一種miR-26a抑制劑及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)microRNA技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種miR-26a抑制劑及其用于制 備治療肺癌藥物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌死亡率居全世界癌癥死亡之首。世界范圍內(nèi)，大約80-85%的病例為非小細(xì)胞 肺癌(NSCLC)，非小細(xì)胞肺癌包括鱗狀細(xì)胞癌（SCC)，腺癌(ADC)和大細(xì)胞癌(LCC)。盡管手 術(shù)、放化療及分子靶向治療在臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是晚期非小細(xì)胞肺癌的生存期短，病 死率仍舊很高。
[0003] microRNA是非編碼小RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)與其相對(duì)應(yīng)靶基因的表達(dá)。隨著實(shí)驗(yàn) 研究的深入，發(fā)現(xiàn)microRNA參與調(diào)節(jié)人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其中miR-26a與非小細(xì)胞肺 癌生長(zhǎng)以及EGFR-TKIs耐藥的關(guān)系引起越來越多的關(guān)注。闡明miR-26a在非小細(xì)胞肺癌中的 作用將有助于新藥研發(fā)和個(gè)體化治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織較正常癌旁組織miR_26a的表達(dá)顯著升高;肺腺癌細(xì) 胞系SPCAl、PC-9、H2170、SW900中miR-26a的表達(dá)較正常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B顯著升高。 PTPN13是已知的抑癌基因，miR-26a通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制PTPN13的表達(dá)而發(fā)揮促進(jìn)非小細(xì) 胞肺癌生長(zhǎng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)PTPN13通過去磷酸化Src而抑制EGFR信號(hào)通路，PTPN13的高表 達(dá)可增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性，因此，miR-26a抑制劑不僅具有抑制肺癌生長(zhǎng)的 作用，而且可以提高耐藥肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏感性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-26a抑制劑 通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后具有抑制miR-26a表達(dá)的作用，對(duì)于miR-26a表達(dá)高的肺癌細(xì) 胞，在抑制miR-26a表達(dá)后，可以抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且增加肺癌細(xì)胞對(duì)EGFR-TKIs的敏 感性。
[0005] 本發(fā)明提供了一種miR-26a抑制劑。
[0006] 本發(fā)明所提供的miR-26a抑制劑核酸序列為AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。
[0007] 本發(fā)明還提供了 miR-26a抑制劑:AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA用于促進(jìn)抑癌基因 PTPN13表達(dá)的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明同時(shí)還提供了 miR-26a抑制劑:AGCCUAUCCUGGAUUA⑶UGAA用于制備治療肺 癌藥物的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了 miR-26a抑制劑:AGCCUAUCCUGGAUUA⑶UGAA與吉非替尼聯(lián)合 用于制備治療肺癌藥物的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的miR-26a抑制劑抑制肺癌中miR-26a從而間接性解除miR-26a對(duì)抑癌基因 PTPN13的抑制作用，達(dá)到抑制肺癌生長(zhǎng)的目的；同時(shí)本發(fā)明的miR-26a抑制劑具有吉非替尼 治療肺癌的增敏作用。
[0011] l.miR-26a抑制劑合成:miR-26a抑制劑是化學(xué)合成的類似miR-26a反義序列的RNA 或DNA〇根據(jù)本發(fā)明所述的miR-26a序列UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU CCUAUCCUGGAUUA⑶UGAAUU，采用寡核苷酸生物合成技術(shù)，分別合成多個(gè)miR-26a抑制劑，通 過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入SPCA1細(xì)胞后，采用qRT-PCR的方法檢測(cè)miR_26a的表達(dá)，選擇抑制效率最 高的miR-26a抑制序列:AGCCUAUCCUG GAUUACUUGAA。
[0012] 2. miR_26a在肺腺癌組織及肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)異常增高:采用qRT-PCR的方法 檢測(cè)了 5對(duì)肺腺癌及其癌旁組織和6株非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPCA1、PC-9、H2170、 SW900、H520中miR-26a的表達(dá)水平（以正常肺支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B作為對(duì)照）。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，肺腺癌組織及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、SPCA1和SW900中miR-26a表達(dá)較BEAS-2B細(xì)胞 顯著升高，細(xì)胞系PC-9、H2170和H520中miR-26a表達(dá)與MAS-2B細(xì)胞無顯著差異（圖1)。 A549、SPCA1 和 SW900 為 EGFR-TKIs 耐藥細(xì)胞系，而 PC-9、H2170 和 H520 為 EGFR-TKIs 敏感細(xì)胞 系，提示miR_26a高表達(dá)可能與肺癌EGFR-TKIs耐藥有關(guān)。
[0013] 3.miR-26a促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，miR-26a抑制劑增強(qiáng)EGFR-TKIs耐藥細(xì)胞對(duì)TKIs的 敏感性:MTS生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)miR-26a的SPCA1細(xì)胞中加入miR-26a抑制劑可抑制細(xì)胞 生長(zhǎng);在低表達(dá)miR-26a的PC-9細(xì)胞中加入miR-26a可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步MTS研究發(fā)現(xiàn)應(yīng) 用miR-26a抑制劑于吉非替尼耐藥的SPCA1細(xì)胞，可增強(qiáng)SPCA1細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性;而 將miR-26a mimics應(yīng)用于吉非替尼敏感的PC-9細(xì)胞中，可減弱PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感 性（圖2、3)。
[0014] 4.miR-26a抑制PTPN13的表達(dá)：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)PTPN13 3'UTR有miR-26a的調(diào) 控序列。在PTPN13低表達(dá)的SPCA1細(xì)胞中，miR-26a抑制劑可促進(jìn)SPCA1細(xì)胞PTPN13的mRNA表 達(dá)和蛋白表達(dá)。在PTPN13高表達(dá)的PC-9細(xì)胞中，miR-26a mimics可抑制PC-9細(xì)胞PTPN13的 蛋白表達(dá)。構(gòu)建包含PTPN133'UTR的質(zhì)粒，將miR-26a mimics與該質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞 中，熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR_26a可以抑制PTPN13的表達(dá)PTPN13 3'UTR突變的質(zhì)粒則無 相應(yīng)改變(圖4)。
[0015] 5.PTPN13靶向p-Src使其脫磷酸化。miR-26a靶向PTPN13,而PTPN13必須調(diào)控EGFR 信號(hào)通路才能發(fā)揮TKIs增敏的作用。免疫共沉淀研究發(fā)現(xiàn)EGFR信號(hào)通路中的Src可與 PTPN13結(jié)合。PTPN13是磷脂酶，與Src結(jié)合可發(fā)揮磷脂酶去磷酸化的作用。生物信息學(xué)計(jì)算 發(fā)現(xiàn)PTPN13-Sr CpTyi416復(fù)合物的時(shí)間空間穩(wěn)定性良好，并且PTPN13-Src復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn) 正是PTPN13的催化域和Src的pTyr416位點(diǎn)。在H520細(xì)胞中基因沉默PTPN13后Src pTyl:416的 磷酸化水平顯著提高（圖5)。
[0016] 6.miR-26a antagomir聯(lián)合吉非替尼可使SPCA1細(xì)胞的肺移植瘤體積、重量明顯縮 ?。▓D6)。移植瘤小鼠分4組:對(duì)照組，吉非替尼組，miR-26a antagomir瘤內(nèi)注射組和吉非替 尼灌胃聯(lián)合miR-26a antagomir瘤內(nèi)注射組。miR-26a抑制劑聯(lián)合吉非替尼組腫瘤體積和重 量縮小最明顯。
【附圖說明】
[0017]圖l.miR_26a在肺癌組織與細(xì)胞系中的表達(dá)差異;A.qRT-PCR法檢測(cè)5對(duì)非小細(xì)胞 肺癌及其癌旁正常組織中miR_26a的表達(dá)水平；B . qRT-PCR法檢測(cè)正常支氣管上皮細(xì)胞 BEAS-2B和6種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中miR-26a的表達(dá)水平。
[0018]圖2.miR-26a在吉非替尼耐藥的SPCA1腺癌細(xì)胞系中的作用;A.miR-26a聯(lián)合吉非 替尼可顯著抑制SPCA1細(xì)胞的生長(zhǎng);B.miR-26a抑制劑(miR-26a antagomir)可增加SPCA1細(xì) 胞對(duì)吉非替尼的敏感性。
[0019] 圖3.miR-26a在吉非替尼敏感的PC-9肺腺癌細(xì)胞系中的作用;A.miR-26a mimics 可促進(jìn)PC-9細(xì)胞的生長(zhǎng);B.miR_26a mimics可降低PC-9細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。
[0020] 圖4.miR-26a抑制PTPN13的表達(dá)；A.PTPN13的3'端存在miR-26a的調(diào)控序列； B. miR-26a抑制劑可促進(jìn)SPCA1細(xì)胞PTPN13的mRNA表達(dá);C .miR-26a抑制劑可促進(jìn)SPCA1細(xì)胞 PTPN13的蛋白表達(dá);D.miR-26a mimics可抑制PC-9細(xì)胞PTPN13的蛋白表達(dá);E.PTPN13的3' UTR及其突變質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK93細(xì)胞中后熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)。
[0021] 圖 5.PTPN13 靶向 p-Src 使其脫磷酸化；A. IP Src 可結(jié)合 ΡΤΡΝ13;Β·ΡΤΡΝ13-SrcpTyr416復(fù)合物的時(shí)間空間穩(wěn)定性好;C.PTPN13-SrcpTyr416復(fù)合物的相互作用位點(diǎn)分 析;D.基因沉默PTPN13后Src的磷酸化水平顯著提高。
[0022]圖6.裸鼠SPCA1細(xì)胞移植瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤生長(zhǎng)變化;移植瘤小鼠分4組:對(duì)照組，吉非替 尼組，miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射組和吉非替尼灌胃聯(lián)合miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射 組。A.miR-26a抑制劑聯(lián)合吉非替尼組腫瘤體積最小;B.miR-26a抑制劑聯(lián)合吉非替尼組腫 瘤重量最小。
【具體實(shí)施方式】
[0023] l.miR-26a抑制劑合成
[0024] 根據(jù)miR-26a序列UUCAAGUAAUCC AGGAUAGGCUCCUAUCCUGGAUUACUUGAAUU，采用寡核 苷酸生物合成技術(shù)，分別合成多個(gè)miR_26a反義寡核苷酸，通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染入SPCA1細(xì)胞 后，采用qRT-PCR的方法檢測(cè)miR_26a的表達(dá)，選擇抑制效率最高的miR_26a抑制序列： AGCCUAUCCUG GAUUACUUGAA。
[0025] 2 .qRT-PCR 檢測(cè) miR_26a 的表達(dá)
[0026] 非小細(xì)胞肺癌組織以及與其相對(duì)應(yīng)的癌旁正常肺組織均取自手術(shù)標(biāo)本，組織樣本 由手術(shù)醫(yī)師取出后立即置于之前已經(jīng)準(zhǔn)備好的液氮罐中保存。BEAS-2B、SW900、H2170、H520 細(xì)胞系均購(gòu)自于六了〇：4549、3?041、？(：-9均由第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 提供，A549細(xì)胞培養(yǎng)在含有10 %胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中，BEAS-2B、SPCA1、PC-9、 SW900、H2170、H520均培養(yǎng)在含有10%胎牛血清(FBS)的改良型1640培養(yǎng)基中。采用TRIzol method(Life Technologies)提取非小細(xì)胞肺癌、癌旁組織、正常肺上皮細(xì)胞、肺癌細(xì)胞總 RNA，米用miScript Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)為cDNA，米用qRT-PCR檢測(cè)miR_26a的 表達(dá)。
[0027] 3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-26a抑制劑或mimics后MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖水平
[0028] SPCA1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染microRNA antagomir NC(對(duì)照）與人miR26a抑制劑（miR26a antagomir)，PC_9細(xì)胞轉(zhuǎn)染microRNA antagomir NC與人miR26a mimics。以SPCA1 或PC-9細(xì) 胞鋪6孔板，8-12小時(shí)觀察細(xì)胞匯合度達(dá)70%，細(xì)胞狀態(tài)良好。用400ul無血清1640分別稀釋 20ul antagomir NC，人miR26a antagomir、人miR26a mimics。輕混轉(zhuǎn)染試劑，并吸取6ul (每孔）加入稀釋的antagomir NC、人miR26a antagomir、人miR26a mimics中，用移液器混 勾靜置20min。每孔中加入400ul的microRNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物(逐滴加入），輕搖6孔板混勾。 根據(jù)需要再分別加入吉非替尼15μΜ，于37°C，5%C0 2孵育箱孵育48小時(shí)后行MTS實(shí)驗(yàn)。
[0029] (1)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，以0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化收集細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求 計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將細(xì)胞濃度調(diào)至8X104/ml，移液器輕混勻細(xì)胞懸液后，取lOOul 分別加到到96孔板中，注意邊緣用無菌PBS填充，對(duì)照組加lOOul培養(yǎng)基。
[0030] (2)置37°C，5%二氧化碳孵育箱孵育4小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
[0031] (3)每孔加入20ulMTS液(PMS50ul+MTS液lml)，37Γ孵育3小時(shí)。
[0032] (4)測(cè)定490nm各孔吸光值，0、24、48、72、96小時(shí)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。
[0033] (5)同時(shí)設(shè)置空白孔(培養(yǎng)基和MTS液，無細(xì)胞），對(duì)照孔(不加處理培養(yǎng)基和MTS液， 有細(xì)胞），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。
[0034] 4.miR-26a 抑制 PTPN13 的表達(dá)
[0035] (1)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)PTPN13 3'UTR有miR-26a的調(diào)控序列。
[0036] (2)在PTPN13低表達(dá)的SPCA1細(xì)胞中，采用qRT-PCR方法檢測(cè)miR_26a抑制劑對(duì) PTPN13的mRNA表達(dá)的影響。
[0037] (3)在PTPN13低表達(dá)的SPCA1細(xì)胞中，采用Western-blot方法檢測(cè)miR-26a抑制劑 對(duì)PTPN13蛋白表達(dá)的影響。
[0038] (4)在PTPN13高表達(dá)的PC-9細(xì)胞中，米用Western-blot方法檢測(cè)miR_26a mimics 對(duì)PTPN13蛋白表達(dá)的影響。
[0039] (5)構(gòu)建包含PTPN13 3'UTR的質(zhì)粒，將miR-26a mimics與該質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染于HEK293 細(xì)胞中，熒光素酶基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR_26a可以抑制PTPN13的表達(dá)。PTPN13 3'UTR突變的質(zhì)粒 則無相應(yīng)改變。具體方法如下：
[0040] 以BEAS-2B基因組DNA為模板，前述生工所合成PTPN13 3'UTR引物為引物行PCR后 瓊脂糖凝膠電泳見612出白色光亮條帶，拍照后以帶酶切位點(diǎn)（EcoRI、PstI)引物行50ul體 系PCR后膠回收光亮區(qū)，并與雙酶切膠回收的SV40-PGL3basic載體連接后行轉(zhuǎn)化、挑克隆后 置于含有氨芐的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床振搖孵育16小時(shí)行菌液為模板PCR，以含有光亮區(qū)的 菌液加含有氨芐的LB5ml37°C搖床振搖孵育16小時(shí)后提取質(zhì)粒，定量后行雙酶切鑒定。
[0041 ] 以HEK293細(xì)胞鋪24孔板，10小時(shí)后觀察細(xì)胞均勻，匯合度達(dá)70%，將PTPN133 'UTR-612野生型質(zhì)粒及PTPN13 3'UTR突變質(zhì)粒與miR-26a共轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞中，48小時(shí)后行熒 光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了 PTPN13野生型miR-26a組 Luc i f eras e較對(duì)照組明顯下降，說明為miR_26a可以革巴向作用于PTPN13。
[0042] 5.PTPN13靶向p-Src使其脫磷酸化
[0043] (1)采用anti-Src抗體做免疫共沉淀，采用anti-PTPN13抗體做Western-blot，發(fā) 現(xiàn)EGFR信號(hào)通路中的Src可與PTPN13結(jié)合。
[0044] (2)采用生物信息學(xué)計(jì)算研究發(fā)現(xiàn)PTPN13-SrcpTyl:416復(fù)合物的時(shí)間空間穩(wěn)定性良 好，并且PTPN13-Src復(fù)合物的結(jié)合位點(diǎn)正是PTPN13的催化域和Src的pTyr416位點(diǎn)。
[0045] (3)采用基因沉默技術(shù)在H520細(xì)胞中靶向沉默PTPN13的表達(dá)，采用Western-blot 技術(shù)檢測(cè)Src ρΤ〃416的磷酸化水平。
[0046] 6.裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SPCA1細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)
[0047]采用SPCA1細(xì)胞皮下注射法做裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為如下4組：
[0048] (1 )NC組(僅接種SPCA1瘤細(xì)胞的裸鼠）；
[0049] (2)吉非替尼灌胃組；
[0050] (3)miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射組；
[0051 ] (4)miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射聯(lián)合吉非替尼灌胃組。
[0052]人肺癌細(xì)胞SPCA1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，其中加入含100IU/ml 青霉素及l(fā)〇〇IU/ml鏈霉素的雙抗100ul/100ml，培養(yǎng)于37°C，5%二氧化碳孵育箱中，細(xì)胞培 養(yǎng)傳達(dá)狀態(tài)良好，消化離心PBS清洗收集(去除二抗影響），細(xì)胞以1 X 1071半小時(shí)內(nèi)接種于裸 鼠腋下，每組設(shè)5只，約4-5天可見移植瘤長(zhǎng)出，待腫瘤長(zhǎng)至約100mm 3時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，吉非替尼 組以吉非替尼灌胃（25mg/kg/day)，miR_26a抑制劑組予miR_26a antagomir瘤內(nèi)注射(40ug 多點(diǎn)注射，2次/周），吉非替尼及miR-26a抑制劑共同作用組上述吉非替尼灌胃及miR-26a抑 制劑瘤內(nèi)注射同時(shí)進(jìn)行;每3天以游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體積大小，按公式V=(寬 2 X長(zhǎng)度/2)計(jì)算 移植瘤體積。
[0053] 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均取均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，以SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，采用配 對(duì)t檢驗(yàn)或單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果P<0.05定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種 miR-26a 抑制劑，該 miR-26a 抑制劑核酸序列為 AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。2. 權(quán)利要求1所述miR-26a抑制劑用于促進(jìn)抑癌基因 PTPN13表達(dá)的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述miR-26a抑制劑用于制備治療肺癌藥物的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述miR-26a抑制劑與吉非替尼聯(lián)合用于制備治療肺癌藥物的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種miR?26a抑制劑及其應(yīng)用。所提供的miR?26a抑制劑核酸序列為AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA。所提供的應(yīng)用包括miR?26a抑制劑用于促進(jìn)抑癌基因PTPN13表達(dá)的應(yīng)用；miR?26a抑制劑用于制備治療肺癌藥物的應(yīng)用；miR?26a抑制劑：AGCCUAUCCUGGAUUACUUGAA與吉非替尼聯(lián)合用于制備治療肺癌藥物的應(yīng)用。本發(fā)明的miR?26a抑制劑抑制肺癌中miR?26a的表達(dá)從而間接性解除miR?26a對(duì)抑癌基因PTPN13的抑制作用，達(dá)到抑制肺癌生長(zhǎng)的目的；同時(shí)本發(fā)明的miR?26a抑制劑具有吉非替尼治療肺癌的增敏作用。
【IPC分類】A61K31/5377, A61K31/7105, A61K48/00, A61P35/00
【公開號(hào)】CN105709240
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610167807
【發(fā)明人】李圣青, 許淑娣, 楊志偉, 王濤, 賈林濤, 張勝利
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)