。KIT引物正向GAATATTGTTGCTATGGTGATCTCCKIT1-FOR反向CCGCTTCTGCGTGATCTTCCTGKIT1-REVCRC引物正向CTGGATGTCCTGTGTTCCCTGTCRC-FORWARD反向AGGTTTGTCTGCAGCAGAAGCTCCRC-REVERSE反向KIT引物和正向CRC引物在5’末端用ABI熒光染料FAM標(biāo)記。(iii)DNA片段的電泳和定量測(cè)定將1μlPCR產(chǎn)物與2.5μl去離子甲酰胺、0.5μlGS350DNA標(biāo)準(zhǔn)、0.4μl藍(lán)色葡聚糖溶液混合，于90℃加熱2分鐘后于冰上迅速冷卻。然后將3μl此混合物上樣至AB1373DNA測(cè)序儀中并以700V、40mA、32W在1XTBE緩沖液中的6％聚丙烯酰胺凝膠中分離DNA片段2小時(shí)。用GeneScan軟件定量測(cè)定對(duì)應(yīng)于KIT和CRC基因產(chǎn)物的片段，每條帶的峰面積得以測(cè)定。(iv)結(jié)果下表中的數(shù)據(jù)代表從實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果，其中DNA裂解液從23頭動(dòng)物中的每只動(dòng)物制備，對(duì)每種裂解液進(jìn)行2次PCR測(cè)試。計(jì)算每種PCRKIT峰面積比CRC峰面積的比例并采用來(lái)自相同動(dòng)物的那些樣品的平均值。</tables>此實(shí)驗(yàn)中不同基因型III、Ii和ii動(dòng)物的比值的上限和下限如下基因型上限下限I/I3.252.80I/i2.451.84i/i1.500.99這些結(jié)果說(shuō)明用此測(cè)試對(duì)這些基因型的鑒別。實(shí)施例13第二種測(cè)試?yán)么嬖谟趶?fù)制區(qū)的一個(gè)末端的獨(dú)特DNA序列(或者如果復(fù)制區(qū)與基因的其余區(qū)域方向相反或復(fù)制區(qū)不與非復(fù)制區(qū)直接串聯(lián)，存在于復(fù)制區(qū)的兩個(gè)末端)。設(shè)計(jì)用于PCR的寡核苷酸引物使得處于PCR過(guò)程中所用的退火溫度時(shí)，它們將僅與復(fù)制區(qū)末端的連接區(qū)域退火。然后用兩對(duì)寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。一對(duì)由前述覆蓋該連接區(qū)域的引物組成而第二對(duì)引物相隔適當(dāng)距離，這使得擴(kuò)增只從含有復(fù)制區(qū)的I等位基因發(fā)生。第二對(duì)引物允許在單倍體基因組中僅以單拷貝存在的序列的擴(kuò)增。在相同反應(yīng)管中進(jìn)行的此反應(yīng)的產(chǎn)物用作以前測(cè)試的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定連接區(qū)域特異性反應(yīng)產(chǎn)物相對(duì)于單拷貝對(duì)照序列產(chǎn)物的比例。在此測(cè)試中不同基因型產(chǎn)物的預(yù)期比例之間存在較大差異。產(chǎn)物的相對(duì)水平及其比例說(shuō)明如下基因型連接區(qū)域產(chǎn)物對(duì)照區(qū)域產(chǎn)物比例II221∶1Ii121∶2ii020∶2這些較大比例使從不同基因型獲得的結(jié)果范圍之間有更大差異，降低了錯(cuò)誤評(píng)估動(dòng)物的危險(xiǎn)。實(shí)施例14(i)DNA制備DNA可按照實(shí)施例12中所述的加以制備。(ii)PCR反應(yīng)在0.25ml薄壁管(PerkinElmer)中如下設(shè)置2.0μl5mM的KITDEL2-FOR引物；2.0μl5mM的KITDEL2-REV引物；1.0μl2mM的dNTPs(Pharmacia)；1.2μl25mMMgCl22.0μl10X緩沖液(無(wú)MgCl2)0.1μl(0.5單位)AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)；2.0μlDNA裂解液；9.7μl無(wú)菌去離子水。然后將反應(yīng)管置于PerkinElmer9600熱循環(huán)儀中并且按照如下方案進(jìn)行PCR95℃1分鐘；3輪循環(huán)，每循環(huán)95℃15秒，50℃20秒和72℃40秒；27輪循環(huán)，每循環(huán)94℃15秒，50℃20秒和72℃50秒；72℃5分鐘；4℃直至需要。循環(huán)數(shù)可以依據(jù)用作DNA來(lái)源的組織而變化。KIT引物正向GAAAGTGA(C/T)GTCTGGTCCTAT(C/G)GGATKITDEL2-FOR反向AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAGKITDEL2-REV(iii)電泳將1μlPCR產(chǎn)物與3μl上樣緩沖液(95％去離子甲酰胺，10mMNaOH，20mMEDTA，0.05％溴酚藍(lán)，0.05％二甲苯苯胺)混合，加熱至95℃3分鐘后于冰上迅速冷卻。然后將樣品上樣于1XTBE緩沖液(89mMTris，89mM硼酸，2mMEDTA.Na2)中的8％天然聚丙烯酰胺凝膠(Protogel，丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝37.5∶1，NationalDiagostics，Atlanta)中。使用0.6XTBE作為電泳緩沖液用20℃恒溫以6W將DNA片段在垂直板裝置(SE600HoeferScientificInstruments，SanFrancisco)中通過(guò)電泳分離4.5小時(shí)。(iv)通過(guò)銀染觀察DNA片段電泳后，將凝膠在固定液中輕輕搖動(dòng)溫育20分鐘或者直到看不到示蹤染料。將凝膠在去離子水中洗3次(每次搖動(dòng)2分鐘)。然后將凝膠在染色液中輕輕搖動(dòng)溫育40分鐘，接著在去離子水中短時(shí)清洗(5-10秒)并直接轉(zhuǎn)入顯色液中。將凝膠在顯色液中溫育直至條帶清晰可見并且然后通過(guò)加入等體積的固定液終止顯色。最后，將凝膠在去離子水中洗2分鐘。試劑固定液10％去離子水中的冰乙酸染色液2g硝酸銀(AgNO3)3ml37％的甲醛2升去離子水顯色液60g溶解于2升去離子水的碳酸鈉(Na2CO3)。臨用之前加入3ml37％的甲醛和400ml硫代硫酸鈉(10mg/ml)。溶液使用時(shí)應(yīng)該為10-12℃溫度。(v)結(jié)果此SSCP分析揭示了到目前為止僅見于具有顯性白色表型動(dòng)物中的信息多態(tài)性(圖9)。在1至8道中，分析是對(duì)攜帶顯性白色的SwedishLandrace豬DNA進(jìn)行的而在9和10道中DNA來(lái)自野生型顏色的野生型豬。多態(tài)性條帶被標(biāo)出。多態(tài)性特征在于僅存在于攜帶I型等位基因的復(fù)制KIT基因的動(dòng)物中的兩條獨(dú)特片段。這些片段代表來(lái)自不同長(zhǎng)度PCR產(chǎn)物的DNA鏈的異源雙鏈，其中PCR產(chǎn)物代表KIT基因的復(fù)制和非復(fù)制拷貝。用此標(biāo)記使用40頭代表5個(gè)品種的無(wú)關(guān)動(dòng)物和190頭LargeWhite/野生型豬雜交F2動(dòng)物的篩選測(cè)試結(jié)果列于下表中這些結(jié)果表明此特定多態(tài)性與KIT復(fù)制的存在非常緊密地相關(guān)。它與復(fù)制不完全相關(guān)，因?yàn)橛行┌咨珓?dòng)物沒有表現(xiàn)異源雙鏈模式。因此此多態(tài)性是緊密連鎖的遺傳標(biāo)記的一個(gè)實(shí)例，其本身或者與其它連鎖標(biāo)記結(jié)合可用于辨別有關(guān)顯性白色皮毛顏色的基因型。實(shí)施例15i)DNA提取按照實(shí)施例12制備DNA。ii)PCR反應(yīng)在0.25ml薄壁管(PerkinElmer)中如下設(shè)置0.5μl5μM的KITDEL1-FOR引物；0.5μl5μM的KITDEL1-REV引物；1.0μl2mM的dNTPs(Pharmacia)；1.0μl15mMMgCl21.0μl10X緩沖液4.9μl無(wú)菌蒸餾水0.1μlAmpliTaqDNA聚合酶1.0μlDNA裂解液然后將反應(yīng)管置于PerkinElmer9600熱循環(huán)儀中并且按照如下方案進(jìn)行PCR。94℃4分鐘；21輪循環(huán)，每循環(huán)94℃30秒，60℃30秒和72℃30秒；72℃4分鐘；4℃直至需要。循環(huán)數(shù)可依據(jù)用作DNA來(lái)源的組織而變化。引物正向TGTGGGAGCTCTTCTCTTTAGGKITDEL1-FOR反向CCAGCAGGACAATGGGAACATCTKITDEL1-REV反向引物用ABI熒光染料FAM在5’末端加以標(biāo)記。iii)DNA片段的電泳和定量測(cè)定將1μlPCR產(chǎn)物與1.5μl去離子甲酰胺、0.25μlGS350DNA標(biāo)準(zhǔn)、0.25μl上樣緩沖液(50mg/ml藍(lán)色葡聚糖，25mMEDTA)混合并于90℃加熱2分鐘，然后于冰上迅速冷卻。然后將1.5μl此樣品上樣于ABI373DNA測(cè)序儀中并以3000V、60mA、200W和48℃在1XTBE緩沖液中的4.12％聚丙烯酰胺凝膠中分離DNA片段2小時(shí)。用GeneScan軟件定量測(cè)分別對(duì)應(yīng)于來(lái)自KIT基因模板的不含缺失和含有缺失的產(chǎn)物的97bp和93bp片段，每條帶的峰面積得以測(cè)定。結(jié)果列于下表中的數(shù)據(jù)代表從實(shí)驗(yàn)獲得的結(jié)果，其中DNA裂解液從已知基因型的20頭動(dòng)物制備，對(duì)每種裂解液進(jìn)行一次PCR測(cè)試。計(jì)算來(lái)自不含4堿基對(duì)缺失比含有缺失的DNA模板的產(chǎn)物峰面積比。</tables>對(duì)于小量樣品，在預(yù)測(cè)的每種基因型比值(對(duì)于Ii預(yù)期比值＝2而對(duì)于II為1)之間的中點(diǎn)的數(shù)值1.5可用作對(duì)動(dòng)物評(píng)估基因型的分界線。從表中可以確定7/10II和9/10Ii被鑒定為正確的基因型。實(shí)施例16KITcDNA克隆的測(cè)序用MessageMakermRNA分離系統(tǒng)(GibcoBRL)通過(guò)從總RNA選擇一種mRNA從白色(Landrace/LargeWhite)和有色(Hampshire)豬外周血白細(xì)胞分離mRNA。用隨機(jī)引物(第1鏈cDNA合成試劑盒，PharmaciaBiotech)反轉(zhuǎn)錄100ng的poly(A)+mRNA，并且根據(jù)制造商建議用糾錯(cuò)AdvantageKlenTaq聚合酶(Clontech)對(duì)該產(chǎn)物的1∶10稀釋液進(jìn)行RT-PCR。下面的引物用于擴(kuò)增幾乎完整的編碼區(qū)和部分5’非翻譯區(qū)對(duì)應(yīng)于5’非翻譯區(qū)的KIT40(5’-GGCTCTGGGGGCTCGGCTTTGC)和對(duì)應(yīng)于外顯子21的KIT22S(5’-TCAGACATCTTCGTGGACAAGCAGAGG)；兩種引物根據(jù)GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)中人和小鼠KIT序列的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。將RT-PCR產(chǎn)物凝膠純化并使用pGEM-T載體系統(tǒng)(Promega)進(jìn)行克隆。用一套內(nèi)部引物和ABIPrismTM羅丹明終止循環(huán)測(cè)序試劑盒(PEAppliedBiosystems)對(duì)質(zhì)粒克隆進(jìn)行測(cè)序。開始對(duì)代表每種類型KIT序列的兩個(gè)亞克隆進(jìn)行測(cè)序，并且在觀察到不匹配的情況(可能由于PCR差錯(cuò))下，對(duì)其它克隆特定核苷酸位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序。用引物KIT1F(5’-TCRTACATAGAAAGAGAYGTGACTC)和KIT7R(5’-AGCCTTCCTTGATCATCTTGTAG)對(duì)KIT外顯子16-19進(jìn)行RT-PCR分析。結(jié)果來(lái)自Hampshire品種動(dòng)物的KIT基因編碼區(qū)的序列示于圖10中。分別從Hampshire和Yorkshire/Landrace豬克隆的KITcDNA序列之間的差異示于下表中。序列比較包括除反轉(zhuǎn)錄PCR引物占據(jù)的27bp外的完整開放閱讀框2919bp。列出了外顯子和堿基對(duì)位數(shù)以及氨基酸密碼子的每個(gè)差異。多態(tài)性堿基以粗體表示。破折號(hào)表示與Hampshire(i)等位基因一致。1由在與Hampshire(i/i)公豬交配后得到100％白色豬仔的母豬推斷的基因型I/I，I/I*或I*/I*2外顯子149(151bp)的跳過(guò)導(dǎo)致于2161處終止的無(wú)義翻譯實(shí)施例17DNA制備按照實(shí)施例12中所述的制備基因組DNA。PCR用正向引物L(fēng)A93(5’-GAGCAGCCCCTACCCCGGAATGCCAGTTGA-3’)和反向引物KIT56(5’-CCTTAAAACAGAACATAAAAGCGGAAACATCATGCGAAGG-3’)擴(kuò)增覆蓋外顯子19末端99bp和KIT基因59bp的158bp片段。PCR在PerkinElmer9600熱循環(huán)儀上于20μl總體積中進(jìn)行，20μl總體積中含有25ng基因組DNA，1.5mMMgCl2，50mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，200μMdNTPs，0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)和10pmol的LA93和KIT56引物。為了活化AmpliTaqGold，起始熱變性在94攝氏度進(jìn)行10分鐘，然后進(jìn)行32輪循環(huán)，每輪循環(huán)由94攝氏度45秒、55攝氏度45秒和72攝氏度45秒組成。限制性消化和電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)158bp。為測(cè)定此產(chǎn)物93位處(對(duì)應(yīng)于KITcDNA序列的2678位)的多態(tài)性，消化反應(yīng)設(shè)定如下6.0μlPCR產(chǎn)物1.0μl10X反應(yīng)緩沖液3(NewEnglandBiolabs)0.2μlAciI(5U/μl)2.8μl去離子水37℃消化120分鐘后，向每10μl反應(yīng)體積中加入2μl上樣染料并將混合物上樣至0.5XTBE(44.5mMTrispH8.0，44.5mM硼酸和0.5mMEDTA)中的8％天然聚丙烯酰胺凝膠(Protogel，37.5∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺，NationalDiagnostics，Atlanta)中，并且于200V在垂直凝膠板裝置(SE600HoeferScientificInstruments)中電泳3小時(shí)。產(chǎn)物通過(guò)溴化乙錠染色加以觀察。結(jié)果設(shè)計(jì)反向引物以將AciI位點(diǎn)導(dǎo)入擴(kuò)增的序列中。用AciI消化擴(kuò)增片段釋放出23bp片段的結(jié)果使得可以證實(shí)消化過(guò)程。將剩余135bp片段消化成92和43bp片段依賴于對(duì)應(yīng)于KITcDNA序列2678位的核苷酸。在此位置的T阻止消化而在此位置的C允許消化。凝膠分辨率不足以分辨23bp片段，但是與未消化產(chǎn)物的對(duì)比使得可以證實(shí)此過(guò)程。圖11說(shuō)明用多種基因型動(dòng)物獲得的結(jié)果。測(cè)試用于分析來(lái)自7個(gè)豬品種的共66個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體。結(jié)果示于下表中1按照實(shí)施例11中所述基于NlaIIIRFLP分析的基因型。實(shí)施例18用快速以DNA為基礎(chǔ)的測(cè)試對(duì)I基因座基因型的測(cè)定從3個(gè)品種系動(dòng)物即基于Hampshire的品系、LargeWhite的品系和來(lái)自最初從前兩個(gè)品系制備的雜交品系的白色動(dòng)物的皮毛樣品制備粗提DNA裂解物。將4個(gè)毛囊置于100μl的K緩沖液(50mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，2.5mMMgCl2，0.5％w/vTween20)中并加入1μl蛋白酶K(15mg/ml)(Boehringer)。將此混合物于55℃溫育2小時(shí)后于95℃溫育16分鐘。DNA按照實(shí)施例12中所述的制備。用PEAppliedBiosystemsTaqManTM系統(tǒng)設(shè)置等位基因鑒別反應(yīng)。25μl反應(yīng)物中含有300nM的引物E19FOR(5-GAGCAGCCCCTACCCCGGAATGCCAGTTGA-3’)和E19REV(5-CTTTAAAACAGAACATAAAAGCGGAAACATCATGCGAAGG-3’)、8％甘油(w/v)、1XTaqManTM緩沖液A(PEAppliedBiosystems)、5mMMgCl2、200μMdATP、dGTP、dCTP和dUTP、0.65單位AmpliTaqGoldTM(PEAppliedBiosystems)、025單位AmpEraseTMUNG(PEAppliedBiosystems)和100mM濃度的TaqManTM探針E19PC(5’-CATACATTTCCGCAGGTGCATGC-FAM)和E19PT(5’-TCATACATTTCCACAGGTGCATGC-TET)。1μl粗提DNA裂解液用作模板。PCR擴(kuò)增用PE9600熱循環(huán)儀(PEAppliedBiosystems)或ABI7700Prism(PEAppliedBiosystems)進(jìn)行，熱循環(huán)方案為50℃2分鐘后95℃10分鐘，然后是95℃15秒、62℃1分鐘的40輪循環(huán)。每個(gè)96孔板使用每種純合基因型2678C和2678T的8個(gè)對(duì)照樣品和8個(gè)用去離子水代替模板對(duì)照的非模板對(duì)照。用ABI7700Prism(PEAppliedBiosystems)的等位基因鑒別功能進(jìn)行基于這些反應(yīng)的等位基因鑒定。結(jié)果此測(cè)試用于分析來(lái)自4個(gè)豬品種的共20頭無(wú)關(guān)個(gè)體。這些結(jié)果在下表中表示實(shí)施例19條帶皮毛顏色與KIT的完全其分離方法Hampshire具有特征性皮毛顏色表型，在純黑色背景上有白色條帶。條帶由顯性等位基因(Be)決定。在Hampshire(Be/Be)與Pietrain(be/be)之間的回交中研究條帶基因座的分離。將F1母豬(Be/Be)與純種Pietrain(be/be)公豬回交。DNA制備完全按照實(shí)施例3中所述進(jìn)行。KIT外顯子19PCRRFLPi)PCR以制備用于RFLP測(cè)試的DNA用下面引物擴(kuò)增覆蓋KIT基因外顯子19的3末端’99bp和內(nèi)含子19的59bp的158bp片段正向引物L(fēng)A93(5’-GAGCAGCCCCTACCCCGGAATGCCAGTTGA-3’)和反向引物KIT56(5’-CTTTAAAACAGAACATAAAAGCGGAAACATCATGCGAAGG-3’)。PCR于20μl總體積中進(jìn)行，該體積中含有25ng基因組DNA，1.5mMMgCl2，50mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，200μMdNTPs，0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)和10pmol的LA93和KIT56引物。為了活化AmpliTaqGold，起始熱變性在94攝氏度進(jìn)行10分鐘，然后進(jìn)行32輪循環(huán)，每輪循環(huán)由94攝氏度45秒、55攝氏度45秒和72攝氏度45秒所組成。ii)限制性酶消化和電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)158bp。為測(cè)定此產(chǎn)物93位的多態(tài)性，消化反應(yīng)設(shè)定如下6.0μlPCR擴(kuò)增的DNA1.0μl10XNE緩沖液30.2μlAciI(5U/μl)2.8μldH2O[1XNE緩沖液(NeeEnglandBiolabs)含有100mM氯化鈉、50mMTris-HCl、10mM氯化鎂和1mMDTT]。37℃消化120分鐘后，向每個(gè)樣品加入2μl上樣染料并將混合物上樣至0.5XTBE(44.5mMTrispH8.0，44.5mM硼酸和0.5mMEDTA)中的12％天然聚丙烯酰胺凝膠中并以200V在垂直板裝置(SE600HoeferScientificInstruments)中電泳3小時(shí)。產(chǎn)物通過(guò)溴化乙錠染色加以觀察。結(jié)果KIT核苷酸2678是多態(tài)性的，并且C或T存在于此位置。C的存在產(chǎn)生AciI限制性位點(diǎn)而T存在時(shí)沒有此位點(diǎn)。已將第2個(gè)AciI位點(diǎn)加工入反轉(zhuǎn)錄引物KIT56中以用作消化的內(nèi)部對(duì)照并且因此是不變的。多態(tài)性可以按照下表中所述通過(guò)簡(jiǎn)單的PCR-RFLP分析加以測(cè)定。2678位KIT單核苷酸多態(tài)性(SNP)的測(cè)定</tables>條帶和KIT基因座在此系譜中的共分離總結(jié)于下表中。在Hampshire/Pietrain回交中KIT和條帶間的共分離</tables>條帶表型與KIT多態(tài)性間的完全共分離表明此表型最有可能受KIT基因座突變控制。這意味著KIT多態(tài)性的檢測(cè)可用于鑒定來(lái)自Hampshire豬的動(dòng)物產(chǎn)品，因?yàn)闂l帶是Hampshire豬中最重要的品種因子。有可能Saddleback和Hannover-Braunschweig豬中存在的條帶表型由相同基因座控制。實(shí)施例20αMSHR基因5’非翻譯區(qū)和5’編碼區(qū)序列的測(cè)定測(cè)定和比較已知在E基因座攜帶不同Eh、E+和Ep的豬品種之間αMSHR基因的完整編碼區(qū)。Hampshire攜帶Eh并且有雜有白色條帶的純黑色身體。該條帶是另一皮毛顏色基因座的結(jié)果。攜帶等位基因E+的WildBoar具有野生型表型而Pietrain品種攜帶Ep并且特征是白色身體上有黑色斑點(diǎn)。PCR以制備用于克隆構(gòu)建的DNA用引物EPIG10和EPIG16從基因組DNA擴(kuò)增αMSHR基因的完整編碼區(qū)。這些引物具有以下序列EPIG105’-GGTCTAGATCACCAGGAGCACTGCAGCACC-3’EPIG165’-GGGAAGCTTGACCCCCGAGAGCGACGCGCC-3’PCR在DNA熱循環(huán)儀(PerkinElmer9600)上于20l總體積中進(jìn)行，20μl體積中含有25ng基因組DNA，1.5mMMgCl2，50mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，200μMdNTPs，5％DMSO(二甲基亞砜)，0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)和10pmol的EPIG10和EPIG16。為了活化AmpliTaqGold，起始熱變性在96℃進(jìn)行10分鐘，然后進(jìn)行32輪循環(huán)，每輪循環(huán)由94℃45秒、55℃45秒和72℃45秒組成。最后的延伸持續(xù)7分鐘。PCR產(chǎn)物的克隆為了利于PCR產(chǎn)物的克隆，設(shè)計(jì)在5’末端具有限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的兩個(gè)引物。引物EPIG10具有用酶XbaI切割的序列TCTAGA而引物EPIG16含有用酶HindIII切割的序列AAGCTT。進(jìn)行上述PCR后，將反應(yīng)物電泳并用QiaexII凝膠提取試劑盒按照制造商指南(Qiagen)加以純化。在連接之前將純化的PCR產(chǎn)物如下消化PCR產(chǎn)物17.0μl0.5u的HindIII(Amersham)1.0μl0.5u的XbaI(Amersham)1.0μlX10反應(yīng)緩沖液M(Amersham3.0μlX10牛血清蛋白(Amersham)3.0μlH2O5.0μl將反應(yīng)物于37攝氏度溫育16小時(shí)后，按照制造商指南(Qiagen)通過(guò)流過(guò)QIAquick離心柱來(lái)純化消化的DNA。用400UT4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)在20μl總體積中將PCR產(chǎn)物連入100ng載體pRc/CMV(Invitrogen)中，20μl體系含有10mMMgCl2，50mMTris-HClpH7.5，10mM二硫蘇糖醇，1mMATP和25μg/ml牛血清白蛋白。連接反應(yīng)在16℃進(jìn)行16小時(shí)。質(zhì)粒DNA的制備和測(cè)序用Jetstar質(zhì)粒midi試劑盒50(Genomed)從過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物純化質(zhì)粒DNA并將得到的DNA稀釋至15ng/μl。按照ABIPrism方法P/N402078(PerkinElmer)用AmpliTaqDNA聚合酶進(jìn)行染料終止循環(huán)測(cè)序。循環(huán)測(cè)序反應(yīng)包括1.6pmol的T7或SP6測(cè)序引物(Progema)、15ng質(zhì)粒DNA和終止備好反應(yīng)混合物(PerkinElmer)。循環(huán)測(cè)序反應(yīng)在GeneAmp9600儀中進(jìn)行25輪循環(huán)，每輪循環(huán)由96℃10秒、50℃5秒和60℃4分鐘組成。用乙醇沉淀純化延伸產(chǎn)物以進(jìn)行凝膠分離，并且按照儀器說(shuō)明書(PerkinElmer方法P/N402078)中所述在377ABIPrismDNA測(cè)序儀中上樣和電泳。結(jié)果在攜帶Ep等位基因的Pietrain品種豬的αMSHR基因中鑒定到WildBoarαMSHR基因序列中的核苷酸位66到67之間的2bp插入。這導(dǎo)致翻譯框的移碼并在WildBoarαMSHR基因序列中的核苷酸位161到163處產(chǎn)生TGA終止密碼子。3個(gè)品種間αMSHR編碼序列的5’部分的比較表示如下。此比較說(shuō)明與Hampshire或WildBoar等位基因比較時(shí)Pietrain動(dòng)物攜帶的等位基因內(nèi)存在雙堿基對(duì)插入。ATG起始密碼子以粗體突出顯示，引物EPIG16的3’末端以斜體表示并且與Pietrain序列相同的堿基以破折號(hào)標(biāo)記。缺失的堿基以標(biāo)記PietrainCGACGCGCCCTCCCTGCTCCCTGGCGGGACGATGCCTGTGCTTGGCCCGGMeishan--------------------------------------------------WildBoar--------------------------------------------------PietrainAGAGGAGGCTGCTGGCTTCCCTCAGCTCCGCGCCCCCAGCCGCCCCCCCCMeishan--------------------------------------::----------WildBoar--------------------------------------::----------PietrainGCCTCGGGCTGGCCGCCAACCAGACCAACCAGACGGGCCCCCAGTGCCTGMeishan--------------------------------------------------WildBoar--------------------------------------------------PietrainGAGGTGTCCATTMeishan------------WildBoar------------這些結(jié)果也加在圖1a中。實(shí)施例21對(duì)豬αMSHR基因中2bp插入突變存在的快速DNA測(cè)試允許鑒別Ep等位基因與在此基因座鑒定到的所有其它等位基因完全按照上述用正向引物EPIG16(見上文)和反向引物MC1R121A進(jìn)行PCR。反向引物用ABI染料Hex標(biāo)記并具有以下序列MC1R121A5’-Hex-GGACTCCATGGAGCCGCAGATGAGCACGGT-3’PCR循環(huán)后，將0.2μl反應(yīng)體積與2.5μl去離子甲酰胺、0.5μlGS500DNA標(biāo)準(zhǔn)(ABI)和0.4μl藍(lán)色葡聚糖溶液混合后加熱至90℃2分鐘并于冰上迅速冷卻。然后將0.1μl此混合物上樣至377ABIPrism測(cè)序儀中并以700V、40mA、32W在1XTBE緩沖液中的6％聚丙烯酰胺凝膠中分離DNA片段2小時(shí)。用GeneScan軟件(ABI)測(cè)定得到的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度。結(jié)果設(shè)計(jì)測(cè)試以直接分析基因組中鑒定到的2bp插入的存在。引物EPIG16和MC1R121A用于PCR擴(kuò)增野生型豬MC1R基因的5’部分的448bp。為了利于擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光測(cè)定，將ABI染料HEX共價(jià)結(jié)合在引物MC1R121A的5’末端。對(duì)來(lái)自3個(gè)品種的多個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體進(jìn)行PCR并用GeneScan軟件(ABI)測(cè)定得到的PCR產(chǎn)物大小對(duì)個(gè)體間擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度的分析表明得到448bp或450bp的產(chǎn)物。從每頭Hampshire動(dòng)物中擴(kuò)增到預(yù)期的448bp片段，然而從測(cè)試的每頭Pietrain和LargeWhite動(dòng)物中檢測(cè)到長(zhǎng)2bp的產(chǎn)物。這表明通過(guò)序列分析鑒定到的2bp插入存在于兩種賦予Ep等位基因的品種Pietrain和LargeWhite的基因組DNA中，而不存在于攜帶Eh的Hampshire基因組DNA中。實(shí)施例22除了αMSHR基因的編碼區(qū)外，DNA序列多態(tài)性可能存在于品種間非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)。收集3’非翻譯區(qū)的序列信息并且在表現(xiàn)各種皮毛顏色表型的6個(gè)豬品種之間進(jìn)行比較。PCR以制備用于測(cè)序的DNA用引物EPIG13和EPIG14擴(kuò)增含有分子3’部分38個(gè)編碼核苷酸和3’非翻譯區(qū)(不包括引物結(jié)合位點(diǎn))416bp的454bp產(chǎn)物。這些引物具有以下序列EPIG135’-GCAAGACCCTCCAGGAGGTG-3’EPIG145’-CACTGAGCCGTAGAAGAGAG-3’PCR在DNA熱循環(huán)儀(PerkinElmer9600)上于20μl總體積中進(jìn)行，20μl體積中含有25ng基因組DNA，1.5mMMgCl2，50mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，200μMdNTPs，0.5UAmpliTaqGold(PerkinElmer)和10pmol的EPIG13和EPIG14。為了活化AmpliTaqGold，起始熱變性在96℃進(jìn)行10分鐘，然后進(jìn)行32輪循環(huán)，每輪循環(huán)由94℃45秒、55℃45秒和72℃45秒組成。最后的延伸于72℃持續(xù)7分鐘。PCR產(chǎn)物的測(cè)序PCR產(chǎn)物用染料終止化學(xué)法進(jìn)行測(cè)序。這首先需要純化PCR產(chǎn)物使之不含有過(guò)量的dNTPs和引物。這可根據(jù)制造商說(shuō)明(Qiagen)通過(guò)使模板DNA流過(guò)QiaQuick離心柱來(lái)實(shí)現(xiàn)。按照實(shí)施例1中所述用EPIG13或EPIG14對(duì)20ng純化的模板進(jìn)行循環(huán)測(cè)序反應(yīng)。結(jié)果引物EPIG13和EPIG14用于擴(kuò)增454bp的DNA區(qū)域，此區(qū)域包含MC1R基因的3’末端編碼區(qū)和與3’UTR緊密相連的區(qū)域。收集到的序列信息顯示于圖5中并且鑒定到2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。鑒定到的第1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)是與Meishan和LargeBlack相同的1bp缺失，它存在于WildBoar序列中相當(dāng)于核苷酸位1007處終止密碼子下游的7個(gè)位置。由于此缺失存在于翻譯區(qū)之外，所以預(yù)期其不改變得到的受體分子的氨基酸組成，然而其通過(guò)內(nèi)切核酸酶切割對(duì)mRNA穩(wěn)定性和3’末端形成的影響是未知的。這對(duì)攜帶Em和攜帶不存在于任何檢測(cè)的其它品種中的αMSHR基因變體的兩個(gè)品種是特有的。第二種多態(tài)性是對(duì)歐洲Wildboar特有的核苷酸位1162處的堿基置換。圖15表示5個(gè)品種在此位置有G堿基而Wildboar在此位置含有A。此序列差異提供了從用基于DNA的測(cè)試分析的其它品種鑒別歐洲Wildboar的可能性。權(quán)利要求1一種用于(a)以品種來(lái)源為基礎(chǔ)鑒別動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品；或(b)測(cè)定或測(cè)試動(dòng)物產(chǎn)品的品種來(lái)源；或(c)鑒定動(dòng)物產(chǎn)品；的方法，包括以下步驟(i)提供動(dòng)物產(chǎn)品的樣品；并且(ii)分析存在于樣品中的一種或多種品種因子的等位基因。2權(quán)利要求1的方法，其中品種因子是單基因性狀。3權(quán)利要求1的方法，其中品種因子是多基因性狀。4權(quán)利要求1-3中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中外在表型性狀是行為或形態(tài)學(xué)性狀。5權(quán)利要求3或4的方法，其中外在表型性狀在不同品種之間有質(zhì)量或數(shù)量上的差異。6前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟(ii)中分析的品種因子基因選自(a)皮毛顏色基因；和/或(b)皮毛圖案基因；和/或(c)皮毛質(zhì)地基因；和/或(d)皮毛密度基因；和/或(e)皮毛長(zhǎng)度基因；和/或(f)耳朵方面的基因；和/或(g)兩種肌肉形成基因；和/或(h)角形態(tài)基因；和/或(i)獠牙形態(tài)基因；和/或(j)眼顏色基因；和/或(k)羽毛基因；和/或(l)喙顏色/形態(tài)基因；和/或(m)發(fā)聲(如吠叫)基因；和/或(n)雞冠或肉垂基因；和/或(o)控制炫耀行為基因。7權(quán)利要求6(a)的方法，其中皮毛顏色基因是KIT或αMSHR基因(例如豬KIT或αMSHR基因)。8前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中樣品是核酸樣品并且分析步驟(ii)包括DNA或RNA分析。9權(quán)利要求1-7中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中樣品是蛋白樣品并且分析步驟(ii)包括蛋白分析。10一種測(cè)定豬皮毛顏色基因型的方法，包括(i)獲取豬核酸樣品；并且(ii)分析(i)中獲取的核酸以測(cè)定哪些αMSHR基因的等位基因存在。11權(quán)利要求8或10的方法，其中分析步驟(ii)包括(a)(例如通過(guò)PCR)選擇性擴(kuò)增特異核酸片段；和/或(b)測(cè)試品種因子基因/αMSHR基因內(nèi)部一個(gè)或多個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的存在[例如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析]；和/或(c)測(cè)定品種因子基因/αMSHR基因的全部或部分核苷酸序列；和/或(d)用等位基因特異性DNA或RNA探針檢測(cè)核酸樣品；和/或(e)用至少一對(duì)適當(dāng)引物對(duì)核酸樣品進(jìn)行一輪或多輪PCR擴(kuò)增循環(huán)，然后對(duì)這樣得到的擴(kuò)增核酸進(jìn)行RFLP分析。12一種測(cè)定豬皮毛顏色基因型的方法，包括(i)獲取豬αMSHR蛋白樣品；并且(ii)分析步驟(i)中獲取的蛋白以測(cè)定那些與皮毛顏色基因型相關(guān)位置的氨基酸序列或蛋白大小。13權(quán)利要求9或12的方法，其中分析步驟(ii)包括(a)用對(duì)等位基因特異性表位特異的抗體(如單克隆抗體)檢測(cè)蛋白樣品；和/或(b)電泳分析；和/或(c)色譜分析；和/或(d)氨基酸序列分析；和/或(e)蛋白水解切割分析；和/或(f)表位作圖；和/或(g)在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中翻譯通過(guò)PCR或其它方法制備的基因DNA或RNA拷貝。14權(quán)利要求7的方法，其中分析步驟(ii)包括測(cè)定KIT或αMSHR基因的核苷酸序列或者KIT或αMSHR蛋白的氨基酸序列。15權(quán)利要求7或14的方法，其中分析步驟(ii)包括確定KIT或αMSHR基因和/或其側(cè)翼區(qū)域中至少一個(gè)核苷酸變化的存在與否。16權(quán)利要求10或11的方法，其中測(cè)定步驟(ii)包括測(cè)定αMSHR基因和/或其相關(guān)側(cè)翼區(qū)域中至少一個(gè)錯(cuò)義突變、插入或缺失的存在與否。17權(quán)利要求7、10、11、14或15中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中分析步驟(ii)進(jìn)一步包括測(cè)定與KIT或αMSHR基因連鎖的一種或多種微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因與KIT或αMSHR基因的特定等位基因之間的關(guān)聯(lián)。18權(quán)利要求17的方法，其中分析步驟(ii)是基于存在于核酸樣品中的微衛(wèi)星標(biāo)記的鑒定。19權(quán)利要求7的方法，其中分析步驟(ii)包括(a)測(cè)定與KIT或αMSHR基因連鎖的一種或多種微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因與KIT或αMSHR基因的特定等位基因之間的關(guān)聯(lián)；(b)測(cè)定哪些微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因存在于核酸樣品中。20測(cè)定豬皮毛顏色基因型的方法，包括(i)測(cè)定與αMSHR基因連鎖的一種或多種微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因與αMSHR基因的特定等位基因之間的關(guān)聯(lián)；(ii)獲取豬核酸樣品；并且(iii)分析(ii)中獲取的核酸樣品以測(cè)定哪些微衛(wèi)星或其它連鎖標(biāo)記等位基因存在。21權(quán)利要求7、10、11和14-20中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中分析步驟(ii)進(jìn)一步包括測(cè)定至少一個(gè)其它基因座基因型的步驟。22權(quán)利要求21的方法，其中其它基因座是其它皮毛顏色基因座。23權(quán)利要求22的方法，其中其它皮毛顏色基因座是KIT基因基因座(如豬KIT基因基因座)。24權(quán)利要求23的方法，其中對(duì)KIT基因基因座進(jìn)行分析以測(cè)定它是否攜帶任何與條帶基因型相關(guān)的多態(tài)性。25權(quán)利要求24的方法，其中的測(cè)定包括RFLP分析。26測(cè)定豬皮毛顏色基因型的方法，包括(i)獲取豬核酸樣品；并且(ii)分析(i)獲取的核酸樣品以測(cè)定KIT基因是否攜帶任何與條帶基因型相關(guān)的多態(tài)性。27如權(quán)利要求26中所述的方法，其中步驟(ii)包括RFLP分析。28如權(quán)利要求26或27中所述的方法，其中豬基因組DNA樣品用PCR和一對(duì)適當(dāng)引物加以擴(kuò)增。29權(quán)利要求21的方法，其中其它基因座是選自權(quán)利要求6中指定的那些基因中的任意一個(gè)的品種因子基因基因座。30權(quán)利要求21的方法，其中其它基因座是品種特異性標(biāo)記。31權(quán)利要求30的方法，其中品種特異性標(biāo)記是微衛(wèi)星標(biāo)記。32權(quán)利要求7、10、11、14-23和28-31中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(ii)包括使用至少一對(duì)適當(dāng)引物的PCR。33權(quán)利要求32的方法，其中基因是豬αMSHR基因并且至少一對(duì)適當(dāng)引物是αMSHR正向引物1(5′-TGTAAAACGACGGCCAGTRGTGCCTGGAGGTGT-3′)；αMSHR反向引物5(5′-CGCCCAGATGGCCGCGATGGACCG-3′)；或αMSHR正向引物2(5′-CGGCCATCTGGGCGGGCAGCGTGC-3′)αMSHR反向引物2(5′-GGAAGGCGTAGATGAGGGGGTCCA-3′)；或αMSHR正向引物3(5′-GCACATCGCCCGGCTCCACAAGAC-3′)αMSHR反向引物3(5′-GGGGCAGAGGACGACGAGGGAGAG-3′).34權(quán)利要求7、10、11、14-23和28-33中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(ii)包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析，例如包括用一種或多種限制性酶BstUI，HhaI和/或BspHI消化豬核酸。35權(quán)利要求34的方法，其中基因是豬αMSHR基因并且分析包括鑒定豬αMSHR基因中核苷酸位283、305、363、370、491、727、729、1162或核苷酸位60與70之間或核苷酸位1005與1010之間的多態(tài)性。36權(quán)利要求7的方法，其中步驟(ii)包括用至少一對(duì)適當(dāng)引物對(duì)核酸樣品進(jìn)行一輪或多輪PCR擴(kuò)增循環(huán)，然后對(duì)這樣得到的擴(kuò)增核酸進(jìn)行RFLP分析以測(cè)定豬的KIT或αMSHR基因型。37權(quán)利要求36的方法，其中基因是豬αMSHR基因并且上述至少一對(duì)適當(dāng)引物是權(quán)利要求35中指定的引物。38權(quán)利要求30或31的方法，其中基因是豬KIT或αMSHR基因并且RFLP分析如權(quán)利要求28中所述。39權(quán)利要求1-9、11、13-19、21-25和29-38中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中動(dòng)物產(chǎn)品是肉(如加工和/或罐裝的肉)、禽蛋、禽蛋擦試物或洗滌物、精液、絨毛或皮革。40權(quán)利要求1-9、11、13-19和21-39中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中樣品包括基因組DNA、RNA或線粒體DNA。41權(quán)利要求1-9、11、13-19和21-40中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中動(dòng)物是哺乳動(dòng)物(如豬、牛、狗、貓、馬、綿羊、嚙齒動(dòng)物或兔)、魚類(如鱒魚或鮭魚)或鳥類(雞或火雞)。42一種用于(a)以品種來(lái)源為基礎(chǔ)鑒別動(dòng)物產(chǎn)品；或(b)測(cè)定或測(cè)試動(dòng)物產(chǎn)品的品種來(lái)源；或(c)鑒定動(dòng)物產(chǎn)品；的試劑盒，包含用于分析存在于樣品中的一種或多種品種因子基因的等位基因的一種或多種試劑。43一種測(cè)定豬皮毛顏色基因型的試劑盒，包含一種或多種用于分析豬αMSHR基因型的試劑。44權(quán)利要求42或43中所述的試劑盒，經(jīng)調(diào)整用于豬基因組DNA樣品。45如權(quán)利要求42到44中所述的試劑盒，包含一種或多種與至少一對(duì)適當(dāng)引物一起用于進(jìn)行至少一輪PCR循環(huán)的試劑。46如權(quán)利要求45中所述的試劑盒，其中至少一對(duì)適當(dāng)引物是αMSHR正向引物1(5′-TGTAAAACGACGGCCAGTRGTGCCTGGAGGTGTCCAT-3′)αMSHR反向引物5(5′-CGCCCAGATGGCCGCGATGGACCG-3′)；或αMSHR正向引物2(5′-CGGCCATCTGGGCGGGCAGCGTGC-3′)αMSHR反向引物2(5′-GGAAGGCGTAGATGAGGGGGTCCA-3′)；或αMSHR正向引物3(5′-GCACATCGCCCGGCTCCACAAGAC-3′)αMSHR反向引物3(5′-GGGGCAGAGGACGACGAGGGAGAG-3′)。47如權(quán)利要求42到46中的任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的試劑盒，包含一種或多種用于豬核酸RFLP分析的試劑。全文摘要本發(fā)明提供分析動(dòng)物產(chǎn)品的方法。特別地,本發(fā)明提供以品種來(lái)源為基礎(chǔ)鑒別動(dòng)物產(chǎn)品或鑒定動(dòng)物產(chǎn)品的方法。文檔編號(hào)C12Q1/68GK1263559SQ9880713公開日2000年8月16日申請(qǐng)日期1998年5月27日優(yōu)先權(quán)日1997年5月30日發(fā)明者L·安德森,J·基加斯,E·吉烏弗拉,G·J·埃文斯,R·威爾斯,G·S普拉斯托申請(qǐng)人:豬改良英國(guó)有限公司