專利名稱：提高天然產(chǎn)生的細胞質(zhì)雄性不育以及恢復(fù)雄性能育的方法和其在雜交作物生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及提高天然產(chǎn)生的細胞質(zhì)雄性不育的方法以及恢復(fù)雄性能育的方法和其在雜交作物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
(b)現(xiàn)有技術(shù)的描述對于許多植物，由兩種或多種不同植株雜交形成的雜種比親本植株本身提供更高的產(chǎn)量。例如，在加拿大最重要的作物，蔓青(canda)(Brassica napus，campestris)，人工產(chǎn)生的雜種具有比其親本系可高達50％的產(chǎn)率。這種稱之為雜種優(yōu)勢的現(xiàn)象已被最成功地應(yīng)用于玉米(Zea mays)中。雜交玉米占北美作物的約90％。
為了以商業(yè)規(guī)模生產(chǎn)雜交種子，必須防止雜交的種子親本的自體受粉。這在玉米中為相對簡單的事情，因為雄性或產(chǎn)生花粉的器官(雄蕊)位于植株不同于雌性或具種子器官(心皮)的部位，并且共同形成稱之為雄穗的結(jié)構(gòu)的雄蕊可很容易地通過人工從大量用于生產(chǎn)種子的操作的植物中去除。相反，在大多數(shù)作物種類中，如蔓青，雄蕊和心皮位于同一花結(jié)構(gòu)中，大量植株的人工去雄是不可能的。因此，種子生產(chǎn)者需要其它受粉控制方法來在這些作物中產(chǎn)生雜種。開發(fā)用于此目的的技術(shù)的綜述可見于The PBI Bulletinarticlen of Arnison P.(Arnison P.等，The PBI Bulletin，1997，1，1-11)。
另一種方法是使用特異性地殺死花粉的稱之為殺配子劑的化學(xué)物質(zhì)。這些化學(xué)物質(zhì)通常價格昂貴并常常僅為部分有效。對于大多數(shù)作物，尤其對于象在長時期內(nèi)開花的蔓青的那些，這種類型的受粉控制成本-效果比不佳。因此，幾乎所有的雜交種子生產(chǎn)系統(tǒng)取決于受粉的遺傳控制。遺傳受粉控制機理分為三種類型自交不親和性、“分子雜交”方法和細胞質(zhì)雄性不育。
自交不親和性(SI)產(chǎn)生于一些植物排斥其自身花粉的能力。表現(xiàn)出SI的植物可被用作產(chǎn)生雜種的雌性系，但由于這些植物通常排斥其自身的花粉，繁殖或保持這些植株系通常是困難且成本-效果不佳。此外，在大多數(shù)植物種類中未發(fā)現(xiàn)自交不親和性。分子雜交方法是最近開發(fā)的。它們?nèi)Q于由毒性蛋白在花粉形成細胞中的特定表達而導(dǎo)致的遺傳改造的雄性不育。這些導(dǎo)入的毒素基因起顯性雄性不育基因的作用并可被用來產(chǎn)生用于雜交種子生產(chǎn)的雌性系。如對于SI，這些雌性系的繁殖不簡單且涉及植物材料的損失。這些方法的這些用途仍不清楚，并且目前它們被用于僅生產(chǎn)一些雜交變異體，并且這些未被廣泛培育。
細胞質(zhì)雄性不育(CMS)是廣泛分布以及傳統(tǒng)的非孟德爾特征。CMS植物不能自體受粉，因此當(dāng)CMS系與雄性能育系并排種植時，在不育植物中形成的所有種子將是兩個親本的雜種。不象大多數(shù)特征，CMS是母本傳遞，即它僅通過種子親本傳給后代。該特性來自于這一事實，即決定CMS的基因或多個基因位于線粒體DNA(mtDNA)上；不象位于核DNA中的大多數(shù)基因，在大多數(shù)植物種類中，mtDNA中的基因僅通過雌性傳遞。作為母體傳遞這一特性的結(jié)果，可容易地通過用雄性能育系“保持”系受粉繁殖雌性CMS系，其中“保持”系在其核基因方面與CMS系相同，但由于缺乏導(dǎo)致CMS的mtDNA，它為雄性能育的。然而，又作為CMS的母體傳遞的結(jié)果，使用雌性CMS系產(chǎn)生的雜交植物還將為雄性不育的，因為它們帶有傳遞雄性不育的mtDNA。這對于種子作物，如玉米或蔓青存在問題，它們需要產(chǎn)生花粉用于為被收集產(chǎn)物的種子形成。慶幸的是，在許多作物種類中，已確定了可抑制雄性不育現(xiàn)象并“恢復(fù)”到能育性F1雜種的稱之為能育性恢復(fù)者“Rf”的特定的顯性核基因。因此，CMS體系的成分由CMS系，保持系和恢復(fù)系組成，其中CMS系包含雄性不育(S)細胞質(zhì)(或mtDNA)并為隱性或恢復(fù)基因的保持等位基因純合，保持系包含能育或正常mtDNA(F)，但在核基因座與CMS系為同基因，并且恢復(fù)系通常包含雄性不育mtDNA，但對于顯性核Rf基因為純合的。這些成分在雜交種子的產(chǎn)生方案中的使用示于

圖1中。
為了使用CMS產(chǎn)生不同組的雜種，必須獲得足夠數(shù)量的包含Rf基因的恢復(fù)系以及由CMS mtDNA導(dǎo)致的不育的“保持”系。通過常規(guī)遺傳方法開發(fā)這些系是一個最少需要數(shù)年努力的緩慢過程。例如，為了開發(fā)一個新的恢復(fù)系，必須首先將受體系與現(xiàn)有的恢復(fù)系雜交以導(dǎo)入Rf等位基因。接著需要一系列的回交以恢復(fù)受體系的基因型。甚至在進行許多代回交后，與Rf基因連鎖的一些供體DNA將保留稱之為連鎖阻礙的現(xiàn)象；該供體DNA可攜帶有有害的特性并損害受體植株的品質(zhì)。
兩個CMS系統(tǒng)被證實在雜交蔓青種子生產(chǎn)中具有一些有限的用途。Polima或pol細胞質(zhì)能在許多蔓青栽培品種中傳遞雄性不育，并已確定在一個核恢復(fù)系基因座中具有顯性等位基因的有效的恢復(fù)系。使用該系統(tǒng)生產(chǎn)雜種的成本-效果比受這一事實的限制，即pol誘導(dǎo)的雄性不育有可能是不完全的或“滲漏的”，尤其是當(dāng)雌性系暴露于較溫暖的生長條件下時。結(jié)果，pol雜交種子可能被由雌性系的自體授粉產(chǎn)生的CMS種子污染。由于這些CMS植株為雄性不育的并不能自發(fā)地結(jié)種，因此它們的存在可顯著降低“雜交”混合物的總的產(chǎn)率。第二個CMS系統(tǒng)基于使用雜種細胞質(zhì)，其中雄性不育決定子來自稱之為Ogura或ogu的蘿卜細胞質(zhì)。由ogu細胞質(zhì)傳授的雄性不育是完全的。最近可獲得通過將一個蘿卜恢復(fù)基因(在本文稱為Rfo)漸滲入蔓青中而開發(fā)的該系統(tǒng)的恢復(fù)系，但恢復(fù)系的開發(fā)受恢復(fù)基因與對種子質(zhì)量具有副作用的基因之間的“連鎖阻礙”所妨礙。
極其希望提供提高天然產(chǎn)生的細胞質(zhì)雄性不育的方法以及恢復(fù)雄性能育的方法和其在雜交作物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供提高天然產(chǎn)生的細胞質(zhì)雄性不育的方法以及恢復(fù)雄性能育的方法和其在雜交作物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，提供一種在植物中提高天然產(chǎn)生的細胞質(zhì)雄性不育的方法；它包括下面的步驟a)向植物細胞的細胞核中導(dǎo)入本質(zhì)上由編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽的序列組成的基因構(gòu)建體，其中該序列在至少一個未改變形式的蔓青(Brassica napus)線粒體的atp6基因和orf224基因的上游和框內(nèi)與其融合；b)選擇具有步驟a)的基因構(gòu)建體的植物細胞；和c)誘導(dǎo)選擇的植物細胞再生以產(chǎn)生成熟的植物。
根據(jù)本發(fā)明，還提供一種將雄性能育恢復(fù)成細胞質(zhì)雄性不育植物的方法；它包括下面步驟a)向植物細胞的細胞核中導(dǎo)入本質(zhì)上由編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽的序列組成的基因構(gòu)建體，其中該序列在與異常CMS相關(guān)線粒體基因共轉(zhuǎn)錄的改變形式的正常線粒體基因的上游和框內(nèi)與其融合；b)選擇具有步驟a)的基因構(gòu)建體的植物細胞；和c)誘導(dǎo)選擇的植物細胞再生以產(chǎn)生成熟的植物。
優(yōu)選的植物為蔓青(Brassica napus)。
優(yōu)選地，使用植物轉(zhuǎn)化載體，如pRD400進行b)。
根據(jù)本發(fā)明，還提供一種將雄性能育恢復(fù)成polima細胞質(zhì)雄性不育蔓青的方法；它包括下面步驟a)向蔓青植物細胞的細胞核中導(dǎo)入本質(zhì)上由編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽的序列組成的基因構(gòu)建體，其中該序列在改變形式的蔓青線粒體的atp6基因的上游和框內(nèi)與其融合；b)選擇具有步驟a)的基因構(gòu)建體的植物細胞；和c)誘導(dǎo)選擇的植物細胞再生以產(chǎn)生成熟的植物。
我們的結(jié)果推出pol CMS在生產(chǎn)雜交蔓青和其它芥屬(Brassica)作物的實踐中的應(yīng)用。向pol CMS植物中導(dǎo)入使得能靶定改變形式的芥屬atp6基因的產(chǎn)物于線粒體的遺傳構(gòu)建體代表了一種新型的方法，通過該方法恢復(fù)了雄性能育的植物可被恢復(fù)；這應(yīng)使得能在通過植物轉(zhuǎn)化的單一個步驟中產(chǎn)生新的pol CMS恢復(fù)系。這代表比目前生產(chǎn)且唯一可產(chǎn)生這些系的方法的常規(guī)植物育種方法在時間和費用上的顯著的節(jié)約。此外，將能靶定未改變形式的atp6基因或orf224的產(chǎn)物的構(gòu)建體導(dǎo)入線粒體中以產(chǎn)生具有提高的雄性不育植物代表了一種方法，通過該方法可有效地產(chǎn)生新的具有增強的維持雄性不育的pol CMS系；如上所述，pol雄性不育的滲漏程度是其在雜交蔓青生產(chǎn)中更廣泛應(yīng)用的主要障礙，并且沒有克服它的有效方法。這些方法還可能代表用于生產(chǎn)提高CMS在其它CMS系統(tǒng)和其它植物種類中的維持或恢復(fù)的變種的更常用方法的實例。
附圖簡要說明圖+1示細胞質(zhì)雄性不育(CMS)在雜交種子生產(chǎn)中的應(yīng)用；圖2A-2J示能育，pol CMS和轉(zhuǎn)基因蔓青載培品種(B.Napus CV.)Westar植物的花；圖2A示pol CMS Westar(左)和用mas2’/A9-A6e構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的pol CMSWestar的完整的花(注意轉(zhuǎn)基因植物花瓣的增加的大小)；圖2B示通過將AP3/A9-A6u導(dǎo)入Westar(nap)獲得的部分雄性不育轉(zhuǎn)基因植物(左)和雄性能育Westar(nap)的完整的花(注意轉(zhuǎn)基因植物花瓣的減退的著色)；圖2C示pol CMS Westar(左)和用mas2’/A9-A6e構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的pol CMSWestar的除去花瓣和萼片的花；注意轉(zhuǎn)基因植物增加的雄蕊大小和更加高度發(fā)育的花藥；圖2D示通過導(dǎo)入AP3/A9-A6u至Westar(nap)獲得的部分雄性不育轉(zhuǎn)基因植物(左)和雄性能育Westar(nap)的除去了花瓣和萼片的花(注意轉(zhuǎn)基因植物花藥大小的減小)；圖2E示pol CMS Westar，通過導(dǎo)入AP3/A9-ORF構(gòu)建體至雄性能育Westar(nap)獲得的雄性不育轉(zhuǎn)基因植物40-8和雄性能育Westar(nap)的完整的花(從左至右)；圖2F示除去了花瓣和萼片的轉(zhuǎn)基因植物40-8的花；注意四個內(nèi)側(cè)雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮；圖2G示通過導(dǎo)入AP3/C4-ORF構(gòu)建體至雄性能育Westar(nap)獲得的部分能育轉(zhuǎn)基因植物40-10(左)的完整的花；受體株Westar(nap)的花示于右側(cè)(注意轉(zhuǎn)基因植物的花瓣大小的減小)；圖2H示除去了花瓣和萼片的轉(zhuǎn)基因植物40-10和雄性能育Westar(nap)的花；圖2I示pol CMS Westar(左)和通過導(dǎo)入AP3/A9-A6e構(gòu)建體至pol CMSWestar獲得的部分能育轉(zhuǎn)基因植物40-10的完整的花(注意轉(zhuǎn)基因植物的增加的花瓣大小)；圖2J示pol CMS Westar(左)和通過導(dǎo)入AP3/A9-A6e構(gòu)建體至pol CMSWestar獲得的部分能育轉(zhuǎn)基因植物的除去了花瓣和萼片的花(注意轉(zhuǎn)基因植物的增加的雄蕊和花藥大小)；圖3A-3D示伴隨pol CMS Westar中的mas2’驅(qū)動的A9-A6e的表達的表型變化；A轉(zhuǎn)基因植物花序；蔓青pol CMS Westar花序；C整個轉(zhuǎn)基因植物；Dpol CMS Westar植物(注意轉(zhuǎn)基因植物增大的花序和營養(yǎng)節(jié)間大小)；圖4示AP3/A9-A6e構(gòu)建體作為顯性能育恢復(fù)基因在蔓青中的應(yīng)用；和圖5示使用AP3/C4-ORF構(gòu)建體增強蔓青的pol細胞質(zhì)雄性不育。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種通過遺傳工程開發(fā)保持系和恢復(fù)系的方法。本發(fā)明特別涉及蔓青(Brassica napus，campestris)的pol CMS系統(tǒng)。然而，該方法原則上可被用來改變這些系對蔓青中的其它CMS系統(tǒng)和大量其它作物中的CMS系統(tǒng)的花粉產(chǎn)生能力。
本發(fā)明基于1987年至1993年在我的實驗室進行的蔓青(Brassica mapusL.)的細胞質(zhì)顯性不育的分子基礎(chǔ)的研究。對蔓青線粒體基因組結(jié)構(gòu)和表達的分析表明蔓青CMS的polima或pol形式與包含嵌合基因orf224的線粒體基因區(qū)的表達相關(guān)，其中orf224與正常的線粒體基因atp6共轉(zhuǎn)錄(Singh，M.P.和Brown，G.G.(1991)。植物細胞3，1349-1362；Bonen，L.和Brown，G.G.(1993)。加拿大植物學(xué)雜志71，645-660)。我們推測pol CMS是由于線粒體膜的功能異常，其中該功能異常來自于(i)線粒體膜中ORF224蛋白的存在或(ii)來自于可能由atp翻譯中orf224的干擾導(dǎo)致的可能的ATP6蛋白的缺乏。
線粒體蛋白具有雙重的遺傳來源一些蛋白，可能為10％左右，包括確定CMS的那些編碼在mtDNA中；其它編碼在核DNA中。mtDNA編碼的蛋白在線粒體核糖體中合成并保留在線粒體中。核編碼的線粒體蛋白以前體的形式合成，該前體通常在N末端包含被稱為轉(zhuǎn)運肽或前序列的另外的氨基酸鏈。這種轉(zhuǎn)運肽起將蛋白定向于線粒體的作用；一旦蛋白位于線粒體內(nèi)，則它被蛋白酶除去。如果通常被編碼在mtDNA中的蛋白的DNA序列與線粒體轉(zhuǎn)運肽的DNA序列融合，并且產(chǎn)生的構(gòu)建體被導(dǎo)入并在核中表達，則產(chǎn)生的前體肽可被運至線粒體內(nèi)，最終產(chǎn)物可以與線粒體產(chǎn)生的形式相同的方式起作用。
我們總結(jié)出如果假設(shè)(i)正確，那么我們能通過表達DNA構(gòu)建體將雄性不育授予雄性能育植物，其中該DNA構(gòu)建體使得核編碼的細胞質(zhì)翻譯的ORF224蛋白被靶定于線粒體。類似的，我們總結(jié)如果假設(shè)(ii)正確，我們能通過表達DNA構(gòu)建體使pol CMS植物恢復(fù)雄性能育，其中該DNA構(gòu)建體使得核編碼的細胞質(zhì)翻譯形式的ATP6蛋白被靶定于線粒體。如果構(gòu)建體改變雄性不育/能育，那么orf224轉(zhuǎn)基因可被認為是合成的雄性不育的保持系，而atp6轉(zhuǎn)基因可被認為是合成的雄性能育的恢復(fù)系。對這些假設(shè)的進一步完善來自于觀察到如大多數(shù)植物線粒體轉(zhuǎn)錄物一樣，orf224和atp6轉(zhuǎn)錄物被改變(Stahl R.等(1994)核酸研究22，2109-2113)。植物線粒體轉(zhuǎn)錄物的改變包括將mRNA分子中的特定的C殘基轉(zhuǎn)變?yōu)楦淖兞吮痪幋a蛋白的氨基酸序列的U殘基(改變的mRNA編碼功能形式的蛋白)。atp6和orf224轉(zhuǎn)錄物在一個位點改變。在某種情況下導(dǎo)致氨基酸序列的一個改變。由于在細胞核中DNA構(gòu)建體的表達，其中該DNA構(gòu)建體能在轉(zhuǎn)基因煙草植物中將未改變的小麥ATP9蛋白靶定為線粒體授予雄性不育(Hernould，M.等(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90，2370-2374)，看來未改變的蔓青ATP6蛋白的表達/靶定也可導(dǎo)致雄性不育并起合成恢復(fù)基因的作用。
這種類型的合成恢復(fù)系原則上可被用來通過基因轉(zhuǎn)化產(chǎn)生新的恢復(fù)系。這將避免目前開發(fā)這些系的長時間和昂貴的植物育種過程。合成的保持基因的可獲得性可使得能通過可完全保持pol不育性的植物轉(zhuǎn)化產(chǎn)生這些系。這些系目前不存在，因此該技術(shù)將有效地通過基于pol的蔓青雜種除去提高產(chǎn)率的最后障礙。最后，類似的方法甚至也可能被用來產(chǎn)生非蔓青的作物的合成的恢復(fù)系和保持系，因此可開發(fā)全球性的用于CMS遺傳改造的保持和恢復(fù)的方法。
ATP6和ORF224蛋白的細胞核編碼的線粒體靶定形式可分別起合成的恢復(fù)和保持基因的作用的證據(jù)為了開始研究這些可能性，我們將對應(yīng)于atp6編碼序列的改變(A6e)和未改變(A6u)形式的DNA與編碼兩種線粒體靶定前序列，酵母COX4(C4)或Neurospora ATP9(A9)之一的DNA融合。通過將相同的前序列與未改變形式的orf224(ORFu)融合制備類似的構(gòu)建體。這些序列在其5’末端與mas2’啟動子連接(van der Leegt-Plegt，L.M.等(1992)植物細胞報道11，20-24)和在其3’末端與花椰菜花葉病毒35S RNA的聚腺苷酸化信號連接。通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將產(chǎn)生的構(gòu)建體導(dǎo)入蔓青的子葉中(Moloney，M.等(1989)植物細胞報道8，238-242)。我們不能再生ORFu被導(dǎo)入其中的植物。在將A9/A6u構(gòu)建體導(dǎo)入能育的蔓青后我們收獲的三種轉(zhuǎn)基因植物為部分雄性不育的，而在將A9/A6e構(gòu)建體導(dǎo)入不育pol CMS蔓青后我們收獲的一種植物是部分雄性能育的。這表明表明未改變形式的atp6的構(gòu)建體起雄性誘導(dǎo)或保持基因的作用，而改變形式起pol能育恢復(fù)系的作用。不幸的是，我們未能從表達任一構(gòu)建體的植物中收獲種子，因此未能表明能育/不育的變化可被遺傳轉(zhuǎn)至隨后的植物世代中或證實表型來自轉(zhuǎn)基因的表達。
最近的研究集中在構(gòu)建體的組裝，其中來自擬南芥的APETALA3(AP3)基因的發(fā)育調(diào)節(jié)啟動子(Jack，T.等(1994)細胞76，703-716)被用來驅(qū)動atp6和orf224構(gòu)建體的表達。由于其在雄蕊(以及花瓣)發(fā)育的極早期表達，AP3被選擇作為組織特異性啟動子。以前的數(shù)據(jù)表明與pol CMS相關(guān)的花粉發(fā)育的抑制是成熟前的，因此僅在雄蕊發(fā)育的早期發(fā)生；我們因此認為為了補償或模擬pol CMS表型，必須在雄蕊發(fā)育的早期表達構(gòu)建體。已完成或目前正構(gòu)建的隨后的構(gòu)建體包括“組成型”mas2’啟動子被用于表達那個。所有的構(gòu)建體被插入至雙轉(zhuǎn)化載體pRD400中，其中該載體被優(yōu)化用于在蔓青中的有效轉(zhuǎn)化并通過子葉轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入植物中。我們組裝的構(gòu)建體的總結(jié)和我們收獲的轉(zhuǎn)基因植物的表型示于下面表1中。
表1遺傳構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因植物的相應(yīng)表型構(gòu)建體1導(dǎo)入 KanR收獲 證實的 證實的轉(zhuǎn)基因植物的表型的植物 轉(zhuǎn)基因2AP3/C4-ORF3能育17 12 從幾乎完全不育(2株植物)Westar 至完全能育(大多數(shù)植株)的(nap) 可變的雄性不育；一些植株在花器官數(shù)目、形態(tài)學(xué)和同一性方面顯示出改變。AP3/A9-ORF ″ 21 7從幾乎完全不育(1株植物)至完全能育(大多數(shù)植株)的可變的雄性不育；一些植株在花器官、形態(tài)學(xué)和同一性方面顯示出改變。AP3/A9-A6e 雄性不 9 7所有植物為部分雄性不育；育 雄蕊和花瓣大小處于能育Westar Westar(nap)和estar(pol)CMS(pol) 植物之間。AP3/A9-A6u 能育20 9大多數(shù)植物為雄性能育，一Westar 些花部分不育；一些植物顯(nap) 示減小的雄蕊；淡黃色花瓣；輪同一性和/或器官數(shù)目變化。mas2/A9-A6e 雄性不2216大多數(shù)植物為部分雄性能育育；雄蕊和花瓣大小位于能Westar育westar(nap)和Westar(pol) (pol)CMS植物之間；一些植物顯示花輪同一性的變化；延長的花序和營養(yǎng)節(jié)間。AP3/GUS Westar139 與Westar(nap)相同；如所期(nap) 望的，在花瓣和雄蕊基部觀察到GUS表達。
1序列中存在的構(gòu)建體元件啟動子/編碼前序列的序列AP3，Arabidopsis APETELA3啟動子，C4，酵母COX4前序列；A9，Neurospora ATP9前序列；ORF，改變的orf224編碼序列；A6e，改變的atp6編碼序列；A6u，未改變的atp6編碼序列。
2通過使用來自NPTII基因的探針的Southern印跡分析所證實的。
3與A9前序列融合的表位標記改變的atp6編碼序列。
4改變的atp6編碼序列，無靶定的前序列。
表2的數(shù)據(jù)表明各種構(gòu)建體誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植物中的雄性不育或能育變化的頻率。在轉(zhuǎn)基因植物中觀察到的雄性能育/不育以及花結(jié)構(gòu)的一些變化示于圖2中。
示于圖2A左側(cè)和圖2B右側(cè)的花分別來自pol CMS Westar和能育Westar(nap)植物。其各自下面的圖(分別為2C和2D)顯示來自除去了花瓣和萼片的相同植物的花。如這些圖中所示，pol CMS植物的雄蕊和花瓣大大小于Westar(nap)花的雄蕊和花瓣。在控制的生長條件下，我們采用(20℃，16小時光照，15℃，8小時黑暗)，在幼嫩的pol CMS植物1花中形成的雄蕊比雌蕊的高度的一半小很多，不完全發(fā)育形成花藥，僅釋放少量的花粉。
表2具有改進的雄性能育/不育性的轉(zhuǎn)基因植物的數(shù)目構(gòu)建體 受體植物 能育1半能育2半不育3不育3AP3/A9-ORF Westar(nap) 631AP3/C4-ORF Westar(nap) 552AP3/A9-A6e PolCMS Westar 52AP3/A9-A6u Westar(nap) 9 6Mas2’/A9-A6e PolCMS Westar 18101與Westar(nap)不能區(qū)分。
2與Westar(nap)相比減少的花粉釋放；自交獲得的飽滿的種子莢果。
3最少的花粉釋放；自交獲得的差的結(jié)實4自交幾乎或完全沒有得到種子；一些mas2’/A9-A6e植物產(chǎn)生顯著的花粉，但未結(jié)種，因此看來為雌性和雄性不育。
如表1和2所示，在我們發(fā)現(xiàn)的約一半的轉(zhuǎn)基因植物中，與任一靶定前序列融合的改變的orf224編碼序列的AP-3驅(qū)動的表達證實能降低Westar(nap)植物的雄性能育以及誘導(dǎo)花的形態(tài)學(xué)變化。如通過在新開花的花粉中可見的花粉的數(shù)量所評價的不育性的程度以及其它花異常的性質(zhì)在不同程度上在不同的轉(zhuǎn)基因植物和有時在更小的程度上在各個植物的不同花序支上發(fā)生變化。在COX4(C4)和ATP9(A9)前序列構(gòu)建體之間在授予的表型或誘導(dǎo)雄性不育的頻率上沒有顯著的不同。對所獲表型的一些說明示于圖2E-H中，其顯示來自從中觀察到花粉產(chǎn)生發(fā)生變化的轉(zhuǎn)基因植物的花。與Westar(nap)相比，在這些植物中，花瓣和雄蕊的大小以及產(chǎn)生的花粉的量減少，雖然未到達它們在pol CMS植物中的減少程度。在轉(zhuǎn)基因植物40-8，A9-ORF轉(zhuǎn)化體(圖2E和2F)觀察到大多數(shù)極端的表型在這些花中，四片內(nèi)側(cè)的雄蕊轉(zhuǎn)化為心皮樣結(jié)構(gòu)；在兩個外側(cè)雄蕊上形成的花藥保持淡黃色并僅釋放極少量的花粉。
我們將各個植物自花受粉結(jié)種的能力評價為對其雄性/雌性能育性的實際測定方法。對于自交植物，我們通常將一個雜交袋放在花序的上面并輕輕地拍打以促進受粉。在正常的雄性能育植物的情況下，袋中的所有種子莢將被完全填滿；在這些條件下，pol CMS植物不產(chǎn)生或產(chǎn)生極少的種子。當(dāng)我們設(shè)法以這種方式讓表達AP3-A9-ORF構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物自交時，我們發(fā)現(xiàn)在一種情況下沒有獲得種子(轉(zhuǎn)基因植物40-8，圖2)，其它一些情況下，僅獲得一些種子。在結(jié)種方面顯示明顯減少，但保留了產(chǎn)生一些花粉的能力的那些植物被稱為“半不育”(表2)。通過該試驗，22株轉(zhuǎn)基因ORF植物中總共3株被證實為半不育。
當(dāng)通過AP3啟動子驅(qū)動時，與ATP9前序列融合的atp6基因的未改變形式的表達還證實能降低Westar(nap)植物的能育性(表1)。稍少于一半的收獲的表達該構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物顯示雄性能育的降低(表2)。然而，根據(jù)結(jié)種的能力雄性不育性的降低通常比ORF構(gòu)建體更顯著；顯示表型的所有轉(zhuǎn)基因植物被分類為半不育。具有降低的能育性的大多數(shù)植物還也具有小的淡黃色花瓣。由一株AP3/A9-A6u植物顯示的半不育表型示于圖2B和D中。我們還發(fā)現(xiàn)這種類型的構(gòu)建體以及ORF構(gòu)建體和第三種類型的AP3/A9-A6構(gòu)建體，AP3/A9-A6ep可增強pol CMS植物的不育性，其中在AP3/A9-A6ep中ATP6編碼序列被編碼小肽的序列打斷。pol CMS植物通常產(chǎn)生少量花粉；表達AP3-A9-A6u的pol CMS植物不釋放花粉。
如圖2I和J所示，pol CMS植物的改變的atp6構(gòu)建體的AP3驅(qū)動的表達導(dǎo)致表型的變化，其與它起合成恢復(fù)基因的作用的預(yù)測一致。這些轉(zhuǎn)基因植物的花具有pol CMS和能育Westar(nap)植物之間大小的花瓣和雄蕊。這些花的花藥發(fā)育成產(chǎn)生顯著量的花粉的小的黃色花藥，雖然不如雄性能育Westar(nap)植物多(表1)。所有轉(zhuǎn)基因植物顯示改變的表型(表2)，雖然植物與植物之間產(chǎn)生的花粉的量發(fā)生略微的變化。這些植物在給花序套袋時均能產(chǎn)生種子；兩個植物僅產(chǎn)生少量種子，同時剩余五株植物產(chǎn)生飽滿的莢果而未進行套袋或其它類型的干擾。因此后五株植物可被認為是在完全具有功能的意義上被恢復(fù)能育性。
我們還評價了當(dāng)使用“組成型”啟動子mas2’表達時，A9-A6e構(gòu)建體誘導(dǎo)pol CMS植物雄性能育性的能力。我們收獲的六株轉(zhuǎn)基因植物具有實質(zhì)上與通過AP3/A9-A6e植物產(chǎn)生的那些的相同的花(圖1A和1C)。其余植物產(chǎn)生較少量的花粉或幾乎不產(chǎn)生花粉。僅一株產(chǎn)生花粉的植物能形成顯著量的種子而不被人工受粉，這表明mas2’/A9-A6e植物的雌性能育性通常被降低。這與以前的使用這種類型的構(gòu)建體的結(jié)果一致，其中我們收獲了具有不能結(jié)種的能育花的植物。我們收獲的植物的第二個特性還與我們預(yù)先的結(jié)果一致從mas2’啟動子表達A9-A6e的所有植物顯示營養(yǎng)性生長的改變。尤其是，營養(yǎng)性和花序節(jié)間段比Westar(nap)或pol CMS Westar植物的那些長(圖3)；在一些轉(zhuǎn)基因植物中，葉的形態(tài)學(xué)也被改變。在任何采用AP3啟動子用于表達的植物中未觀察到類似的變化。因此，雌性能育性和其它異常的減少都來自從mas2’啟動子的融合蛋白的一般性表達。
對多種獨立轉(zhuǎn)化的植物中的類似類型的不育性改變的觀察為我們最初的假設(shè)提供非常強的支持，即(i)使得ORF224或未改變的ATP6多肽靶定于線粒體的構(gòu)建體可為雄性能育植物授予不育性，因此起合成的保持基因的作用；和(ii)使得改變的ATP6多肽靶定于線粒體的構(gòu)建體可起合成的恢復(fù)基因的作用。數(shù)據(jù)還表明為了避免對營養(yǎng)生長和雌性能育性的有害作用，必須使用組織特異性或可誘導(dǎo)啟動子表達這些構(gòu)建體。對C4-ORF表達植物40-8所RO植物(從轉(zhuǎn)化-再生方法獲得的植物)的R1后代的分析(見上文)提供了令人信服的證據(jù)，即觀察到的表型是可遺傳的并且是由于轉(zhuǎn)基因的原因。我們將20株這種植物培育至成熟。花表型的范圍顯著，從親本植物的極其異常，其中僅兩個為極其不育花藥形式，其余四個花藥轉(zhuǎn)化為雌蕊樣器官，至在許多表達該構(gòu)建體的RO植物中觀察到變化雄性能育性。所有R1后代植物包含轉(zhuǎn)基因，這表明原有的40-8 RO植物可能具有多于一個的基因拷貝。這進一步表明表達的不育性程度取決于基因劑量。該基因劑量作用提供另一種改變由轉(zhuǎn)基因植物表達的不育性程度的方法。
總之，我們的實驗代表第一種情況，其中雄性不育性通過同源宿主植物中線粒體ORF產(chǎn)物(orf224和未改變的atp6)的靶定來誘導(dǎo)，芥屬基因首次被用于此目的。我們的結(jié)果還強有力地表明A9-A6e構(gòu)建體的AP3驅(qū)動的表達可起pol CMS的不育性恢復(fù)基因的作用。這是我們注意到的第一種情況，其中CMS的天然形式被合成基因構(gòu)建體抑制。
我們的結(jié)果與其它研究者進行的實驗一致，這些研究者發(fā)現(xiàn)大豆CMS相關(guān)的ORF(He，S.等(1996).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93，11763-11768)或為改變的小麥ATP9基因(Hernould，M.等(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90.2370-2374)在異源受體植物煙草中的蛋白產(chǎn)物的表達/靶定可誘導(dǎo)雄性不育。令人感興趣的是，使用來自玉米和矮牽牛的CMS相關(guān)的ORF進行的類似類型的實驗導(dǎo)致獲得雄性不育植物(Chaumont，F(xiàn).等(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 92，1167-1171；Wintz H.等(1995)植物分子生物學(xué)28，83-92)。我們恢復(fù)雄性不育植物的頻率高于對大豆ORF所觀察到的，并難于與使用未改變的小麥ATP9基因的結(jié)果比較。
通過參考下面提供的用來說明本發(fā)明而非限制其范圍的實施例更容易理解本發(fā)明。
實施例I使用AP3/A9-A6e構(gòu)建體作為蔓青的顯性能育恢復(fù)基因在本實施例中，通過基因轉(zhuǎn)化將圖4所示的A9/A6e構(gòu)建體導(dǎo)入一品種，如通常通過(pol)細胞質(zhì)不育的Westar的基因組中。將基因?qū)雙ol細胞質(zhì)系中，獲得的產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因作為被期望為部分雄性能育。結(jié)種將該系自花受粉以產(chǎn)生A9/A6e轉(zhuǎn)基因純合的部分雄性能育的恢復(fù)系。接著可將該系與不同的pol CMS系雜交以產(chǎn)生恢復(fù)能育的F1雜種。
實施例II使用AP3/C4-ORF構(gòu)建體以增強蔓青的pol細胞質(zhì)雄性不育通過pol細胞質(zhì)對大多數(shù)蔓青基因型誘導(dǎo)的不育是不完全的，尤其是在較高溫度下。在雜交種子產(chǎn)生操作中，剩余花粉的產(chǎn)生導(dǎo)致可變化水平的CMS系的自花受粉。從這些種子培育的植物不是雜種并將具有降低的自身結(jié)種的能力。這些因素在一起可顯著程度地降低“雜交”種子分批的產(chǎn)率。在本實施例中，采用圖5所示的C4-ORF的顯性傳遞不育的特性以降低或消除CMS系中剩余花粉的產(chǎn)生，從而提高獲得的雜交種子的百分數(shù)，并因此提高雜交種子分批的產(chǎn)率。提高遺傳轉(zhuǎn)化將C4-ORF構(gòu)建體導(dǎo)入完全顯性能育Westar(nap)系中以產(chǎn)生包含C4-ORF轉(zhuǎn)基因的部分顯性能育系。接著讓該系自花受粉以產(chǎn)生部分顯性能育保持系，并也與相同細胞核基因型但具有pol細胞質(zhì)的未轉(zhuǎn)化系雜交以產(chǎn)生C4-ORF雜合的完全不育的polCMS系。
讓它與C4-ORF部分顯性能育保持系回交以產(chǎn)生C4-ORF純合的完全雄性不育pol CMS系。當(dāng)與pol恢復(fù)系雜交時，該CMS系產(chǎn)生能育F1雜種。通過將其作為雌性與nap細胞質(zhì)部分雄性能育轉(zhuǎn)基因C4-ORF保持系雜交來繁殖完全不育的pol CMS系。
雖然我們描述了使用AP3/C4-ORF構(gòu)建體提高pol CMS作為不育性的方法，AP3/A9-A6a和AP3/A9-A6ep構(gòu)建體也可被用于此目的，因為所有這些構(gòu)建體的表達導(dǎo)致完全雄性不育pol CMS轉(zhuǎn)基因植物。
雖然結(jié)合其具體的實施方案描述了本發(fā)明，但應(yīng)理解它能被進一步修改，通常根據(jù)本發(fā)明的原則，本申請將覆蓋本發(fā)明的任何改變，應(yīng)用或修改，它們包括脫離本發(fā)明公開，落在本發(fā)明涉及的現(xiàn)有技術(shù)的已知或常規(guī)實踐中，并可適用本文提出的必要技術(shù)特征，落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)的那些。
權(quán)利要求
1.一種在植物中提高天然產(chǎn)生的細胞質(zhì)雄性不育的方法；它包括下面的步驟a)向植物細胞的細胞核中導(dǎo)入本質(zhì)上由編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽的序列組成的基因構(gòu)建體，其中該序列在至少一個未改變形式的Brassica napus線粒體的atp6基因和orf224基因的上游和框內(nèi)與其融合；b)選擇具有步驟a)的基因構(gòu)建體的植物細胞；和c)誘導(dǎo)選擇的植物細胞再生以產(chǎn)生成熟的植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中植物為Brassica napus。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中使用植物轉(zhuǎn)化載體進行步驟b)。
4.一種將雄性能育恢復(fù)成細胞質(zhì)雄性不育植物的方法；它包括下面步驟a)向植物細胞的細胞核中導(dǎo)入本質(zhì)上由編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽的序列組成的基因構(gòu)建體，其中該序列在與異常CMS相關(guān)線粒體基因共轉(zhuǎn)錄的改變形式的正常線粒體基因的上游和框內(nèi)與其融合；b)選擇具有步驟a)的基因構(gòu)建體的植物細胞；和c)誘導(dǎo)選擇的植物細胞再生以產(chǎn)生成熟的植物。
5.權(quán)利要求4的方法，其中植物為Brassica napus。
6.權(quán)利要求4的方法，其中使用植物轉(zhuǎn)化載體進行步驟b)。
7.一種將雄性能育恢復(fù)成polima細胞質(zhì)雄性不育B.napus的方法；它包括下面步驟a)向B.napus植物細胞的細胞核中導(dǎo)入本質(zhì)上由編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽的序列組成的基因構(gòu)建體，其中該序列在改變形式的B.napus線粒體的atp6基因的上游和框內(nèi)與其融合；b)選擇具有步驟a)的基因構(gòu)建體的植物細胞；和c)誘導(dǎo)選擇的植物細胞再生以產(chǎn)生成熟的植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及提高天然發(fā)生的細胞質(zhì)雄性不育的方法以及恢復(fù)雄性能育的方法和其在雜交作物生產(chǎn)中的應(yīng)用。還公開了一種將雄性能育恢復(fù)成細胞質(zhì)雄性不育植物的方法;它包括下面步驟:a)向植物細胞的細胞核中導(dǎo)入本質(zhì)上由編碼線粒體轉(zhuǎn)運肽的序列組成的基因構(gòu)建體,其中該序列在改變形式的正常線粒體基因上游和框內(nèi)與其融合,該正常線粒體基因與非常規(guī)CMS相關(guān)的線粒體基因共轉(zhuǎn)錄;b)選擇具有步驟a)的基因構(gòu)建體的植物細胞;和c)誘導(dǎo)選擇的植物細胞再生以產(chǎn)生成熟的植物。
文檔編號C12N15/29GK1265151SQ98807637
公開日2000年8月30日 申請日期1998年5月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年5月30日
發(fā)明者格雷戈里·G·布朗 申請人:麥吉爾大學(xué)