專利名稱：核酸序列分析的制作方法
發(fā)明范圍本發(fā)明涉及測定多聚核苷酸序列的方法。
背景技術(shù)：
測定多聚核苷酸有重要的科學(xué)意義。例如，全球正在雄心勃勃地進(jìn)行的人類基因組計劃，便是為人類基因組中編碼DNA的30億個堿基進(jìn)行繪圖和測序。倘若完成，得到的序列數(shù)據(jù)庫可作為生物醫(yī)學(xué)研究空前有力的工具。成功完成該計劃的主要障礙與測序過程中使用的技術(shù)有關(guān)。
一般用于大范圍DNA測序的重要方法是鏈終止法。該方法由Sanger和Coulson提出(Sanger等人，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)1977；745463-5467)，需使用在聚合酶反應(yīng)中摻入到新生的多聚核苷酸鏈中的四種核苷三磷酸的雙脫氧衍生物。摻入后雙脫氧衍生物使聚合酶反應(yīng)終止，然后通過凝膠電泳將產(chǎn)物分離，分析特定雙脫氧衍生物在鏈中的摻入位置。
雖然該方法得到廣泛使用且結(jié)果可靠，但是此方法速度慢、工作量大而且昂貴。
EP-A-0471732提出了另一種測序方法，即通過光譜方法對核苷酸摻入到與靶鏈互補(bǔ)的新生多聚核苷酸鏈中的情況進(jìn)行檢測。該方法需使用模板和引物的固定化復(fù)合物，該復(fù)合物與僅含有不同核苷酸的一種的液體接觸。然后采用光譜技術(shù)對隨聚合酶催化的模板拷貝的延長而增強(qiáng)的時間依賴性信號進(jìn)行測量。上述光譜技術(shù)為可在倏逝波場內(nèi)測量分析物中的變化的表面等離子體共振(SPR)光譜法，和熒光測量技術(shù)。然而該方法有局限性；SPR技術(shù)最嚴(yán)重的問題在于，當(dāng)拷貝鏈的長度增加時，由于鏈的運動使信號的絕對值也超出了倏逝波場，不易檢測到增加。熒光測量技術(shù)的缺點是摻入到延長的新生多聚核苷酸鏈中的熒光團(tuán)會造成背景干擾。隨著鏈的延伸，背景“噪音”增加，檢測每個核苷酸摻入的所需時間也要增加。這就嚴(yán)重限制了該方法在大片段多聚核苷酸測序中的應(yīng)用。
因此需要多聚核苷酸測序的改進(jìn)方法，其可明顯提高對多聚核苷酸的測序速率，并優(yōu)選通過自動化過程進(jìn)行，從而降低現(xiàn)有方法的復(fù)雜性和成本。
發(fā)明概述本發(fā)明建立在以下認(rèn)識的基礎(chǔ)上，即通過測量電磁或其他輻射，可以檢測核苷酸摻入到新生多聚核苷酸鏈中時聚合酶發(fā)生的構(gòu)象和/或質(zhì)量變化。
根據(jù)本發(fā)明，對多聚核苷酸測序的方法包括步驟(i)在聚合酶反應(yīng)足以進(jìn)行的條件下，使靶多聚核苷酸與固定在固體支持物上的聚合酶及不同的核苷酸進(jìn)行反應(yīng)；和(ii)通過測量輻射來檢測與靶多聚核苷酸互補(bǔ)的特定核苷酸的摻入。
可用多種技術(shù)測量樣品的輻射，包括表面敏感的檢測技術(shù)，其中用固體光學(xué)表面的光反應(yīng)的變化表示在該表面的結(jié)合作用。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，采用的技術(shù)為瞬間波光譜法，尤其是表面等離子體共振(SPR)光譜法。
在本發(fā)明的一實施方案中，本方法采用的核苷酸包括在3’端任選在5’端，有防止該核苷酸摻入到多聚核苷酸鏈中的封閉基團(tuán)，但可將封閉基團(tuán)選擇性地切除以允許進(jìn)一步進(jìn)行摻入。通過使用封閉的核苷酸，本方法可在任何時間內(nèi)用反應(yīng)中存在的全部核苷酸進(jìn)行反應(yīng)。以確保每個已摻入的核苷酸可被檢測的方式選擇性切除封閉基團(tuán)。因此本方法可以在“實時”的基礎(chǔ)上進(jìn)行，以實現(xiàn)快速序列分析。
附圖描述通過舉例的方式來描述本發(fā)明，僅參考下列附圖，其中

圖1是采用SPR光譜法進(jìn)行多聚核苷酸序列分析的圖解性說明；和圖2表示每種不同的核苷酸聚合時檢測到的不同反應(yīng)信號。
圖3表示雙封閉核苷酸的合成步驟。
發(fā)明描述用于測定多聚核苷酸序列的本方法包括對聚合酶、靶多聚核苷酸和互補(bǔ)核苷酸之間的動力學(xué)相互作用的分析。通過監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)行時造成的電磁或其他輻射的變化或吸收，來測量這種動力學(xué)相互作用。
此處使用的術(shù)語“多聚核苷酸”廣義上講，包括DNA和RNA，包括修飾的DNA和RNA，也包括其他雜交的核酸樣分子如肽核酸(PNA)。
一般地，通過采用電磁輻射、使用表面等離子體共振或核磁共振技術(shù)來實施本方法。也可考慮測量輻射變化的其他技術(shù)，例如通過全內(nèi)反射熒光(TIRF)、衰減全反射(ATR)、破壞全反射(FTR)、Brewster角反射光度法、散射全內(nèi)反射(STIR)或倏逝波橢圓偏振測量術(shù)進(jìn)行光譜分析。
除了需要電磁輻射的技術(shù)外，也可考慮其他技術(shù)，尤其是光化學(xué)技術(shù)如化學(xué)發(fā)光法，和包括共振系統(tǒng)如表面聲波(SAW)技術(shù)和石英晶體微量秤(QCM)技術(shù)在內(nèi)的比重測量技術(shù)。
一種優(yōu)選方法是表面等離子體共振(SPR)光譜法，其通過檢測溶液的體相與倏逝波域之間折射指數(shù)的差異對溶液性質(zhì)進(jìn)行測量。入射的單色光以一定角度自對側(cè)的固體光學(xué)(傳感器芯片)表面反射到待測樣品。該光進(jìn)入樣本中很短的一段距離，并受表面相互作用的影響。
合適的傳感器芯片在本領(lǐng)域已知。一般地，其包括光學(xué)透明材料如玻璃，和反射薄片如銀片或金片。SPR光譜法綜述見歐洲專利公開文本0648328(在此全部引入供參考)。
另一優(yōu)選方法是核磁共振(NMR)光譜法，測量化合物的磁性。通過施加磁場和射頻輻射的結(jié)合使化合物的核能量定向。當(dāng)施加給核的能量與自旋狀態(tài)之間的能差(與施加的場的方向平行或反平行取向之間的差別)相同時，即達(dá)到所謂的共振狀態(tài)。通過射頻接收器檢測與自旋狀態(tài)的變化有關(guān)的能量的吸收和隨后的發(fā)射。
本發(fā)明方法的一個重要方面是對固定在固體支持物上的聚合酶的使用。固定該酶為本方法獲得成功提供了幾點優(yōu)勢。首先，大大減少了測量可溶性分子中的能量吸收時出現(xiàn)的隨機(jī)“噪音”問題。其次，由于聚合酶可維持在相對于測量區(qū)域的特定限制范圍內(nèi)，減少了由任何無直接關(guān)系的底物(如核苷酸)與聚合酶作用而產(chǎn)生的噪音問題。這在用來測量輻射變化的技術(shù)需要測量熒光時尤為重要，如在TIRF中，其中背景熒光會隨新生鏈的延伸而增加。還有，使用SPR光譜法時，是在倏逝波場內(nèi)維持聚合酶反應(yīng)，因此不論多聚核苷酸的長度如何均可進(jìn)行準(zhǔn)確測量。最后，由于靶多聚核苷酸和寡聚核苷酸引物均非不可逆地與固體表面結(jié)合，更新該表面便變得相對簡單，從而可用同樣的固定化聚合酶進(jìn)行更多的測序反應(yīng)。
可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行固定。具體地，可用標(biāo)準(zhǔn)的胺偶合方法進(jìn)行固定，使連有配基的胺與，如，葡聚糖或N-羥基琥珀酰亞胺酯-活化的表面結(jié)合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，將聚合酶固定在維持該酶和傳感器表面緊密相連的SPR傳感器芯片表面上，該表面可測量折射指數(shù)的變化。將生物分子固定到光學(xué)傳感器上的方法示例見EP-A-0589867，和Lofas等人，生物傳感器與生物電子(Biosens.Bioelectron.)(1995)10813-822。
本發(fā)明使用的聚合酶可以是任何已知類型。例如，聚合酶可以是任何DNA依賴的DNA聚合酶。如果靶多聚核苷酸是RNA分子，則聚合酶可以是RNA依賴的DNA聚合酶，即逆轉(zhuǎn)錄酶，或RNA依賴的RNA聚合酶，即RNA復(fù)制酶。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚合酶為Taq聚合酶。在本發(fā)明更優(yōu)選的實施方案中，聚合酶是大腸桿菌(E.Coli)III型聚合酶全酶(McHenry，生物化學(xué)綜述年刊(Ann.Rev.Biochem.)1988；57519)、T7聚合酶(Schwager等人，分子與細(xì)胞生物學(xué)方法(Methods in Molecular and Celular Biology)(1989/90)；卷1(4)155-159)、或復(fù)合有大腸桿菌硫氧還蛋白的T7噬菌體基因5聚合酶(Tabor等人，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)(1987)；2621612-1623)。每種聚合酶都能以高忠實度與靶多聚核苷酸發(fā)生結(jié)合，并因此甚至在未發(fā)生有效聚合的時候維持聚合酶-多聚核苷酸復(fù)合物。
III型聚合酶全酶包括可產(chǎn)生加工酶的三個亞組(I)核心聚合酶，包括聚合酶α亞基；(II)β-二聚體亞基，其作為圍繞DNA的手鐲樣結(jié)構(gòu)；和(III)含有τ和γ亞基的亞組，可結(jié)合并水解ATP以形成圍繞DNA的β-二聚體。
作為測序過程的第一步，可使靶多聚核苷酸與合適的引物在雜交/聚合緩沖液進(jìn)行作用。一般地，緩沖液的溫度應(yīng)足夠高以破壞(或融解)靶多聚核苷酸中存在的任何二級結(jié)構(gòu)。冷卻時，引物與靶互補(bǔ)序列退火。再將該樣品與固定化的聚合酶進(jìn)行作用，以形成靶多聚核苷酸/聚合酶復(fù)合物。
在本發(fā)明的一個實施方案中，控制核苷酸的添加，使不同的核苷酸順序加入聚合酶/靶復(fù)合物。例如，添加dGTP使之流過聚合酶/多聚核苷酸復(fù)合物；然后檢測任何摻入情況。未結(jié)合的dGTP流出反應(yīng)位點，再導(dǎo)入另一種核苷酸。以這種方式，動力學(xué)相互作用的檢測可與其時出現(xiàn)的特定核苷酸有關(guān)，然后可以確定多聚核苷酸的序列。
不同的核苷酸同時存在時也可以實施本方法。為成功實施之，需要至少在核苷酸的3’位置導(dǎo)入一個封閉基團(tuán)，但優(yōu)選在3’和5’端均導(dǎo)入。封閉基團(tuán)可以是光敏的，能用一定波長的光去除從而得到活性分子。若核苷酸的3’和5’端都摻入了封閉基團(tuán)，則應(yīng)能基于光譜吸收度對封閉基團(tuán)加以區(qū)分，即應(yīng)可通過使用特定波長的光選擇性去除一種封閉基團(tuán)而不影響其他封閉基團(tuán)。也希望去除3’端封閉基團(tuán)所需的光照時間比去除5’端封閉基團(tuán)長。這樣，封閉基團(tuán)可通過光譜和時間的方式得以區(qū)分。
一般地，光敏性封閉基團(tuán)在200nm到450nm波長范圍發(fā)生光裂解。封閉基團(tuán)一般衍生自分子式為R1-[O-CO-]X的化合物，其中R1是光不穩(wěn)定基團(tuán)，X是離去基團(tuán)。例如R1是鄰硝基芐基。特別優(yōu)選的封閉基團(tuán)包括WO-A-92/10092與WO-A-97/39151中描述的鄰硝基芐基保護(hù)基。這些基團(tuán)包括硝基藜蘆基氧羰基(NVOC)、硝基胡椒基氧羰基(NPOC)、α-甲基-硝基藜蘆基氧羰基(MeNVOC)、α-甲基-硝基胡椒基氧羰基(MeNPOC)和1-芘基甲基氧羰基(PYMOC)。
合適的3’封閉基團(tuán)為(4，5-二甲氧基-2-硝基芐基)氧羰基，其可通過核苷酸與式(I)的化合物反應(yīng)形成
其中R是任何合適的酯化基，如甲基?？捎?60nm波長的光脈沖選擇性去除該封閉基團(tuán)。
5’端合適的封閉基團(tuán)是1-(2-硝基苯)乙基(II)
其中是R是任何合適的官能團(tuán)，如鹵素?？捎?60nm波長選擇性去除該封閉基團(tuán)。
例如，將雙封閉的核苷酸注射到含有引物的多聚核苷酸上(已與高忠實度聚合酶復(fù)合物相結(jié)合)，在足以從每一核苷酸末端磷酸釋放封閉基團(tuán)的波長下使單色光聚焦到聚合酶的上游。將核苷酸流至結(jié)合的聚合酶上，摻入到新生的多聚核苷酸鏈中。然而，由于3’端的封閉基團(tuán)仍處于結(jié)合狀態(tài)，只能摻入一種核苷酸。對這種動力學(xué)相互作用進(jìn)行測量可得知摻入到新生鏈中的特定核苷酸的信息。使用的聚合酶應(yīng)為在反應(yīng)終止時不易從靶上解離的高忠實度聚合酶。另外，可使用競爭性抑制劑防止聚合酶從靶上解離。
測量完摻入的核苷酸后，將單色光脈沖聚焦到聚合酶催化位點內(nèi)的封閉基團(tuán)上，以去除3’端的封閉基團(tuán)。單色光脈沖時間可比去除5’端所需時間長，這樣僅僅與聚合酶復(fù)合物中的核苷酸連接的封閉基團(tuán)得以去除。這就減少了未與聚合酶復(fù)合物連接的核苷酸摻入的可能性。
一旦釋放3’端的封閉基團(tuán)，另一核苷酸到達(dá)聚合酶反應(yīng)位點時可以繼續(xù)聚合酶反應(yīng)。通過改變?nèi)コ忾]基團(tuán)所需的光脈沖防止自由聚合。
盡管優(yōu)選使用雙封閉核苷酸，如上所述，也可使用僅在3’端帶有封閉基團(tuán)的核苷酸實施本方法。這種情況下，要用聚合酶的競爭性抑制劑來減少3’端沒有封閉基團(tuán)的核苷酸摻入到新生鏈中的可能性。合適的聚合酶的競爭性抑制劑是羰基二膦酸酯(COMDP)。
參照附圖，用下述實施例說明本發(fā)明。實施例在改進(jìn)的BIAcore2000系統(tǒng)(BIAcoreAB，Uppsala，瑞典)上進(jìn)行以下分析，該系統(tǒng)以CM5傳感器芯片(研究級，BIAcoreAB)作為光學(xué)傳感器表面。該儀器帶有完整的μm-流體筒(IFC)，可以通過一次樣品注射在4個槽內(nèi)進(jìn)行分析。聚合酶的制備按照如所述方法(Millard等人，酶學(xué)方法(Methods Enzymol.)(1995)；26222)在纈氨酰-瓊脂糖上通過疏水相互作用色譜法制備大腸桿菌III型聚合酶全酶，并在高鹽濃度下純化。純化后，用Kirkcgaard等人在生物化學(xué)分析(Anal.Biochem.)(1972)；50122中所述的離子-過濾技術(shù)濃縮該酶。聚合酶的固定按照(Jonsson等人，生物技術(shù)(Biotechniques)(1991)；11620-627)所述，將聚合酶固定到傳感器芯片表面。簡言之，用Hepes緩沖液(10mMHepes、150mM氯化鈉、0.05％表面活性劑P20(BIAcoreAB，Uppsala，瑞典)、pH7.4)使傳感器芯片的環(huán)境平衡。將等體積的N-羥基琥珀酰亞胺(0.1M水溶液)和N-乙基-n’-(二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)(0.1M水溶液)混合，注射入芯片表面(CM5)使羧甲基化葡聚糖活化。將III型聚合酶核心亞組(160μl，500U)與10mM乙酸鈉(100μl，pH5)混合，注射入活化表面。最后，使傳感器芯片表面殘余的N-羥基琥珀酰亞胺酯與乙醇胺(35μl，1M水溶液，pH8.5)反應(yīng)，洗去表面上未結(jié)合的聚合酶。在25℃下用連續(xù)流動的Hepes緩沖液(5μl/分鐘)進(jìn)行固定。寡聚核苷酸采用標(biāo)準(zhǔn)的氨基亞磷酸酯(Phosphoramidity)化學(xué)法合成寡聚核苷酸。把序列為SEQ ID No.1的寡聚核苷酸用作靶多聚核苷酸，序列為SEQ ID No.2的寡聚核苷酸用作引物。
CAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGACGAGAGAAGGGAGAG SEQ ID No.1CTCTCCCTTCTCTCGTCSEQ ID No.2在雜交條件下使兩寡聚核苷酸反應(yīng)形成靶-引物復(fù)合物。
再將帶有引物的DNA懸浮于緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.5、8mM氯化鎂、4％(v/v)甘油、5mM二硫蘇糖醇(DDT)、40μg牛血清白蛋白)中，該緩沖液含21μg ssDNA結(jié)合蛋白和形成手鐲樣結(jié)構(gòu)所需的DNA聚合酶III亞組(1.6pmol-β-二聚體和195fmolγ亞基)。還有0.5mMATP和60μM羰基二膦酸酯(COMDP)。在此反應(yīng)中，γ亞基作為分子媒體水解ATP，使β-二聚體亞基移到DNA上形成聚合酶亞組(Studwell等人，UCLA Symp.Mol.Cell.Biol.New Ser.1990；127153)。
將帶引物的DNA/亞組復(fù)合物以5μm/分鐘的流速注射到傳感器芯片表面的III型聚合酶上，并通過γ亞基的作用與聚合酶結(jié)合。
在本實驗中，需要鎂和ATP使聚合酶III與帶引物的DNA結(jié)合。但是鎂也可通過核驗性3’→5’核酸外切酶活性促使引物被切除。通過納入聚合酶活性的競爭性抑制劑羰基二膦酸酯可克服此問題(也可使用缺乏3’→5’核酸外切酶活性的III型聚合酶避免此具體問題)。
在芯片表面保持60μM羰基二膦酸酯的連續(xù)流動，防止核酸外切酶活性將引物從靶DNA上切除。摻入兩個封閉基團(tuán)的核苷酸如圖3所示，每個核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和dATP)在5’端含有1-(2-硝基苯基)乙基封閉基團(tuán)，3’端含有(4，5-二甲氧基-2-硝基芐基)氧羰基封閉基團(tuán)。雙封閉核苷酸的合成如下階段1(4，5-二甲氧基-硝基芐基)氧羰基核苷三磷酸的合成。
全部同樣的方法應(yīng)用于dGTP、dCTP、dTTP。室溫下在15mlDMSO中將dATP二水合物(0.4mmol)與約3mmol的4，5-二甲氧基-2-硝基苯基重氮甲烷混合液避光攪拌40小時，后者由900mg(4mmol)的4，5-二甲氧基-2-硝基苯腙新鮮制備而來(通過按照Wootton與Trentham，生物化學(xué)中的光化學(xué)探針(Photochemical Probes inBiochemistry)(Nielsen，P.E.，編)NATO ASI Ser.C，272卷，277-296頁(1989)中的方法通過用肼單水合物氯仿溶液處理藜蘆醛而合成)。通過氯仿/甲醇(5∶1v/v)溶劑系統(tǒng)中的TLC來監(jiān)視反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)有Rf為0.54的點與籠閉核苷酸對應(yīng)。通過60ml乙醚反復(fù)提取來去除DMSO、未反應(yīng)的重氮化合物和低極性的反應(yīng)產(chǎn)物。將含有未反應(yīng)的核苷酸和所需產(chǎn)物及其他物質(zhì)的剩余物質(zhì)溶于最小量的氯仿中，并在硅膠柱(3×30cm)上用快速色譜法分離。用100％氯仿和甲醇/氯仿(95∶5v/v)洗脫去掉柱上的4，5-二甲氧基-2-硝基苯基重氮甲烷疏水性副產(chǎn)物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥級分。再凍干78mg籠閉產(chǎn)物?？偖a(chǎn)率為45％。用制備性反相HPLC從粗品中直接分離出純度更高的3’封閉的4，5-二甲氧基-2-硝基芐基氧羰基dATP。階段25’1-(2-硝基苯基)乙基基團(tuán)至3’4，5-二甲氧基-2-硝基芐基氧羰基封閉的dATP的添加。
室溫下在15ml DMSO中將4，5-二甲氧基-2-硝基芐基氧羰基5’dATP(0.4mmol)與約3mmol的1-(2-硝基苯基)重氮乙烷混合液避光攪拌40小時，后者由716.7mg(4mmol)2-硝基苯乙酮的腙與2.9g(30mmol)MnO2(90％)在20ml氯仿中按照Walker等人的方法新鮮制備而來(Walker等人，酶學(xué)方法1989；172288-301)，其中所述的腙通過用水合肼乙醇溶液處理2-硝基苯乙酮而合成。通過氯仿/甲醇(5∶1v/v)溶劑系統(tǒng)中的TLC來監(jiān)視反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)Rf為0.68和0.58的一對點，分別與4，5-二甲氧基-2-硝基芐基氧羰基5’dATP的1-(2-硝基苯基)乙酯平伏式的兩個非對映異構(gòu)體和軸向非對映異構(gòu)體相對應(yīng)。用50ml乙醚反復(fù)提取來去除DMSO、未反應(yīng)的重氮化合物和低極性的反應(yīng)產(chǎn)物。
將含有未反應(yīng)的4，5-二甲氧基-2-硝基芐基氧羰基5’dATP和所需的雙封閉dATP及其他物質(zhì)的剩余物質(zhì)溶于最小量的氯仿中，并在3×30cm硅膠柱上用快速色譜法分離。用100％氯仿洗脫去掉柱上的1-(2-硝基苯基)重氮乙烷疏水性副產(chǎn)物。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上干燥產(chǎn)物。凍干得到74mg籠閉化合物?？偖a(chǎn)率為57％。
聚合酶反應(yīng)緩沖液(1mMTris-HCl pH8.8，5mM氯化鉀，0.15mM氯化鎂，0.01％(w/v)明膠)中每種核苷酸為0.2mM。DNA測序圖1表示SPR傳感系統(tǒng)和流體槽(7)，帶有施加電磁輻射(1)至在傳感器表面帶有固定化的聚合酶(3)的傳感器芯片(2)上裝置，并帶有使不同的核苷酸進(jìn)入槽內(nèi)的入口(4)和使脈沖單色光進(jìn)入槽內(nèi)的兩個聚焦部件(5)和(6)。
在25℃和10Hz的數(shù)據(jù)收集速度下，使不同的核苷酸以30μl/分鐘的流速進(jìn)入流體槽(7)。當(dāng)核苷酸經(jīng)過聚焦部件(5)時，發(fā)射波長為260nm的單色光脈沖去除5’端的封閉基團(tuán)。核苷酸然后流到傳感器芯片(2)上，與該處被β-二聚體亞基固定的靶多聚核苷酸/聚合酶復(fù)合物接觸。由于引物序列的3’端可以自由反應(yīng)，核苷酸摻入到靶多聚核苷酸上的互補(bǔ)體時可發(fā)生聚合。再通過SPR設(shè)備中的p-極化的單色光檢測該摻入。因為已摻入的核苷酸在3’端帶有封閉基團(tuán)，不會發(fā)生進(jìn)一步的聚合。再在聚合位點通過聚焦部件(6)發(fā)射波長為360nm的單色光脈沖。流體槽內(nèi)的高流速可確保未結(jié)合聚合酶的核苷酸在吸收足夠能量以釋放其3’端封閉基團(tuán)之前從槽內(nèi)流出。
一旦3’端的封閉基團(tuán)從聚合的核苷酸中釋放出來，可以發(fā)生進(jìn)一步聚合。
圖2表示測序?qū)嶒炛袚饺氲酱郎y新生鏈中的每一核苷酸的結(jié)果。結(jié)果表明其順序與SEQ ID No.1中的序列互補(bǔ)。
權(quán)利要求
1.一種多聚核苷酸的測序方法，包括步驟(i)在聚合酶反應(yīng)足以進(jìn)行的條件下，使靶多聚核苷酸與固定在固體支持物上的聚合酶及不同的核苷酸進(jìn)行反應(yīng)；和(ii)檢測與靶多聚核苷酸互補(bǔ)的特定核苷酸摻入后的作用結(jié)果。
2.權(quán)利要求1的方法，其中通過測量輻射來檢測步驟(ii)的作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中輪流使用每種不同的核苷酸來進(jìn)行步驟(i)和(ii)，直到摻入得以檢測，然后重復(fù)上述步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中在所有核苷酸均存在的情況下進(jìn)行步驟(i)。
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的方法，其中核苷酸包括聚合酶反應(yīng)后被去除的3’封閉基團(tuán)。
6.權(quán)利要求5的方法，其中可通過脈沖單色光選擇性去除封閉基團(tuán)。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中核苷酸包括三磷酸鏈的末端磷酸基上的另一封閉基團(tuán)，該封閉基團(tuán)在3’封閉基團(tuán)去除前被去除。
8.權(quán)利要求7的方法，其中上述另一封閉基團(tuán)可在與去除3’封閉基團(tuán)所需條件不同的條件下通過脈沖單色光選擇性去除。
9.權(quán)利要求8的方法，其中上述另一封閉基團(tuán)通過使用與去除3’封閉基團(tuán)所需持續(xù)時間不同的脈沖單色光去除。
10.任一前述權(quán)利要求的方法，其中步驟(i)還包括導(dǎo)入聚合酶的競爭性抑制劑。
11.任一前述權(quán)利要求的方法，其中步驟(i)的靶多聚核苷酸通過β2二聚體復(fù)合物結(jié)合到聚合酶上。
12.任一前述權(quán)利要求的方法，其中聚合酶為大腸桿菌DNA聚合酶III或T7聚合酶。
13.權(quán)利要求1到11中任一項的方法，其中聚合酶為Taq聚合酶。
14.權(quán)利要求1到11中任一項的方法，其中聚合酶為逆轉(zhuǎn)錄酶。
15.任一前述權(quán)利要求的方法，其中步驟(ii)包括在一段時間內(nèi)對共振信號變化的檢測。
16.任一前述權(quán)利要求的方法，其中輻射為電磁輻射。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中電磁輻射在紅外光譜范圍內(nèi)。
18.任一前述權(quán)利要求的方法，其中步驟(ii)包括使用表面等離子體共振。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中電磁輻射在射頻光譜范圍內(nèi)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中采用NMR檢測核苷酸的摻入。
21.任一前述權(quán)利要求的方法，其中多聚核苷酸為DNA。
22.一種上面固定有聚合酶的傳感器芯片。
23.一種3’端和三磷酸鏈的末端磷酸基帶有封閉基團(tuán)的核苷酸，其中可通過不同波長的單色光去除這兩種封閉基團(tuán)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的核苷酸，其中封閉基團(tuán)衍生自式R1-[O-CO-]X的化合物，其中R1是光不穩(wěn)定基團(tuán)，X是離去基團(tuán)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的核苷酸，其中3’端的封閉基團(tuán)是鄰硝基芐基氧羰基。
26.根據(jù)權(quán)利要求23到25任一項的核苷酸，其中末端磷酸的封閉基團(tuán)是鄰硝基芐基。
27.根據(jù)權(quán)利要求23到26任一項的核苷酸，其中3’端的封閉基團(tuán)是(4，5-二甲氧基-2-硝基芐基)氧羰基。
28.根據(jù)權(quán)利要求23到27任一項的核苷酸，其中末端磷酸的封閉基團(tuán)是1-(2-硝基苯基)乙基。
29.一種多聚核苷酸的測序裝置，包括光學(xué)傳感器芯片、光源、成像設(shè)備和光檢測器，其中傳感器芯片如權(quán)利要求22所限定。
全文摘要
本發(fā)明涉及測定多聚核苷酸序列的方法,該方法包括步驟:(i)在聚合酶反應(yīng)足以進(jìn)行的條件下,使靶多聚核苷酸與固定在固體支持物上的聚合酶及不同的核苷酸進(jìn)行反應(yīng);和(ii)通過測量輻射來檢測與靶多聚核苷酸互補(bǔ)的特定核苷酸的摻入。
文檔編號C12N15/09GK1265158SQ9880762
公開日2000年8月30日 申請日期1998年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月28日
發(fā)明者D·H·登斯哈姆 申請人:醫(yī)療生物系統(tǒng)有限公司