專利名稱：控制發(fā)芽的遺傳學方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在植物和包括營養(yǎng)貯藏器官的植物部分中控制芽形成的方法。
馬鈴薯塊莖在經(jīng)濟上非常重要。它們代表許多食物的碳水化合物資源，并且做為各種加工產(chǎn)品的基礎(chǔ)使用。除了淀粉之外，塊莖含有高質(zhì)量的蛋白質(zhì)、大量的維生素、礦物質(zhì)和痕量元素。在種植馬鈴薯的大多數(shù)地區(qū)都不可能全年持續(xù)生產(chǎn)馬鈴薯塊莖。因此需要儲存收獲的塊莖。
儲存期間潛在的最具破壞性的現(xiàn)象之一是早熟發(fā)芽。長期儲存涉及冷卻、強制通風和使用化學發(fā)芽抑制劑。與長期儲存直接相關(guān)的問題是多方面的。
冷卻是抑制發(fā)芽的方法之一，在北歐通常通過用室溫的空氣通風進行冷卻。除了相關(guān)的費用之外，于4℃長期冷卻導致冷甜化和黑化(變深)的問題。
目前，化學發(fā)芽抑制劑是擬用于加工和新鮮消費的馬鈴薯抑制發(fā)芽的唯一可能，因為低溫儲存導致不能接受的還原糖積累。但是，近年來產(chǎn)生了諸如氯化烴的化學抑制劑對環(huán)境和營養(yǎng)的影響的問題。因此確實需要替代方法以控制諸如塊莖的營養(yǎng)貯藏器官的發(fā)芽。
延遲發(fā)芽的一個替代途徑是使用具有延長的休眠期的轉(zhuǎn)基因植物。馬鈴薯塊莖的發(fā)芽涉及幾個獨立的步驟，這些步驟可能是遺傳工程的目標。第一個步驟以淀粉為主的儲備的活動化。淀粉降解在造粉體中發(fā)生，由淀粉磷酸化酶和/或淀粉酶介導。在淀粉降解后的下一步驟中，必須將產(chǎn)生的己糖和/或磷酸己糖從造粉體輸出。產(chǎn)生的己糖和磷酸己糖在轉(zhuǎn)移入細胞溶膠后就分布于糖酵解和蔗糖合成之間。第三個步驟是在細胞溶膠中形成蔗糖。蔗糖合成依賴于能量，因此需要進行糖酵解和呼吸。第四個步驟是將蔗糖運輸至發(fā)育的芽。最后，輸入的蔗糖在所述芽中被利用以支持生長和發(fā)育。
我們已經(jīng)開發(fā)了在營養(yǎng)貯藏器官中控制發(fā)芽的方法，使得可以關(guān)閉或啟動發(fā)芽，且沒有任何諸如產(chǎn)量降低的不需要的副作用。該新方法涉及導致破壞發(fā)芽的基因的定向表達與在需要時恢復(fù)發(fā)芽的基因開關(guān)技術(shù)的結(jié)合。
按照本發(fā)明的第一個方面，提供在植物中選擇性的誘導或抑制發(fā)芽的方法，該方法包括通過轉(zhuǎn)化將DNA構(gòu)建物整合并最好穩(wěn)定地整合入所述植物的基因組，所述DNA構(gòu)建物包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，藉此所述第一多核苷酸序列中的DNA序列在源自所述轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)器官的休眠期間表達，導致有效地抑制發(fā)芽，并且所述抑制被通過外部使用誘導物質(zhì)從所述可控制啟動子區(qū)誘導所述第二多核苷酸序列中的DNA序列的表達而中和，使得所述營養(yǎng)貯藏器官發(fā)芽的恢復(fù)取決于該誘導物的使用。
本文使用的術(shù)語“組織或器官選擇性啟動子區(qū)”指那些在所需組織或器官中產(chǎn)生目的DNA序列的優(yōu)先表達的啟動子區(qū)。
對于所述轉(zhuǎn)化的宿主而言，所述DNA構(gòu)建物中的DNA序列可以是內(nèi)源的或異源的。
可以用于本發(fā)明控制發(fā)芽的方法的DNA序列的實例包括那些DNA序列，所述DNA序列編碼參與休眠期中儲備活動化諸如儲存化合物降解的蛋白質(zhì)，例如在淀粉降解中的蛋白質(zhì)，即淀粉磷酸化酶、淀粉酶(例如α或β淀粉酶)和麥芽糖酶；例如糖酵解和后續(xù)代謝中的蛋白質(zhì)，例如果糖磷酸激酶、己糖激酶；蔗糖生物合成中的蛋白質(zhì)，例如蔗糖合酶；休眠期中儲備運輸中例如在韌皮部裝入中的蛋白質(zhì)，例如ATP酶；在長距離韌皮部運輸中和韌皮部卸出中的蛋白質(zhì)，例如無機焦磷酸化酶(iPPase)；和在休眠期中儲備的利用中諸如同化物降解中的蛋白質(zhì)，例如在生長的芽中蔗糖的降解的蛋白質(zhì)，即轉(zhuǎn)化酶；和在同化物利用中例如利用蔗糖衍生的代謝物以提供芽形成所需的能量，例如編碼參與線粒體功能的蛋白質(zhì)的DNA序列，諸如呼吸中的蛋白質(zhì)諸如線粒體酶和諸如轉(zhuǎn)運蛋白的運輸?shù)鞍祝缦佘账徂D(zhuǎn)運蛋白(ANT)和蘋果酸氧化戊二酸轉(zhuǎn)運蛋白(MOT)和其諸如解偶聯(lián)蛋白的抑制劑。有用的DNA序列的實例亦包括參與馬鈴薯發(fā)芽的任何其它序列。
可以用于本發(fā)明控制發(fā)芽的方法的優(yōu)選DNA序列的實例，包括那些導致產(chǎn)生參與馬鈴薯發(fā)芽和線粒體功能(諸如呼吸)中的活動化和/或蔗糖利用的蛋白質(zhì)的有義、反義或部分有義序列，和/或編碼所述蛋白質(zhì)的有義、反義和部分有義序列。
特別優(yōu)選的DNA序列的實例包括那些編碼源自植物、細菌或真菌源(例如來自酵母)的轉(zhuǎn)化酶、源自植物、細菌或真菌源的焦磷酸酶和源自植物、細菌或真菌源的諸如MOT和ANT的參與線粒體功能的蛋白質(zhì)的序列，在下文描述。
可以以各種途徑實現(xiàn)抑制發(fā)芽。所述第一DNA序列可以在所述營養(yǎng)貯藏器官休眠期表達，并在需要發(fā)芽是被減量調(diào)節(jié)。當需要發(fā)芽時，所述第二DNA序列的表達被啟動，導致第一DNA序列的減量調(diào)節(jié)，由此恢復(fù)發(fā)芽。
可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法實現(xiàn)所需DNA序列的減量表達，諸如例如使用阻抑蛋白、有義、反義、部分有義和表達互補蛋白。合適的操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)的實例包括例如lac、tet或λ434系統(tǒng)和其突變型，諸如Lac IΔ His突變型(Lehming，N.，Sartoris，J.，Niemoeller，M.，Geneger，G.，v.Wilcken-Bergman，B.和Muller-Hill，Benno(1987)，EMBO J.6(10)3145-3153-其中所述突變型在Lac I的氨基酸17有一個變化，將酪氨酸變?yōu)榻M氨酸)?；蛘?，可以使用AmpliconTM減量調(diào)節(jié)基因(Angell，S.M.，Baulcombe，D.C.，(1997)16，3675-3684)。在這方面，使用其中插入了轉(zhuǎn)基因的復(fù)制型馬鈴薯病毒(PVX)RNA的cDNA，藉此與該轉(zhuǎn)基因有同源性的瞬時表達的RNA被抑制。
或者，第一多核苷酸序列中的DNA序列的表達可以導致產(chǎn)生有義、反義或部分有義序列，這些序列起作用抑制參與發(fā)芽的基因或參與AmpliconTM表達的基因。在這種情況下，通過啟動第二多核苷酸序列中的DNA序列的表達恢復(fù)發(fā)芽，所述表達導致產(chǎn)生所述蛋白或其對應(yīng)蛋白，所述蛋白的產(chǎn)生被第一DNA序列中的有義、反義和部分有義序列所抑制。亦可以利用合適的操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)恢復(fù)發(fā)芽。
如果所述構(gòu)建物中的任一個或兩個多核苷酸序列包含超過一個DNA序列，則最好它們不相同，以避免任何共抑制效應(yīng)。
第一多核苷酸序列中的DNA序列的表達在組織或器官選擇性啟動子的控制之下，以確保所述DNA序列的定向表達，藉此以器官或組織特異性方式誘導表達。組織選擇性啟動子的實例包括韌皮部選擇性啟動子，例如rolC啟動子，器官選擇性啟動子的實例包括塊莖特異性啟動子，諸如patatin啟動子。特別優(yōu)選使用諸如rolC和塊莖啟動子的組織或器官選擇性啟動子。
所述構(gòu)建物的第二多核苷酸序列中的DNA序列在可控制啟動子區(qū)的控制之下。
本文使用的術(shù)語“可控制啟動子區(qū)”包括可以被化學誘導的啟動子。最特別優(yōu)選使用由外源化學刺激物的使用控制的啟動子序列。所述外源化學刺激物優(yōu)選為農(nóng)業(yè)可接受的化學藥品，使用該化學藥品與農(nóng)業(yè)實踐相匹配，并且對植物或哺乳動物無害。
所述可控制啟動子區(qū)最優(yōu)選包含一個誘導型開關(guān)啟動子系統(tǒng)，諸如例如雙組分系統(tǒng)，例如我們的公開國際專利申請WO 93/21334中描述的alcA/alcR基因開關(guān)啟動子系統(tǒng)；我們的公開國際專利申請WO 90/08826和WO 93/031294中描述的GST啟動子；我們的公開國際專利申請WO 96/37609中描述的蛻皮激素開關(guān)系統(tǒng)，其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。本文將這種啟動子系統(tǒng)稱為“開關(guān)啟動子”。與所述開關(guān)啟動子結(jié)合使用的開關(guān)化學藥品是農(nóng)業(yè)可接受的化學藥品，使得該系統(tǒng)對本發(fā)明的方法特別有用。在alcA/alcR啟動子開關(guān)系統(tǒng)的情況下，優(yōu)選的化學誘導物是或者液體或者更優(yōu)選的蒸汽形式的乙醇。使用乙醇蒸汽的主要優(yōu)點之一是僅需要小量的乙醇，并且達到高水平的表達。在以上剛剛列出的專利申請中提供了開關(guān)化學藥品的詳情。
可以使用的合適的轉(zhuǎn)錄終止子亦是本領(lǐng)域眾所周知的，包括例如胭脂氨酸合酶終止子和章魚氨酸合酶終止子。所述啟動子最好是晚期塊莖啟動子，該啟動子在休眠期的晚期即在即將發(fā)芽之前有活性。
用于本發(fā)明的方法的可控制啟動子區(qū)最好是GST或alcA/alcR啟動子開關(guān)系統(tǒng)。最好使用本文詳細描述的可開關(guān)反義或可開關(guān)有義或部分有義物的方法，或者通過使用AmpliconTM，或利用合適的操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)的方法，達到恢復(fù)發(fā)芽。在我們的國際專利申請WO 91/08299(其內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中)描述了由部分有義共抑制引起的基因活性的減量調(diào)節(jié)，必要時通過使用源自不同生物體的基因序列可以避免這種情況。
按照本發(fā)明的第二個方面，提供包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的DNA序列編碼參與蔗糖活動化和/或利用的蛋白質(zhì)，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列對于所述蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含可以引起對所述蛋白質(zhì)的抑制的DNA序列。
按照本發(fā)明的第三個方面，提供包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含編碼參與蔗糖活動化和/或利用的蛋白質(zhì)的第一DNA序列，并且還包含編碼與所述第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白。
按照本發(fā)明的第四個方面，提供包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的DNA序列對于參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含的DNA序列可以引起抑制參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的第五個方面，提供包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的第一DNA序列對于參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含可以引起抑制參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)的DNA序列，還包含編碼與所述第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白。
按照本發(fā)明的第六個方面，提供包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的DNA序列對于參與線粒體功能的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含可以引起抑制參與線粒體功能的蛋白質(zhì)的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼參與線粒體功能的蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的第七個方面，提供包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的第一DNA序列對于參與線粒體功能的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含可以引起抑制參與線粒體功能的蛋白質(zhì)的DNA序列，還包含編碼與所述第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)以下DNA序列的組合特別適用于本發(fā)明的方法通過將編碼轉(zhuǎn)化酶的DNA序列置于韌皮部選擇性啟動子諸如rolC啟動子的控制之下，可以將所述DNA序列的表達定向至韌皮部并且有效地抑制發(fā)芽，然后可以通過使用alcA/alcR化學開關(guān)啟動子啟動編碼轉(zhuǎn)化酶反義的DNA序列恢復(fù)發(fā)芽。葉子韌皮部中的蔗糖濃度是如此之高，以至于轉(zhuǎn)化酶表達的效應(yīng)被有效地壓倒，避免了任何不想要的副作用。這與芽韌皮部的情況形成對比，在芽韌皮部中轉(zhuǎn)化酶的表達具有顯性效應(yīng)，結(jié)果使得蔗糖被降解，發(fā)芽被有效地抑制。
再一有用的組合是在塊莖啟動子控制之下的編碼無機焦磷酸酶(iPPase)的DNA序列。蔗糖的攝取和在韌皮部中的運輸是一個需能過程，通過表達編碼無機焦磷酸酶的DNA序列抑制能量的提供，可以抑制攝取過程。通過使用例如alcA/alcR化學誘導開關(guān)啟動子啟動編碼與iPPase反義、有義或部分有義的序列的DNA序列，可以逆轉(zhuǎn)這種抑制，恢復(fù)發(fā)芽。使用組織或器官特異性啟動子再一次確保對蔗糖攝取和在韌皮部中運輸?shù)囊种撇辉谡麄€植株中發(fā)生，而僅在塊莖中發(fā)生，由此消除了在所述植株中的任何有害效應(yīng)。
在這二種情況下，恢復(fù)發(fā)芽的替代方法是通過使用AmpliconTM，其中與轉(zhuǎn)基因享有同源性的瞬時表達的RNA被抑制。這種轉(zhuǎn)基因可以例如是轉(zhuǎn)化酶或iPPase的cDNA。恢復(fù)發(fā)芽的再一替代方法是通過使用合適的操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)。
我們亦發(fā)現(xiàn)，通過選擇性地抑制塊莖中芽生長和發(fā)育所需的能量的提供，可以抑制發(fā)芽而且沒有任何不想要的副作用，即將編碼與編碼參與線粒體功能的蛋白質(zhì)的DNA序列有義、反義或部分有義的DNA序列置于塊莖選擇性啟動子的控制之下，所述蛋白質(zhì)例如腺苷酸轉(zhuǎn)運蛋白(ANT)或線粒體氧化戊二酸轉(zhuǎn)運蛋白(MOT)?；蛘?，可以使用引起這種蛋白質(zhì)的抑制的DNA序列?？梢詫崿F(xiàn)這種抑制的逆轉(zhuǎn)的一種方法是啟動第二DNA序列的表達，第二DNA序列的產(chǎn)物與第一DNA序列互補，例如可以使用編碼源自不同來源(最好源自擬南芥屬(Arabidopsis))的ANT的DNA序列，以抵消所述ANT反義表達的效果。在MOT的情況下，合適的互補序列可以是由Taniguchi和Sugiyama在Plant Molec.Biol.30，51-64(1996)中描述的源自黍(Panicum miliaceum)的序列?；蛘撸梢允褂煤线m的操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)抑制。如上所述可以使用alcA/alcR化學開關(guān)啟動子。這里更詳細地描述上述實例。
按照本發(fā)明的一些實施方案，第一多核苷酸序列包含再一個編碼與第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列的DNA序列，第二多核苷酸序列包含編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白的DNA序列，它處于開關(guān)啟動子的控制之下，使得使用誘導物時導致編碼所述阻抑蛋白的DNA序列的表達，該阻抑蛋白接著就與所述操縱基因結(jié)合，則第一多核苷酸序列中的第一DNA序列的表達被關(guān)閉。這種系統(tǒng)的實例是乳糖操縱子和阻抑蛋白，如公開的國際專利申請WO 90/08830中所述。其它實例包括四環(huán)素和λ434操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)。
可以按照各種已知方法用重組DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物細胞，所述方法例如農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒、電穿孔、微注射和使用微粒槍。然后可以在合適的情況下將轉(zhuǎn)化的細胞再生成完整的植株，其中新的核酸物質(zhì)已經(jīng)整合、最好是穩(wěn)定地整合入其基因組。以此方法可以得到轉(zhuǎn)化的單子葉和雙子葉植物。
按照本發(fā)明的第八方面，提供用上述任何一種DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植物細胞。
按照本發(fā)明的第九方面，亦提供用按照本發(fā)明的上述方面的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的完整植株，其中所述DNA構(gòu)建物被整合、最好是穩(wěn)定地整合入所述植株的基因組。
按照本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明再包括前述段落的植株的后代以及這種植株和這種后代的種子和塊莖，所述后代包含整合入、最好是穩(wěn)定地整合入其基因組的按照本發(fā)明的上述方面的DNA構(gòu)建物。
本發(fā)明的方法特別適用于控制馬鈴薯塊莖發(fā)芽。
在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供在馬鈴薯中選擇性誘導或抑制發(fā)芽的方法，包括通過轉(zhuǎn)化將DNA構(gòu)建物穩(wěn)定地整合入所述馬鈴薯的基因組，所述DNA構(gòu)建物包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，藉此所述第一多核苷酸序列中的DNA序列在源自所述轉(zhuǎn)基因植物馬鈴薯的塊莖的休眠期間表達，導致有效地抑制發(fā)芽；所述抑制通過外部使用誘導物質(zhì)從所述可控制啟動子區(qū)誘導所述第二多核苷酸序列中的DNA序列的表達而被中和，使得所述塊莖發(fā)芽的恢復(fù)取決于該誘導物的使用。
我們亦鑒別了五種我們認為在本發(fā)明的方法中特別有用的特別優(yōu)選的DNA序列。我們在塊莖儲存期間誘導時鑒別了這些DNA序列，并將其命名為16-3(序列2)、16-8(序列-3)、10-1(序列4)和AC4(序列5)、M-1-1(MOT)(

圖19中的序列)和MOT變異體(序列6，EMBL儲存號碼為X99853)。在所附的實施例中全面描述了所述DNA序列及其分離。因此按照再一方面，本發(fā)明提供在按照本發(fā)明的控制植物發(fā)芽的方法中源自克隆16-3、10-1、AC4、16-8、M-1-1和MOT變異體的全部或部分DNA序列的用途。
相信16-3、16-8、AC4和M-1-1的DNA序列是新穎的，本發(fā)明的第十二方面擴展至包含以下核苷酸的多核苷酸序列2(對應(yīng)于16-3)中的核苷酸1-870、序列3(對應(yīng)于16-8)中的核苷酸1-712或序列5(對應(yīng)于AC4)中的核苷酸1-386或圖19序列(對應(yīng)于編碼MOT的M-1-1)中的核苷酸1-1351，本發(fā)明的第十二方面再擴展至由這些核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，且擴展至具有與所述產(chǎn)物大致類似活性和具有至少85％氨基酸序列類似的那些蛋白質(zhì)。類似程度優(yōu)選為至少90％，類似程度更優(yōu)選為95％，類似程度最優(yōu)選為97％。
所述多核苷酸的特別優(yōu)選的實施方案包括序列2中的核苷酸55-751、序列3中的核苷酸87-473、和圖19中的核苷酸192-1164，及其編碼的翻譯產(chǎn)物和具有與所述產(chǎn)物大致類似活性和具有至少85％氨基酸序列類似的那些蛋白質(zhì)。類似程度優(yōu)選為至少90％，類似程度更優(yōu)選為95％，類似程度最優(yōu)選為97％。
本文使用的術(shù)語“類似程度”用來指那些序列，當進行序列對比時，在同樣的位置或區(qū)具有類似的(相同或保守置換的)氨基酸，相同或保守置換的氨基酸是那些與起始蛋白質(zhì)相對比不改變所述蛋白質(zhì)的活性或功能的氨基酸。例如，相互之間具有至少85％同源性的兩個氨基酸序列當最多允許三個缺口(gap)而進行最佳對比時，在同樣的位置具有至少85％的相似性(相同或保守置換的氨基酸殘基(amido residue))，前提是，所述缺口最多影響不超過15個氨基酸殘基。類似程度可以使用本領(lǐng)域眾所周知的方法確定(參見，例如，Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.“核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的快速相似性檢索”Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80，726-730(1983)和Myers E.和Miller W.“線性空間中的最佳序列對比”，Comput.Appl.Biosci.411-17(1988))。可以用于確定類似程度的一個程序是MegAlign Lipman-Pearson一對方法(使用缺省參數(shù))，該程序可以從DNAstar Inc，1228，Selfpark Street，Madison，Wisconsin，53715，USA做為Lasergene系統(tǒng)的一部分而得到。
按照本發(fā)明的第十三方面，提供其編碼的蛋白質(zhì)具有與由序列2、3和5和圖19中提供的核苷酸編碼的蛋白質(zhì)大致相似活性的多核苷酸序列，該多核苷酸與當在低、高嚴格條件下或在低、高嚴格條件之間溫育時仍然與序列2、3或5或圖19中提供的序列所包含的序列雜交的多核苷酸互補。一般而言，低嚴格條件可以定義為約室溫至約65℃下的3×SSC，高度嚴格條件定義為約65℃下的0.1×SSC。SSC指緩沖液0.15M NaCl，0.015M檸檬酸三鈉，3×SSC的強度是SSC的三倍，0.1×SSC的強度是SSC的十分之一。
本發(fā)明再提供其編碼的蛋白質(zhì)具有與以下核苷酸編碼的蛋白大致相似活性的多核苷酸序列序列2中的核苷酸55-751、序列3中的核苷酸87-473、或圖19中的核苷酸192-1164，該多核苷酸與當在低、高嚴格條件下或在低、高嚴格條件之間溫育時仍然與序列2中的核苷酸55-751、序列3中的核苷酸87-473包含的序列雜交或與圖19中的核苷酸192-1164雜交的多核苷酸互補。一般而言，低嚴格條件可以定義為約室溫至約65℃下的3×SSC，高度嚴格條件定義為約65℃下的0.1×SSC。SSC指緩沖液0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉，3×SSC的強度是SSC的三倍，0.1×SSC的強度是SSC的十分之一。
描述于序列2、3和5和圖19中的按照本發(fā)明的多核苷酸可以可操作地連接至啟動子區(qū)，該啟動子區(qū)對于所述多核苷酸可以是同源的或異源的，本發(fā)明擴展至這種構(gòu)建物。本發(fā)明亦擴展至包含所述多核苷酸的DNA構(gòu)建物，該多核苷酸再包含編碼可以將所述多核苷酸的翻譯產(chǎn)物定向至所需細胞或亞細胞位置的肽的一個區(qū)。本發(fā)明再提供包含優(yōu)選地可操作地連接至啟動子區(qū)并可選地連接至轉(zhuǎn)錄終止子和或如上述的定向序列的如序列2、3、5和圖19描述的所述多核苷酸序列的載體。
本文提供的16-3、16-8、10-1、AC-4、M1-1和MOT變異體的序列是cDNA序列，按照本發(fā)明的再一方面可以用作探針，以從基因組文庫分離和鑒別含有天然啟動子區(qū)的5’區(qū)上游的序列。然后可以鑒別、分離和測序所述啟動子區(qū)。
按照本發(fā)明的第十五方面，提供用包含如序列2、3和5和圖19所述的多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物或者包含所述多核苷酸序列的上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。所述宿主細胞優(yōu)選為如前述的植物細胞，并且本發(fā)明亦擴展至已在其基因組中整合、最好是穩(wěn)定整合如上述的多核苷酸序列、DNA構(gòu)建物或載體的完整植株以及所述植株的種子、塊莖和后代。
按照本發(fā)明的第十六方面，提供包含多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述多核苷酸序列包含一個開關(guān)啟動子系統(tǒng)，該啟動子系統(tǒng)可操作地連接至包含有義、反義或部分有義轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的多核苷酸序列，其中當從所述開關(guān)啟動子開啟所述多核苷酸序列的表達時，產(chǎn)生所述有義、反義或部分有義序列的表達，導致編碼轉(zhuǎn)基因的再一多核苷酸序列表達的減量調(diào)節(jié)。
在第十七方面中本發(fā)明提供控制轉(zhuǎn)基因表達的方法，包括用二種DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述第一種DNA構(gòu)建物包含一個可操作地連接至包含有義、反義或部分有義轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的多核苷酸序列的開關(guān)啟動子系統(tǒng)，再一種DNA構(gòu)建物包含一個編碼轉(zhuǎn)基因的編碼序列；控制從所述開關(guān)啟動子表達所述多核苷酸序列，使得產(chǎn)生的所述有義、反義或部分有義構(gòu)建物的表達導致所述轉(zhuǎn)基因的表達的減量調(diào)節(jié)。
本文使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”用于指對于轉(zhuǎn)化的宿主細胞是外源的或異源的基因。
在上述方面的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供DNA構(gòu)建物，所述構(gòu)建物包含可操作地連接至包含有義、反義或部分有義轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的多核苷酸序列的alcA/alcR開關(guān)啟動子。
本發(fā)明亦擴展至包含按照本發(fā)明上述方面的所述DNA構(gòu)建物的載體。
按照本發(fā)明的第十八方面，提供用包含多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的宿主細胞，所述多核苷酸序列包含一個可以通過施用的化學刺激物啟動的開關(guān)啟動子，該啟動子系統(tǒng)可操作地連接至包含有義、反義或部分有義轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的多核苷酸序列，其中當從所述開關(guān)啟動子開啟所述多核苷酸序列的表達時，產(chǎn)生所述有義、反義或部分有義序列的表達，導致編碼轉(zhuǎn)基因的再一多核苷酸序列表達的減量調(diào)節(jié)。
所述宿主細胞最好是前述的植物細胞，本發(fā)明亦擴展至由其衍生的、已在其基因組中整合、最好是穩(wěn)定地整合了上述多核苷酸序列、DNA構(gòu)建物或載體的完整植株，本發(fā)明亦擴展至所述植株的種子、塊莖和后代。
使用開關(guān)啟動子系統(tǒng)控制所述有義、反義或部分有義構(gòu)建物的表達有許多用途。對于其表達會產(chǎn)生致死或抑制效應(yīng)的基因，使用可開關(guān)的有義、反義或部分有義物可以控制該基因的減量調(diào)節(jié)，以便于鑒別合適的除草劑靶。亦可以使用采用有義、反義或部分有義序列的可開關(guān)減量調(diào)節(jié)鑒別細胞脫離(cell ablation)的機制。
按照第十九方面，本發(fā)明因此提供可能是與除草劑相互作用的合適靶位點的鑒別方法，包括以下步驟用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物，所述多核苷酸序列包含可以影響所述靶位點DNA表達的第一DNA序列，其中所述第一DNA序列的表達在開關(guān)啟動子的控制之下；控制從所述開關(guān)啟動子的所述DNA序列的表達，使得編碼除草劑靶位點的DNA的表達被減量調(diào)節(jié)，并且確定所述減量調(diào)節(jié)對所述植株生存力的影響。
將要監(jiān)測的影響的類型包括靶位點的減量調(diào)節(jié)必須維持的時間、需要的減量調(diào)節(jié)水平，以得到的結(jié)果為基礎(chǔ)，可以決定所述靶位點是否合適作為除草劑靶位點。
我們極其意外地發(fā)現(xiàn)，STLS-1葉啟動子序列以塊莖中基因表達的增強子起作用，使用STLS-1序列做為塊莖中基因表達的增強子形成了本發(fā)明的再一方面。
在第二十方面中，本發(fā)明提供增強塊莖中基因表達的方法，包括用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化塊莖植物細胞，所述多核苷酸序列包含連接至再一啟動子區(qū)的編碼全部或部分STLS-1葉啟動子的DNA序列。
STLS-1葉啟動子是本領(lǐng)域中已知的(Eckes等(1986)Mol.Gen.Genet.205，14-22)，在所附的實施例中進行描述。全部或部分編碼STLS-1葉啟動子的DNA序列可以用作按照本發(fā)明的增強子。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)可以鑒別STLS-1的活性片段，所述技術(shù)諸如限制酶消化，接著進行由此所獲片段的基因表達增強的分析。該STLS-1啟動子序列可以插入在所述再一啟動子區(qū)的或者上游即5’端或者下游即3’端。特別優(yōu)選將所述STLS-1序列插入在所述啟動子區(qū)的上游。在本發(fā)明此方面的特別優(yōu)選實施方案中，將所述STLS-1序列插入在35S CaMV啟動子的上游。
在第二十一方面中，本發(fā)明提供源自轉(zhuǎn)基因植物的用化學誘導物處理才發(fā)芽的塊莖，最好是馬鈴薯塊莖。
按照本發(fā)明的第二十二方面，提供多核苷酸序列，該多核苷酸序列包含圖25、26或27中所描述序列中的至少一個的全部或部分序列，還提供與描述于圖25、26或27中的序列功能相同的多核苷酸，該多核苷酸與當在低、高嚴格條件下或在低、高嚴格條件之間溫育時仍然與圖25、26或5或27中提供的序列所包含的序列雜交的多核苷酸互補。這種序列最好是塊莖特異性啟動子。
按照本發(fā)明的第二十三方面，提供控制植物或其部分的基因表達的方法，包括用化學誘導型植物基因表達盒轉(zhuǎn)化植物細胞，該表達盒包含可操作地連接至源自alc R基因的調(diào)節(jié)基因序列的第一啟動子和可操作地連接至靶基因的源自alc A基因的可控制啟動子，其中該可控制啟動子在存在乙醇蒸汽時由調(diào)節(jié)蛋白激活，由此引起所述靶基因表達。
現(xiàn)在通過以下非限制性實施例描述本發(fā)明，并用附圖做為參考，其中圖1顯示質(zhì)粒pBIN-IN8構(gòu)建圖解。
圖2顯示質(zhì)粒PPA-2的結(jié)構(gòu)圖。
圖3顯示野生型(Desiree)和具有韌皮部特異性胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株(基因型DIN-87、DIN-90和DIN-30)在黑暗中于室溫延長儲存后的照片。
圖4顯示使用抗無機焦磷酸酶的抗體進行的對照植株和PPaII-2、-3和-5和PPaI-2和PPaI-55的馬鈴薯塊莖蛋白提取物的蛋白印跡分析。泳道1和2是來自兩個不同塊莖的樣品。
圖5顯示從野生型和轉(zhuǎn)基因植株收獲的塊莖在黑暗中于室溫儲存5個月后的照片。A野生型對照(Desiree)；B轉(zhuǎn)基因植株P(guān)PaII-2；C轉(zhuǎn)基因植株P(guān)PaII-3；D轉(zhuǎn)基因植株P(guān)PaII-5。
圖6顯示A質(zhì)粒pJIT 166圖解BpAGS/pUC GUS報道基因構(gòu)建物圖解圖7顯示質(zhì)粒AlcR/AGUS的圖譜圖8將組織培養(yǎng)生長的馬鈴薯植株轉(zhuǎn)移至溫室中。于2.5升花盆中栽培8周后，通過用50ml 5％乙醇溶液給所述植株澆水三次(第0、1和2天)，誘導Alc表達。首次誘導后第4天，收獲匍匐莖和發(fā)育的塊莖，使用組織化學染色程序展現(xiàn)GUS活性。0天誘導前；4天，首次誘導后4天顯示莖、根和匍匐莖中的alcGUS活性的組織化學檢測。1未誘導的匍匐莖，2膨脹的塊莖；3發(fā)育的塊莖和4成熟塊莖。圖9顯示乙醇蒸汽處理后組織化學檢測alcGUS活性后的馬鈴薯塊莖照片。A0天，B3天，C7天，D，未處理的對照，E，處理后7天。
圖10顯示質(zhì)粒pGSTTAK圖譜。
圖11顯示GST-GUS轉(zhuǎn)化的植株在含有0％■、0.4％
、2.0％□和10％
R-25788的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天后的完全發(fā)育葉的GUS活性直方圖分析。
圖12顯示質(zhì)粒SQ03構(gòu)建圖解。
圖13顯示質(zhì)粒SQ-01構(gòu)建圖解。
圖14顯示質(zhì)粒SQ-02構(gòu)建圖解。
圖15顯示馬鈴薯ANT克隆圖解。
圖16顯示馬鈴薯塊莖于室溫儲存時UBL-、GTP-結(jié)合-、AC-4-和16-8-特異性轉(zhuǎn)錄物的積累。
圖17顯示發(fā)芽塊莖的不同區(qū)域的UBL-、GTP-結(jié)合、16-8-，和MOT特異性轉(zhuǎn)錄物的積累。
圖18顯示反義MOT構(gòu)建物構(gòu)建圖解圖19顯示編碼分離自馬鈴薯的MOT的DNA序列。
圖20顯示由克隆M-1-1(MOT)編碼的蛋白質(zhì)與黍線粒體氧化戊二酸之間的序列同源性。
圖21顯示將lac操縱子序列克隆入RolC-轉(zhuǎn)化酶質(zhì)粒的策略。
圖22顯示將Lac I克隆入Alc開關(guān)雙載體和連接入RolCopINV的策略。
圖23顯示通過PCR分離UBL-1啟動子。
圖24顯示通過PCR分離MOT-啟動子。
圖25顯示UBL-1啟動子核酸序列。
圖26顯示MOT3啟動子核酸序列。
圖27顯示MOT6啟動子核酸序列。
圖28顯示CAT檢測用乙醇源封住24小時的植株的ALC-CAT煙草葉。各列上面的數(shù)字代表ng乙醇/ml液面上空間。
圖29顯示乙醇誘導后35S-Alc-GUS馬鈴薯塊莖中CUS RNA轉(zhuǎn)錄物的動力學。外部指所述馬鈴薯塊莖皮下1-3mm的部分，所述馬鈴薯的剩余部分稱為內(nèi)部部分。在用橡膠密封的40升塑料箱中進行誘導1周。乙醇濃度是0.02％氣相(8ml 96％乙醇/40升)，向每個槽中加入20μg總RNA。
圖30顯示用1％乙醇誘導的35S-Alc-GUS馬鈴薯塊莖中GUS轉(zhuǎn)錄物的動力學和活性。
實施例I.芽抑制的范例1.通過表達韌皮部特異性轉(zhuǎn)化酶抑制馬鈴薯塊莖發(fā)芽1.1.構(gòu)建質(zhì)粒pBIN-RolC按照制造商的說明書(Perkin Elmer，Ueberlingen，德國)通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)克隆發(fā)根農(nóng)桿菌的rolC啟動子。PCR循環(huán)(40個循環(huán))的溫度分布型如下95℃ 1分鐘、45℃ 1分鐘和72℃ 2分鐘。使用標準程序(Sambrook等，A Cloning Manual Cold Spring HarborLaboratory Press 1989)，從攜帶質(zhì)粒pABC002的發(fā)根農(nóng)桿菌(Schmülling等，Plant Cell 1，665-670(1989))分離含有所述rolC啟動子的質(zhì)粒DNA。基于rolC啟動子片段的已發(fā)表序列(Slightom等，J.Biol Chem 261(1)108-121，1986)，合成合成寡核苷酸。引物序列是5’-rolC引物d(GGAATTCGATACGAAAAAGGCAAGTGCCAGGGCC)和3’-rolC引物d(CCCATG GTACCCCATAACTCGAAGCATCC)。將擴增的DNA克隆入PCR載體pCR1000TM(Invitrogen，Norwalk，CT)。為排除PCR循環(huán)中擴增DNA的突變，使用雙脫氧法對所述克隆測序。然后通過使用包含于所述PCR引物中的EcoRI的5’-限制位點和Asp718的3’-限制位點，通過rolC啟動子置換35S花椰菜花葉病毒啟動子序列(Franck等，Cell 21 285-294(1980))，將1150-bp啟動子片段克隆入植物表達盒pBINAR(Hfgen和WillmitzerPlant Sci.66，221-230 1990)。最終的構(gòu)建物是基于雙載體pBin19(Bevan，Nucl Acid Res 12，8711-8721(1984))。產(chǎn)生的質(zhì)粒含有rolC啟動子和章魚氨酸合酶多聚腺苷酸化信號(Gielen等，EMBO J 3，835-8461984)。1.2.構(gòu)建質(zhì)粒pBIN-IN8(圖1)為獲得酵母Suc 2基因的截短形式，進行PCR以從質(zhì)粒PI-3-INV(von Schaewen等EMBO J 9 3033-3044，(1990))擴增轉(zhuǎn)化酶基因，該PCR使用了寡核苷酸5’-Suc2 d(GAGCTGCAGATGGCAAACGAAACTAGCGATAGACCTTTGGTCACA)和3’-Suc2 d(GAGACTAGTTTATAACCTCTATTTTACTTCCCTTACTTGGAA)。將所述PCR產(chǎn)物用PstI/SpeI消化，克隆入質(zhì)粒YIP128A1的PstI/XbaI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒181A1-INV(Riesmeier等，EMBO J.11 4705-13(1992))。為在轉(zhuǎn)化酶基因的兩端均得到BamHI位點，用PstI/BamHI消化質(zhì)粒181A1-INV，將轉(zhuǎn)化酶片段連接入載體pBlueSK-產(chǎn)生質(zhì)粒pBlue-Suc2A。接著，將質(zhì)粒pBlue-Suc2A用SpeI/EcoRV消化，用DNA聚合酶平端化，并克隆入pBlueSK-的SmaI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pBlue-Suc2B。使用質(zhì)粒pBlue-Suc2B，將轉(zhuǎn)化酶基因做為BamHI片段分離，并克隆入質(zhì)粒pBIN-RolC的BamHI位點。產(chǎn)生的質(zhì)粒(pBIN-IN8)在rolC啟動子和章魚氨酸合酶多聚腺苷酸化信號(Gielen等，EMBO J.3，835-46，1984)之間具有所述Suc2基因(核苷酸849-2393)。1.3.構(gòu)建物pBIN-IN8的轉(zhuǎn)化如Hfgen和Willmitzer(Nucl Acid Res.16，9877(1988))所述，用質(zhì)粒pBIN-IN8通過直接轉(zhuǎn)化變種Desiree，轉(zhuǎn)化含有pGV2260的根癌農(nóng)桿菌菌株C58Cl(Deblaere等，Nuc.Acid Res.13，4777-4788(1989))。按照Rocha-Sosa等(EMBO J.8，23-29(1989))的方法，完成馬鈴薯的轉(zhuǎn)化。在組織培養(yǎng)再生植株的中脈完成增加的轉(zhuǎn)化酶活性的初步篩選。從75個獨立的轉(zhuǎn)化子中選擇出三個系(DIN-87、90和30)做進一步分析。為詳細分析，將每種預(yù)選擇的轉(zhuǎn)化子的十個復(fù)制物轉(zhuǎn)移至溫室以產(chǎn)生塊莖。1.4.轉(zhuǎn)化酶活性轉(zhuǎn)化酶檢測。將在液氮中快速冷凍的植物組織在提取緩沖液(50mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(Hepes)-KOH，pH 7.4；5mM MgCl2；1mM EDTA；1mM乙二醇-二(b-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)；1mM苯基甲磺酰氟(PMSF)；5mM二硫蘇糖醇(DTT)；0.1％Triton X-100，10％甘油)中勻漿和離心(5分鐘，4℃，9000g，Biofuge 13；Heraeus，Hanau，德國)。為檢測中性轉(zhuǎn)化酶，該反應(yīng)混合物在100μl終體積中含有20mM Hepes-KOH pH 7.5 100mM蔗糖和10-30μl的所述蛋白提取液。于30℃溫育30-60分鐘，于95℃終止3分鐘?？瞻拙哂邢嗤姆磻?yīng)混合物，但是被熱滅活、未進行溫育。如Stitt等所述(Methods Enzymol.174，518-522(1989))測定葡萄糖和果糖。為檢測可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶，該反應(yīng)混合物在100μl終體積中含有20mM乙酸鈉pH 4.7、100mM蔗糖和10-30μl的所述蛋白提取液。于30℃溫育30-90分鐘，為在95℃終止所述反應(yīng)3分鐘之前中和該反應(yīng)混合物，加入10μl 1M磷酸鈉pH 7.2?？瞻拙哂邢嗤姆磻?yīng)混合物，但是被熱滅活、未進行溫育。
收獲后，將轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株的塊莖于20℃儲存5個月。接著測定馬鈴薯塊中的中性和酸性轉(zhuǎn)化酶活性。結(jié)果示于表1。表120℃儲存5個月的馬鈴薯塊莖中的轉(zhuǎn)化酶活性基因型 中性轉(zhuǎn)化酶酸性轉(zhuǎn)化酶對照32.7±4.2 18.0±1.3DIN-87 115.3±6.1141.2±8.8DIN-90 93.9±4.7 126.0±6.2DIN-30 121.5±8.4174.8±16.5給出平均值±標準差(n＝4)。以nmol gFW-1min-1表示轉(zhuǎn)化酶活性。對照是野生型Desiree。1.5.轉(zhuǎn)化酶對馬鈴薯塊莖中糖積累的影響測定可溶性糖。收獲塊莖，將塊莖塊(60-70mg鮮重，0.1cm3平均體積)立即在液氮中冷凍。用1ml 80％乙醇(10mM Hepes-KOH，pH7.4)于80℃提取所述塊1-2小時。如Stitt等所述(1989)，使用上清液測定葡萄糖、果糖和蔗糖。將沉淀第二次提取，在水中洗滌并干燥。使用淀粉測定藥盒(Boehringer Mannheim)進行淀粉含量測定。結(jié)果示于表2。表2在RolC啟動子控制下表達胞質(zhì)酵母轉(zhuǎn)化酶的馬鈴薯塊莖的糖類組成。基因型 果糖 葡萄糖 蔗糖 淀粉對照 0.9±0.1 6.2±0.28.7±0.4 652±15DIN-30 0.3±0.1 8.7±1.02.1±0.2 604±19DIN-87 0.8±0.1 6.5±0.43.1±0.2 753±26DIN-90 0.8±0.01 3.1±0.63.5±0.1 903±39給出平均值±標準差(n＝12，對照；n＝4，轉(zhuǎn)基因植株)。以μmol己糖gFW-1表示糖含量。對照是野生型Desiree。1.6.產(chǎn)量馬鈴薯植株生長于溫室中，相對濕度60％、16小時光照(22℃)和8小時黑暗(15℃)循環(huán)(輻照度300μmol m-2s-1)。為評估韌皮部特異性胞質(zhì)酵母源轉(zhuǎn)化酶對塊莖鮮重和塊莖數(shù)量的影響，將每種基因型10個植株在2升花盆中培養(yǎng)。如表3所示，所述轉(zhuǎn)基因植株的總鮮重和塊莖數(shù)量與野生型沒有區(qū)別。表3表達轉(zhuǎn)化酶的馬鈴薯植株的塊莖產(chǎn)量基因型 總鮮重 塊莖數(shù)量對照 118.3±1.1 15±0.01DIN-87 116.5±6.1 11±1.9DIN-90 121.1±0.2 12±1.9DIN-30 106±10.513.5±2.8
給出平均值±標準差(n＝10)。以克表示塊莖鮮重。對照是野生型Desiree。1.7.轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽抑制為研究韌皮部特異性胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶對塊莖發(fā)芽的影響，將轉(zhuǎn)化的和野生型植株收獲的塊莖于室溫在黑暗中儲存延長的時間。野生型Desiree塊莖在5-6個月后開始發(fā)芽，而轉(zhuǎn)基因植株的塊莖未顯示發(fā)芽的任何可見跡象。轉(zhuǎn)基因植株的塊莖甚至在儲存一年后也未發(fā)育出任何有活力的芽(圖3)。因此，韌皮部特異性轉(zhuǎn)化酶的表達導致對馬鈴薯塊莖發(fā)芽的完全抑制。2.通過表達大腸桿菌無機焦磷酸酶抑制塊莖發(fā)芽2.1.構(gòu)建質(zhì)粒PPA-2和馬鈴薯轉(zhuǎn)化(圖2)將STLS-1基因(Eckes等，Mol.Gen.Genet.205，14-22(1986))的1600bp啟動子片段做為EcoRI-BamHI片段從質(zhì)粒1600-CAT(Stockhaus等，1987)分離。除去重疊的核苷酸后，將該片段克隆入如Sonnewald(Plam J.2，571-581(1992))所述的嵌合ppa基因的平端化EcoRI位點。將最終構(gòu)建物做為EcoRI-HindIII片段克隆入雙載體Bin19(Bevan，1984上述引文中的雜志(J.loc cit))，所述最終構(gòu)建物含有STLS-1啟動子/增強子、35S CaMV啟動子、TMV-U1翻譯增強子、大腸桿菌ppa編碼區(qū)和章魚氨酸合酶多聚腺苷酸化信號。如Hfgen和Wilmitzer所述(Nucl Acid Res.16 9877(1988))完成根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1pGV2260的直接轉(zhuǎn)化。如Rocha-Sosa等所述(EMBO J.8 23-29(1989))進行使用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移的馬鈴薯轉(zhuǎn)化。
在農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移之后，使用免疫印跡分析40個獨立的轉(zhuǎn)化植株P(guān)Pase蛋白質(zhì)的存在。選擇具有最高量的PPase蛋白質(zhì)的三個植株(PPaII-2、3和5)進行進一步分析。為比較嵌合35S CaMV啟動子(PPaII)和未修飾的35S CaMV啟動子(PPaI)的啟動子強度，通過蛋白質(zhì)印跡分析馬鈴薯塊莖的蛋白提取物。如圖4中所示，與PPaI對照相比，生長中的PPaII塊莖中蛋白質(zhì)提取物中可檢測到的PPase蛋白質(zhì)的量顯著地較高。在于室溫儲存3個月和12個月的塊莖中得到了同樣的結(jié)果。這個分析比較了PPaI和PPaII群體的最高水平表達系，選擇了70個獨立的PPaI轉(zhuǎn)化子，選擇了40個獨立的PPaII轉(zhuǎn)化子。該分析清楚地表明，STL1啟動子片段增強了塊莖的無機焦磷酸酶表達。與所述大腸桿菌無機焦磷酸酶表達相平行的是在PPaII塊莖蛋白質(zhì)提取物中檢測到的焦磷酸酶活性的增加(表4)。根據(jù)焦磷酸酶活性的量，焦磷酸含量最多降低了二倍(表4)。表4水平升高的胞質(zhì)無機焦磷酸酶導致PPaII轉(zhuǎn)化子塊莖中PPi積累的降低基因型 焦磷酸酶活性 焦磷酸[μmolg FW-1分鐘-1][nmolg FW-1]對照 3600±4102.4±0.2PPaII-2 5600±1501.4±0.2PPaII-3 6200±2201.2±0.3PPaII-5 8500±2201.1±0.1從在溫室中生長150天的植株收獲塊莖。結(jié)果是三種不同的野生型植株的三個塊莖和每種PPaII植株2-4個塊莖的平均值±標準差(野生型n＝3，轉(zhuǎn)基因植株n＝4)。2.2.免疫印跡分析在12.5％ SDS聚丙烯酰胺凝膠(Laemmli，1970)上分離后，使用半干電印跡裝置(Multiphore II；LKB，Bromma，Sweden)將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Millipore，Bradford，Mass.，美國)。于室溫與1∶1000稀釋度的抗-PPase多克隆抗體(Lerchl等，Plant Cell 7 259-270(1995))溫育90分鐘。使用Amersham Buchler的生物素-鏈霉抗生物素系統(tǒng)，用兔生物素化種特異性全抗體(源自驢)和鏈霉抗生物素-生物素化辣根過氧化物酶完成所述抗原的免疫檢測。2.3.焦磷酸酶活性檢測為檢測焦磷酸酶(PPase)活性，將100-200mg馬鈴薯塊莖塊在0.5ml 100mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)-KOH(pH 7.5)、2mM MgCl2、1mM EDTA、1mM EGTA、5mM巰基乙醇中勻漿。離心(10分鐘，4℃，13,000rpm)后，將20μl的上清液在160μl 50mMTris-HCl(pH 8.0)、16mM MgSO4和100mM KCl中分析PPase活性。在加入20μl 50mM NaPPi后，于30℃進行反應(yīng)20分鐘。通過加入20μl 1M檸檬酸終止反應(yīng)，如Heinonen和Lathi所述(Anal Biochem113，313-317(1981))分析無機磷酸的釋放。該分析對于時間和提取物的量是線性的。2.4.測定塊莖組織中無機焦磷酸為測定焦磷酸，將200-300mg塊莖組織在液氮中冷凍。然后將冷凍的材料在置于粉狀干冰(固體二氧化碳)上的研缽內(nèi)的液氮中勻漿為細粉末。加入預(yù)先冷卻至干冰溫度的15ml等份的乙醚中的16％(v/v)三氯乙酸(TCA)，將該樣品進一步勻漿。在將該勻漿置于干冰上20分鐘后，加入0.8ml水中的含有5mM NaF的16％TCA。將該混合物溫至4℃并靜置3小時。接著如Weiner等所述(Biochem Biophys Acta893，13-21(1987))，用乙醚抽提該勻漿4次并用KOH/三乙胺中和。所有的研缽和材料都在2N HCl中預(yù)洗滌12小時，平行制備假提取物以檢查所述試劑和裝置未被焦磷酸污染。在檢測焦磷酸含量之前，將400μl的提取液加入400μl陽離子交換劑(Serva，Heidelberg，聯(lián)邦德國；Dowex AG 50×8，100-200目，用2N HCl預(yù)平衡，用水調(diào)至pH5，然后于室溫干燥12小時)，混合20秒鐘，離心除去提取液中的干擾該代謝物檢測的化合物。如Weiner等所述，用光度法檢測焦磷酸。通過在TCA和乙醚殺死的混合物中的植物材料中加入小的代表性量(內(nèi)源含量的2-3倍)焦磷酸，檢查該提取液和檢測的可靠性。2.5.產(chǎn)量馬鈴薯植株生長于溫室中，相對濕度60％、16小時光照(22℃)和8小時黑暗(15℃)循環(huán)(輻照度300μmol m-2s-1)。為評估大腸桿菌無機焦磷酸酶對塊莖鮮重和塊莖數(shù)量的影響，將每種基因型5個植株在2升花盆中培養(yǎng)。PPaII植株的總塊莖鮮重與野生型對照相比沒有改變(表5)。表5大腸桿菌無機焦磷酸酶對馬鈴薯塊莖發(fā)育的影響。從已在溫室中生長150天的植株收獲塊莖。結(jié)果是每種基因型的5個單獨植株的平均值?；蛐?總鮮重[克] 塊莖數(shù)對照 89-148 12±0.6PPaII-399-139 19±1.7PPaII-5110-16721±4.0PPaII-289-192 19±0.52.6.轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)芽抑制從野生型植株收獲的塊莖在儲存5-6個月后開始發(fā)芽，而PPaII的塊莖未發(fā)育出任何可見的芽(圖5)。隨著野生型塊莖的芽發(fā)育繼續(xù)進行，儲存12個月后PPaII塊莖中仍然沒有發(fā)芽的跡象。甚至在延長儲存2年后，PPaII塊莖也未發(fā)芽。用赤霉素、乙烯磷、高溫和低溫或光照處理馬鈴薯塊莖，都未誘導PPaII塊莖發(fā)芽。PPaI轉(zhuǎn)基因植株中的低水平表達不足以防止發(fā)芽。II.馬鈴薯塊莖中誘導型基因表達的范例3.乙醇誘導型基因表達3.1.構(gòu)建質(zhì)粒AlcGUSGUS基因的來源是基于pUC的質(zhì)粒pJIT166(圖6)。使用SalI和BglII，將含有GUS編碼區(qū)和CaMV35S終止子的源自pJIT166的片段克隆入pACN/pUC載體。BglII在CaMV35S終止子中切割三次。第一次切割在GUS基因末端之外的250堿基處發(fā)生。盡管這只取出了所述終止子的一小部分，但該片段含有終止轉(zhuǎn)錄所需的所有必需的序列。pJIT166的SalI-BglII消化產(chǎn)生了一個含有所述GUS基因加上截短的CaMV35S終止子的1.8kbp片段。將該片段克隆入pACN/pUC，所述pACN/pUC已用SalI和BglII消化以除去CAT基因和nos終止子，在alcA啟動子后的5’端留下一個SalI突出，在該線性化載體的3’端留下一個BglII突出。使用標準程序，將含有所述GUS基因和CaMV35S終止子的片段連接入含有alcA啟動子的線性化pUC載體?？寺〕绦虻淖詈笠徊绞菍lcA-GUS-35St片段克隆入pSRN-ACN/BinN19，代替alcA-CAT-nos片段。則產(chǎn)生的Bin19載體含有alc調(diào)節(jié)子的所有組分，但卻具有GUS報道基因。用HindIII消化，從pSRN-ACN/Bin19載體切出alcA-CAT-nos片段。通過電洗脫從凝膠提取剩余的16.1kbp片段，該片段是仍然具有35S-alcR-nos區(qū)的Bin19載體。然后用HindIII XmnI雙消化pAGS/pUC，切出alcA-GUS-35St片段。限制性酶XmnI將pUC19載體切掉850bp，產(chǎn)生分離并使得可取出alcA-GUS-35St片段。然后將alcA-GUS-35St片段克隆入pSRN/Bin19中未被占用的HindIII位點。使用限制酶切作圖將該片段定向，然后測序以確認它們含有正確的序列。在圖7中提供了質(zhì)粒AlcR/AGUS的圖譜。3.2.構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的雜志)所述，完成根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1pGV2260的直接轉(zhuǎn)化。按照Rocha-Sosa等(1989)(上述引文中的雜志)的方法，進行采用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移的馬鈴薯(Solara)的轉(zhuǎn)化。
在農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移后，選擇100個獨立的轉(zhuǎn)化植株。為測試GUS活性的誘導性，在組織培養(yǎng)中復(fù)制轉(zhuǎn)基因植物的苗。根形成后，將一組植株轉(zhuǎn)移進入溫室。轉(zhuǎn)移進入溫室2周后，通過向所述馬鈴薯植株的根系統(tǒng)加入50ml 5％乙醇溶液檢測乙醇誘導性。接著使用組織化學檢測系統(tǒng)展示GUS活性。乙醇誘導后，在所有測試的組織中都可見到GUS活性(sink-和源葉、莖、根和匍匐莖)。如圖8所示，GUS活性在發(fā)育和成熟的塊莖中是高度可誘導的。在未誘導的馬鈴薯植株的任何器官中都沒有可檢測的GUS活性。
為研究Alc-開關(guān)對乙醇蒸汽的敏感性，使用了一個實驗系統(tǒng)，其中將一個Alc-CAT(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)煙草植株(CaMV35S-AlcR-nos，AlcA-CAT-nos；Caddick等，1988)封閉于一個密封的容器中，用一盆特定濃度的乙醇做為乙醇蒸汽源。24小時后取液面上空間和葉樣品。通過將用氣密針管注射入配有質(zhì)譜分析檢測儀的氣相色譜儀得到的峰與乙醇標準溶液得到的峰進行比較，將液面上空間樣品中乙醇的絕對量定量。通過CAT ELISA測定葉中總CAT表達水平。在用5、1、0.1和0.05％乙醇溶液封閉的煙草植株中，CAT的表達相對穩(wěn)定，但在使用0.01、0.005和0.001％乙醇溶液時顯著下降(參見圖28)。將CAT活性水平與容器中的乙醇蒸汽濃度相聯(lián)系，看出Alc-開關(guān)激活的閾值在乙醇濃度為72和21ng/ml空氣之間。
為進一步研究儲存馬鈴薯塊莖中GUS的誘導性，選擇四個GUS陽性轉(zhuǎn)基因系進行詳細分析。在組織培養(yǎng)中增殖后，將每種基因型5個植株轉(zhuǎn)移至溫室進行塊莖的產(chǎn)生。收獲后，將塊莖置于密封的玻璃容器中，該容器中具有用5％乙醇溶液浸泡的3MM紙。
為證明乙醇誘導在整個馬鈴薯塊莖中都是有效的，在乙醇誘導后不同的時間取塊莖小塊，使用組織化學檢測方法展示GUS活性。如圖9中所示，在整個馬鈴薯塊莖中都發(fā)現(xiàn)GUS活性的均勻誘導。
在Alc-GUS馬鈴薯塊莖(CaMV35S-AlcR-nos，AlcA-GUS-nos)中研究使用乙醇蒸汽激活A(yù)lc-開關(guān)。通過RNA分析測定GUS RNA轉(zhuǎn)錄物積累的動力學。用乙醇源封閉馬鈴薯塊莖3、6、9、12、24、48小時和1周時間，移走乙醇源，于2、3和4周的時間點取樣。通過改變所述封閉系統(tǒng)中用于誘導的乙醇濃度，可以改變GUS轉(zhuǎn)錄物積累的時間進程。在40升容器中使用8ml無水乙醇，首先在6小時時在塊莖皮下的外層1-3mm中檢測到低水平的GUS轉(zhuǎn)錄物，于12小時時在皮下3mm或更深處檢測到低水平的GUS轉(zhuǎn)錄物(參見圖29)。于24小時時檢測到最高水平的轉(zhuǎn)錄物，轉(zhuǎn)錄物持續(xù)到4周。與之相對比，使用5％乙醇溶液產(chǎn)生較低的乙醇蒸汽濃度時，首次在1周時檢測到轉(zhuǎn)錄物。通過保持恒定的乙醇源，在整個實驗過程中檢測到高水平的GUS轉(zhuǎn)錄物(最后一個時間點是3個月)(參見圖30)。
這些乙醇蒸汽研究的延伸是研究西紅柿果實中Alc-開關(guān)誘導。將5％乙醇溶液封閉于裝有Alc-GUS西紅柿果實(CaMV35S-AlcR-nos，AlcA-GUS-nos)的2.6升容器中，在暴露于乙醇中4周后，在源自果實中stig的果皮壁中觀察到顯著的GUS染色。將西紅柿果實切片，在50mM磷酸鈉緩沖液pH 7.0中簡單地洗滌，并在染色緩沖液(50mM磷酸鈉緩沖液，pH 7.0，50μM鐵氰化鉀，50μM亞鐵氰化鉀，2％tritonX-100，20％甲醇和1mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-B-D-葡糖苷酸)按照需要進行溫育。通過進行100％和70％乙醇洗滌終止染色，將果實切片儲存于4℃中的70％乙醇中。3.3.GUS活性的熒光測定如下進行GUS活性的熒光測定將乙醇誘導后指定時間收獲的塊莖塊在液氮中冷凍。接著將塊莖組織在50mM NaHPO4(pH 7.0)、10mM巰基乙醇、10mM EDTA、0.1％月桂基肌氨酸鈉、0.1％ TritonX-100中勻漿。將勻漿在4℃于13,000rpm離心10分鐘，收集澄清的上清液并用于測定蛋白含量和GUS活性。對于熒光測定，將20μl提取液(稀釋至合適的濃度)加入480μl GUS檢測緩沖液(提取緩沖液中2mM MUG)，并于37℃溫育30分鐘。然后將50μl的反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1950μl終止溶液中。用TKO 100微型熒光計(于365nm激發(fā)，于455nm發(fā)射)測定每個樣品的熒光測定信號。根據(jù)通過將熒光測定值對時間作圖得到的曲線的起始斜率，計算酶活性。熱滅活的提取物做為對照。將活性值針對每個提取液的蛋白濃度歸一化。3.4.組織化學檢測GUS活性為組織化學檢測GUS活性，將組織樣品在X-gluc緩沖液(25mM磷酸鈉緩沖液(pH 7.2)，25mM磷酸鉀(pH 7.2)，0.1％ Triton X-100，1mM X-gluc)中溫育。使用短暫的真空滲入(30秒)以支持底物穿透入植物組織。接著，將該材料于37℃溫育3-24小時，在照相之前用水漂洗。用乙醇漂白光合成組織。使用配備了Wild MPS46自動照相裝置(photoautomat)的Wild Makroskop M420進行顯微分析。III.馬鈴薯植株中安全劑誘導型基因表達4.1.構(gòu)建GSTGUS質(zhì)粒在構(gòu)建質(zhì)粒載體時采用標準重組DNA方法。將含有源自pG1E7的GST-27 3.8kb EcoRI-Nde I 5’側(cè)翼區(qū)的報道基因構(gòu)建物平端化，并連接入農(nóng)桿菌Ti載體pBI101的Sma I位點。平端化后，位于GST-27的預(yù)期翻譯起始密碼子的Nde I位點被破壞。這形成方便的與在pBI101中編碼b-葡糖醛酸酶(GUS)的大腸桿菌UidA基因融合的點。通過限制和序列分析，確認了產(chǎn)生的嵌合報道基因構(gòu)建物pGSTTAK的結(jié)構(gòu)。在圖10中提供了質(zhì)粒pGSTTAK的圖譜。4.2.構(gòu)建物的轉(zhuǎn)化和誘導性的測試如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的雜志)所述，使用質(zhì)粒pGST∷GUS完成根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1pGV2260的直接轉(zhuǎn)化。按照Rocha-Sosa等(1989)(上述引文中的雜志)的方法，進行采用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移的馬鈴薯(Solara)的轉(zhuǎn)化。
在農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移后，選擇100個卡那霉素抗性再生的苗。通過將GST∷GUS轉(zhuǎn)化的馬鈴薯植株的莖插條轉(zhuǎn)移至含有0、0.4、2.0和10‰R-25788(終濃度)的MS培養(yǎng)基，檢測安全劑誘導性。培養(yǎng)14天后，收獲完全發(fā)育的葉，測定GUS活性。如圖11中所示，安全劑誘導后GUS活性得到3-20倍的增長。IV.靶基因表達的誘導型阻抑5.誘導型共抑制5.1.構(gòu)建誘導型FNR共抑制的嵌合基因為達到NADP-鐵氧化還原蛋白氧化還原酶(FNR)的乙醇誘導型共抑制，將煙草FNR cDNA的一個約450堿基對3’-片段(序列1)以有義定向融合至alcA啟動子，產(chǎn)生質(zhì)粒SQ03。在圖12中描繪了克隆策略。
如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的雜志)所述，完成根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1pGV2260的直接轉(zhuǎn)化。如Rosahl等(EMBO J 6，23-29，(1987))所述，進行采用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移的煙草轉(zhuǎn)化(Samsun)。
在農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移后，選擇100個獨立的轉(zhuǎn)化植株。序列1堿基總數(shù)423AATTTCAAAG GAAAAATTTA CCTATCTACA TGGATGCAGG GGGAGAGAAG CATAAAGTTGGCTCATATTT GTACAAAGAA AAGTAAAAAT ATTTAGTAGA CTTCAACATT CCATTGCTCTGCCTTCTTCA ATTGCTTCTT GTAGTCCGCC CAGACAATAC CATCTCTTTC AGCAAGAGCAGACATAATTT CATCAATTCC CTGCTCCATG CCCTTGAGTC CACACATGTA GATGAAGGTGTTGTCTTTTT GGAGCAAAGT CCATAGTTCT TCAGCATATT GAGCCATTCT GGTTTGAATGTACATCTTTT CACCCTTTCC GTTCGTTTGC TCTCTGCTCA CAGCAAAGTC CAATCTGAAGTTT-3′V.異源基因的誘導型反義阻抑如I節(jié)中所述，當使用合適的啟動子驅(qū)動相應(yīng)基因表達時，胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶和無機焦磷酸酶的表達可以導致不發(fā)芽表現(xiàn)型。為達到所述不發(fā)芽表現(xiàn)型的誘導型逆轉(zhuǎn)，采用了異源基因誘導型反義策略。6.焦磷酸酶表達的誘導型反義阻抑6.1.構(gòu)建質(zhì)粒SQ01如圖5中所示，大腸桿菌無機焦磷酸酶的高水平表達導致收獲的馬鈴薯塊莖的不發(fā)芽表現(xiàn)型。為化學控制大腸桿菌無機焦磷酸酶的表達，設(shè)計了質(zhì)粒SQ01。該質(zhì)粒含有三個嵌合基因(a)在35S CaMV啟動子控制之下的alcR基因，(b)在增強的35S CaMV啟動子控制之下的ppa基因和(c)在alcA啟動子控制之下的反義定向的ppa基因。質(zhì)粒SQ01的構(gòu)建示于圖13。6.2.植物轉(zhuǎn)化如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的雜志)所述，完成根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1pGV2260的直接轉(zhuǎn)化。按照Rocha-Sosa等(1989)(上述引文中的雜志)所述和如Rosahl等(1987)(上述引文中的雜志)所述，進行采用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移的馬鈴薯轉(zhuǎn)化(Solara)和煙草轉(zhuǎn)化(Samsun)。
在農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移后，選擇100個獨立的轉(zhuǎn)化植株。6.3.ppa的免疫學檢測通過免疫學檢測組織培養(yǎng)生長的馬鈴薯植株的葉提取物中的大腸桿菌焦磷酸酶蛋白，檢測成功的轉(zhuǎn)化。根據(jù)初次篩選，可以鑒定15個獨立的轉(zhuǎn)基因植株。在組織培養(yǎng)中復(fù)制后，將表達焦磷酸酶的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株轉(zhuǎn)移至溫室以形成塊莖。7.轉(zhuǎn)化酶表達的誘導型反義阻抑7.1.構(gòu)建質(zhì)粒SQ02如圖3中所示，胞質(zhì)酵母源轉(zhuǎn)化酶的韌皮部特異性表達導致收獲的馬鈴薯塊莖的不發(fā)芽表現(xiàn)型。為化學控制酵母轉(zhuǎn)化酶的表達，構(gòu)建了質(zhì)粒SQ02。該質(zhì)粒含有三個嵌合基因(a)在35S CaMV啟動子控制之下的alcR基因，(b)在rolC啟動子控制之下的編碼成熟轉(zhuǎn)化酶蛋白的截短的suc2基因和(c)在alcA啟動子控制之下的反義定向的suc2基因。質(zhì)粒SQ02的構(gòu)建示于圖14。7.2.植物轉(zhuǎn)化如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的雜志)所述，完成根癌農(nóng)桿菌菌株C58C1pGV2260的直接轉(zhuǎn)化。按照Rocha-Sosa等(1989)(上述引文中的雜志)所述和如Rosahl等(1987)(上述引文中的雜志)所述，進行采用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移的馬鈴薯轉(zhuǎn)化(Solara)和煙草轉(zhuǎn)化(Samsun)。
在農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移后，選擇100個獨立的轉(zhuǎn)化植株。7.3.轉(zhuǎn)化酶活性通過如von Schaewen等所述(EMBO J.9，3033-3044(1990))檢測SDS PAA凝膠中轉(zhuǎn)化酶活性，檢測成功的轉(zhuǎn)化。為此目的，從組織培養(yǎng)生長的馬鈴薯植株中脈制備蛋白提取物。在12.5％SDS PAA凝膠中分離蛋白提取物后，將該凝膠在100mM乙酸鈉緩沖液pH 5.0中洗滌30分鐘。接著將該凝膠在含有100mM蔗糖的100mM乙酸鈉緩沖液中于37℃溫育1小時。在用蒸餾水簡單洗滌后，通過檢測釋放的還原糖(葡萄糖和果糖)展示轉(zhuǎn)化酶活性。通過將該凝膠在0.5NNaOH中的0.1％氯化2，3，5-三苯基四氮唑中煮沸2-5分鐘檢測己糖。轉(zhuǎn)化酶活性由于形成濃厚的紅色而可見?；诔醮魏Y選，可以鑒定18個獨立的轉(zhuǎn)基因植株。在組織培養(yǎng)中復(fù)制后，將表達轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株轉(zhuǎn)移至溫室以形成塊莖。VI.使用操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)阻抑異源基因8.使用具有rolC啟動子、酵母源轉(zhuǎn)化酶基因和Alc開關(guān)的Lac操縱基因/阻抑蛋白系統(tǒng)8.1.將lacI克隆入ALC開關(guān)雙載體從圖22可見，用BamH1/HindIII從35S-LacI-nos質(zhì)粒切出lacI-nos區(qū)，并克隆入BamH1/HindIII消化的pMSC2載體。該載體具有一個距BamH1位點5’幾個堿基的Pst1位點，所以Pst1消化取出了lacI編碼區(qū)。然后將此編碼區(qū)克隆入pst1消化的pACN載體(AlcA-cat-nos)，用lacI基因取代了AlcA基因，產(chǎn)生pALN載體(AlcA-lacI-nos)。用HindIII消化從該載體移出所述ALN區(qū)并克隆入HindIII消化的雙SRNACN(35S-AlcR-Nos-AlcA-Cat-Nos)載體，用ALN盒取代CAN。8.2.將lacI操縱基因克隆入RolC-轉(zhuǎn)化酶合成具有BamHI和Asp718限制位點的兩個寡核苷酸SC24TTGGTACCAATTGTGAGCGCTCACAATTGGATCCTTSC25AAGGATCCAATTGTGAGCGCTCACAATTGGTACCAA將各10μM的這二種寡核苷酸退火，即在存在20mM Tris.Cl(pH 8.4)50mM KCl和1.5mM MgCl2的情況下在水浴中煮沸5分鐘，然后在約1小時內(nèi)冷卻至30℃，接著在冰上靜置5分鐘。用BamH1和Asp718消化該退火的寡核苷酸，通過酚抽提和乙醇沉淀滅活所述限制酶。將所述片段連接入BamH1和Asp718切割的pUC19，產(chǎn)生pUC-lacO。通過測序確認所述質(zhì)粒。從BINAR質(zhì)粒移出OCS終止子并克隆入質(zhì)粒pUC-lacO的SalI和HindIII限制位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pUC-lacO-ocs。用EcoR1和Asp718(KpnI)插入RolC啟動子，產(chǎn)生質(zhì)粒pUC-RolC-lacO-ocs。將酵母源的轉(zhuǎn)化酶插入pUC-RolC-lacO-ocs的BamHI位點，產(chǎn)生質(zhì)粒pUC-RolC-lacO-INV-ocs。圖21顯示了該質(zhì)粒的克隆策略。8.3.連接上述二種組分產(chǎn)生最終的雙載體RolCopINVocs盒位于HindIII片段上(使用865bp RolC啟動子)，以三方式連接將其連接入HindIII消化的雙SRNAlacI，產(chǎn)生最終的構(gòu)建物35S-AlcR-nos-AlcA-lacI-nos-RolC-op-轉(zhuǎn)化酶-ocs。VII.另外的靶基于已知的參與馬鈴薯塊莖發(fā)芽的生化步驟，我們已經(jīng)鑒別了可以用于產(chǎn)生遺傳工程改造的不發(fā)芽馬鈴薯塊莖的幾個另外的靶。此外，呼吸酶或參與線粒體輸出代謝物的膜蛋白質(zhì)是有希望的。這些候選者之一就是線粒體ATP/ADP轉(zhuǎn)運蛋白和第二蘋果酸氧化戊二酸轉(zhuǎn)運蛋白。9.參與線粒體功能的基因9.1.克隆ATP/ADP轉(zhuǎn)運蛋白(ANT)和構(gòu)建嵌合反義基因基于已發(fā)表的馬鈴薯ADP/ATP轉(zhuǎn)運蛋白的序列(Emmermann等(1991)Curr.Genet.20，405-410)，設(shè)計及寡核苷酸以允許PCR擴增內(nèi)部ANT-片段(參見圖5)。使用以下PCR引物5’-ANT引物5’-AACGGATCCATGGCAGATATGAACCAGC-3’；3’ANT引物5’-TTGGATCCTTACAACACACCCGCCCAGGC-3’。為優(yōu)化后續(xù)的ANT-片段克隆入植物表達載體，在這兩個PCR引物中都包含有BamHI位點。使用從生長的馬鈴薯塊莖分離的mRNA做為逆轉(zhuǎn)錄模板。按照Logemann等的方法(1987；Anal.Biochem.，163，16-20)完成RNA分離。按照制造商說明書(Gibco，BRL)，使用M-MLV superscipt逆轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA。PCR循環(huán)(40個循環(huán))的溫度分布型如下95℃ 1分鐘、45℃ 1分鐘和72℃ 2分鐘。將擴增的DNA克隆入PCR載體pCR1000TM(Invitrogen，Norwalk，CT)。為排除PCR循環(huán)中擴增DNA的突變，使用雙脫氧法對所述克隆測序。然后將1120-bp ANT片段以反義定向克隆入植物表達盒pBINAR(Hfgen和WillmitzerPlant Sci.66，221-230(1990))。9.2.克隆線粒體氧化戊二酸轉(zhuǎn)運蛋白(MOT)使用9.1.節(jié)描述的方法分離編碼MOT的cDNA片段。圖17的RNA分析顯示，當剛好在塊莖芽下抽提RNA時，MOT mRNA表達是最高的。該區(qū)對應(yīng)于高代謝活性。基本如8.1.節(jié)用于ANT的所述方法，但是使用示于圖18的引物，通過擴增MOT片段制備反義減量調(diào)節(jié)構(gòu)建物。將BamHI/SalI PCR片段克隆入Bam/Sal切割的pBluescript SK。為排除PCR循環(huán)中擴增DNA的突變，使用雙脫氧法對所述克隆測序。從所述的pBluescript載體切出Asp718/BamHI片段并克隆入BamHI/Asp718切割的pBinAR。這產(chǎn)生了具有驅(qū)動反義定向的MOT的35S CaMV啟動子的植物轉(zhuǎn)化盒。9.3.轉(zhuǎn)化如Hfgen和Willmitzer(1988)(上述引文中的雜志)所述，完成根癌農(nóng)桿菌菌株C58ClpGV2260的直接轉(zhuǎn)化。按照Rocha-Sosa等(1989)(上述引文中的雜志)所述，進行采用農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移的馬鈴薯轉(zhuǎn)化。
在農(nóng)桿菌介導的基因轉(zhuǎn)移后，選擇70個獨立的轉(zhuǎn)化植株。10.馬鈴薯塊莖儲存期間誘導的基因10.1.分離在塊莖儲存期間誘導的基因10.1.1.差異顯示為探究在生長至發(fā)芽塊莖的轉(zhuǎn)變期間發(fā)生的分子變化，使用差異顯示技術(shù)。為此目的，從生長和儲存的馬鈴薯塊莖(Desiree)分離總RNA。在DNaseI消化后，使用M-MLV superscipt逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco，BRL)逆轉(zhuǎn)錄5μg的總RNA，產(chǎn)生單鏈cDNA模板。接著，在存在(α-35S)dATP的情況下，使用寡聚d(T)11-XN和100種不同的RAPD引物進行所制備的cDNA模板的PCR擴增。使用以下RAPD-引物導致分離源塊莖特異性cDNA片段5’-AAGCGACCTG-3’；5’-GTTGGTGGCT-3’；5’-ACGGGACCTG-3’。
PCR循環(huán)(40個循環(huán))的溫度分布型如下94℃ 30秒鐘、42℃ 1分鐘和72℃ 30秒鐘。將擴增的DNA于94℃在甲酰胺緩沖液中變性5分鐘，上樣至PAA凝膠(TBE緩沖液中6％丙烯酰胺、0.3％雙丙烯酰胺、7M尿素)。于1.75KV、130mA 3小時完成所述cDNA片段的分離。分離后，將該凝膠于80℃干燥，使用Kodak X-OMAT X膠片通過放射自顯影展示放射性標記的cDNA片段。曝光時間為2-5天。比較從生長或發(fā)芽的塊莖擴增的cDNA片段使得檢測到僅在發(fā)芽馬鈴薯塊莖中存在的cDNA片段。然后從所述PAAG洗脫發(fā)芽塊莖特異性cDNA片段，使用相應(yīng)的PCR引物再擴增。將所述再擴增的cDNA片段接著克隆入PGEMT載體(Promega)。所述擴增的cDNA片段的大小在200和450堿基對之間變化。10.1.2.塊莖儲存期間誘導的基因的RNA印跡分析為確認所分離的cDNA片段是在儲存的馬鈴薯塊莖中誘導的，分離生長的和儲存1、7、14、21、30、60、90、120、150和180天的馬鈴薯塊莖的總RNA，在1.5％含甲醛(15％v/v)的瓊脂糖凝膠上分離，并在將所述RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上之后探測相應(yīng)轉(zhuǎn)錄物的存在。如圖16所示，4個分離克隆(16-3，10-1，AC4和16-8)的轉(zhuǎn)錄物在馬鈴薯塊莖儲存期間積累。10.1.4.構(gòu)建cDNA文庫為得到編碼M-1-1、16-3、10-1、AC4和16-8的全長cDNA克隆，構(gòu)建儲存的塊莖特異性cDNA文庫。為此目的，從于室溫儲存5個月的馬鈴薯塊莖分離polyA RNA。使用Pharmacia的cDNA合成藥盒進行cDNA合成。在接頭連接后(EcoRI/NotI-接頭)，按照制造商說明書(Stratagene)將所述cDNA連接入λZAP II載體。使用Stratagene的Gigapack2II Gold包裝提取物進行體外包裝。10.1.5.分離編碼儲存的塊莖特異性cDNA克隆的cDNA克隆在擴增一級cDNA文庫后，篩選2×105Pfu(噬斑形成單位)中存在的與M-1-1、16-3、10-1、AC4和16-8 PCR片段雜交的噬菌體。在所有的情況下，分離了幾個與相應(yīng)的PCR探針雜交的獨立的噬菌體，進行分離克隆的體內(nèi)切除之后的限制分析。在四種情況下(M1-1、16-3、10-1和16-8)可以得到全長cDNA克隆。在測定完整核苷酸序列(序列2-6)和圖19之后，進行同源檢索。根據(jù)同源性，克隆16-3對應(yīng)于人、果蠅屬和酵母遍在蛋白質(zhì)羧基末端水解酶，發(fā)現(xiàn)克隆10-1與馬鈴薯ADP-核糖基化因子1(屬于GTP結(jié)合蛋白家族)相同，而克隆16-8與草莓未知功能的生長素阻抑的蛋白質(zhì)有同源性。未發(fā)現(xiàn)克隆AC4的同源性。差異表達的克隆M-1-1編碼一種我們命名為MOT的蛋白質(zhì)，我們發(fā)現(xiàn)它與牛和人線粒體2-氧化戊二酸載體蛋白有同源性。在圖20中提供了序列對比。10.1.6.所誘導克隆的核苷酸序列序列216-3(與人、果蠅屬和酵母的遍在蛋白質(zhì)羧基末端水解酶有同源性)GGGCTGCAGGAATTCGAGGCCGCTAGAGAGAGTTAAAATAGAGGAAAGGAATCCATGGCGGAAAGCACAGGCTCTAAGAAGAGATGGCTTCCTCTTGAAGCTAACCCCGATGTCATGAATCAGTTTCTTTGGGGTCTTGGTGTTCCACCGAATGAGGCCGAGTGCTGTGATGTTTATGGGTTAGATGAAGAACTTCTGGAGATGGTGCCAAAGCCAGTGCTTGCTGTTTTATTTCTCTATCCTCTCACATCTCAGAGTGAAGAAGAGAGAATAAAGCAAGACAGCGAAACAAAGGTGCAGGATCCCAGTAGTACAGTTTACTACATGAAACAAACAGTGGGAAATGCATGCGGAACAATTGGCCTTCTTCATGCTATTGGGAATATCACCTCTCAGATAAAACTTACCGAGGGTTCATTCTTGGACAAGTTCTTTAAATCAACCTCAAGCATGGACCCAATGCAGCGTGCTTTGTTCCTTGAAAATGATAGGGAAATGGAAGTTGCTCATTCAGTGGCAGCCACTGCTGGTGATACTGAGGCTACCGACGATGTGAACGCTCATTTCATCTGCTTCACCTGTGTTGATGGACAACTCTATGAACTTGATGGAAGGAGGGCTGGACCTATTACACATGGCGCATCCTCTCCAAACAGCTTATTAAAGGATGCAGCCAGAGTTATCAAAAAGATAATCGAGAAAAATCCAGACTCAATCAACTTCAACGTTATTGCTATTTCCCAAAACGTTTAGGCCAATCTAGAGGCTTTTATCGATGAGATGGTTTAAACCAATTTTAGCTTTTCATGTTTCTGCCGTTTCCAGTACTATGTTTCTTCTTGTTTGCAATAAGTTACTTTTGAGAAAAAA序列316-8(與生長素阻抑的草莓蛋白質(zhì)有同源性)TGTTCTATCCCAGCGGACGCAGAATTTCCTTTTTTATTCTTCTCTTCTTCTCCCCTAAAACGTGAGCCGATTGGCTAACCTGCACCATGAGCTTACTTGACAAGCTCTGGGACGACACCGTTGCCGGTCCCCTGCCAGATAGTGGCCTCGGGAAACTCCGGAAGTATTCTACTTTTAGTCCGCGTTCAAATTCCGGCAAGGAATCAGAAGTTTCCACACCGAGATCCTTCACCGAGGAAGCAAGTGAGGACGTGGTGAAGGTGACGAGAAGTATCATGATAGTAAAGCCTTCCGGGAGTCAGAATAGAGATTCACCTCCAGTTTCTCCGGCCGGTACTACTCCTCCGGTATCTCCTTTTGCCGGTTCCGCTGGAAGAGAAGCATTTCGGTTCCGGCGGCGATCAGCGTCATTTGCATACGAGAATGCCAGTGGGGTTGGACCCAGAAGCCCTCGTCCTCCTTACGACCTGTGAGATATAGTCGGGTTCTCTTTTTTTGTTATCCCTCTTGAGGCGGTTGAATGTAGTATAGCTAGTCGACATACTCAACATGTTCCTGGTTGAGAGTGTTGTTTTGTGTGGTGTTTAATTTGTTTGCTTAATTTTGTAAATAGTGCAAGTGGTTCTTCATCTTGCGGATGTTGTGACGAAGGTTTAGCACAAGATGTAAGCGTCCAAGTTGGTCATGTATTCTGCTTTGTATTAAAAAAAAA序列410-1(馬鈴薯的ADP-核糖基化因子1，屬于GTP結(jié)合蛋白家族)TGGACAATAGAGATCTACTGATTTCATCCTCTCTCATCGGCCGATCTTCGATTAACGGAGATGGGGCTGTCTTTCACTAAACTCTTTAGTTCGCCTCTTTGCAAGAAAGAAATGCGAATTCTTATGGTTGGTCTCGATGCTGCTGGTAAAACCACAATTCTGTACAAGCTCAAGTTGGGAGAAATTGTTACCACTATCCCAACCATTGGTTTCAATGTGGAGACTGTTGAATACAAAAACATCAGCTTTACTGTGTGGGATGTTGGTGGTCAGGACAAGATTAGACCTCTATGGAGGCACTATTTCCAGAACACACAGGGCCTCATCTTTGTGGTTGATAGCAATGACAGAGACCGTGTAGTTGAGGCAAGGGATGAGCTTCACAGGATGTTAAATGAGGATGAATTAAGAGAAGCTGTGTTGCTTGTTTTTGCGAACAAACAAGATCTTCCAAATGCAATGAATGCNNCTGAAATCACCGACAAGCTTGGCCTTCATTCTCTCAGACAACGACACTGGTATATCCAGAGTACATGTGCTACTTCTGGAGAAGGGCTATATGAGGGACTGGATTGGCTTTCAAACAACATCGCCAGCAAGGCCTAATGCAATGGTACTATGCTTCTTGTGTTGCTATATCCGGAGAAATAAACATCATTGTCTCGAGATTTTAAATATCTGTTCAGCTCACAATTCTGGGGAAGGCCTTACCCTTCTTCACTCTCTATGGTTTATGTCAAAGACCATGACATAGTTTACACATTGCTGGATGCACATTGGCAATGTAATGATATTTTAGTATAATATCTGGTTTTGAAACTTGGCGCAGCCGTGTGCACCATTTTGTTGTCCTGTGTGTCTGATGTTGCAATGGGTGTACAAAATGTAATACAGATCAATAGTAAGTATCGGA序列5AC4(無同源性)ACGGGACCTGGTCAATACTAATGTATCAGTCAACCAGCTCGAAAATCCACAAAATATAGAAGGGGAGGGAGGATCACCAAGGATAAACCATCTGAACCCAGACGACAACCTCCTTCTTCTTCTTCGATCCCTTAGGGAAGAGATACCCCGATCACCTGGATTAGGAAATAAGAGGAGCAAAATAACTTCAGAAACAGGAGGAATAAAGAGATCTAGTAAGGAGAGGGGAAGCACAAACTCTGAACCTTGGAAATGTGAAGCAGAGTAATGGTCTAACAGAGTTCACCATCGACTAGTGGAAGCACAAGCATAAGAACATCCAAAGGAGAAGGAGCTTAAGTCGGTGGTTCCAGCGACATG序列6MOT變異體GAATTCGCGGCCGCAAGAGAAAGAGAGCTGAGAAAGAATGGGTGAGAAGCCAGTATCTGGAGGTGTTTGGCCTACTGTTAAGCCATTTATTAATGGAGGTGTTTCTGGTATGCTTGCTACCTGTGTTATTCAGCCTATTGATATGATAAAGGTGAGGATACAATTGGGACAGGGATCAGCAGCTGATGTTACCAAAACCATGCTTAAAAATGAAGGCTTTGGTGCCTTTTACAAGGGTCTGTCAGCTGGGCTTCTTAGGCAGGCAACCTACACAACTGCCCGACTTGGGTCATTCAGAATTTTGACGAACAAGGCCATTGAGGCTAATGAAGGGAAGCCCTTACCTCTGTACCAAAAGGCTTTGTGTGGTCTAACTGCTGGAGCAATTGGTGCAACTGTTGGCAGTCCAGCAGATTTGGCCCTCATTCGTATGCAAGCTGATGCTACCTTGCCTTTAGCACAGAGACGCAATTACACAAATGCATTCCATGCACTCTCCCGTATTGCGGTTGATGAGGGAGTTCTAGCCCTCTGGAAAGGTGCTGGCCCAACAGTAGTAAGGGCAATGGCATTGAACATGGGTATGCTTGCCTCTTATGATCAGAGTGTGGAGTTCTTCAGGGACAACCTTGGCATGGGCGAGGCTGCTACAGTAGTAGGGGCCAGCAGTGTCTCTGGGTTCTTTGCTGCTGCTTGCAGTTTACCATTTGATTACGTCAAGACCCAGATTCAGAAAATGCAGCCAGATGCTGAAGGAAAATTGCCCTACACTGGTTCTTTCGATTGTGCCATGAAGACTTTGAAGGCAGGAGGACCCTTCAAATTTTACACTGGATTTCCAGTATATTGTATTAGGATTGCCCCTCATGTTATGATGACTTGGATTTTCCTTAACCAAATTCAGAAGGTGGAGAAGAAAATCGGATTGTGATTGTTGCAAAAAAAGATACATCCTCTCAAGTTGAGCTTTATTAGAAATAACATCTTCGCCTTGTTGTATTAGTACTGTTTTCGCTCTTTCTTTATCCTCACGCCTTCAAAGGCTTTAAGATTTTTGTGGTGATACATTGACTCGCGGAAATTTAGGGTTAGACATTTGGTCTTTTCAATATTCCTACCAATATAGTTTTGGGAAGATTACTTTATCCAAACTGATGGGAAGATTCTTTTAGCTGAATAATCTATGTACTTCAAAAACCGTCTTGAAGTAGGTAGTATGGAGTTCACCAATTTTGGTGTCATCTTGAACTTGATCTTGTTGCCTATTTTTGGATATACACTCATTTGTTAGCATCCTTCCTGGTATGAGCTATTGAGTATTATTGGAGTAAAAATGCATCCTAATGTTCTTGCTCCATTTGGATATATAGTTTTTTCATGCACCGCGGCCGCGAATTCVIII.鑒別啟動子區(qū)11.分離基因組克隆11.1篩選了Zap-表達載體(Stratagene)中的馬鈴薯Solara變種(Solanum tuberosum var.Solara)的基因組文庫(篩選了750 000個噬斑)。用差異顯示的cDNA片段做為探針。11.1.1UBL(圖23)在第三次篩選中分離了三種噬菌體，體內(nèi)制備表明其中二種是相同的，第三種沒有UBL基因的5’區(qū)。使用二種相同的噬菌體之一用于PCR方法。用讀入啟動子的寡核苷酸(GCT TTC CGC CCATGG ATT CC)對該克隆測序。從該序列，推導出另一個寡核苷酸(加入一個BamHI-位點)，并將其用于進行使用反向引物(Stratagene)的PCR。將此片段克隆入pGemT(Promega)并進行測序。將其做為BamHI片段克隆入pBI101(Jefferson等1987 EMBO 6)。產(chǎn)生了具有如前述的UBL啟動子GUS構(gòu)建物的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯系。在包括莖和葉在內(nèi)的各種組織中未觀察到可檢測的GUS活性。收獲塊莖，發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)基因系表現(xiàn)出GUS表達。11.1.2.MOT(圖24)從所述文庫分離出6個克隆。用基因特異性引物(CCA GGA GATGGG AAT GGA GAC CG)對其中兩個測序，推導出這兩個克隆的寡核苷酸。結(jié)合通用引物(Stratagene)分離MOT6和MOT3片段并克隆入pGemT。將MOT3做為BamHI片段克隆入pBI101，MOT6做為BamHI/XbaI片段。12.構(gòu)建反義/有義構(gòu)建物12.1.1.UBL-反義構(gòu)建物將BamHI(內(nèi)部限制位點bp 301)/Asp718(位于載體pBluescript中的cDNA的3-引物(Prime)端)片段克隆入pBinAR。pBinAR是pBin19的衍生物，含有35S-啟動子(Hoefgen und Willitzer 1990，Plant Sci.，66，221-230)。12.1.2.MOT-反義/有義構(gòu)建物將具有cDNA的限制位點5引物BamHI堿基對292-315和3引物SalI堿基對993-969的寡核苷酸用于PCR。將以下片段克隆入pGemT在pBinAR(有義)和pBluescript(stratagene)中的-BamHI/SalI-片段，和pBinAR(反義)中的源自pBluescript的BamHI/Asp718片段。12.1.3.16-8有義/反義構(gòu)建物使用具有限制位點5引物BamHI bp 6-29 cDNA和3引物XbaI(有義)或Asp718(反義)bp 682-662 cDNA的寡核苷酸。將片段克隆入pGemT，并從pGemT克隆入pBinAR。12.1.4.UBL-1、MOT6和MOT6啟動子序列在圖25、26和27中給出了這些啟動子的序列。
不偏離本發(fā)明的范圍的本發(fā)明的其它修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.選擇性誘導或抑制植物發(fā)芽的方法，包括通過轉(zhuǎn)化將DNA構(gòu)建物整合并最好穩(wěn)定地整合入所述植物的基因組，所述DNA構(gòu)建物包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，藉此所述第一多核苷酸序列中的DNA序列在源自所述轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)器官的休眠期間表達，導致有效地抑制發(fā)芽；所述抑制通過外部使用誘導物質(zhì)從所述可控制啟動子區(qū)誘導所述第二多核苷酸序列中的DNA序列的表達而被中和，使得所述營養(yǎng)貯藏器官發(fā)芽的恢復(fù)取決于該誘導物的使用。
2.按照權(quán)利要求1的選擇性誘導或抑制馬鈴薯發(fā)芽的方法，包括通過轉(zhuǎn)化將DNA構(gòu)建物整合并最好穩(wěn)定地整合入馬鈴薯基因組，所述DNA構(gòu)建物包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，藉此所述第一多核苷酸序列中的DNA序列在源自所述轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的塊莖的休眠期間表達，導致有效地抑制發(fā)芽；所述抑制通過外部使用誘導物質(zhì)從所述可控制啟動子區(qū)誘導所述第二多核苷酸序列中的DNA序列的表達而被中和，使得所述塊莖發(fā)芽的恢復(fù)取決于該誘導物的使用。
3.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸序列包含編碼參與蔗糖活動化和/或利用的蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.按照前述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述第一多核苷酸序列中的DNA序列包含編碼源自植物、細菌或真菌來源的無機焦磷酸酶或源自植物、細菌或真菌來源的轉(zhuǎn)化酶的DNA序列。
5.按照前述任何一項權(quán)利要求的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的DNA序列包含的DNA序列對于所述第一DNA序列是有義、反義或部分有義序列，或包含的DNA序列可以引起抑制所述第一DNA序列。
6.按照權(quán)利要求1和權(quán)利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸序列中的DNA序列包含的DNA序列對于參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或包含的DNA序列可以引起抑制參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)。
7.按照權(quán)利要求1、2和6的任何一項的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的DNA序列包含編碼參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)的DNA序列。
8.按照權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述第一多核苷酸序列中的DNA序列包含的DNA序列對于參與線粒體功能的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或包含的DNA序列可以引起抑制參與線粒體功能的蛋白質(zhì)。
9.按照權(quán)利要求1-3和8的任何一項的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的DNA序列包含編碼參與線粒體功能的蛋白質(zhì)的DNA序列。
10.按照權(quán)利要求8和9的方法，其中所述蛋白質(zhì)是MOT或ANT。
11.按照前述權(quán)利要求的任何一項的方法，其中所述組織或器官選擇性啟動子是rolC啟動子或塊莖啟動子。
12.按照前述權(quán)利要求的方法，其中所述構(gòu)建物的第二多核苷酸序列中的DNA序列在一個可控制啟動子區(qū)的控制之下，可以通過使用外源化學刺激物化學誘導該可控制啟動子區(qū)。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中該可控制啟動子區(qū)是alcA/alcR或GST或蛻皮激素開關(guān)啟動子。
14.按照權(quán)利要求1-4、6、8和10-13的任何一項的方法，其中所述第一多核苷酸序列包含再一個DNA序列，該DNA序列編碼與第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列，并且第二多核苷酸序列包含編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白的DNA序列。
15.按照權(quán)利要求14的方法，其中所述操縱基因和阻抑蛋白序列包含乳糖、四環(huán)素或λ434操縱基因/阻抑蛋白序列及其突變體。
16.包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的DNA序列編碼參與蔗糖活動化和/或利用的蛋白質(zhì)，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列對于所述蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含可以引起對所述蛋白質(zhì)的抑制的DNA序列。
17.包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含編碼參與蔗糖活動化和/或利用的蛋白質(zhì)的第一DNA序列，并且還包含編碼與所述第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白。
18.包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的DNA序列對于參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含的DNA序列可以引起抑制參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)。
19.包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含對于參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列的第一DNA序列，或者包含可以引起抑制參與馬鈴薯發(fā)芽的蛋白質(zhì)的DNA序列，還包含編碼與所述第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白。
20.包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含的DNA序列對于參與線粒體功能的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列，或者包含的DNA序列可以引起抑制參與線粒體功能的蛋白質(zhì)，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼參與線粒體功能的蛋白質(zhì)。
21.包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，其中所述第一多核苷酸序列包含對于參與線粒體功能的蛋白質(zhì)是有義、反義或部分有義序列的第一DNA序列，或者包含可以引起抑制參與線粒體功能的蛋白質(zhì)的DNA序列，還包含編碼與所述第一DNA序列可操作地連接的操縱基因序列的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含的DNA序列編碼可以與所述操縱基因序列結(jié)合的阻抑蛋白。
22.按照權(quán)利要求16-21的任何一項的DNA構(gòu)建物，其中可控制啟動子區(qū)是alcA/alcR或GST啟動子區(qū)或蛻皮激素受體開關(guān)。
23.用按照權(quán)利要求16-21或權(quán)利要求22的任何一項的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的植物細胞。
24.包含按照權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化細胞的完整植株。
25.按照權(quán)利要求24的植株的后代和這種植株和后代的種子或塊莖，所述后代包含穩(wěn)定地整合入其基因組的DNA構(gòu)建物，所述DNA構(gòu)建物包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列。
26.包含序列2、序列3、序列5和圖19中所描述序列中的至少一個的全部或部分序列的多核苷酸。
27.其編碼的蛋白質(zhì)具有與序列2、3、5或圖19編碼的蛋白質(zhì)大致相似活性的多核苷酸，該多核苷酸與當在低、高嚴格條件下或在低、高嚴格條件之間溫育時仍然與序列2、3或5或圖19中提供的序列所包含的序列雜交的多核苷酸互補。
28.按照權(quán)利要求26和27的多核苷酸，其再包含與其可操作地連接的啟動子區(qū)。
29.按照權(quán)利要求26-28的任何一項的多核苷酸，其再包含可以將所述序列的翻譯產(chǎn)物導向至細胞或亞細胞位置的序列。
30.包含按照任一前述權(quán)利要求的多核苷酸序列或DNA構(gòu)建物的載體。
31.用按照權(quán)利要求26-29的多核苷酸序列或按照權(quán)利要求30的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
32.按照權(quán)利要求31的宿主細胞，其是植物細胞。
33.由按照權(quán)利要求32的細胞衍生的完整植株及其種子、塊莖和后代。
34.源自克隆16-3、10-1、AC4、16-8、M-1-1和EMBL儲存號碼為X99853的MOT變異體的DNA序列的全部或部分在按照本發(fā)明控制植物發(fā)芽的方法中的用途。
35.cDNA序列16-3、10-1、AC4、16-8、M-1-1和EMBL儲存號碼為X99853的MOT變異體中的至少一個的全部或部分的用途，即做為基因探針，篩選基因組、cDNA和其它文庫中編碼在塊莖儲存期間誘導的蛋白質(zhì)的對應(yīng)基因組序列的基因。
36.包含多核苷酸序列的DNA構(gòu)建物，所述多核苷酸序列包含一個開關(guān)啟動子系統(tǒng)，該啟動子系統(tǒng)可操作地連接至包含有義、反義或部分有義轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的多核苷酸序列，其中當從所述開關(guān)啟動子開啟所述多核苷酸序列的表達時，產(chǎn)生所述有義、反義或部分有義序列的表達，導致編碼轉(zhuǎn)基因的再一多核苷酸序列表達的減量調(diào)節(jié)。
37.控制轉(zhuǎn)基因表達的方法，包括用二種DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化宿主細胞，所述第一種DNA構(gòu)建物包含一個可操作地連接至包含有義、反義或部分有義轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的多核苷酸序列的開關(guān)啟動子系統(tǒng)，再一種DNA構(gòu)建物包含一個編碼所述轉(zhuǎn)基因的編碼序列；控制從所述開關(guān)啟動子表達所述多核苷酸序列，使得產(chǎn)生的所述有義、反義或部分有義構(gòu)建物的表達導致所述轉(zhuǎn)基因表達的減量調(diào)節(jié)。
38.按照權(quán)利要求37的方法，其中所述DNA構(gòu)建物包含可操作地連接至包含有義、反義或部分有義轉(zhuǎn)錄構(gòu)建物的多核苷酸序列的GST或alcA/alcR開關(guān)啟動子。
39.用按照權(quán)利要求36的DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
40.按照權(quán)利要求39的宿主細胞，其是植物細胞。
41.由按照權(quán)利要求40的植物細胞衍生的完整植株和其種子、塊莖和后代。
42.鑒別可能是與除草劑相互作用的合適靶的位點的方法，包括以下步驟用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化植物，所述多核苷酸序列包含一個可以影響所述靶位點DNA表達的第一DNA序列，其中所述第一DNA序列的表達在開關(guān)啟動子的控制之下；控制從所述開關(guān)啟動子的所述DNA序列的表達，使得編碼除草劑靶位點的DNA的表達被減量調(diào)節(jié)，并且確定所述減量調(diào)節(jié)對所述植株生存力的影響。
43.增強塊莖中基因表達的方法，包括用多核苷酸序列轉(zhuǎn)化塊莖植物細胞，所述多核苷酸序列包含連接至再一啟動子區(qū)的編碼全部或部分STLS-1葉啟動子的DNA序列。
44.按照權(quán)利要求43的方法，其中將所述STLS-1葉啟動子可操作地連接至35S CaMV啟動子。
45.按照權(quán)利要求44的方法，其中該STLS-1序列位于所述35SCaMV上游。
46.源自轉(zhuǎn)基因植物的塊莖，其中所述塊莖用化學誘導物處理才發(fā)芽。
47.按照權(quán)利要求46的塊莖，其中所述轉(zhuǎn)基因植物已在其基因組中整合、最好是穩(wěn)定地整合DNA構(gòu)建物，所述DNA構(gòu)建物包含一個第一多核苷酸序列和一個第二多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列包含至少一個與組織或器官選擇性啟動子區(qū)和可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，所述第二多核苷酸序列包含至少一個與可控制的啟動子區(qū)可操作地連接并受該啟動子區(qū)控制、并可選地與轉(zhuǎn)錄終止子區(qū)可操作地連接的DNA序列，藉此所述第一多核苷酸序列中的DNA序列在源自所述轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的塊莖的休眠期間表達，導致有效地抑制發(fā)芽；所述抑制通過外部使用誘導物質(zhì)從所述可控制啟動子區(qū)誘導所述第二多核苷酸序列中的DNA序列的表達而被中和，使得所述塊莖發(fā)芽的恢復(fù)取決于該誘導物的使用。
48.源自按照權(quán)利要求46或權(quán)利要求47的轉(zhuǎn)基因植物的馬鈴薯塊莖，其用化學誘導物處理才不發(fā)芽。
49.包含圖25、26或27中所描述序列中的至少一個的全部或部分序列的多核苷酸。
50.具有與描述于圖25、26或27中的序列相同功能的多核苷酸，該多核苷酸與當在低、高嚴格條件下或在低、高嚴格條件之間溫育時仍然與圖25、26或5或27中提供的序列所包含的序列雜交的多核苷酸互補。
51.按照權(quán)利要求49或50的多核苷酸，其中該序列是塊莖特異性啟動子序列。
52.控制植物或其部分的基因表達的方法，包括用化學控制型植物基因表達盒轉(zhuǎn)化植物細胞，該表達盒具有可操作地連接至源自alcR基因的調(diào)節(jié)基因序列的第一啟動子和可操作地連接至靶基因的源自alcA基因的可控制啟動子，其中該可控制啟動子在存在乙醇蒸汽時由調(diào)節(jié)蛋白激活，由此引起所述靶基因表達。
53.大致上如同參考附圖所述的方法、DNA構(gòu)建物或多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制植物及其包括營養(yǎng)貯藏器官的部分的芽形成的方法。該方法涉及使用靶和器官特異性啟動子控制DNA序列的表達以抑制發(fā)芽。通過使用誘導型啟動子區(qū)啟動DNA序列的表達而恢復(fù)發(fā)芽,其中可以通過例如使用外源化學刺激物控制發(fā)芽。
文檔編號C12Q1/68GK1265150SQ9880761
公開日2000年8月30日 申請日期1998年7月10日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月30日
發(fā)明者I·杰普森, M·埃布尼斯, U·松尼瓦德 申請人:曾尼卡有限公司