專利名稱：一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥制藥領(lǐng)域，涉及蛋白質(zhì)和基因工程藥物的納米乳新型載藥系統(tǒng)， 具體涉及一種蛋白質(zhì)藥物新型納米乳載藥系統(tǒng)及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著生物科技及分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的高純度蛋白質(zhì)藥物出現(xiàn)并開(kāi)始應(yīng) 用于醫(yī)藥領(lǐng)域。蛋白質(zhì)藥物與其他藥物相比，具有高活性、特異性強(qiáng)、低毒性、生物功能明 確、成本低廉、成功率高、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，從而成為醫(yī)藥產(chǎn)品中的重要組成部分。自1982 年美國(guó)Lilly公司將第一個(gè)重組蛋白質(zhì)藥物_重組胰島素投放市場(chǎng)來(lái)，以蛋白質(zhì)藥物研發(fā) 為主的全球生物技術(shù)公司總數(shù)已近5000家，上市公司600余家。到目前為止，全球已批準(zhǔn) 適應(yīng)癥多達(dá)220種的150個(gè)蛋白質(zhì)藥物上市，其產(chǎn)值和銷售額已超過(guò)400億美元。雖蛋白 質(zhì)藥物發(fā)展迅速，但其研發(fā)方面還面臨著嚴(yán)峻和巨大挑戰(zhàn)，這根本原因在于以下自身特點(diǎn) 與不足(1)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，影響因素多，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，質(zhì)量不易控制和檢測(cè)，穩(wěn)定性差，使 其保存、運(yùn)輸過(guò)程均需低溫或凍干，使用也不方便；(2) —些蛋白質(zhì)藥物的分子量大，口服 給藥易受胃腸道PH、菌群及酶系統(tǒng)破壞，生物膜穿透性差，吸收困難，生物利用度低，非注射 給藥一般僅為百分之幾；(3)擴(kuò)散差、分配系數(shù)小使其難通過(guò)生物屏障及脂質(zhì)膜，傳遞效率 與靶向性較低；(4)顯著的肝、胃腸首過(guò)效應(yīng)，經(jīng)過(guò)首過(guò)效應(yīng)后僅保留2 3% ； (5)生物半 衰期短，體內(nèi)清除率高。由于蛋白質(zhì)藥自身特點(diǎn)，用藥方式大多只能用頻繁地注射給藥，但 這往往會(huì)對(duì)患者造成費(fèi)用高、順應(yīng)差、安全性差、治療率低等問(wèn)題。蛋白質(zhì)藥物和其他藥物 一樣都要理想、合適的載藥系統(tǒng)，才能發(fā)揮出最佳的藥物效果。由于載藥系統(tǒng)是蛋白質(zhì)藥物 研發(fā)是非常關(guān)鍵和重要環(huán)節(jié)，用藥物載藥系統(tǒng)來(lái)改變蛋白質(zhì)藥物自身不足，成為當(dāng)前研發(fā) 白勺 ^^ ； ^^ O由于蛋白質(zhì)藥物不穩(wěn)定性和成本原因，在研究中通常先要用蛋白質(zhì)模型藥物進(jìn)行 研究。因此，國(guó)內(nèi)外蛋白質(zhì)藥物研發(fā)中，通常用具有性質(zhì)穩(wěn)定，在多數(shù)生化反應(yīng)中不發(fā)生作 用，價(jià)格低廉，蛋白分子量較小、溶解度較大、穩(wěn)定性較好且容易較大量、高純度的制備的人 和牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)藥物研發(fā)中標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)模型藥物。同時(shí)，它還常被作為生物 相容性和水溶性的生物大分子被廣泛研究。由于蛋白質(zhì)藥物的載藥系統(tǒng)是蛋白質(zhì)藥物研發(fā)中重要和關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，因此標(biāo)準(zhǔn) 的蛋白質(zhì)模型藥物牛和人血清白蛋白的載藥系統(tǒng)也成為國(guó)內(nèi)外蛋白質(zhì)藥物研究的熱點(diǎn)。 以BSA為蛋白質(zhì)藥物模型，國(guó)外內(nèi)研究主要有胡凱莉(2009)制備的乳鐵蛋白修飾聚乳 酸-聚羥基乙酸和乳鐵蛋白修飾聚乳酸納米粒載藥系統(tǒng)[1]；張慧芳(2009)以丙烯酸和 N-乙烯基吡咯烷酮為反應(yīng)單體，用原位聚合法制備BSA納米囊和微球[2]。薛璇(2008)制 備出粒徑為2.0 3. Oum，載藥量為14. 72%，包封率為92. 07%的BSA凝膠[3]；王黎(2007) 制備的BSA多囊脂質(zhì)體M。Byimg Soo Kim(2009)用聚乳酸-聚乙二醇酸(PLGA)和聚乙烯 醇為材料，制備的用FITC標(biāo)記的BSA微球[5] ；Yunqing Kang (2009)以聚L-丙交酯(PLLA) 材料，制備 1. 22um 的 BSA 微球[6] ；MarciIene Μ. A (2009)制備的直徑 170 520nm 的 BSA納米球[7] ；Yujun Wang (2009)用殼聚糖為材料，制備直徑為10 20nm的磁性BSA納米粒 [8] J. C. Gayet (1996)制備出 BSA-PEG 凝膠[9] ；Tse-Ying Liu (2005)制備含缺鈣性羥基磷 灰石BSA控釋系統(tǒng)_ ；M. Igartua (1998)用PLGA材料制備出粒徑在0. 6 2um的BSA微 球[11]；曹金娜(2009)制備的包封率為46. 82%的N-三甲基殼聚糖BSA脂質(zhì)體[12]；夏洪 男(2009)用生物可降解材料PLG607材料，用溶劑揮發(fā)法制備了粒徑為40 70im，包封 率為46. 3%的BSA微球[13]；黃婉丹(2009)以PLGA為材料，制備復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備 BSA-PLGA微球[14]；張良珂(2005)用Ca2+，Ba2+為交聯(lián)劑，制備果膠BSA凝膠微丸[15]；梁曉 暉(2008)制得平均粒徑為284. lnm，包封率為34. 21%,Zeta電位為+27. ImV的肝靶向BSA 脂質(zhì)體[16]。國(guó)內(nèi)專利主要有戴傳云以磷脂和海藻酸鈉為材料，制備的BSA多泡脂質(zhì)體 [CN1727001A]；張陽(yáng)德的BSA納米粒[CN1736489A]；張麗娜以殼聚糖和海藻酸鈉為材料，制 備BSA微囊[CN1546557A]；王身國(guó)制備親水性藥物BSA釋放體系[CN1393217A]、脂肪族內(nèi) 酯共混物釋藥體系[CN1393267A]和生物可降解持續(xù)釋藥體系[CN1393218A]；張政樸以四 臂型聚乙烯丙交酯為材料，制備BSA微球[CN1927906]；王榮民制備納米級(jí)BSA微球及納米 囊[CN101401490A]；杜予民制備羧甲基殼聚糖納米粒[CN100393782C]。以人血清白蛋白 (HAS)為藥物模型的主要有孟慧(2009)用PLGA、N-甲基_2_卩比咯烷酮、苯甲酸芐酯為材料 制備可注射HSA凝膠[17]。劉世蕓(2009)以用聚乳酸為材料，用復(fù)乳法制備出粒徑在10 40 μ m，包封率為85. 25%，負(fù)載率為14. 52%的復(fù)合HSA微球[18]?？傊?，以牛和人血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)模型藥物的蛋白質(zhì)藥物載藥系統(tǒng)研究 主要集中在納米粒、納米囊、納米微球、微囊、多泡脂質(zhì)體、脂質(zhì)體；藥用輔料主要是PLA、 PLAG、PLG607、三甲基殼聚糖、殼聚糖、聚乳酸-聚羥基乙酸、聚3-羥基丁酸酯、磷脂和海藻 酸鈉、PVP、PLLA等；制備方法多用復(fù)乳_(kāi)溶劑揮發(fā)法、原位包合法、乳化交聯(lián)法、吸附法等。 這些載藥系統(tǒng)或藥用輔料、制備方法存在以下問(wèn)題(1)藥物包封率及載藥量低；(2)使用 材料毒副作用較大，制備過(guò)程中有機(jī)溶媒殘余量大，毒性大；(3)制造工藝復(fù)雜、條件要求 高、工藝操作時(shí)間長(zhǎng)；(4)制備過(guò)程易破壞藥物；(5)具有突釋效應(yīng)；(6)生物相容性不理 想，產(chǎn)率低、不易滅菌、穩(wěn)定性和重復(fù)性差，難大規(guī)模生產(chǎn)；(7)原料價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高。 用納米乳載藥系統(tǒng)可較好地解決。納米乳(Nanoemulsion)，曾稱微乳狀液、微乳液或微乳劑，現(xiàn)又稱納米乳液、納 米乳狀液、納米乳劑，是一個(gè)由油、水、表面活性齊U、助表面活性劑四個(gè)組分組成的、粒徑為 1 lOOnm、液滴多為球形，大小比較均勻，透明或半透明、具熱力學(xué)穩(wěn)定和各向同性、熱壓 滅菌或高速離心穩(wěn)定不分層的膠體分散系統(tǒng)。其具有的顯著特點(diǎn)有各向同性的透明液體， 熱力學(xué)穩(wěn)定，經(jīng)熱壓滅菌或高速離心不分層；自發(fā)形成、工藝簡(jiǎn)單，易于制備、制備過(guò)程不需 特殊設(shè)備、制劑質(zhì)量穩(wěn)定；在一定程度上能保護(hù)藥物在胃腸、肝臟內(nèi)免遭酶解，避免藥物首 過(guò)效應(yīng)；粒徑小，增強(qiáng)藥物在胃腸道吸收，提高生物利用度；改變藥物在體內(nèi)分布，具有一 定的組織與器官靶向性；對(duì)于易水解藥物保護(hù)作用，有緩釋作用。由于納米乳以上的顯著 優(yōu)勢(shì)，因此在國(guó)內(nèi)外研究如火如荼，尤其是在蛋白質(zhì)藥物方面。研究主要有葛偉(2009) 制備了胃癌特異性(MAGE1-HSP70/SEA)納米乳疫苗，可明顯提高細(xì)胞的免疫應(yīng)答，具有明 顯抗腫瘤活性[19’2°] ；Makidon(2009)制備了洋蔥伯克氏菌17kDa的外膜蛋白納米乳疫苗。 免疫后，可明顯提高CD-I小鼠血清的IgG和SIgA水平，增強(qiáng)抗體交叉中和反應(yīng)水平[21]； Bielinska(2008)制備HIV gpl20重組抗原水包油納米乳[22] ；Paul E(2008)用大豆油、酒精為材料，制備出粒徑小于400nm無(wú)需注射的納米乳乙肝疫苗。實(shí)驗(yàn)證實(shí)該疫苗無(wú)毒、免疫 效果好、可產(chǎn)生長(zhǎng)久的免疫力[23]；葛偉(2008)制備了腫瘤基因工程(MAGE-1/HSP70/SEA) 納米乳疫苗，口服、皮下、靜脈和腹腔注射4種途徑免疫C57BL/6小鼠后，都能有效地抑制腫 瘤生長(zhǎng)[24]。Bielinska(2007)用非離子表面活性劑為原料，制備含炭疽芽孢桿菌保護(hù)性 抗原(rPA)納米乳[25]；孫玉靜(2005)包裹含腫瘤特異性抗原MAGE-1-HSP70融合蛋白與 適量超抗原SEA配比組成的復(fù)合抗原，制備出腫瘤基因工程納米乳疫苗。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明能 顯著激活針對(duì)MAGE-I的細(xì)胞免疫反應(yīng)，對(duì)小鼠腫瘤模型能產(chǎn)生明顯的治療效果[26]。師瑞 (2005)研制出胃癌MG7基因特異性納米乳疫苗具有將強(qiáng)的免疫原性和較強(qiáng)的抗腫瘤作用 [27]。Hamoudal (2001)制備I型單純性皰疹、流感病毒A和牛痘的納米乳疫苗[28]。上述用 納米乳作為蛋白質(zhì)藥物的載藥系統(tǒng)成功研究為本發(fā)明提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和可行性。

發(fā)明內(nèi)容
理想藥物及其制劑應(yīng)遵循“三效”、“三小”和“五便”原則，“三效”高效、速效、長(zhǎng)
效；“三小”劑量小、副作用小、毒性小；“五便”生產(chǎn)、儲(chǔ)藏、運(yùn)輸、攜帶、使用。而理想載藥 系統(tǒng)的則應(yīng)具有(1)所用全部輔料均是藥用輔料，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)、生物相容性好，安全無(wú) 毒副作用；(2)載藥量大，能滿足用藥要求；(3)包封率高，至少80%以上；(4)生產(chǎn)過(guò)程和 工藝簡(jiǎn)單，易推廣、無(wú)有積溶劑殘留；(5)制劑質(zhì)量穩(wěn)定、安全，有效；(6)粒徑小，吸收快，在 體內(nèi)維持時(shí)間長(zhǎng)，且具有一定的緩釋和靶向作用。設(shè)計(jì)思路由于蛋白質(zhì)藥物在醫(yī)藥制藥領(lǐng)域非常重要地位，其載藥系統(tǒng)成為研究 熱點(diǎn)。針對(duì)蛋白質(zhì)藥物本身特點(diǎn)及載藥系統(tǒng)中存在不足與缺陷，根據(jù)藥物所遵循的三原則 和理想載藥系統(tǒng)的要求，利用現(xiàn)代納米乳技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行包裹，提出一種包封率高 和載藥量大、制備過(guò)程和工藝簡(jiǎn)單、使用藥用輔料安全且無(wú)有機(jī)溶劑殘留，且可極大提高蛋 白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性、成本低廉、便于應(yīng)用和推廣的，粒徑在1 IOOnm范圍，符合納米乳質(zhì)量 要求的蛋白質(zhì)藥物新型納米乳載藥系統(tǒng)。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案是一種蛋白質(zhì)藥物新型納米乳載藥系統(tǒng)，由下列部分 組成0. 15%蛋白質(zhì)藥物、10% 30%的表面活性劑、5% 25%的助表面活性劑、 3% 20%的油相、0% 10%的穩(wěn)定劑，20% 70%的水相，所述表面活性劑為聚山梨酯 或聚氧乙烯脂肪酸酯，助表面活性劑為失水山梨醇脂肪酸酯或者C2 C4的一元醇或多元 醇，所述油相為食用藥用液體石蠟、食用色拉油或有機(jī)酸酯，所述水相為蒸餾水，生理鹽水， pH為6. 5 7. 5磷酸鹽緩沖液中的一種或幾種，所述穩(wěn)定劑為甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。所述的蛋白質(zhì)藥物包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰島素、肌紅蛋白，或者水 溶性或難溶性蛋白質(zhì)類似藥物，所述蛋白質(zhì)藥物濃度范圍牛血清白蛋白1 10% ；胰島 素1 5% ；肌紅蛋白1 10% ；人血清白蛋白1 10%。所述聚山梨酯為吐溫-80、吐溫-85、吐溫60中的一種或幾種，所述聚氧乙烯脂 肪酸酯為聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一種及一種以上組合；其有效量為吐 溫-80 10 30%、吐溫-85 10 30%、吐溫60 :5 30%、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40) 10 30%、聚氧乙烯蓖麻油(EL35) :10 30%。所述失水山梨醇脂肪酸酯是司盤(pán)-85、司盤(pán)80和司盤(pán)60中的任一種及一種以上組 合；其有效量為司盤(pán)-85 5 15%、司盤(pán)80 5 15%、司盤(pán)60 5 10%。
所述C2-C4的一元醇或多元醇為無(wú)水乙醇、正丁醇、甘油、1，3-丁二醇、1，3-丙二 醇中的任一種，其有效量為無(wú)水乙醇5 10% ；甘油5 10% ；1，3-丙二醇5 10% ； 1，3_ 丁二醇5 10%，正丁醇5 10%。較優(yōu)選組合表面活性劑與助表面活性劑的互配為吐溫80/司盤(pán)80、吐溫85/司 盤(pán) 85、RH40/ 丙二醇、EL35/ 丙二醇。所述有機(jī)酸酯為肉豆蔻酸異丙酯(IPM)、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一種， 其中油相的有效量分別為IPM :10 20%、油酸乙酯5 20%、乙酸乙酯10 20%、 GTCC :3 15%。所述穩(wěn)定劑的有效量為甘露醇1 10%、甘氨酸1 10%、丙氨酸1 10%。優(yōu)選EL35 丙二醇IPM(27% 9% 3% )，蛋白質(zhì)藥物濃度4. 5%和生理鹽 水56. 5%，丙氨酸5%。所述納米乳的粒徑為1 lOOnm。所述納米乳載藥系統(tǒng)可以是上述納米乳的水和緩沖液無(wú)限稀釋液。本發(fā)明的另一目的是提供一種蛋白質(zhì)藥物新型納米乳載藥系統(tǒng)的制備方法，具體 包括下列步驟1)按配方稱取蛋白質(zhì)藥物、溶劑、表面活性劑、助表面活性劑、油相、穩(wěn)定劑、水相2)將所述量的表面活性劑與蛋白質(zhì)藥物混勻且使牛血清白蛋白部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性劑讓蛋白質(zhì)藥物完全溶解，得到澄清的溶液；4)再加入所述量的油相和穩(wěn)定劑，攪拌下緩慢加入處方量70%水相，得到澄清的 溶液；5)最后再加入余量水相，混勻，得到澄清透明的納米乳。所述步驟⑵的混勻?yàn)?°C下，轉(zhuǎn)速為50 100r/m攪拌。所述步驟(4)中的攪拌為在25°C 37°C恒溫水浴下，轉(zhuǎn)速為100 200r/m攪拌。所述制備方法還包括納米乳的除菌、檢測(cè)和包裝步驟，所述除菌為采用0. 2μπι微 孔濾膜過(guò)濾。本發(fā)明的蛋白質(zhì)藥物新型納米乳載藥系統(tǒng)是由表面活性劑、助表面活性劑、油 相、水相及穩(wěn)定劑組成。制備出的該納米乳是粒徑在1 IOOnm間的乳滴分散在另一種液 體中形成的具有各向同性的熱力學(xué)穩(wěn)定的膠體分散系統(tǒng)。處方設(shè)計(jì)原則納米乳作為藥物載體，首先應(yīng)在國(guó)家食品藥品衛(wèi)生藥用輔料目錄， 并符合藥物載體基本要求，即無(wú)毒、無(wú)刺激、無(wú)不良藥理作用、具有良好的生物相容性、不影 響主藥的藥效和穩(wěn)定性；另外由于納米乳自身特性，它對(duì)各處方組成還有特殊的要求，在用 滴定法繪制偽三元相圖的基礎(chǔ)上，篩選出形成穩(wěn)定的納米乳區(qū)的較大區(qū)域作為其最優(yōu)化處方。表面活性劑是納米乳形成所必需的物質(zhì)，其主要作用是降低界面張力形成界面 膜，促使納米乳形成；增加主藥的溶解性，確保制劑的穩(wěn)定性。表面活性劑分為非離子型表 面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、嵌段共聚物、兩性離子表面活性劑、氟化 表面活性劑6類。目前較常用的脂肪酸山梨坦(親油性)、聚山梨酯(吐溫類，親水性)、聚 氧乙烯脂肪酸酯類(商品名Myr j，親水性)、聚氧乙烯脂肪醇醚類(商品名Brij，親水性)、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物類(聚醚型，商品名Poloxamer或Pluronic)、蔗糖脂肪酸酯類和 單硬脂酸甘油酯、琥珀酸甘油酯/Brii類和EmLphor、Labraso 1。但是表面活性劑的選擇決 定于所形成的納米乳的特性和使用目的。HLB值在4 7的表面活性劑可制備W/0型納米 乳，HLB值在8 18內(nèi)的表面活性劑可制備0/W型納米乳。本發(fā)明采用高HLB值的表面活 性劑吐溫類和聚氧乙烯脂肪酸酯類，這些表面活性劑，無(wú)毒無(wú)刺激，生物相容性好，有一定 的營(yíng)養(yǎng)作用，是制備各種納米乳的較好輔料。優(yōu)選吐溫60、吐溫80、吐溫85、聚氧乙烯蓖 麻油(EL35)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40)。納米乳的形成還要求有短暫的負(fù)表面張力。因此，常需要有助表面活性劑的參與。 助表面活性劑有三方面作用協(xié)助表面活性劑降低界面張力，降低表面活性劑分子間的排 斥力；增加界面流動(dòng)性，減少納米乳形成時(shí)的界面彎曲能，使納米乳自發(fā)形成；調(diào)節(jié)表面活 性劑的HLB值，使表面活性劑在油-水界面有較大的吸附。最常用的是適宜HLB值的非離 子表面活性劑。本發(fā)明用目前最常用的司盤(pán)類(85、60、80)為其主要的助表面活性劑，同時(shí) 還加入具有增強(qiáng)助表面活性劑的作用的低鏈醇類溶劑(乙醇、甘油、1，3_ 丁醇、正丁醇，丙 二醇)，可讓納米乳中所使用的油相與界面膜上表面活性劑分子之間保持滲透和聯(lián)系，并易 于與表面活性劑形成界面膜，從而更有利于納米乳的形成。本發(fā)明采用的油相有色拉油、肉豆蔻酸異丙酯、油酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸/葵酸 三甘油脂(GT°C C)、藥用液體石蠟中等，這些油相材料均可食用，無(wú)毒無(wú)刺激，生物相容性 好，有一定的營(yíng)養(yǎng)作用，是制備各種納米乳的主要醫(yī)藥輔料。本發(fā)明還加入少量的穩(wěn)定劑O 10%，可讓本發(fā)明的劑型穩(wěn)定性更好，便于儲(chǔ)存。本發(fā)明與其它現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的有益效果1.解決蛋白質(zhì)和基因工程藥物的穩(wěn)定性差，制備蛋白質(zhì)的納米乳可極大蛋白質(zhì)提 高其穩(wěn)定性。2.制備的蛋白質(zhì)藥物新型納米乳載藥系統(tǒng)可進(jìn)一步加入任意比例的水分稀釋，熱 力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可用微孔濾膜過(guò)濾除菌，易于制備、運(yùn)輸和儲(chǔ)存、澄清透明的納米乳；3.解決目前蛋白質(zhì)的藥物存在的藥物包封率及載藥量低，本發(fā)明制備的蛋白質(zhì)藥 物新型納米乳載藥系統(tǒng)的載藥量大，包封率高，提高藥效。4.本發(fā)明所選擇的原料均是藥用輔料，制備過(guò)程不涉及任何有機(jī)溶劑，無(wú)殘留，安 全無(wú)毒，制備過(guò)程溫和，對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)破壞作用。5.本發(fā)明采用的配方和方法簡(jiǎn)單可行、成本低廉，可以便于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。


1.部分蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳外觀圖，圖中主要處方依次為1號(hào)為吐溫80、司盤(pán)80、IPM ；2號(hào)為吐溫85、司盤(pán)85、 IPM、3 號(hào)為PMH40/丙二醇、吐溫 85、司盤(pán) 85、IPM、4 號(hào)為EL35、丙二醇、IPM。2.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳透射電鏡圖，3.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳粒徑與粒度分布圖，4. BCA法檢測(cè)蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程圖，5.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩(wěn)定性部分研究結(jié)果圖，圖中1和2號(hào)處方質(zhì)量穩(wěn)定，3號(hào)發(fā)生明顯絮凝，4、5號(hào)變成半透明，有明顯破乳和乳析。6.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳室溫放置不同時(shí)間的SDS-PAGE圖，圖6從做左到右條帶次依次為最優(yōu)含4. 5%的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納 米乳在室溫放置30、60、180、360d ；而相同質(zhì)量比的牛血清白蛋白的溶液室溫放置30和 60d。7.不同pH下的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的電位，8.不同溫度下的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的粒徑，9.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的電泳分析其完整性圖，從左到右的順序依次為空白納米乳劑未破乳上清，空白納米乳劑未破乳沉淀，空 白納米乳劑破乳上清，空白納米乳劑破乳沉淀，蛋白分子Marker、蛋白質(zhì)模型藥物牛血清 白蛋白納米乳劑未破乳上清，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑未破乳沉淀，蛋白質(zhì) 模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑破乳上清，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑破乳沉 淀、牛血清白蛋白水溶液。10.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的免疫印跡分析其特異性圖，從左到右的順序依次為牛血清白蛋白水溶液，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米 乳劑破乳沉淀，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑破乳上清，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清 白蛋白納米乳劑未破乳沉淀，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳劑未破乳上清，蛋白分 子預(yù)染Marker、空白納米乳劑破乳沉淀、空白納米乳劑破乳上清、空白納米乳劑未破乳沉 淀、空白納米乳劑未破乳上清。11.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳在體外抗腐蝕圖，從右到左的順序依次為條帶1和2分別為牛血清白蛋白水溶液放入水中0. 5h， lh,條帶3和4分別為牛血清白蛋白水溶液放入人工胃液中0. 5h，lh,條帶5、6、7分別為蛋 白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳處方1水溶液放入人工胃液中0. 5h、lh、3h，條帶8、9、10 分別為蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳處方2水溶液放入人工胃液中0. 5h、lh、3h。12.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳對(duì)正常小鼠口服后，IgG效價(jià)柱形圖，13.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳對(duì)正常小鼠口服后，IgG效價(jià)變化折線 圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體試驗(yàn)例中選擇目前常用的兩種比較標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)模型藥物人和牛血 清白蛋白、肌肉紅蛋蛋白和胰島素共4種蛋白質(zhì)藥物為本發(fā)明的納米乳載藥系統(tǒng)的藥物有 效成分；在實(shí)施例來(lái)用目前用的最多的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白為藥物載體，進(jìn)一步 對(duì)闡述和證實(shí)蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)的有益效果。由于蛋白質(zhì)藥物種類繁多， 不可能一一舉例，因此并不意味著本發(fā)明僅僅限于此。實(shí)施例實(shí)施例1 蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)(IOOg)1)稱取牛血清白蛋白5g、正丁醇5g、吐溫_8030g、司盤(pán)_8010g、藥用IPM 10g、蒸 餾水39g.2)將所述量的表面活性劑與牛血清白蛋白混勻，并在轉(zhuǎn)速為50 100r/m恒溫磁力攪拌器攪拌，溫度在4°C下先讓牛血清白蛋白部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性劑和溶劑讓牛血清白蛋白完全溶解，得到澄清的溶 液；4)再加入所述量的油相和穩(wěn)定劑Ig甘露醇，25°C 37°C恒溫水浴，并在轉(zhuǎn)速為 100 200r/m恒溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入約70%處方量蒸餾水，得到澄清的溶液；5) 最后再加入余量的蒸餾水，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔濾膜過(guò)濾除菌，檢測(cè)質(zhì)量合格后，灌裝、密封、保存。制備的蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白的納米乳載藥系統(tǒng)外觀黃色、澄清透明、粒徑在 1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為4. 5%，包封率為93%，室溫和 4°C放置半年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例2 蛋白質(zhì)藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取人血清白蛋白lg、甘油5g、吐溫_8010g、司盤(pán)_805g、藥用液體石蠟5g、生 理鹽水69g，備用；步驟2)、3)同實(shí)施例1相同；4)再加入所述量的油相和穩(wěn)定劑5g甘露醇，25°C 37°C恒溫水浴，并在轉(zhuǎn)速為 100 200r/m恒溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入蒸餾水，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量的蒸餾水，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔濾膜過(guò)濾除菌，檢測(cè)質(zhì)量合格后，灌裝、密封、保存。制備的蛋白質(zhì)藥物人血清白蛋白的納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為1. 9%，包封率為93%，室溫和4°C 放置半年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例3蛋白質(zhì)藥物胰島素納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取胰島素0. 5g、無(wú)水乙醇5g、吐溫_6010g、司盤(pán)_805g、色拉油5g、甘氨酸5g、 蒸餾水69g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物胰島素納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm間， 12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為0. 49%，包封率為99%，室溫和4°C放置半年 后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例4蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取牛血清白蛋白8g、丙二醇5g、吐溫-6030g、司盤(pán)_6010g、GTCC 10g、 ρΗ6· 80. OlM磷酸鹽緩沖液32g，備用；步驟2)、3)同實(shí)施例1相同；、4)再加入所述量的油相和穩(wěn)定劑5g丙氨酸，25 V 37°C恒溫水浴，并在轉(zhuǎn)速為 100 200r/m恒溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入蒸餾水，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量的磷酸鹽緩沖液，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔濾膜過(guò)濾除菌，檢測(cè)質(zhì)量合格后，灌裝、密封、保存。制備的蛋白質(zhì)藥物胰島素納米乳載藥系統(tǒng)外觀深黃色、澄清透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為7. 2%，包封率為90%，室溫和4°C 放置半年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例5 蛋白質(zhì)模型藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取人血清白蛋白 4. 5g、l，3 丁二醇 10g、EL3520g、司盤(pán) _8015g、GTCClOg、 pH7. 40. OlM磷酸鹽緩沖液37. 5g，備用；步驟2)、3)同實(shí)施例1相同。
10
4)再加入所述量的油相和穩(wěn)定劑3g甘氨酸，25°C恒溫水浴，并在轉(zhuǎn)速為100 200r/m恒溫磁力攪拌器攪拌，緩慢加入蒸餾水，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量的磷酸鹽緩沖液，混勻，得到澄清透明的溶液。6)最后用微孔濾膜過(guò)濾除菌，檢測(cè)質(zhì)量合格后，灌裝、密封、保存。制備的蛋白質(zhì)藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，實(shí)際載藥量4. 1 %，包封率91 %，室溫和4°C 放置半年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例6 蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取牛血清白蛋白 10g、l，3 丁二醇 5g、RH4027g、GTCC 3g、甘露醇 10g、 ρΗ7· 40. 05Μ磷酸鹽緩沖液45g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀深黃色、澄清、透明、粒徑在 1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為9. 1 %，包封率為91 %，室溫和 4°C放置三個(gè)月后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例7 蛋白質(zhì)藥物胰島素蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取胰島素2g、甘油10g、EL3530g、液體石蠟15g、甘氨酸IOg pH7. 40. IM磷酸 鹽緩沖液33g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為1. 76 %，包封率為88 %，室溫和4°C 放置半年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例8 蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取牛血清白蛋白15g、甘油10g、EL3530g、乙酸乙酯10g、0. 9%生理鹽水35g， 備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀深黃色、澄清、透明、粒徑在 1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為13.8%，包封率為92 %，室溫 和4°C放置三個(gè)月后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例9 蛋白質(zhì)模型藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取人血清白蛋白10g、甘油5g、RH-4030g、司盤(pán)_855g、色拉油15g、pH6. 80. IM 磷酸鹽緩沖液30g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為8. 7%，包封率為87%，室溫和4°C 放置三個(gè)月后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例10 蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取牛血清白蛋白lg、無(wú)水乙醇10g、RH_4014g、司盤(pán)_605g、油酸乙酯5g、甘氨 酸10g、蒸餾水55g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清、透明，粒徑在1 IOOnm間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為0. 96 %，包封率為96 %，室溫和4°C 放置一年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例11 蛋白質(zhì)藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取肌紅蛋白10g、正丁醇10g、吐溫8020g RH-40 10g、司盤(pán)-80 5g、乙酸乙酯20g、丙氨酸lg、蒸餾水24g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm 間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為4. 25%，包封率為85%，室溫和4°C放置 一年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例12 蛋白質(zhì)藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取肌紅蛋白5g、吐溫8530g、司盤(pán)-8515g、IPM20g、蒸餾水30g，備用；步驟2)、 3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清、透明、粒徑在1 IOOnm 間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，載藥量為4. 35%，包封率為87%，室溫和4°C放置 半年后，納米乳無(wú)明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例13 蛋白質(zhì)藥物肌紅蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取肌紅蛋白lg、甘油5g、吐溫8520g、EL3510g、司盤(pán)-855g、GTCC 15g、甘氨酸 lg、蒸餾水43g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同。制備的蛋白質(zhì)藥物人血清白蛋白的納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm之間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，實(shí)際載藥量4. 5 %，包封率92 %，室溫和 4°C放置半年后，納米乳不發(fā)生明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例14 蛋白質(zhì)模型藥物人血清白蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取人血清白蛋白5g、丙二醇10g、吐溫6010g、吐溫8015g、司盤(pán)-8515g、油酸 乙酯15g、甘氨酸5g、甘露醇5g、蒸餾水20g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同制備的蛋白質(zhì)藥物人血清白蛋白的納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm之間，12000rpm, IOmin高速離心后不分層，實(shí)際載藥量4. 5%，包封率92%。室溫和 4°C放置半年后，納米乳不發(fā)生明顯的絮凝、分層和藥物析出。實(shí)施例15 蛋白質(zhì)藥物胰島素蛋白納米乳載藥系統(tǒng)1)稱取胰島素5g、吐溫8510g、吐溫8015g、司盤(pán)_8515g、液體石蠟10g、甘氨酸5g、 甘露醇5g、蒸餾水35g，備用；步驟2)、3)、4)、5)、6)同實(shí)施例1相同制備的蛋白質(zhì)藥物胰島素納米乳載藥系統(tǒng)外觀澄清透明、粒徑在1 IOOnm之間， 12000rpm, IOmin高速離心后不分層，實(shí)際載藥量4. 5 %，包封率91 %。試驗(yàn)例在以下的試驗(yàn)例，主要用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳為蛋 白質(zhì)藥物的代表進(jìn)行證明本發(fā)明蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)及其制備方法所帶來(lái) 的效果。試驗(yàn)材料與儀器設(shè)備試驗(yàn)材料牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, Fraction V, > 98% ), Sigma 公司生產(chǎn)；吐溫80、吐溫85、吐溫60、司盤(pán)80、司盤(pán)85、司盤(pán)60購(gòu)至中國(guó)上海國(guó)藥集團(tuán)；BCA 試劑盒，購(gòu)至武漢博士德公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)，德國(guó) BASF公司生產(chǎn)，購(gòu)至北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；GTCC英國(guó)CRODA公司生產(chǎn)，購(gòu)至北京 鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司；乙酸乙酯、油酸乙酯均購(gòu)至北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司。 低分子蛋白Marker和預(yù)染蛋白Ladder Marker均購(gòu)至Fermentas公司。儀器設(shè)備透射電鏡(荷蘭PHILIPS公司)；NanOZS90Zeta電位及粒度分析儀(英 國(guó)馬爾文公司)；SDS-PAGE電泳裝置電泳儀(Mini-Protein III)、半干電轉(zhuǎn)儀、酶標(biāo)儀、洗
12板機(jī)均是BIO-RAD公司；ND-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)NanoDrop公司)、藥物穩(wěn)定檢測(cè)箱 等國(guó)家免疫制劑技術(shù)工程研究中心現(xiàn)有儀器。試驗(yàn)例1 蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白的納米乳制備及其理化性質(zhì)檢測(cè)1.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白的納米乳最優(yōu)處方的篩選油相的篩選選擇IPM(CH)、色拉油(C17 22)、乙酸乙酯(C4)、油酸乙酯(C20)、GTCC (C18)、 液體石蠟(C16 C20)等6種不同碳鏈長(zhǎng)短的油，20°C黏度大小依次為液體石蠟(110 230mPas)、GTCC (25. 0 33. OmPas)、色拉油(8. 5mPas)、IPM (5 6mPas)、油酸乙酯 (5. 15mPas)、乙酸乙酯(0. 449mPas)。分別取上述6種油適量，分別置具塞錐形瓶中，加入過(guò) 量的牛血清白蛋白，4°C水浴，震搖24h到達(dá)平衡。用BCA法測(cè)定牛血清白蛋白在各種油相 中的溶解度。結(jié)果表明IPM(C14)、色拉油、乙酸乙酯、油酸乙酯、GTCC、液體石蠟分別為 0. 35mg/g、0. 15mg/g、0. 14mg/g、0. 13mg/g、0. 12mg/g、0. 08mg/g，在 IPM 的溶解度最大，為 0.35mg/g。這可能與IPM的碳鏈長(zhǎng)短與黏度有關(guān)，有利于藥物在油相中的分布和溶解。因 此，選擇IPM作為蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的最優(yōu)化油相。表面活性劑和助表面活性劑的篩選用篩選蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳 油相的方法對(duì)表面活性劑吐溫80、吐溫85、吐溫60、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氫化 蓖麻油(RH40)和助表面活性劑(CoSF)，即司盤(pán)80、司盤(pán)85、司盤(pán)60、以及乙醇、甘油、丙二 醇的同樣方法篩選牛血清白蛋白的飽和濃度。在用其較大濃度的表面活性劑和助表面活性 劑，全面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組，按 9 1、8 2、7 3、6 4、5 5、4 6、3 7、2 8、1 9，(SF 和CoSF的質(zhì)量比)，稱取SF-CoSF，加入所選擇的油相，渦旋震蕩，滴加水，觀察各組的變化， 以離心(13，OOOrpm, 30min)穩(wěn)定性和乳滴粒徑為主要的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，從而確定出形成納米乳 的SF和CoSF。以表面活性劑/助表面活性劑(混合表面活性劑)、油相和去離子水作為等 邊三角形的3個(gè)頂點(diǎn)，繪制偽三元相圖，相圖每條邊上的點(diǎn)分別表示相應(yīng)兩組分之間的比 例關(guān)系，相圖任意一點(diǎn)表示相應(yīng)體系中各組分的質(zhì)量百分含量。根據(jù)油、水、混合表面活性 劑在臨界點(diǎn)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，繪制偽三元相圖，確定最大的納米乳區(qū)。納米乳的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為制備的液體呈澄清透明或半透明；有藍(lán)色乳光； 高速離心(13000r/m，30min)離心后，穩(wěn)定不分層；平行光入射后有丁達(dá)爾現(xiàn)象；通過(guò)透射 電子顯微鏡和激光粒度儀，檢測(cè)出乳滴在1 IOOnm之間。若制備的混合液體呈乳白色，平 行光入射后有散射現(xiàn)象，則為乳劑；若澄清透明、稠厚，則為凝膠。同時(shí)在相轉(zhuǎn)變過(guò)程還會(huì)產(chǎn) 生液晶。利用液晶有折光存在，在偏光顯微鏡檢測(cè)中，會(huì)出現(xiàn)明暗變化，所以往往用其來(lái)區(qū) 分液晶和凝膠，如發(fā)亮為液晶，不發(fā)亮的凝膠。對(duì)上述表面活性劑與助表面活性劑的溶解度測(cè)定結(jié)果是牛血清白蛋白在吐溫 80、吐溫85、聚氧乙烯蓖麻油(EL35)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40)、司盤(pán)80、司盤(pán)85、正丁 醇、丙二醇均有較大的溶解度(大于0.2mg/ml)，符合可以制備納米乳要求。但是根據(jù)其最 大的偽三元相圖區(qū)域，最終確定其表面活性劑與助表面活性劑互配較優(yōu)組合為吐溫80/ 司盤(pán)80、吐溫85/司盤(pán)85、RH40/丙二醇、EL35/丙二醇。2.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳制備根據(jù)序貫設(shè)計(jì)思想，以水、油、SF/CoSF為三相，采用滴定法繪制偽三元相圖。選擇離心(13，000rpm，30min)穩(wěn)定，直徑在1 IOOnm的納米乳區(qū)為處方候選區(qū)。精確稱取 處方量的牛血清白蛋白，處方量的表面活性劑與助表面活性劑(表面活性劑與助表面活性 劑為上述篩選出來(lái)的4種較優(yōu)互配組合)，處方量的油相，先加入大約70%的水溶液或緩 沖液，攪拌均勻，最后逐步加入水或緩沖液，即得澄清透明的納米乳液，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。從 圖1可看出，制備的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳外觀淡黃色澄清透明液體。根據(jù) 繪制偽三元相圖的最終表明制備的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的最優(yōu)化處方為 EL35 丙二醇IPM(27% 9% 3% )，牛血清白蛋白濃度4. 5%和生理鹽水56. 5%，丙 氨酸5%。以下性能檢測(cè)如無(wú)表明處方均采用的該最優(yōu)化處方。3.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的形態(tài)少量納米乳適量，用水稀釋100倍后，滴在覆有支持膜的銅網(wǎng)上，靜止IOmin后用 濾紙片吸干，再滴加2%磷鎢酸(pH為7. 4)溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染3min，自然揮干，用透射電子 顯微鏡觀察并攝制照片，結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，納米乳在電鏡下均呈圓球形，內(nèi)部為油相，見(jiàn)圖2從電鏡下，隨機(jī)選取 不少于500個(gè)液滴測(cè)量粒徑，得納米乳液滴粒徑范圍在1 lOOnm，平均粒徑為21. 8nm。4.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的溶液顏色用蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳最優(yōu)化處方制備的納米乳液均為淡黃色 澄清、均一、透明液體，根據(jù)《中國(guó)藥典》(2005年版)II部附錄IXA溶液顏色檢查法，配制黃 綠色調(diào)標(biāo)準(zhǔn)比色液。納米乳液顏色與黃綠色調(diào)1號(hào)比色液相比，不得更深。5.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的澄清度根據(jù)《中國(guó)藥典》(2005年版)II部附錄IXB澄清度檢查法下檢查，為澄清的溶液。 經(jīng)蒸餾水稀釋后，即出現(xiàn)明顯的淡黃色的乳光。6.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的粒徑和粒度分布取模型蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白納米乳適量，用適量蒸餾水稀釋后用激光粒度測(cè) 定儀進(jìn)行測(cè)定，納米乳的粒徑與粒度分布見(jiàn)圖3。測(cè)定結(jié)果圖3表明，實(shí)驗(yàn)制備的蛋白質(zhì)模 型藥物牛血清白蛋白納米乳平均粒徑21. 81nm。小于50nm的粒子占75% ；小于60nm的粒 子占90%，可見(jiàn)制得的納米乳載藥系統(tǒng)的粒徑分布范圍窄，粒徑比較均勻。7.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的理化性質(zhì)檢測(cè)考察了空白納米乳和模型蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白納米乳的黏度(旋轉(zhuǎn)式黏度 計(jì))、折光率(25°C、阿貝折光儀)、電導(dǎo)率(電導(dǎo)率儀)、Zeta電位(電勢(shì)顯微電泳儀)。結(jié) 果見(jiàn)表1。從表1結(jié)果表明，藥物的加入使納米乳的電導(dǎo)率增加，Zeta電位減小，而黏度和 折光率無(wú)明顯變化(P > 0. 05)。表1納米乳的理化性質(zhì)測(cè)定η = 3 (χ士 s)
樣品黏;Ι/πιιη2 折光率電導(dǎo)率/mS_1Zeta 電位/mV空白納米乳5.24±0.041.422±0.0021328±12.530.1&t0.03牛血清蛋白納米乳5.31±0.051.412±0.0142345±13.824.21±0.01 試驗(yàn)例2 蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的質(zhì)量檢測(cè)
1.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的載藥量和包封率和測(cè)定1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線①實(shí)驗(yàn)方法參照BCA蛋白試劑盒進(jìn)行根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1 體積試劑B配制適量BCA工作液，充分混勻。②稀釋標(biāo)準(zhǔn)品溶液將凍干的標(biāo)準(zhǔn)品用0. 9% NaCl稀釋成2000ug/mL的儲(chǔ)存液， 讓后 0. 9% NaCl 用將其稀釋成濃度分別為:0、25、125、250、500、750、1000、1500、2000ug/ mL。分別取25u L的稀釋不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的樣品分別添加到96孔的微孔中。③各孔加入200u L BCA工作液，充分混勻，蓋上96孔板蓋，37°C放置30min。④用Nanodrop ND-1000C紫外分光光度計(jì)，選擇562nm為測(cè)定波長(zhǎng)，根據(jù)吸光度值 與蛋白濃度之間的關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見(jiàn)圖4，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 0. 0008X+0. 1637 (R2 = 0. 9951，線性方程范圍25_1000ug/mL)，具有較高的相關(guān)性和較寬的 檢測(cè)范圍，因該檢測(cè)方法此可用于BCA檢測(cè)BSA的包封率和載藥量。2)蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳蛋白濃度的測(cè)定稱取制備好的模型蛋白質(zhì)藥物牛血清白蛋白納米乳和空白的納米乳各三份，每份 lg(體積約Iml)。將其分別放置在無(wú)菌的3mlPE管中，用0. 9% NaCl稀釋稀釋到牛血清白 蛋白的理論值為250 500mg/ml，然后分別將稀釋好的牛血清白蛋白直接用無(wú)水乙醇按照 體積比為(1 2)加入后，搖勻使其破乳后，高速離心(13000，30min)，離心后取其上清和沉 淀，其中沉淀用上清液體中相同的體積的0. 9% NaCl進(jìn)行稀釋，用BCA法測(cè)定破乳前的上 清液(C游上)和沉淀中的牛血清白蛋白的濃度(C游沉)、破乳后的上清液(C破上)和沉 淀中的牛血清白蛋白的濃度(C破沉)。根據(jù)稀釋倍數(shù)和體積量，各取25uL溶液，添加到96 孔板中，用BSA標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)方法，測(cè)定其吸光度值，并將吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程， 分別計(jì)算出破乳前牛血清白蛋白的在上清液中的質(zhì)量(M游上)和沉淀中的質(zhì)量(M游沉)、 破乳后的牛血清白蛋白在上清液(M破上)和沉淀中的牛血清白蛋白的質(zhì)量(M破沉)。載藥量=[(M破沉)+ (M破上)]/M總X 100 %。包封率=[(M破沉)+ (M破上)-(M游上)-(M游沉)]/ [ (M破沉)+ (M破上)]X 100 %其中M總為稱取的納米乳總質(zhì)量。試驗(yàn)測(cè)定三批納米乳劑的載藥量分別為4. 5%,4. 3%,4. 4%平均值為4. 4% ；包 封率分別為98. 3%,97. 5%,93. 5%，其平均值為96. 4%。制備出的牛血清白蛋白具有較大 的載藥量，且包封率高達(dá)96. 4 %，完全符合納米乳的質(zhì)量要求，且解決了目前牛血清白蛋白 的載藥量和包封率低的最大問(wèn)題。2.蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩(wěn)定性檢測(cè)按照《中華人民共和國(guó)藥典》2000年版附錄197頁(yè)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，納米乳穩(wěn)定性試 驗(yàn)分為加速穩(wěn)定性試驗(yàn)及長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)兩部分。加速穩(wěn)定性試驗(yàn)取蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳適量3份，分別放置在 4°C、25°C、40°C、6(rC條件下，分別于5、10、30、45、60、90d取樣考察，首先對(duì)其外觀是否發(fā) 生明顯絮凝、分層、沉淀、乳析、破乳等及載藥量、包封率情況進(jìn)行考察；分別將納米乳樣品 適量裝于離心管中，高速離心(13000，30min)，用上述相同的指標(biāo)觀察進(jìn)行考察。將納米乳 熔封于5ml安瓿瓶中，放置在自然光照射條件下，分別于l、3、7、10d取樣，對(duì)其進(jìn)行外觀考
15察，觀察是否有渾濁、破乳、分層等現(xiàn)象。長(zhǎng)期穩(wěn)定性試驗(yàn)取蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳適量3份，分別分別放 置在4°C、25°C、40°C、60°C條件下，分別于30d、60d、90d、180d、360d取樣考察對(duì)其進(jìn)行外觀 考察，觀察是否有渾濁、破乳、分層等現(xiàn)象。同時(shí)放置室溫的30d、60d、180d、360d的蛋白質(zhì) 模型藥物牛血清白蛋白納米乳和牛血清白蛋白水溶液的樣品按照載藥量和包封率檢測(cè)制 備的方法進(jìn)行處理后的上清液用SDS-PAGE觀察牛血清白蛋白降解情況。見(jiàn)圖5和圖6，制備的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的外觀無(wú)明顯絮凝、分 層、沉淀、乳析、破乳，且其載藥量和包封率為發(fā)生明顯的改變。這表明制備的蛋白質(zhì)模型 藥物牛血清白蛋白納米乳具有良好的穩(wěn)定性。從圖6可看出，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋 白納米乳在室溫放置30、60、180、360d均有明顯的一條帶；而牛血清白蛋白的溶液在30和 60d有明顯一條帶，且在60d的條帶，蛋白質(zhì)雖然為一條帶，但濃度減少，表明蛋白質(zhì)明顯降 解。從圖6可看出，制備的蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩(wěn)定性得到較高的提高。3.用電位及粒度分析儀檢測(cè)蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的穩(wěn)定性取用蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳最優(yōu)化處方制備的納米乳適量，用適量 蒸餾水稀釋后用激光粒度測(cè)定儀，測(cè)定牛血清白蛋白的納米乳在不同溫度下的納米乳的粒 徑，其粒徑變化圖，見(jiàn)圖7和表2。從圖7的不同溫度下的納米乳粒徑圖可看出，隨著溫度升 高，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳的平均粒徑增大，但是當(dāng)溫度大于80°C，其平均粒 徑小于30nm，當(dāng)溫度高于80°C，其平均粒徑增大變化趨勢(shì)非常明顯，當(dāng)溫度到90°C，其平均 粒徑還是小于lOOnm。圖7結(jié)果表明，蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白納米乳非常穩(wěn)定，可以 室溫保存。表2不同溫度下的納米乳粒徑
權(quán)利要求
一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，其載藥系統(tǒng)組合特征在于0.1％～15％的蛋白質(zhì)藥物、10％～30％的表面活性劑、5％～25％的助表面活性劑、3％～20％的油相、0％～10％的穩(wěn)定劑，20％～70％的水相；所述表面活性劑為聚山梨酯或聚氧乙烯脂肪酸酯，助表面活性劑為失水山梨醇脂肪酸酯或者C2～C4的一元醇或多元醇，所述油相為食用藥用液體石蠟、食用色拉油或有機(jī)酸酯，所述水相為蒸餾水，等滲的生理鹽水、pH為6.5～7.5磷酸鹽緩沖液中的一種或幾種，所述穩(wěn)定劑為甘露醇、甘氨酸和丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，所述的蛋白質(zhì)藥物 包括牛血清白蛋白、人血清白蛋白、胰島素、肌紅蛋白，或者水溶性或難溶性蛋白質(zhì)類似藥 物，所述蛋白質(zhì)藥物濃度范圍牛血清白蛋白1 10% ；胰島素1 5% ；肌紅蛋白1 10% ；人血清白蛋白1 10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，所述表面活性劑 為聚山梨酯為吐溫-80、吐溫-85、吐溫60中的一種或幾種，聚氧乙烯脂肪酸酯為聚氧乙烯 氫化蓖麻油、聚氧乙烯蓖麻油中任一種或其組合；其有效量分別為吐溫-80 10 30%、吐 溫-85 10 30%、吐溫60 5 30%、聚氧乙烯氫化蓖麻油10 30%、聚氧乙烯蓖麻油 10 30%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，所述助表面活性劑 為失水山梨醇脂肪酸酯是司盤(pán)85、司盤(pán)80和司盤(pán)60中的任一種及一種以上組合；C2 C4的一元醇或多元醇為無(wú)水乙醇、正丁醇、甘油、1，3_ 丁二醇、1，3_丙二醇中的任一種；其 有效量分別為司盤(pán)-85 5 15%、司盤(pán)80 5 15%、司盤(pán)60 5 10% ；無(wú)水乙醇5 10% ；甘油5 10% ；1，3-丙二醇5 10% ；1，3-丁二醇5 10%，正丁醇5 10%。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，表面活性劑與助表 面活性劑的互配組合為吐溫80/司盤(pán)80、吐溫85/司盤(pán)85、聚氧乙烯氫化蓖麻油/丙二醇、 聚氧乙烯蓖麻油/丙二醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，所述的有 機(jī)酸酯是IPM、油酸乙酯、乙酸乙酯、GTCC中的任一種，其中油相的有效量分別為IPM :10 20%、油酸乙酯5 20%、乙酸乙酯10 20%、GTCC :3 15%、藥用液體石蠟5 15%、 食用色拉油5 15%;所述穩(wěn)定劑的有效量分別為甘露醇1 10%、甘氨酸1 10%、 丙氨酸1 10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，蛋白質(zhì)模型藥物牛 血清白蛋白4.5%、聚氧乙烯蓖麻油27%、丙二醇9%、肉豆蔻酸異丙酯3%、等滲的生理鹽 水56. 5%，丙氨酸5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7任一所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)，用水或緩 沖液無(wú)限稀釋，粒徑在1 IOOnm范圍。
9.權(quán)利要求1 7任一所述的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)的制備方法，具 體包括下列步驟1)按配方稱取蛋白質(zhì)藥物、表面活性劑、助表面活性劑、油相、穩(wěn)定劑、水相備用；2)將所述量的表面活性劑與蛋白質(zhì)藥物混勻且使蛋白質(zhì)藥物部分溶解；3)再加入所述量的助表面活性劑讓蛋白質(zhì)藥物在4°C下完全溶解，得到澄清的溶液；4)再加入所述量的油相和穩(wěn)定劑，攪拌下緩慢加入處方量70%水相，得到澄清的溶液；5)最后再加入余量水相，混勻，得到澄清透明的納米乳。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，所述步驟(2)的混勻?yàn)?°C下，轉(zhuǎn)速為50 IOOr/ m ；所述步驟⑷中的攪拌是25°C 37°C下恒溫水浴，轉(zhuǎn)速為100 200r/m ；所述制備方法 中還包括納米乳的除菌、檢測(cè)和包裝步驟，所述除菌為用0. 2 μ m微孔濾膜過(guò)濾。
全文摘要
本發(fā)明的一種蛋白質(zhì)藥物的新型納米乳載藥系統(tǒng)及其制備方法，主要用以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)模型藥物牛血清白蛋白等為藥物模型，制備出了蛋白質(zhì)藥物的納米乳載藥系統(tǒng)。其組合特征在于0.1％～15％的蛋白質(zhì)藥物、10％～30％的表面活性劑、5％～25％的助表面活性劑、3％～20％的油相、0％～10％的穩(wěn)定劑，20％～70％的水相。本發(fā)明的蛋白質(zhì)藥物納米乳載藥系統(tǒng)可較大提高蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性，保留良好免疫學(xué)與生物學(xué)活性，載藥量大、包封率高、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、安全無(wú)毒、無(wú)有機(jī)溶劑殘留、便于運(yùn)輸和儲(chǔ)存，較好地解決目前蛋白質(zhì)藥物存在的穩(wěn)定性差、藥效容易喪失、載藥量和包封率低、制備工藝復(fù)雜和有機(jī)溶劑殘留、毒性大等問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61K38/28GK101961314SQ20101029208
公開(kāi)日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者劉唯, 劉開(kāi)云, 孫紅武, 張衛(wèi)軍, 毛旭虎, 鄒全明, 郭剛 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)