Angpt2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明首次證實(shí)在小鼠CCM3模型和人的CCM3腦血管組織中，發(fā)現(xiàn)ANGPT2顯著上調(diào)，在小鼠CCM3敲除模型中應(yīng)用ANGPT2中和抗體能夠顯著改善因血管滲漏導(dǎo)致的腦出血情況，并顯著降低血管畸形病灶數(shù)目。由此可見，ANGPT2在血管發(fā)生異常的疾病發(fā)病中起重要調(diào)控作用，應(yīng)用ANGPT2中和抗體等抑制劑，能夠?yàn)橹苽溲馨l(fā)生異常疾病相關(guān)的藥物提供依據(jù)。
【專利說明】
ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腦海綿狀血管畸形(cerebral carvernous malformat1n，CCM)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種血管錯(cuò)構(gòu)畸形，是先天性腦血管畸形的一種，約占腦血管畸形的10%?20%，人群患病率約0.1%?4%。
[0003]CCM由缺乏肌層和彈性纖維的大小不等的海綿狀血管竇組成，團(tuán)狀毛細(xì)血管擴(kuò)張，內(nèi)壁為單層扁平的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)，缺乏周細(xì)胞(pericyte，PCs)覆蓋，無正常的血管基膜。由于血管內(nèi)皮屏障發(fā)生改變，導(dǎo)致血管通透性增高，紅細(xì)胞外滲，并繼發(fā)腦實(shí)質(zhì)炎癥反應(yīng)，從而顯著增加中風(fēng)、癲癇、神經(jīng)功能缺失的風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]CCM分為散發(fā)性和常染色體顯性遺傳，遺傳性CCM與3個(gè)致病基因種系突變相關(guān)，包?CCMl(KRITl,7qll.2-q21)^CCM2(MGC4607^7pl5-pl3)^PCCM3(CCM3^3q25.2-q27)o90%l^上的CCM病人攜帶這3個(gè)致病基因的突變。近十幾年來，3個(gè)CCM致病基因種系突變的研究報(bào)道非常多。由于CCM病灶組織內(nèi)體細(xì)胞基因突變的發(fā)現(xiàn)提出了“二次打擊”機(jī)制(two-hitmechanism)學(xué)說，認(rèn)為其參與了腦海綿狀血管瘤的發(fā)病機(jī)制，導(dǎo)致表達(dá)于腦海綿狀血管瘤毛細(xì)血管腔內(nèi)皮細(xì)胞的致病基因編碼蛋白完全失去功能。這種學(xué)說最近已經(jīng)在小鼠動(dòng)物模型中被證實(shí)。出生后特異的內(nèi)皮細(xì)胞Ccm基因的失活，會(huì)導(dǎo)致大腦出現(xiàn)CCM樣的損傷。雖然CCM發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但分子遺傳學(xué)研究為我們深入理解CCM的發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供了重要依據(jù)。鑒于目前缺乏有效的治療藥物，手術(shù)切除是CCM的唯一治療手段，因此，研究CCM的發(fā)病機(jī)制和尋找新的有效藥物或治療方法是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。
[0005]血管生成素(ang1poietin)是內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促血管生成因子，在血管生成中起到重要作用。血管生成素家族有4種亞型，分別為Ang-1，Ang-2，Ang-3，Ang-4.Ang-1為由498個(gè)氨基酸組成的同源六聚體，基因位于8q22，主要由血管內(nèi)皮周圍細(xì)胞(如周細(xì)胞)分泌，廣泛分布于胚胎及富含血管的成熟組織中，如子宮內(nèi)膜、卵巢、肺、皮膚等。Ang-2基因位于8q23，是由496個(gè)氨基酸組成的同源二聚體，主要由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，分布于胚胎及血管重塑明顯的成熟器官，如胎盤、子宮、卵巢等。Tie 2是血管生成素家族的共同受體，Ang-1可與Tie 2受體特異性結(jié)合使其磷酸化，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞間及和周圍支持細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)微血管結(jié)構(gòu)的成熟和穩(wěn)定，降低血管通透性。Ang-2(又簡稱ANGPT2)通過競爭阻斷Ang-1與Tie 2受體結(jié)合，抑制Tie 2受體磷酸化，減弱內(nèi)皮細(xì)胞與周圍支持細(xì)胞及基質(zhì)間的相互作用，解除血管基底膜和周圍細(xì)胞對血管結(jié)構(gòu)的限制，松解血管結(jié)構(gòu)，促使內(nèi)皮細(xì)胞分離和迀移，導(dǎo)致血管的穩(wěn)定性降低，通透性增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供了ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ANGPT2在血管發(fā)生異常的疾病發(fā)病中起重要調(diào)控作用，應(yīng)用ANGPT2中和抗體等ANGPT2抑制劑，能夠?yàn)橹苽銫CM及其他血管瘤疾病藥物提供依據(jù)。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用，所述ANGPT2抑制劑通過降低ANGPT2蛋白水平來治療血管瘤，所述血管瘤以單層擴(kuò)張的血管內(nèi)皮細(xì)胞和減少的周細(xì)胞覆蓋為特征。
[0008]作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述血管瘤為腦海綿狀血管瘤，所述血管內(nèi)皮細(xì)胞為腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。
[0009]作為對上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述腦海綿狀血管瘤由CCM3基因的功能缺失引發(fā)。
[0010]作為對上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述ANGPT2抑制劑為ANGPT2中和抗體。
[0011]作為對上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述ANGPT2中和抗體為單克隆抗體。
[0012]作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述ANGPT2中和抗體的用量為10yg/g體重。
[0013]作為對上述技術(shù)方案的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述ANGPT2中和抗體隔天腹腔注射。
[0014]作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述藥物通過穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞連接、血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的相互作用和血管的完整性來抑制血管瘤損害。
[0015]作為對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體。
[0016]本發(fā)明建立了他莫昔芬誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞特定Ccm3基因敲除的CCM3小鼠動(dòng)物模型(Ccm3-1ecK0);通過實(shí)時(shí)全內(nèi)反射熒光顯微鏡，觀察Ccm3-1ecK0小鼠腦微血管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)CCM樣改變，內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞松解，縫隙連接被破壞，血管通透性增加；同時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞分泌ANGPT2增加。進(jìn)一步，通過ANGPT2中和抗體，挽救內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除CCM3引起的腦血管病變，病灶數(shù)目減少。
[0017]發(fā)明人還在人的CCM標(biāo)本中，證實(shí)了ANGPT2在正常腦組織區(qū)域不表達(dá)，但是在CCM損傷區(qū)域顯著上調(diào)。
[0018]因此，可以利用ANGPT2中和抗體，制備出治療CCM及其他血管畸形(即血管瘤)疾病藥物。
[0019 ]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為:
[0020]本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次證實(shí)在小鼠CCM3模型和人的CCM3腦血管組織中，發(fā)現(xiàn)ANGPT2顯著上調(diào)，在小鼠CCM3敲除模型中應(yīng)用ANGPT2中和抗體能夠顯著改善因血管滲漏導(dǎo)致的腦出血情況，并顯著降低血管畸形病灶數(shù)目。由此可見，ANGPT2在血管發(fā)生異常的疾病發(fā)病中起重要調(diào)控作用，應(yīng)用ANGPT2中和抗體等抑制劑，能夠?yàn)橹苽溲馨l(fā)生異常疾病相關(guān)的藥物提供依據(jù)。
【附圖說明】
[0021 ]圖1顯示了誘導(dǎo)型的內(nèi)皮細(xì)胞特異性CCM3敲除的小鼠快速出現(xiàn)腦和視網(wǎng)膜CCM病變表型;野生型(WT)和誘導(dǎo)型的內(nèi)皮細(xì)胞特異性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，在P2-P10天取腦組織進(jìn)行檢測；其中，A顯示了P2，P5，PlO天的WT和Ccm3-1ecKO小鼠腦組織切片HE染色結(jié)果;B顯示了 P2，P5，PlO天的WT和Ccm3_iecK0小鼠腦組織總CCM病灶數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C顯示了 P2，P5，PlO天Ccm3-1ecK0小鼠腦組織CCM不同大小病灶數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果；圖D-G顯示了CCM病變部位血管滲漏，其中:D為PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠新鮮腦組織;E-G:P10天的小鼠用FITC-葡聚糖灌注后進(jìn)行免疫熒光檢測，E為腦組織熒光圖，箭頭指示血管滲漏，F(xiàn)為⑶31染色圖，箭頭表示正常腦組織結(jié)構(gòu)，星號*顯示CCM病灶，G伊文思藍(lán)白蛋白檢測評價(jià)小鼠血腦屏障滲透性；圖H-J顯示了Ccm3-1ecKO小鼠視網(wǎng)膜病變，對PlO天的WT和Ccm3-1ecKO小鼠視網(wǎng)膜組織的CD31和isolectin蛋白進(jìn)行免疫熒光染色，放大倍數(shù)H為20X，I為80X，星號*顯示CCM病變部位呈海綿狀異常血管團(tuán)，J顯示了損害區(qū)域占比。
[0022]圖2顯示了 Ccm3-1ecK0小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞連接的破壞、EC與PC的解離、和ANGPT2表達(dá)的升高;野生型(WT)和誘導(dǎo)型的內(nèi)皮細(xì)胞特異性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，在P5和PlO天取腦組織進(jìn)行檢測;其中，A顯示了PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小腦組織切片內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記⑶31和周細(xì)胞標(biāo)記NG2免疫熒光染色，B顯示了⑶31和EC-PC縫隙鏈接標(biāo)記connexin-43(CX43)染色，其中，箭頭指示正常腦組織結(jié)構(gòu)，星號*顯示CCM病灶，箭指示小腦葉之前的血管;C分別顯示了NG2和CX43在⑶31陽性的血管上的覆蓋率;D-F顯示了 PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小腦組織切片VE-cadherin/CD31染色(D)和claudin-5/⑶31染色(E)，箭頭指示正常腦組織結(jié)構(gòu)，星號*顯示CCM病灶;方框區(qū)域圖片用高倍顯示W(wǎng)T和Ccm3_iecK0病灶中VE-cadherin/CD31免疫焚光染色；F分別顯不了 VE-cadherin和claudin-5在CD31陽性的血管上的覆蓋率;G-H顯示了 P5和PlO天的WT和Ccm3-1ecK0小鼠小腦組織切片ANGPT2/⑶31染色結(jié)果，其中圖G中的高倍圖源自方框區(qū)域，標(biāo)尺:10ym; I顯示了 ELI SA檢測WT和Ccm3-1ecK0小鼠的小腦、視網(wǎng)膜、肺和血液中的ANGPT2蛋白水平的結(jié)果；J-K顯示了 qRT-PCR和蛋白免疫印跡分別檢測P5和PlO天的WT和Ccm3_iecK0小鼠小腦組織中ANGPT2-TIE2信號通路的mRNA水平和蛋白水平的結(jié)果，所得統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為倍數(shù)變化(Ccm3-1ecKO組數(shù)值除以WT組數(shù)值所得倍數(shù)改變，把WT組的數(shù)值當(dāng)為1);L-M顯示了 ANGPT2-TIE2信號通路在人CCM3病灶高表達(dá)，人CCM3切片標(biāo)本作CD31和ANGPT2或p-TIE2(L)或Claudin-5(M)免疫熒光共染色，其中，箭頭指示正常血管，星號*指示CCM病灶，箭顯示CCM病灶中八恥?了2-1'^2染色陽性但(:1311(1丨11-5染色陰性。11=10，沖〈0.05，*仲〈0.01(非配對雙尾七檢驗(yàn))，數(shù)值為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤。
[0023]圖3顯示了CCM3維護(hù)EC管腔形成和周細(xì)胞募集;其中，A-B顯示了Organotypic血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果;siRNAs轉(zhuǎn)染的HBMVECs被種在單層融合的成纖維細(xì)胞之上，在培養(yǎng)液中加或不加ant1-ANGPT2(10yg/ml)，共培養(yǎng)14天，通過VE-cadherin和collagen IV免疫熒光染色觀察EC出芽和管腔形成過程，結(jié)果如圖A所示;B顯示定量分析顯示血管分支的數(shù)量、平均管腔直徑、和成管的面積(collagen IV覆蓋的區(qū)域)；C_D顯示了3D出芽實(shí)驗(yàn)結(jié)果;siRNAs轉(zhuǎn)染的HBMVECs包被在cytodex球珠上，然后cytodex球珠被埋在fibrin膠里，在EGM2培養(yǎng)液中培養(yǎng)8天，結(jié)果如圖C、D所示，其中，箭頭指示出芽，星號指示管腔，圖D顯示了出芽數(shù)量、出芽長度和管腔面積的定量分析結(jié)果；圖E-F顯示了3D出芽實(shí)驗(yàn)觀察EC-PC相互作用；為了同時(shí)觀察出芽過程中的EC和PC，我們把表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP的HBMVEC轉(zhuǎn)染不同的siRNAs(包括(:壯1或010或1^(:138)和表達(dá)紅色熒光蛋白1110^^7的正常!181^?(:以2:1的比例同時(shí)包被在cytodex球珠上，在培養(yǎng)液中加或不加ant1-ANGPT2( 10yg/ml)，共培養(yǎng)8天；圖E、F顯示了觀察到的EC出芽和周細(xì)胞覆蓋率及定量分析結(jié)果;n= 10，*P〈0.05，#P〈0.01,標(biāo)尺:ΙΟΟμπι，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；需要說明的是，圖B從左至右依次顯示了 siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2的分支數(shù)量、管腔直徑、血管面積，圖D從左至右依次顯示了siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2 的出芽數(shù)量、出芽長度、血管面積，圖 F從左至右依次顯示了 siCtrl、siUNC13B、siCCM3、siCCM3/siUNC13B、siCCM3/aAngpt2、s iCCM3/s iUNCl 3B/aAngpt2 的出芽數(shù)量、PC 覆蓋率。
[0024]圖4顯示了 ANGPT2中和抗體能阻斷Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管損害的形成;野生型(WT)、誘導(dǎo)型的內(nèi)皮細(xì)胞特異性CCM3敲除(Ccm3-1ecK0)和在Ccm3_iecKO基礎(chǔ)上合并Unc13b基因敲除(Ccn^kx/^^CdhS-CreEin^UnclSb—A，DK0)的小鼠在出生后1-3天喂他莫昔芬，從P2開始，隔天腹腔注射ANGPT2中和抗體(10yg/g體重)或正常IgGl到小鼠體內(nèi)，在PlO天取腦組織進(jìn)行檢測；圖A為新鮮腦組織大體形態(tài)學(xué)圖片，箭顯示CCM病灶，標(biāo)尺:2mm;圖B-C顯示了HE染色和CCM病灶統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；圖D-E顯示了NG2/CD31，VE-cadherin/CD31 和Claudin-5/CD31免疫熒光共染和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；圖F顯示了ANGPT2/CD31免疫熒光共染結(jié)果圖；G顯示了ELISA檢測腦組織中ANGPT2蛋白水平的結(jié)果圖；圖H-1顯示了P-TIE2/CD31免疫熒光共染和定量分析結(jié)果圖；η = 1，*P〈0.05，**P〈0.01，標(biāo)尺:ΙΟΟμπι，數(shù)值為均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤；需要說明的是，圖C、E、G、I分別從左至右依次顯示了WT+IgG、WT+aAngpt2、iecK0+IgG、iecK0+aAngpt2、DK0+aAngpt2的CCM病灶數(shù)量，NG2覆蓋率、VE-cad覆蓋率、Cld5覆蓋率，Angpt2蛋白水平和P-TIE2陽性的EC。
【具體實(shí)施方式】
[0025]為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0026]我們研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞特異敲除Ccm3基因的小鼠CCM模型中，內(nèi)皮細(xì)胞分泌到胞外的ANGPT2增多，引起周細(xì)胞解離，血管通透性增加;通過ANGPT2抗體，中和分泌到胞外的ANGPT2，能夠減輕CCM樣損傷，揭示ANGPT2抗體可能成為CCM治療的新途徑。
[0027]它莫西芬(tamoxifen)，也即他莫昔芬；Ccm3與CCM3可替換使用；Ang_2、Angpt2、ANGPT2可替換使用；磷酸化的TIE2、p-Tie2、p-TIE2可替換使用;Uncl3b和Uncl3B可替換使用;Px天即第X天;aAngpt2即Angpt2中和抗體。
[0028]實(shí)施例
[0029]1、材料與方法
[0030]1.1它莫西芬誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的(:(；1113基因敲除鼠((:(；1113-16(；1(0)模型的建立
[0031]為了便于通過Cre-LoxP系統(tǒng)研究Ccm3在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的功能，我們使用Cdh5-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠。Cdh5-CreERT2轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理是，首先將雌激素受體(ER)的配體結(jié)合域(LBD)突變，進(jìn)而使其與Cre重組酶融合產(chǎn)生一個(gè)嵌合重組酶(Cre-ER)，該酶活性依賴于它莫西芬的存在，而不受體內(nèi)雌激素的影響。通過利用Cdh5基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cre重組酶基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)。該轉(zhuǎn)基因小鼠若服用它莫西芬，Cre重組酶的活性被激活，SP可導(dǎo)致Cre介導(dǎo)的重組在預(yù)定時(shí)間內(nèi)和特定的組織細(xì)胞類型(這里是指血管內(nèi)皮細(xì)胞)上發(fā)生。Cdh5-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠的獲取也可參考已報(bào)道的文獻(xiàn)(可參見:Wang，Y.，etal.Ephrin-B2controls VEGF-1nduced ang1genesis andIymphangi ogene s is.Nature.2010May 27；465(7297):483-6.do 1: 10.1038/nature09002.)DCcm3fl/fl 小鼠(可參見:He Y，et al.Stabilizat1n of VEGFR2 s i gna lingby cerebral cavernous malformat1n 3is critical for vascular development.SciSignal.2010Apr 6;3(116):ra26.do1:10.1126/scisignal.2000722.)與Cdh5_CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠交配，即得到可誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的Ccm3基因敲除鼠(Ccm3-1ecK0)。為了在小鼠體內(nèi)用它莫西芬誘導(dǎo)Ccm3基因的敲除，我們用玉米油把它莫西芬(Sigma，T5648)配成濃度為10mg/ml的液體，給剛出生的Ccm3-1ecK0和WT(Ccm3fVfl)幼鼠從Pl至P3每天喂10Ug/g(體重)的它莫西芬一次，連續(xù)三天。我們從Dr.Nils Brose(Max Planck Institute ofExperimental Medicine ,Germany)得到Unc 13B基因缺失鼠，該鼠無任何表型，除了在I年后可發(fā)生癲癇，這可能是由于UNC13在腦的功能缺失導(dǎo)致。
[0032]1.2臨床樣品
[0033]我們從耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的神經(jīng)病理學(xué)系的人體標(biāo)本檔案館得到CCM3樣品。所有樣品均由兩名獨(dú)立的富有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家來評估CCM3樣品的免疫組化結(jié)果，他們事先并不知道患者的臨床信息。我們得到8例CCM3患者的蠟塊標(biāo)本，并且每個(gè)蠟塊已有切好的切片20多張。我們通過H&E染色發(fā)現(xiàn)6例CCM3樣本含有典型的CCM樣損害，其病變周圍有相對正常的組織包繞;2例CCM3樣本有明顯的血管纖維化。我們進(jìn)一步把這8例CCM3樣本進(jìn)行免疫染色分析。
[0034]1.3小鼠體內(nèi)ANGPT2中和抗體治療
[0035]我們用無菌的生理鹽水把人源化的鼠單克隆ANGPT2中和抗體(Genentech，USA，或DarronMedscience公司(廣州道瑞醫(yī)藥科技有限公司))稀釋成lmg/mL。從P2開始，隔天腹腔注射ANGPT2中和抗體(10yg/g體重)或正常IgGl到WT或Ccm3_iecK0小鼠體內(nèi)。
[0036]1.4異硫氰酸熒光素葡聚糖$11~(:-(1^壯&11)灌注和伊文思藍(lán)化^11 Blue)染料滲透試驗(yàn)
[0037]異硫氰酸熒光素葡聚糖(FD2000S; Sigma-Aldrich公司，St.Louis，M0，美國)溶于無菌的生理鹽水，離心10，OOOg 5分鐘，調(diào)整濃度為50mg/ml，收集上清，避光。同胎出生的WT或Ccm3-1ecK0小鼠經(jīng)ANGPT2中和抗體處理或不經(jīng)ANGPT2中和抗體處理均稱重，并腹部注射麻醉((氯胺酮100mg/kg+甲苯噻嗪10mg/kg))。眼球后注射按照已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行。注射部位選定為左眼角外眥。用3/10ml胰島素注射器(31G針頭)輕輕的沿45°角刺入小鼠的眼眶靜脈竇。以10μ1異硫氰酸熒光素葡聚糖對應(yīng)Ig體重來根據(jù)體重?fù)Q算相應(yīng)異硫氰酸熒光素葡聚糖注射量，并注射入小鼠眼眶靜脈竇。5分鐘后，收集腦和視網(wǎng)膜，并進(jìn)行組織鋪片或切片免疫染色處理。
[0038]伊文思藍(lán)染料滲透性實(shí)驗(yàn)(Miles實(shí)驗(yàn))。伊文思藍(lán)染液(用0.9%NaCl溶液配成1%伊文思藍(lán)溶液;Sigma-Aldrich)注射入已麻醉的WT和Ccm3-1ecK0小鼠眼球后血管叢，注射量為ΙΟμΙ/g體重。注射30分鐘后，殺死小鼠并往左心室灌注PBS，以清洗血管內(nèi)的染料。收集小腦組織，并在60°C中干燥過夜，在伊文思藍(lán)染料取出前稱重，用Iml的甲酰胺55°C下孵育小腦組織16小時(shí)以取出伊文思藍(lán)染料。用分光光度計(jì)(激發(fā)光波長為630nm)來檢測伊文思藍(lán)的含量。
[0039]1.5免疫熒光分析
[0040]收集小鼠腦組織，用4%多聚甲醛固定，OCT包埋并切片(5μπι厚度)，PBS沖洗兩次組織切片以移除OCT，并用PBS配成含5 %驢血清和0.3 % Tri tonX-100的封閉液，封閉和滲透組織切片半小時(shí)，以排除非特異性染色。組織切片用一抗4°C孵育過夜，如抗⑶31(1:100)，抗NG2(1: 100)，抗 VE-cadherin(l: 100)，抗 ΖΟ_1(1: 100)，抗 Claudin-5 (1: 100)，抗Ang1poietin-2(l: 100)，抗Connexin_43(l: 100)等。次日用PBS沖洗組織切片三遍，用二抗(l:200to 1:400)在室溫下孵育組織切片I小時(shí)。然后用I3BS沖洗三遍，組織切片用含DAPI(Vector Laboratory)的防焚光淬滅封片劑封片并拍照。細(xì)胞爬片免疫焚光染色方法與組織切片類似。簡言之，4 % PFA固定HBMVECs 20分鐘，用PBS清洗掉PFA，繼而用0.1 %的TritonX-1OO處理細(xì)胞爬片2分鐘以增加細(xì)胞通透性。封閉細(xì)胞半小時(shí)，相繼用一抗二抗孵育細(xì)胞，然后進(jìn)行封片和拍照。
[0041]視網(wǎng)膜熒光染色。異硫氰酸熒光素葡聚糖灌注P5至P15出生的新生小鼠的眼眶周靜脈叢，收集眼球并在冰上用4%多聚甲醛固定2小時(shí)。繼而用PBS清洗掉4%PFA，在顯微鏡下去除角膜、晶狀體、鞏膜和玻璃體血管，解剖出完整的視網(wǎng)膜。將視網(wǎng)膜浸潤于含5%驢血清、0.5%Triton的PBS中4°C封閉過夜，然后相繼用含1%驢血清、0.1%Triton的PBS稀釋一抗(1:50)并4°C孵育過夜，熒光二抗4°C孵育過夜，用PBS清洗視網(wǎng)膜5次。以視乳頭為中心，在視網(wǎng)膜上用剪刀對稱地沿周邊視網(wǎng)膜向中心放射狀做4個(gè)切口，使視網(wǎng)膜平鋪成花瓣?duì)睿瑹晒夥馄瑒┓馄?。用TCS SP5共聚焦顯微鏡(Leica，德國)拍照。用NIH Image J軟件統(tǒng)計(jì)血管面積占整個(gè)視網(wǎng)膜的百分比。
[0042]1.6組織中的基因表達(dá)
[0043]用含DNaseI的RNeasy 1^1:((^38611，\^1611(^3，0六)消化組織，提取出總1?嫩。按Qiagen標(biāo)準(zhǔn)程序(Super Script first-strand synthesis system;Qiagen)將RNA(Iyg量)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。繼而用特定引物(如ANGPTl ,ANGPT2和Tie-2)和iQ SYBRGreen Supermix配好反應(yīng)液，在iCycler實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)(B1-Rad Laboratories, Inc.,Hercules ,CA)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR) ^NGPTl，ANGPT2和Tie-2引物序列如下:
[0044 ] 小鼠來源:
[0045]ANGPTIRTF:ATTCTTCGCTGCCATTCT
[0046]ANGPTIRTR:CAGTTCCCGTCGTGTTCT
[0047]ANGPT2RTF:TTCCTCTTGGGTGCTTTA
[0048]ANGPT2RTR:CGCTTATTTGGTGGTTATT[0049 ] T i e 2RTF:AGGGCAAGATGGATAGGG
[0050 ] T i e 2RTR:TGAGCACAGGGAGGGTTA[0051 ]人來源:
[0052]ANGPTIRTF:AGAACCTTCAAGGCTTGGTTAC
[0053]ANGPTIRTR:GGTGGTAGCTCTGTTTAATTGCT
[0054]ANGPT2RTF:CTCGAATACGATGACTCGGTG
[0055]ANGPT2RTR:TCATTAGCCACTGAGTGTTGTTT
[0056]Tie2RTF:TCCGCTGGAAGTTACTCAAGA
[0057]T i e 2RTR:GAACTCGCCCTTCACAGAAATAA
[0058]1.7細(xì)胞培養(yǎng)和生長因子
[0059]我們根據(jù)以前的實(shí)驗(yàn)方法(可參見:Waters JP,Kluger MS,Graham M,Chang WG,Bradley JR and Pober JS.1n vitro self-assembly of human pericyte-supportedendothelial microvessels in three-dimens1nal coculture:a simple model forinterrogating endothelial-pericyte interact1ns.J Vasc Res.2013;50:324-31.)分離Ccm3_iecK0小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Mouse brain microvascular ECs，MBMVECs)。純的微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)VE-cadherin，血管性假性血友病因子(von ffillebrand factor)和CD31陽性及VEGFR2信號，但不表達(dá)周細(xì)胞的標(biāo)記(如SMA和NG2)。所有實(shí)驗(yàn)我們用3代以內(nèi)的原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。我們用10nM的4羥基它莫西芬(Sigma, H7904)處理MBMVECs以在體外誘導(dǎo)Ccm3基因的敲除，用溶劑(DMSO/乙醇)處理的細(xì)胞為正常對照組。我們從Ang1-Proteomie公司(Boston，USA)購買到人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human brain microvascularECs，HBMVECs ； cAP0002)和人腦微血管周細(xì)胞(HBMVPCs ； cAP-0030)。內(nèi)皮細(xì)胞用微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長液(Microvascular Endothelial Cell Growth Medium_2MV，Lonza)培養(yǎng)，周細(xì)胞用含有FBS和生長因子(Ang1-Proteomie)的周細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。人肺成纖維細(xì)胞用含有1 % FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，并在14代以內(nèi)使用。
[0060] 1.8慢病毒載體和包裝系統(tǒng)
[0061 ]我們使用Trans-Lentiviral 包裝系統(tǒng)。CCM3-WT(l-212aa)和 CCM3-N(人類患者中含有N端l-95-aa的縮短突變體)的編碼序列通過pLEX MCS載體克隆(Clontech)。從Clontech購買能表達(dá)mCherry(rLV.EFl.mCherry-9)的慢病毒。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并包裝慢病毒。轉(zhuǎn)染62小時(shí)后，收集條件培養(yǎng)基，通過低速離心清除碎片，0.45-μΜ過濾器(Falcon ,LincolnPark，NJ)過濾。然后用所得條件培養(yǎng)基稀釋病毒載體，并加入8yg/ml聚凝胺(Sigma，St.Louis，M0)，培養(yǎng)過夜轉(zhuǎn)染HBMVEC。第二天換液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)36小時(shí)，并用熒光顯微鏡觀察RFP的表達(dá)量。CCM3突變的表達(dá)量用蛋白質(zhì)印跡檢測。通過50，000g 90分鐘高速離心條件培養(yǎng)液來濃縮病毒載體。離心后的濃縮小球用含有4yg/ml聚凝胺的PBS重懸，PBS體積為0.05%的初始條件培養(yǎng)液的容量，滴定病毒載體濃度并于_80°C中保存。
[0062]1.9酶聯(lián)免疫吸附測定ANGPT2
[0063]為測量人內(nèi)皮細(xì)胞的上清液中ANGPT2的含量，處理細(xì)胞后在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞上清液。ELISA實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的ELISA方法實(shí)施，并用以下抗體檢測，R&D的抗ANGPT2抗體、重組人4吣?了2(625-4^025)、人4吣?了21&113(]\^8098)、人4吣?了2生物素化]\&113(831110981)。為了測量在老鼠細(xì)胞和組織的ANGPT2，相應(yīng)的ELISA試劑盒來自R&D(MANG20 WPABCAM(abl71335)。為進(jìn)行免疫印跡，速凍老鼠組織，并在聚丙烯酰胺凝膠電泳前混勻于RIPA裂解液。為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，需碾碎新鮮的老鼠組織并在無血清培養(yǎng)皿中孵化2小時(shí)，進(jìn)而測定上清液中的ANGPT2蛋白水平。
[0064]1.10實(shí)時(shí)TIRF顯微鏡
[°065] 我們根據(jù)以前的實(shí)驗(yàn)方法(可參見:Zhang Y,Tang W1Zhang H,Niu X，Xu Y,ZhangJ,Gao K,Pan W1Boggon TJ,Toomre D,Min V and Wu D.A network of interact1nsenables CCM3and STK24to coordinate UNC13D-driven vesicleexocytosis inneutrophils.Dev Cel I.2013; 27: 215-26.)進(jìn)行實(shí)時(shí)全內(nèi)反射熒光顯微鏡檢測。具體用1X70倒置顯微鏡像(Olympus)，裝備一個(gè)氬激光譜線(488nm)，一個(gè)TIRFM冷凝器，一個(gè)60 X1.45NA TIRF物鏡(Olympus)和一個(gè)EMCCD鏡頭(iXon887;AndorTechnology)。通過iQ軟件(And0rTechn0l0gy)控制成像系統(tǒng)。關(guān)于活細(xì)胞成像，HBMVEC細(xì)胞種入含1.5號玻璃底的35mm培養(yǎng)皿中(MatTek，Ashland，MA)，并用EGM-2-MV培養(yǎng)基培養(yǎng)(Lonza，cc-3202)。首先用RNAiMAX(ThermoFisher)轉(zhuǎn)染 siRNAs 到HBMVEC 細(xì)胞內(nèi)。24 小時(shí)后，用Cytofect-內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(Cell Applicat1ns Inc.,TF101K)轉(zhuǎn)染VAMP8_Phluorin質(zhì)粒到細(xì)胞內(nèi)。再經(jīng)過24小時(shí)，細(xì)胞放入37 0C的孵化室，以200毫秒的間隔獲取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像，進(jìn)而用MATLAB系統(tǒng)的ImageJl.42軟件(來源于美國國立衛(wèi)生研究院)處理分析圖像。
[0066]I.11跨內(nèi)皮通量和TEER測量
[0067]跨內(nèi)皮通量的檢測，內(nèi)皮細(xì)胞接種入纖維蛋白包被的96W20idf金電極的ECIS培養(yǎng)皿中(Applied B1Physics)，并用EGM-2培養(yǎng)基(Lonza，cc_3202)培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染siRNAs。通過記錄72小時(shí)內(nèi)的細(xì)胞基質(zhì)的電阻抗傳感來評估內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能。
[0068]1.12 Organotypic血管生成實(shí)驗(yàn)
[0069]我們采用經(jīng)改進(jìn)的Organotypic血管生成實(shí)驗(yàn)(可參見:Hetheridge C1Mavria Gand Mellor H.Uses of the in vitro endothelial-fibroblast organotypic co-culture assay in ang1genesis research.B1chem Soc Trans.201I;39:1597-600.)。用逆轉(zhuǎn)錄病毒(Μ0Ι 20)轉(zhuǎn)染HBMVECs使其表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)，2天后再轉(zhuǎn)染siRNAs到細(xì)胞體內(nèi)；或直接給未轉(zhuǎn)染EGFP的HBMVECs轉(zhuǎn)染siRNAs，I天后消化HBMVECs，并在預(yù)先鋪上2X 14人成纖維細(xì)胞并達(dá)到融合的24孔板內(nèi)每孔接種含或不含EGFP表達(dá)的經(jīng)siRNAs轉(zhuǎn)染的8.5 X 13的HBMVECs。我們每兩天給細(xì)胞換EGM2培養(yǎng)液，并在2至14天在熒光顯微鏡下直接通過綠色焚光蛋白觀察小管形成，或通過VE-cadherin和Co I Iagen IV免疫焚光染色觀察小管形成。
[0070]1.13三維出芽實(shí)驗(yàn)
[0071 ]用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)轉(zhuǎn)染siCtrl, siUNC13B，siCCM3或siCCM3與siUNC13B的聯(lián)合到HBMVECs作用8小時(shí)或過夜，接著給HBMVECs換成新鮮的微血管內(nèi)皮細(xì)胞生長液(Microvascular Endothelial Cell Growth Medium_2MV，Lonza)培養(yǎng)。我們參照文南犬(Nakatsu MN and Hughes CC.An optimized three-dimens1nal in vitro modelfor the analysis of ang1genesis.Methods Enzymol.2008 ;443:65-82.)進(jìn)行三維出芽實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，S卩被消化并與一定數(shù)量的微載體珠(C3275，Sigma)混勻在含有1.5ML EGM2 — MV培養(yǎng)液的流式細(xì)胞管里，放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，4小時(shí)內(nèi)每隔20分鐘輕拍打管壁，以使最終每個(gè)微載體珠包被有接近400個(gè)細(xì)胞。第二天，把這些包被有HBMVECs的微載體珠包埋在2mg/ml的纖維蛋白膠里，繼而把20，000/孔的成纖維細(xì)胞鋪在纖維蛋白膠上層，并給每孔細(xì)胞1.01^含或不含4如?12中和抗體(148/!111或1(^8/1111;661^1^6(*或廣州道瑞醫(yī)藥科技有限公司)的EGM2—MV培養(yǎng)液。每兩天給細(xì)胞換液并從2至13天通過顯微鏡觀察細(xì)胞出芽狀況、管腔形成、血管分支形成及融合過程。
[0072]1.14HBMVECS和HBMVPCs共培養(yǎng)系統(tǒng)的三維出芽實(shí)驗(yàn)
[0073]我們參照文獻(xiàn)進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的相互作用的三維出芽實(shí)驗(yàn)(Waters，J.P.,et al.1n vitro self-assembly of human pericyte-supported endothelialmicrovessels in three-dimens1nal coculture:a simple model for interrogatingendothelial-pericyte interact1ns.J Vasc Res 50，324-331(2013);Chang，W.G.，Andrejecsk,J.ff.,Kluger,M.S.,Saltzman,ff.M.&Pober,J.S.Pericytes modulateendothelial sprouting.Card1vasc Res 100，492-500(2013);Scheppke，L.，etal.Notch promotes vascular maturat1n by inducing integrin-mediated smoothmuscle cell adhes1n to the endothelial basement membrane.Blood I19，2149—2158(2012).首先用逆轉(zhuǎn)錄病毒(MOI 20)轉(zhuǎn)染HBMVECs使其表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)，用腺病毒(MOI 20)轉(zhuǎn)染HBMVPCs使其表達(dá)mCherry。繼而用LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)轉(zhuǎn)染siCtrl，siUNC13B，siCCM3 或 siCCM3 與 siUNC13B 的聯(lián)合到 HBMVECs。細(xì)胞轉(zhuǎn)染 24 小時(shí)后，即被消化并按ECs:PCs(2:1)的比例與一定數(shù)量的微載體珠(C3275，Sigma)混勻，培養(yǎng)在含有
1.5MLEGM2—MV培養(yǎng)液的流式細(xì)胞管里，放進(jìn)培養(yǎng)箱，4小時(shí)內(nèi)每隔20分鐘輕拍打管壁，以使最終每個(gè)微載體珠包被有接近400個(gè)細(xì)胞。我們選擇ECs:PCs(2:1)的比例是因?yàn)橹芗?xì)胞比血管內(nèi)皮細(xì)胞長得快，且在ECs: PCs (1:1)的比例條件下周細(xì)胞限制內(nèi)皮細(xì)胞的出芽。第二天，把這些包被有HBMVECs的微載體珠包埋在2mg/ml的纖維蛋白膠里，繼而把20，000/孔的成纖維細(xì)胞鋪在纖維蛋白膠上層，并給每孔細(xì)胞1.0ML含或不含ANGPT2中和抗體(lyg/ml或10yg/ml;美國Genentech公司或廣州道瑞醫(yī)藥科技有限公司)的EGM2—MV培養(yǎng)液。每兩天給細(xì)胞換液并從2至8天通過熒光顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞出芽狀況、血管內(nèi)皮細(xì)胞形成小管的周細(xì)胞的覆蓋率。
[0074]以上試驗(yàn)中我們所用的siRNA由美國SantaCruz公司合成，人的UNC13B基因?yàn)橐韵氯齻€(gè)有效s iRNA的混合物:
[0075]sc-42022A:
[0076]正義鏈序列:GGAUUGCGCUGAAGACUAUtt
[0077]反義鏈序列:AUAGUCUUCAGCGCAAUCCtt
[0078]sc-42022B:
[0079]正義鏈序列:GACAUCAAGUCAAGAGUAAtt
[0080]反義鏈序列:UUACUCUUGACUUGAUGUCtt[0081 ] sc-42022C:
[0082]正義鏈序列:GGAUCGACCUCUCUACAUAtt
[0083]反義鏈序列:UAUGUAGAGAGGUCGAUCCtt
[0084]CCM3基因的s iRNA為以下三種s iRNA的混合物:
[0085]sc-62084A:
[0086]正義鏈序列:GGAUAUAGCUAGUGCAAUAtt
[0087]反義鏈序列:UAUUGCACUAGCUAUAUCCtt；
[0088]sc-62084B:
[0089]正義鏈序列:CAACCGACUAAUUCAUCAAtt
[0090]反義鏈序列:UUGAUGAAUUAGUCGGUUGtt；
[0091]sc-62084C:
[0092]正義鏈序列:GGAUUAUUGCCAUCUUACAtt
[0093]反義鏈序列:UGUAAGAUGGCAAUAAUCCtt。
[0094]2.結(jié)論
[0095]2.1誘導(dǎo)型的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性Ccm3敲除的小鼠產(chǎn)生CCM損害
[0096]給剛出生的WT(Ccm3fl/fl)幼鼠和可誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的Ccm3基因敲除(Ccm3-1ecK0)小鼠從Pl至P3每天喂他莫昔芬，在P2-P10取腦組織進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ccm3-1ecK0小鼠能在小腦快速產(chǎn)生CCM血管損害，即擴(kuò)張膨脹伴出血的毛細(xì)血管，該病損在P5可見、PlO急劇增大增多(如圖1A—C所示)。沒有Ccm3-1ecK0能存活超過Ρ15(η>50)<^ΙΤ(:-dextran小鼠體內(nèi)循環(huán)灌注實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)ITC-dextran局限于WT小鼠腦和視網(wǎng)膜的毛細(xì)血管床內(nèi)，但在Ccm3-1ecK0小鼠FITC-dextran彌散滲漏到小腦擴(kuò)張的毛細(xì)血管床外的周邊組織(如圖1D-F所示hEvans Blue染料滲漏實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Ccm3_iecK0小鼠小腦增強(qiáng)的血管滲漏(如圖1G所示)XCM樣靜脈血管畸形也在Ccm3ECK0小鼠視網(wǎng)膜周邊血管叢被檢測到(如圖1H-1所示)。
[0097]2.2CCM損害表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞連接的破壞和ANGPT2表達(dá)的升高
[0098]Ccm3_iecK0小鼠的小腦血管損害以單層擴(kuò)張的血管內(nèi)皮和嚴(yán)重減少的周細(xì)胞覆蓋為特征(如圖2A-C所示)?？p隙連接蛋白connexin-43免疫熒光染色在Ccm3-1ecK0小鼠也明顯減少，這表明血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞相互作用的完整性受破壞(如圖2A-C所示)。類似地，Ccm3_iecK0小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞粘合連接蛋白VE-cadherin和緊密連接蛋白claudin-5在小腦CCM血管損害處表達(dá)不規(guī)則、明顯減少(如圖2D-F所示)。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ANGPT2被經(jīng)典地認(rèn)為是ANGPTl的拮抗劑，ANGPT2能拮抗ANGPTl穩(wěn)定血管的功能，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。在WT小鼠小腦ANGPT2可在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)檢測到，然而它在Ccm3-1ecK0小鼠的小腦擴(kuò)張的血管內(nèi)和血管病損周圍均顯著升高(如圖2G-H所示)JLISA也檢測到Ccm3-1ecKO小鼠的小腦和視網(wǎng)膜顯著升高的ANGPT2蛋白水平，但在Ccm3-1ecK0小鼠的肺和血樣未檢測到升高的ANGPT2蛋白水平(如圖21所示)，這與CCM血管損害形成部位一致。ANGPT2(而不是ANGPTl或TIE2)的mRNA表達(dá)水平在P5天Ccm3-1ecK0小鼠的小腦輕度增加，在PlO顯著增加(如圖2J所示)。我們意外地發(fā)現(xiàn)Ccm3ECK0小鼠的小腦增加的TIE2蛋白磷酸化水平(如圖2K所示)，提示CCM血管損害發(fā)展過程中ANGPT2-TIE2信號通路的激活。為證明ANGPT2的上調(diào)具有臨床相關(guān)性，我們檢測CCM3病變患者的ANGPT2的表達(dá)水平。我們在相對正常區(qū)域的腦組織未發(fā)現(xiàn)ANGPT2和p-TIE2陽性染色，但在CCM病變區(qū)域發(fā)現(xiàn)顯著升高的ANGPT2和P-TIE2表達(dá)，伴血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的破壞(如圖2L-M所示)。
[0099]2.3 CCM3-ANGPT2信號軸調(diào)控EC管腔形成和周細(xì)胞募集
[0100]如我們在Ccm3-1ecK0小腦所見CCM3調(diào)控血管管腔直徑，我們用體外實(shí)驗(yàn)EC出芽模型和管腔形成模型分析CCM3對內(nèi)皮出芽和管腔形成的影響。表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP和/或siRNAs轉(zhuǎn)染的HBMVECs被種在單層融合的成纖維細(xì)胞之上，在7至14天共培養(yǎng)過程中觀察管腔形成過程。VE-cadherin和collagen IV免疫熒光染色顯示CCM3缺失的內(nèi)皮細(xì)胞出芽和管腔形成明顯增加(如圖3A所示)。定量分析顯示血管分支的數(shù)量、平均管腔直徑、和成管的面積(Co I Iagen IV覆蓋的區(qū)域)在CCM3敲低組明顯增加(如圖3A-B所示)。因CCM3缺失引起的增加的EC出芽和擴(kuò)大的管腔形成不受正常IgG處理的影響，但能被同時(shí)沉默UNC13B表達(dá)或用ANGPT2中和抗體所抑制(如圖3A-B所示)。為了進(jìn)一步證實(shí)CCM3調(diào)控EC管腔形成和周細(xì)胞募集，我們用3D出芽實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證，該實(shí)驗(yàn)中ECs包被在cytodex球珠上，然后cytodex球珠被埋在fibrin膠里，繼而在膠上層鋪上成纖維細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，因CCM3敲低引起的增加的EC出芽和擴(kuò)大的管腔形成能被同時(shí)沉默UNC13B表達(dá)或用ANGPT2中和抗體所抑制(如圖3C-D所示)。
[0101]3D出芽實(shí)驗(yàn)也是被用來研究周細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞募集和血管成熟的一個(gè)系統(tǒng)。為了同時(shí)觀察出芽過程中的E C和PC，我們把表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP的HBMVE C轉(zhuǎn)染不同的siRNAs(包括Ctrl或CCM3或UNC13B)和表達(dá)紅色熒光蛋白mCherry的正常HBMVPC以2:1的比例同時(shí)包被在cytodex球珠上。在出芽過程中，PC被招募到正常的EC上，但CCM3敲低的EC不能招募PC(如圖3E所示)。然而，在EC同時(shí)沉默UNCl3B表達(dá)或用ANGPT2中和抗體或兩者的結(jié)合能恢復(fù)正常的PC募集到出芽EC上(如圖3E-F所示)。我們的結(jié)果提示CCM3能通過抑制EC中ANGPT2的胞吐作用，維護(hù)正常EC細(xì)胞連接、EC管腔形成和PC募集。
[0102]2.4 ANGPT2中和抗體能阻斷Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管損害的形成
[0103]研究表明高劑量的ANGPT2中和抗體能強(qiáng)烈抑制血管生成。大體形態(tài)學(xué)和HE染色結(jié)果顯示ANGPT2中和抗體能顯著減少Ccm3-1ecK0小鼠的CCM血管損害的形成(如圖4A-C所示)。我們進(jìn)一步檢測ANGPT2中和抗體和Uncl3b基因缺失的聯(lián)合效應(yīng)對CCM血管損害的影響。ANGPT2中和抗體能完全消除DKO小鼠(Ccm3-1ecK0:Uncl3b—Λ)小腦和視網(wǎng)膜的CCM血管病變(如圖4Α-C所示)ο微血管周細(xì)胞(NG2陽性)覆蓋率在正常IgG處理的Ccm3-1ecKO小鼠為20 %，在ANGPT2中和抗體處理的Ccm3-1ecKO小鼠上升到超過80 %，而在ANGPT2中和抗體處理的DKO小鼠上升到接近100 % (如圖4D-E所示)。在EC粘附連接和緊密連接方面，我們也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果(如圖4D-E所示)。我們進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測ANGPT2中和抗體對ANGPT2-TIE2信號通路的影響。我們檢測到Ccm3-1ecK0小鼠的小腦病變擴(kuò)張血管周圍彌漫著ANGPT2陽性的免疫熒光染色伴隨著升高的TIE2蛋白磷酸化染色(如圖4F，H所示)<XCm3-1ecK0小鼠的病變小腦彌漫的ANGPT2陽性的免疫熒光染色，升高的ANGPT2總蛋白水平和TIE2蛋白磷酸化水平能被ANGPT2中和抗體顯著降低，甚至在DKO小鼠能被ANGPT2中和抗體完全抑制(如圖4F-1所示)。綜上所述，我們的研究結(jié)果支持以下結(jié)論:Ccm3基因敲除能誘導(dǎo)ECs分泌ANGPT2，從而導(dǎo)致EC細(xì)胞連接的破壞、EC和PC的解離，有助于CCM疾病表型的進(jìn)展。
[0104]3.結(jié)論分析
[0105]本研究，我們報(bào)道血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性Ccm3基因敲除(Ccm3-1ecK0)的小鼠產(chǎn)生的CCM損害表現(xiàn)為小腦出血、EC細(xì)胞連接的破壞、EC和PC的解離，這與小腦擴(kuò)張的微血管周圍升高的ANGPT2分泌有關(guān)。我們在Ccm3-1ecK0小鼠小腦和視網(wǎng)膜組織發(fā)現(xiàn)升高的ANGPT2分泌，但未在肺組織和血樣中發(fā)現(xiàn)升高的ANGPT2分泌。CCM3只在腦和視網(wǎng)膜對ANGPT2有作用，這為血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性Ccm3基因敲除的小鼠只在腦和視網(wǎng)膜組織產(chǎn)生CCM損害提供了一個(gè)可能的解釋。體外研究證實(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞Ccm3基因缺失能導(dǎo)致EC細(xì)胞連接的破壞、擴(kuò)大的管腔形成和減少的周細(xì)胞募集。這些EC表型與Ccm3基因缺失內(nèi)皮細(xì)胞中增高的ANGPT2分泌和釋放有關(guān)，ANGPT2中和抗體能顯著抑制Ccm3基因缺失的EC表型，在小鼠CCM模型能抑制CCM損害的進(jìn)展，這與它能穩(wěn)定EC細(xì)胞連接、EC-PC相互作用和血管完整性有關(guān)。
[0106]最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.ANGPT2抑制劑在制備用于治療血管瘤的藥物中的應(yīng)用，所述ANGPT2抑制劑通過降低ANGPT2蛋白水平來治療血管瘤，所述血管瘤以單層擴(kuò)張的血管內(nèi)皮細(xì)胞和減少的周細(xì)胞覆蓋為特征。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述血管瘤為腦海綿狀血管瘤，所述血管內(nèi)皮細(xì)胞為腦血管內(nèi)皮細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述腦海綿狀血管瘤由CCM3基因的功能缺失引發(fā)。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述ANGPT2抑制劑為ANGPT2中和抗體。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗體為單克隆抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗體的用量為10yg/g體重。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述ANGPT2中和抗體隔天腹腔注射。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述藥物通過穩(wěn)定血管內(nèi)皮細(xì)胞連接、血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的相互作用和血管的完整性來抑制血管瘤損害。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號】A61K45/00GK106075448SQ201610590828
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月25日 公開號201610590828.6, CN 106075448 A, CN 106075448A, CN 201610590828, CN-A-106075448, CN106075448 A, CN106075448A, CN201610590828, CN201610590828.6
【發(fā)明人】王敏, 周煥嬌
【申請人】廣州道瑞醫(yī)藥科技有限公司