專(zhuān)利名稱(chēng)：：具有多拷貝目的基因和可篩選標(biāo)記而不具選擇性標(biāo)記的產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種構(gòu)建不含有插入選擇性標(biāo)記基因的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的方法；通過(guò)該方法可獲得的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞；以及使用這種微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：本領(lǐng)域描述了大量制備能夠表達(dá)高產(chǎn)量目的蛋白質(zhì)的微生物菌株的方法。這些方法通常是基于多拷貝菌株的構(gòu)建，即該菌株含有多于一個(gè)拷貝的編碼目的蛋白質(zhì)的基因。這些多拷貝菌株通常按如下策略構(gòu)建1)將一段序列導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中，由此使該細(xì)胞染色體含有DNA結(jié)構(gòu)A-P-M-A，其中A表示同源DNA序列，P表示編碼目的蛋白質(zhì)的DNA序列，M表示編碼選擇性標(biāo)記的DNA序列(如抗生素抗性)，2)在對(duì)選擇性標(biāo)記增加的選擇壓力下增殖所述細(xì)胞；3)鑒定通過(guò)同源序列A的同源重組獲得了增加的抗性的細(xì)胞。構(gòu)建的多拷貝菌株然后含有結(jié)構(gòu)---A-P-M-A-P-M-A-P-M-A---專(zhuān)利US4959316，US5695976，US5733753和WO94/14968，描述了這些構(gòu)建多拷貝菌株的方法，此外引入的參考提供了更多的細(xì)節(jié)。發(fā)明概述基于環(huán)境的考慮，在蛋白質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)中選擇性標(biāo)記尤其是抗生素抗性標(biāo)記用于細(xì)胞中，在各種方法中不是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種在實(shí)際多拷貝分離過(guò)程中不使用任何選擇性標(biāo)記的多拷貝細(xì)胞構(gòu)建新方法，由此提供了獲得不含有插入選釋性標(biāo)記基因，尤其是沒(méi)有插入抗生素抗性標(biāo)記基因的多拷貝細(xì)胞的可能性。問(wèn)題的解決基于本發(fā)明人證實(shí)，可以使用可篩選蛋白質(zhì)(screenableprotein)作為標(biāo)記替代本領(lǐng)域中已知的使用選擇性蛋白質(zhì)(selectableprotein)作為標(biāo)記來(lái)構(gòu)建多拷貝菌株。因此，本發(fā)明第一部分涉及一種構(gòu)建不含有插入選擇性標(biāo)記基因的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的方法，包括a)將一段序列導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中，由此使該細(xì)胞染色體含有DNA結(jié)構(gòu)A-P-S-A，其中A表示同源DNA序列，P表示編碼目的蛋白質(zhì)的DNA序列，S表示編碼可篩選蛋白質(zhì)的DNA序列b)增殖所述細(xì)胞；c)篩選產(chǎn)生增加量的選擇性蛋白質(zhì)的細(xì)胞；以及c)回收c)所鑒定的細(xì)胞；以及任選地d)使用步驟d)中回收的細(xì)胞作為起始材料重復(fù)步驟b-d。術(shù)語(yǔ)“可篩選蛋白質(zhì)”表示一種蛋白質(zhì)不是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的，即如果它被從細(xì)胞中去除，那么在類(lèi)似的生長(zhǎng)條件下，與所述細(xì)胞中包含可篩選蛋白質(zhì)時(shí)相比，該細(xì)胞仍然能夠以基本上相同的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)。一個(gè)合適的“可篩選蛋白質(zhì)”可以是在適宜暴露下發(fā)熒光的蛋白質(zhì)，比如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或其變體(更多細(xì)節(jié)見(jiàn)下)。這一術(shù)語(yǔ)是與此處定義為“選擇性蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)相對(duì)應(yīng)而言的；“選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)”或“選擇標(biāo)記蛋白質(zhì)”表示一種是細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的蛋白質(zhì)，即如果它被從細(xì)胞中去除，那么那么在類(lèi)似的生長(zhǎng)條件下，與所述細(xì)胞中包含“選擇性蛋白質(zhì)”相比，該細(xì)胞將不能在以基本上相同的生長(zhǎng)速率生長(zhǎng)。這種“選擇性標(biāo)記蛋白質(zhì)”通常可以是一種抗生素抗性蛋白質(zhì)。因此，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)抗生素抗性蛋白質(zhì)的量可以基本上影響細(xì)胞的實(shí)際生長(zhǎng)速率。術(shù)語(yǔ)“不含有插入選擇性標(biāo)記基因的多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞”表示一個(gè)細(xì)胞不含有在制備多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中被插入細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。本領(lǐng)域中制備含有這種插入選擇性標(biāo)記基因多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的已知方法的討論見(jiàn)上述“背景”部分。術(shù)語(yǔ)“基因”表示編碼具特異活性的多肽的DNA序列，即術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記基因”表示編碼具選擇性標(biāo)記活性的多肽的DNA序列。根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的多拷貝細(xì)胞，通過(guò)同源序列“A”的自發(fā)同源重組在染色體中獲得了增加數(shù)目的可篩選蛋白質(zhì)“S”基因。自發(fā)同源重組通常是相當(dāng)稀有的事件。然而，通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法篩選合適數(shù)量的細(xì)胞(優(yōu)選多于105個(gè)細(xì)胞)，本發(fā)明人證實(shí)可以鑒定出這種細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明所最終構(gòu)建的多拷貝細(xì)胞，含有---A-P-S-A-P-S-A-P-S-A---結(jié)構(gòu)，由此含有多拷貝的目的蛋白質(zhì)“P”。根據(jù)本發(fā)明的方法制備的多拷貝細(xì)胞的一個(gè)好處是，它不含有插入的選擇性標(biāo)記基因“M”(本領(lǐng)域中已知方法的描述見(jiàn)“背景”部分，其中最終構(gòu)建的多拷貝細(xì)胞的特征是含有這種插入的選擇性標(biāo)記基因)。這些基因特別是抗生素抗性基因的存在，從環(huán)境角度和產(chǎn)品獲準(zhǔn)角度考慮是不希望有的。本發(fā)明的第二部分涉及通過(guò)本發(fā)明的任一種方法可獲得的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞，其特征是該細(xì)胞含有多拷貝表達(dá)的目的蛋白質(zhì)的基因(“P”)和表達(dá)可篩選蛋白質(zhì)的基因(“S”)。術(shù)語(yǔ)“多拷貝表達(dá)目的蛋白質(zhì)的基因(“P”)”表示所述細(xì)胞含有至少2個(gè)拷貝的表達(dá)該目的蛋白質(zhì)的基因；更優(yōu)選所述細(xì)胞含有至少4個(gè)拷貝表達(dá)該目的蛋白質(zhì)的基因；最優(yōu)選所述細(xì)胞含有至少7個(gè)拷貝表達(dá)該目的蛋白質(zhì)的基因。術(shù)語(yǔ)“多拷貝表達(dá)可篩選蛋白質(zhì)的基因(“S”)”表示所述細(xì)胞含有至少2個(gè)拷貝的表達(dá)該可篩選蛋白質(zhì)的基因；更優(yōu)選所述細(xì)胞含有至少4個(gè)拷貝表達(dá)該可篩選蛋白質(zhì)的基因；最優(yōu)選所述細(xì)胞含有至少7個(gè)拷貝表達(dá)該可篩選蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的第三部分涉及在微生物細(xì)胞中產(chǎn)生至少一個(gè)目的蛋白質(zhì)基因的方法，方法包括1)在許可產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)的根據(jù)權(quán)利要求9)微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞；及2)從獲得的培養(yǎng)液或微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞中回收該目的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)施方案僅通過(guò)實(shí)施例描述如下。附圖這些圖顯示了根據(jù)本發(fā)明，在工作實(shí)施例1和工作實(shí)施例2中，通過(guò)構(gòu)建微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的方法，制備多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞時(shí)使用的質(zhì)粒。隨后在實(shí)施例1和實(shí)施例2中提供了對(duì)該質(zhì)粒的更多描述。發(fā)明詳述將序列導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中以使細(xì)胞染色體含有DNA結(jié)構(gòu)A-P-S-A將序列導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中以使細(xì)胞染色體含有DNA結(jié)構(gòu)A-P-S-A(步驟a))可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的將含有A-P-M-A(“M”是選擇性標(biāo)記基因)結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建到微生物細(xì)胞染色體中的類(lèi)似策略進(jìn)行。將這種DNA結(jié)構(gòu)構(gòu)建到微生物細(xì)胞染色體中可以進(jìn)行如下，將含有結(jié)構(gòu)A-P-S-A，或更優(yōu)化含有結(jié)構(gòu)A-P-S的載體，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，隨后該結(jié)構(gòu)整合入該微生物細(xì)胞的染色體中。或可以以類(lèi)似的方法將一個(gè)含有可篩選蛋白質(zhì)“S”的DNA片段直接導(dǎo)入已含有A-P-A結(jié)構(gòu)的染色體中，以在染色體上產(chǎn)生DNA結(jié)構(gòu)A-P-S-A。對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，選擇一個(gè)特別合適的策略將A-P-S-A結(jié)構(gòu)導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中是常規(guī)工作。WO94/23073，US5695976，US5733753，和US4959316非常詳盡地描述了這些策略，這些文獻(xiàn)此處引入作為將這種DNA結(jié)構(gòu)導(dǎo)入微生物細(xì)胞染色體的詳細(xì)描述。再者，此處的工作實(shí)施例描述了合適策略的例子(見(jiàn)下文)。另外，術(shù)語(yǔ)“將序列導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中以使細(xì)胞染色體含DNA結(jié)構(gòu)A-P-S-A”可以定義為“將含有結(jié)構(gòu)A-P-S-A的DNA構(gòu)造導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中”。篩選產(chǎn)生增加量的可篩選蛋白質(zhì)的細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明為了鑒定多拷貝細(xì)胞，優(yōu)選篩選大量細(xì)胞。優(yōu)選(在步驟c)中)至少篩選105個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選篩選至少106個(gè)細(xì)胞，以及更優(yōu)選篩選107至少個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟c)中的可篩選蛋白質(zhì)是一種在合適暴露下發(fā)熒光的蛋白質(zhì)，該熒光蛋白質(zhì)特別是綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或其變種。本領(lǐng)域描述了綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或其變種在本領(lǐng)域中已有描述，更多細(xì)節(jié)見(jiàn)Crameri等，NatureBiotechnology14315-319(1996)；Cormack等，GENE17333-38(1996)；WO97/11094。GFP在合適曝光下發(fā)熒光。另一例可供選擇的合適的可篩選蛋白質(zhì)是β-半乳糖苷酶，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知方法，用合適的發(fā)熒光酶底物檢測(cè)它。篩選可以使用任何可測(cè)定熒光蛋白質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)篩選系統(tǒng)進(jìn)行?；趯?shí)施這一方法的高篩選能力和商業(yè)上可獲得的儀器，優(yōu)選使用具細(xì)胞分選能力的流式細(xì)胞計(jì)通過(guò)已知的流式細(xì)胞計(jì)技術(shù)進(jìn)行步驟C)的篩選(Cormack等，“FACS-優(yōu)化的綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)突變體”GENE17333-38(1996))。這種流式細(xì)胞計(jì)的一個(gè)例子是BectonDickinsonand公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)。因此，在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，通過(guò)使用有細(xì)胞分選能力的流式細(xì)胞計(jì)完成步驟c)的篩選，篩選具增加量的發(fā)熒光可篩選蛋白質(zhì)的細(xì)胞，此處該發(fā)熒光蛋白質(zhì)特別是綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)或其變種，在篩選過(guò)程中，GFP或其變種在合適的曝光下發(fā)出熒光。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，特別地此處該細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)胞，特別是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)，短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)，嗜熱芽孢桿菌(Bacillusstearothermophus)，嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophlus)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)，燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，幽閉芽孢桿菌(Bacillusclausii)或地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)的細(xì)胞。在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)(步驟a)中的“P”)是一種酶，特別是蛋白質(zhì)酶，脂酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支鏈淀粉酶(pullanase)，纖維素酶，葡萄糖異構(gòu)酶，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，環(huán)化糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase，cyclodextringluconotransferase)，肌醇六磷酸酶，葡萄糖氧化酶，葡糖基轉(zhuǎn)移酶，漆酶，或木聚糖酶。根據(jù)本發(fā)明的任何方法可獲得的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞如上所述，該多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)是含有多個(gè)拷貝的表達(dá)目的蛋白質(zhì)(P)的基因和多個(gè)拷貝表達(dá)可篩選蛋白質(zhì)(“S”)的基因。如上所進(jìn)一步顯示的，該多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步的特征是它不含有在制備多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中插入細(xì)胞的選擇性標(biāo)記基因。在微生物細(xì)胞中產(chǎn)生至少一個(gè)目的蛋白質(zhì)的方法培養(yǎng)微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何傳統(tǒng)的適于所研究的細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。表達(dá)的目的蛋白質(zhì)可常規(guī)地分泌到培養(yǎng)基中，然后通過(guò)眾所周知的方法從中回收，包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，通過(guò)硫酸銨等鹽沉淀蛋白質(zhì)性物質(zhì)，接著通過(guò)諸如離子交換層析，親和層析等層析方法分離蛋白質(zhì)。本發(fā)明通過(guò)下面的非限制性實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明。再者，該申請(qǐng)要求優(yōu)先權(quán)的丹麥專(zhuān)利申請(qǐng)DK0792/97的內(nèi)容，和伴隨該申請(qǐng)的摘要此處引入作為參考。材料和方法普通分子生物學(xué)方法除非另外提及，DNA操作和轉(zhuǎn)化按照標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行(Sambrook等，(1989)分子克隆---實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷泉港NY；Ausubel，F(xiàn).M.等(eds)，“currentprotocolsinMolecularBiology”.JohnWileyandSons，1995；Harwood，C.R.，和Cutting，S.M.(eds)，芽孢桿菌的分子生物方法.JohnWileyandSons1990).除非另外提及，PCR操作使用標(biāo)準(zhǔn)方法和PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行，可參見(jiàn)例如教科書(shū)(PCR實(shí)用方法IRL出版社，(1991))。DNA操作所用的酶根據(jù)供應(yīng)商的說(shuō)明等使用。DNA操作所用的酶除非另外提及，所有的酶，例如限制性?xún)?nèi)切酶，連接酶等，均獲自新英格蘭Biolabs公司。流式細(xì)胞計(jì)流式細(xì)胞術(shù)使用BectonDickinson公司生產(chǎn)的FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)進(jìn)行。在FACSCalibur流式細(xì)胞計(jì)上根據(jù)供應(yīng)商的指導(dǎo)，例如1996年8月的FACSCaliburTM系統(tǒng)用戶指導(dǎo)的描述進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。流式細(xì)胞術(shù)術(shù)語(yǔ)學(xué)依該FACSCaliburTM系統(tǒng)用戶指導(dǎo)使用。培養(yǎng)基TY，BPX和LB瓊脂已在EP0506780中描述，LBPSG瓊脂是添加了磷酸鹽(0.01MK3PO4)，葡萄糖(0.4％)和淀粉(0.5％)的LB瓊脂。實(shí)施例1含有可擴(kuò)增盒的細(xì)菌菌株的構(gòu)建，該盒包含有經(jīng)典的抗生素抗性標(biāo)記基因，和編碼綠色熒光蛋白的可篩選基因。質(zhì)粒的構(gòu)建A)pSJ2773美國(guó)專(zhuān)利57333753描述了質(zhì)粒pSJ2059和它作為產(chǎn)生插入地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)的amyL位點(diǎn)的基因擴(kuò)增的工具。為使質(zhì)粒能通過(guò)接合而轉(zhuǎn)移，質(zhì)粒pUB110的oriT區(qū)被插入pSJ2059以產(chǎn)生質(zhì)粒pSJ2773(圖1)。如WO96/23073所描述的，pUB110的轉(zhuǎn)移依賴(lài)于位于5’到(orfβ)的順式作用區(qū)oriT(Selinger，L.B.，McGroger，N.F.，Khachatourians，G.G.，和Hynes，M.F.(1990)等，通用芽孢桿菌質(zhì)粒pXO503密切相關(guān)的質(zhì)粒pUB110和pBC16的轉(zhuǎn)移需要反式作用開(kāi)放讀框β.J.Bacteriol.，172，3290-3297)。使用引物L(fēng)WN5232和LWN5233進(jìn)行PCR擴(kuò)增pUB110序列中pos.1020到pos.1575的550bp的片段(McKenzie，T.，Hoshino，T.，Tanaka，T.，Sueoka，N.(1986).pUB110的核苷酸序列一些突出的與復(fù)制和其調(diào)節(jié)有關(guān)特征.Plasmid，15，93-103)。LWN52325’-GTCGGAGCTCATTATTAATCTGTTCAGCAATCGGGC-3’LWN52335，-GTCGGAGCTCTGCCTTTTAGTCCAGCTGATTTCAC-3’擴(kuò)增的片段用SacI酶消化，先克隆到大腸桿菌質(zhì)粒(pUC19衍生物)的SacI位點(diǎn)。接著又用SacI酶切下該片段，克隆到pUC19衍生物pDN3000SacI位點(diǎn)(Diderchsen，B.，Wedsted，U.，Hedegaard，L.，Jensen，B.R.，Sjoholm，C.(1990).編碼一個(gè)從短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)來(lái)的胞外酶，乙酰乳酸脫羧酶的aldB的克隆J.Bacteriol.，172，4315-4321)上，得到pSJ2742(圖2)。然后OriT片段被從質(zhì)粒pSJ2742上以0.5kb的BamHI-BglII片段切下，連接到BamHI酶消化的pSJ2059質(zhì)粒上，連接混合物轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)DN1885的感受態(tài)細(xì)胞中，在30℃篩選對(duì)紅霉素(5μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的抗性。獲得的一個(gè)轉(zhuǎn)化體是含有pSJ2773的SJ2773。B)pSJ4574如WO97/11094所述獲得編碼“F64L-S65T-GFP”，一個(gè)綠色熒光蛋白突變品種的基因。該基因是使用引物#109563和#128360經(jīng)PCR擴(kuò)增的。#1095635’-GACTGCATGCGGGGAGGAGAATCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’#1283605’-CGTGAATTCGAGCTCTGCAGATCCCTTTAGTGTCAATTGG-3’用EcoRI和BspHI酶消化PCR擴(kuò)增的片段。使用從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因amyQ的啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)以使“F64L-S65T-GFP”的編碼基因得以表達(dá)，使用引物L(fēng)WN8741和LWN8742從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色體DNA上通過(guò)PCR擴(kuò)增amyQ啟動(dòng)子。LWN87415’-GTCACTGATCAATCGATTGTTTGAGAAAAGAAG-3’LWN87425’-GTCACTCATGAGTTTCCTCTCCCTCTC-3’用BclI和BspHI酶消化獲得的PCR片段，將該片段克隆到pUB110衍生的芽孢桿菌(Bacillus)載體上。對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該序列與發(fā)表的amyQ啟動(dòng)子序列一致(Palva，I.，Pettersson，R.F.，Kalkkinen，N.，Lehtovaara，P.，Sarvas，M.，Soderlund，H.，Takkinen，K.，Kaariainen，L.(1981)解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因啟動(dòng)子和NH2-未端的信號(hào)肽區(qū)的核苷酸序列。Gene15，43-51)。接著再將啟動(dòng)子現(xiàn)在以ClaI-BspHI片段從這個(gè)載體上切下。用AccI和EcoRI酶消化克隆載體pUC19，載體片段在三片段連接中與含amyQ啟動(dòng)子的ClaI-BspHI片段及含有“F64L-S65T-GFP”編碼基因的BspHI-EcoRI片段相連接。用此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌SJ2(Diderichsen等，1990)獲得的轉(zhuǎn)化體具很強(qiáng)的綠色熒光。其中一個(gè)轉(zhuǎn)化體是含有pSJ4574的SJ4574。C)pSJ4621通過(guò)下列步驟將從amyQ啟動(dòng)子表達(dá)的“F64L-S65T-GFP”編碼基因插入到擴(kuò)增載體質(zhì)粒pSJ2773中(i)用HindIII和AflIII酶消化pSJ2773質(zhì)粒，純化3.95bp的片段。(ii)用AflIII和EcoRI酶消化pSJ2773質(zhì)粒，純化4.25bp的片段。(iii)用EcoRI和HindIII酶消化pSJ4574質(zhì)粒，純化1.0bp的片段。連接三個(gè)純化的片段，將混合物轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌(B.subtilis)DN1885中，在30℃選擇對(duì)卡那霉素(10μg/ml)和紅霉素(5μg/ml)的抗性。保存的兩個(gè)發(fā)熒光的轉(zhuǎn)化體是含有pSJ4621的SJ4621菌株(圖4)和含有pSJ4622的SJ4622菌株。接合供體菌株的構(gòu)建將如WO96/23073實(shí)施例4所述的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株P(guān)P289-5制成感受態(tài)并用質(zhì)粒pSJ4621(得到菌株SJ4623和SJ4624)和pSJ4622(得到菌株SJ4625和SJ4626)轉(zhuǎn)化。在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的平板上在30℃選擇對(duì)紅霉素(5μg/ml)和四環(huán)素(5μg/ml)的抗性。質(zhì)粒向地衣芽孢桿菌(Blichenifomis)的轉(zhuǎn)移菌株SJ4623和SJ4625被用作接合過(guò)程的供體菌株以將擴(kuò)增質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)受體菌株中，接合過(guò)程基本上按WO96/23073所述進(jìn)行。這些受體菌株含有一個(gè)染色體拷貝的α-淀粉酶基因amyL。獲得的轉(zhuǎn)化接合子具有對(duì)紅霉素(5μg/ml)和卡那霉素(10μg/ml)的抗性，轉(zhuǎn)化接合子菌落的綠色熒光顯示出表達(dá)了F64L-S65T-GFP基因。擴(kuò)增盒的染色體整合將轉(zhuǎn)化接合子菌落在含紅霉素(10μg/ml)的LBPSG平板上劃線，在50℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出擴(kuò)增載體質(zhì)粒整合入染色體的菌落。然后將這些50℃平板上的單菌落接種到不含抗生素的TY培養(yǎng)基(10ml)中，在30℃生長(zhǎng)過(guò)夜，以使質(zhì)粒復(fù)制恢復(fù)，結(jié)果是質(zhì)粒從染色體上的最終切除，在缺少選擇壓力的情況下，切下的質(zhì)粒將從細(xì)胞中丟失。重復(fù)一次在不含抗生素的TY培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，將細(xì)胞涂布于含卡那霉素(10μg/ml)的平板上。這些細(xì)胞然后影印涂布于含紅霉素(5μg/ml)的平板上，分離出具卡那霉素抗性而對(duì)紅霉素敏感的菌落。這些菌落一些天后表現(xiàn)出明顯的綠色熒光。具有幾個(gè)基因拷貝的菌株的分離從上述構(gòu)建的菌株中分離含有多個(gè)拷貝編碼α-淀粉酶，“F64L-S65T-GFP”和卡那霉素抗性基因的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)菌株。這些菌株是在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中存在的卡那霉素濃度增加時(shí)，通過(guò)前面描述的增殖方法分離的，該方法篩選的存活菌株具有多個(gè)基因拷貝(見(jiàn)US5,733,753)。因此，篩選的是能在10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，50μg/ml，100μg/ml和200μg/ml時(shí)生長(zhǎng)的菌株。測(cè)定所獲菌株在搖瓶培養(yǎng)中的淀粉酶產(chǎn)量。同時(shí)測(cè)定這些培養(yǎng)物細(xì)胞“F64L-S65T-GFP”蛋白質(zhì)的細(xì)胞含量，建立起卡那霉素抗性，α-淀粉酶產(chǎn)量和細(xì)胞熒光的相關(guān)性。在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)程序中，分離具有多個(gè)基因拷貝的菌株的方法不依賴(lài)于基于卡那霉素抗性基因的直接存活選擇，而依賴(lài)于對(duì)較一般細(xì)胞顯示出更高細(xì)胞熒光的細(xì)胞的物理分離。如果細(xì)胞含有的“F64L-S65T-GFP”表達(dá)基因的拷貝數(shù)增加，該細(xì)胞就會(huì)具有較高的細(xì)胞熒光，因而這種方法就會(huì)使具有多個(gè)基因拷貝的細(xì)胞得以分離。如果用作多基因拷貝細(xì)胞分離起點(diǎn)的細(xì)胞中不存在抗生素抗性標(biāo)記基因，那么獲得的細(xì)胞將含有多拷貝的目的基因(如淀粉酶基因)，以及“F64L-S65T-GFP”編碼基因，但是不含有抗生素抗性基因。更多細(xì)節(jié)見(jiàn)此文實(shí)施例2后一部分(見(jiàn)后)。依照如上描述的實(shí)驗(yàn)程序，構(gòu)建這種細(xì)胞的方法是使用一種擴(kuò)增載體質(zhì)粒，其中的卡那霉素抗性基因處于位點(diǎn)專(zhuān)一性重組酶識(shí)別位點(diǎn)，如質(zhì)粒pAMbetal的res位點(diǎn)的側(cè)翼。一旦細(xì)胞獲得整合的擴(kuò)增盒(由卡那霉素抗性，F(xiàn)64L-S65T-GFP的表達(dá)和紅霉素抗性的缺失顯示)，就通過(guò)將編碼pAMbetal解離酶蛋白的載體導(dǎo)入細(xì)胞來(lái)去除卡那霉素抗性基因。WO96/23073詳細(xì)描述了使用res位點(diǎn)和解離酶介導(dǎo)整合的抗生素抗性標(biāo)記基因去除的技術(shù)。構(gòu)建這種細(xì)胞的另一個(gè)方法在下面的實(shí)施例2中描述。實(shí)施例2內(nèi)含擴(kuò)增盒具有編碼綠色熒光蛋白的可篩選基因，而不具抗生素抗性標(biāo)記基因的擴(kuò)增盒的細(xì)菌菌株的構(gòu)建這個(gè)實(shí)施例中的策略是構(gòu)建一個(gè)擴(kuò)增載體質(zhì)粒，其中無(wú)啟動(dòng)子的GFP基因緊隨插入在解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)amyL基因編碼序列的下游，再接著是一個(gè)拷貝的amyL啟動(dòng)子區(qū)。質(zhì)粒構(gòu)建A)pSJ4284和pSJ4285使用引物#109561和#109562通過(guò)PCR從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色體DNA擴(kuò)增編碼AmyLC-未端部分的一個(gè)大約400堿基對(duì)的amyL基因的片段。#1095615’-GACTGAATTCCAAACATGGTTTAAGCC-3’#1095625’-GACTAAGCTTGGATCCGCATGCCTATCTTTGAACATAAATTG-3’擴(kuò)增的片段用EcoRI和HindIII酶消化，連接到EcoRI和HindIII酶消化的質(zhì)粒pUC19上，產(chǎn)生質(zhì)粒pSJ4284和pSJ4285(圖5)。B)pSJ4286和pSJ4285使用引物#109564和#109565通過(guò)PCR從解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)染色體DNA擴(kuò)增從緊接著amyL基因編碼區(qū)下游起始的大約200堿基對(duì)的一個(gè)片段。#1095645’-GACTGAATTCGGATCCGCAGAGAGGACGGATTTCC-3’#1095655’-GACTAAGCTTCGATACCGTCATTTTCG-3’擴(kuò)增的片段用EcoRI和HindIII酶消化，連接到EcoRI和HindIII酶消化的質(zhì)粒pUC19上，產(chǎn)生pSJ4286和pSJ4287(圖6)。C)pSJ4294和pSJ4295這些質(zhì)粒(圖6)通過(guò)將從pSJ4286切下的0.2kb的BamHI-HindIII片段插入BamHI+HindIII消化的質(zhì)粒pSJ4285而創(chuàng)建。C)pSJ4313和pSJ4314編碼“F64L-S65T-GFP”的基因。使用引物#109563和#18842通過(guò)PCR擴(kuò)增該基因。#1095635’-GACTGCATGCGGGGAGGAGAATCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’#188425’-CGTGCTCGAGAATTCGGATCCCTTTAGTGTCAATTGG-3’擴(kuò)增的片段用BamHI和SphI酶消化，連接到BamHI+SphI酶消化的質(zhì)粒pSJ4295上，產(chǎn)生質(zhì)粒pSJ4313和pSJ4314(圖8)。E)pSJ4530應(yīng)用下列步驟構(gòu)建實(shí)際的擴(kuò)增載體質(zhì)粒(i)用BglII和HindIII消化PSJ1985(見(jiàn)US5,737,753，實(shí)施例1和圖4所描述)，分離1.7kb的片段。(ii)用BamI和HindIII消化pSJ4313，分離3.9kb片段。(iii)將這兩個(gè)片段然后混合起來(lái)并連接，連接混合物然后EcoRI和HindIII酶消化，從瓊脂糖凝膠電泳中分離2.9kb的片段。(iv)然后將分離的片段連接到PSJ2739(見(jiàn)WO96/23073，實(shí)施例6所描述)的5.4kb的EcoRI-HindIII片段上，連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)DN1885菌株中，在30℃選擇紅霉素(5μg/ml)。如此分離到含有質(zhì)粒pSJ4530(圖9)的菌株SJ4530。接合供體菌株的構(gòu)建將如WO96/23073實(shí)施例4所述的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)菌株P(guān)P289-5被制成感受態(tài)并用質(zhì)粒pSJ4530轉(zhuǎn)化，得到菌株SJ4541和SJ4542。在含有D-丙氨酸(100μg/ml)的平板上在30℃篩選對(duì)紅霉素(5μg/ml)和四環(huán)素(5μg/ml)的抗性。質(zhì)粒向地衣芽孢桿菌(B.lichenifomis)的轉(zhuǎn)移菌株SJ4541和SJ4542被用作接合過(guò)程的供體菌株以將擴(kuò)增載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)受體菌株中，接合過(guò)程基本上按WO96/23073所述進(jìn)行。這些受體菌株含有一個(gè)染色體拷貝的α-淀粉酶基因amyL。獲得的轉(zhuǎn)化接合子具有對(duì)紅霉素(5μg/ml)的抗性。擴(kuò)增盒染色體整合將轉(zhuǎn)化接合子菌落在含紅霉素(5μg/ml)的LBPSG平板上劃線，在50℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出擴(kuò)增載體質(zhì)粒整合入染色體的菌落。然后將這些50℃平板上的單菌落接種到不含抗生素的液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在30℃增殖，以使質(zhì)粒復(fù)制恢復(fù)，結(jié)果是質(zhì)粒從染色體上的最終切除，在缺少選擇壓力的情況下，切下的質(zhì)粒將從細(xì)胞中丟失。在此過(guò)程中發(fā)生了所需的重組事件，即Amy-LC-未端編碼區(qū)的整合和在更下游區(qū)的切除(或相反)，這些細(xì)胞含有緊隨amyL基因編碼區(qū)的下游插入的F64L-S65T-GFP基因，能夠基于F64L-S65T-GFP蛋白質(zhì)的表達(dá)而鑒定。這些細(xì)胞傳統(tǒng)上使用具細(xì)胞分選功能的流式細(xì)胞計(jì)，比如FASCalibur流式細(xì)胞計(jì)從其他細(xì)胞中分離出。具有幾個(gè)基因拷貝的菌株的分離從如上構(gòu)建的菌株中分離含有幾個(gè)拷貝的編碼α-淀粉酶和F64L-S65T-GFP基因的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)菌株。以如上構(gòu)建的菌株作為起始培養(yǎng)物在F64L-S65T-GFP可以表達(dá)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖。從培養(yǎng)物中取樣，適當(dāng)稀釋?zhuān)ǔＶ?×105和5×106細(xì)胞/毫升之間。在FASCalibur流式細(xì)胞計(jì)上分析稀釋的樣品，其中顆粒由氬離子激光器在488nm處的暴露明。調(diào)整FASCalibur流式細(xì)胞計(jì)以便能夠根據(jù)其前向光散射(FSC)，側(cè)向光散射(SSC)，和在大約530nm處綠色/黃綠熒光(FL1)信號(hào)檢測(cè)細(xì)胞。以FSS或SSC為一軸，F(xiàn)L1為另一軸建立點(diǎn)圖。相應(yīng)于比普通細(xì)胞具較高FL1熒光的細(xì)胞建立起分選門(mén)(sortgate)，而帶有的流式細(xì)胞計(jì)信號(hào)在這個(gè)分檢門(mén)內(nèi)的細(xì)胞被從全部細(xì)胞群中分選出。將分選出的細(xì)胞涂布于LBPSG平板上，在37℃培養(yǎng)1-2天。將細(xì)胞刮去平板上并收集。這構(gòu)成了新的中間細(xì)胞群。使用新的中間細(xì)胞群作為起始材料，整個(gè)增殖過(guò)程，具有將FL1熒光比普通細(xì)胞較高的細(xì)胞分選出能力的流式細(xì)胞術(shù)，培養(yǎng)分選出的細(xì)胞以產(chǎn)生另一個(gè)中間細(xì)胞群體，重復(fù)一定次數(shù)直至用FASCalibur流式細(xì)胞計(jì)可測(cè)出比起始培養(yǎng)物具顯著高的FL1細(xì)胞熒光的細(xì)胞群。從這些比起始培養(yǎng)物具顯著高的FL1細(xì)胞熒光的細(xì)胞群體中分選細(xì)胞，在LBPSG平板上涂板，在37℃培養(yǎng)1-2天，分離單菌落。在允許α-淀粉酶和F64L-S65T-GFP表達(dá)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，單菌落與原起始培養(yǎng)物比較。當(dāng)FASCalibur上測(cè)定的FL1細(xì)胞熒光和α-淀粉酶產(chǎn)量都比原起始培養(yǎng)物增加時(shí)，就獲得了含有幾個(gè)基因克隆的菌株。權(quán)利要求1.一個(gè)構(gòu)建不含有插入選擇性標(biāo)記基因的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的方法，包括a)將一段序列導(dǎo)入微生物細(xì)胞的染色體中，由此使該細(xì)胞染色體含有DNA結(jié)構(gòu)A-P-S-A，其中A表示同源DNA序列，P表示編碼目的蛋白質(zhì)的DNA序列，S表示編碼可篩選蛋白質(zhì)的DNA序列b)增殖所述細(xì)胞；c)篩選產(chǎn)生增加量的選擇性蛋白質(zhì)的細(xì)胞；以及d)回收c)所鑒定的細(xì)胞；以及任選地e)使用步驟d)中回收的細(xì)胞作為起始材料重復(fù)步驟b-d。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該可篩選蛋白質(zhì)是在合適暴露下發(fā)熒光的蛋白質(zhì)。3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中該發(fā)熒光蛋白質(zhì)是綠色熒光蛋白(GFP)或其變種。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的方法，其中的篩選步驟C)是通過(guò)使用具細(xì)胞分選能力的流式細(xì)胞計(jì)，篩選發(fā)熒光可篩選蛋白質(zhì)的量增加的細(xì)胞進(jìn)行的。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中該發(fā)熒光蛋白質(zhì)是綠色熒光蛋白(GFP)或其變種，在篩選步驟中，在合適的暴露下使GFP或其變種發(fā)出熒光。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任意方法，其中該微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌(Bacillus)屬的細(xì)胞，特別是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，緩慢芽孢桿菌(Bacilluslentus)，短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)，嗜熱芽孢桿菌(Bacillusstearothermophus)，嗜堿芽孢桿菌(Baci′lusalkalophlus)，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)，燦爛芽孢桿菌(Bacilluslautus)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，幽閉芽孢桿菌(Bacillusclausii)或地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenifomis)的細(xì)胞。8.前述任何權(quán)利要求的方法，其中該目的蛋白質(zhì)是一種酶，特別是蛋白質(zhì)酶，脂酶，淀粉酶，半乳糖苷酶，支鏈淀粉酶，纖維素酶，葡萄糖異構(gòu)酶，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶，環(huán)化糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase，cyclodextringluconotransferase)，肌醇六磷酸酶，葡萄糖氧化酶，葡糖基轉(zhuǎn)移酶，漆酶，或木聚糖酶。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任何方法可獲得的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞，其特征是該細(xì)胞含有多個(gè)拷貝表達(dá)目的蛋白質(zhì)(“P”)的基因和多個(gè)拷貝表達(dá)可篩選蛋白質(zhì)(“S”)的基因。10.在微生物細(xì)胞中產(chǎn)生至少一個(gè)目的蛋白質(zhì)的方法，這一方法包括(i)在允許目的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求9的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞；以及(ii)從獲得的培養(yǎng)液或微生物的多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞中回收該目的蛋白質(zhì)。全文摘要一個(gè)構(gòu)建不含有插入選擇性標(biāo)記基因的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞的方法;由此法獲得的微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞;以及用該微生物多拷貝產(chǎn)蛋白質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生目的蛋白的方法。文檔編號(hào)C12N15/90GK1261918SQ9880687公開(kāi)日2000年8月2日申請(qǐng)日期1998年7月2日優(yōu)先權(quán)日1997年7月3日發(fā)明者斯蒂恩·T·喬根森,基姆·B·佩德森申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司