專利名稱：人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)修飾物領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及用聚乙二醇修飾的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的修飾產(chǎn)物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor，簡(jiǎn)稱為FGF)-21是FGF家族的一個(gè)新成員，是一種分泌蛋白，最早從鼠胚胎中分離出來。人的FGF-21cDNA編碼209個(gè)氨基酸，與鼠的FGF-21的氨基酸序列大約有75%的同源性。迄今為止FGF-21的生物活性作用方式主要體現(xiàn)在降低血糖、改善血脂方面(降低血糖的同時(shí)不導(dǎo)致低血糖)，可用于治療II型糖尿病，并且對(duì)藥物引發(fā)的早期肝癌有一定的治療作用，另外在胚胎發(fā)育中的也能起到一定作用。FGF-21的廣泛的生物學(xué)活性表明其在醫(yī)療上有廣泛的應(yīng)用前景。但大量研究和臨床實(shí)踐表明FGF-21存在穩(wěn)定性差、體內(nèi)半衰期短以及存在免疫原性等缺陷。因此如何提高 FGF-21穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期成為一個(gè)重要的課題。因此，美國(guó)禮來公司等利用聚乙二醇(polyethylene glycol，簡(jiǎn)稱為PEG)來對(duì)FGF-21進(jìn)行修飾，用以提高FGF-21穩(wěn)定性、延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期(可參見 W02009020802A、W02008011633A、W02006091727A、W02006050247A、 W02005091944A等)。但是這些技術(shù)多數(shù)屬于定點(diǎn)PEG化，甚至為了 PEG化而突變FGF-21蛋白本身的氨基酸殘基，除了部分實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的意外，將導(dǎo)致突變后的FGF-21蛋白是否能具有原有功能的不可預(yù)料性。然而，非定點(diǎn)PEG化蛋白質(zhì)盡管相對(duì)于定點(diǎn)PEG化蛋白質(zhì)的制備方式簡(jiǎn)單些，成本通常也較低，但是，PEG通過活性基團(tuán)與蛋白質(zhì)的末端或側(cè)鏈連接，理論上將造成蛋白質(zhì)本身折疊構(gòu)型的改變，因此，該蛋白質(zhì)經(jīng)PEG化是否仍舊具有原有蛋白功能并起相應(yīng)作用，是難以預(yù)料的。Harris 等(Clinical Pharmocokinetics, 2001,40 (7) :539-551)明確指出， PEG的大小、幾何特征和連接位點(diǎn)等均對(duì)最終PEG化的產(chǎn)物構(gòu)成關(guān)鍵的影響，有眾多因素可能影響蛋白質(zhì)的PEG化，包括但不限于
1，不同的氨基酸序列所能提供的連接位點(diǎn)數(shù)目不同；
2，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會(huì)將連接位點(diǎn)包埋在內(nèi)部，從而在一定條件下的PEG化將使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)翻轉(zhuǎn)；
3，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能會(huì)使PEG在連接位點(diǎn)處形成空間位阻，造成蛋白質(zhì)折疊的不可逆轉(zhuǎn)
變；
4，可能在PEG化后破壞蛋白質(zhì)的配體-受體結(jié)合界面； 5，不同的PEG化模式可能導(dǎo)致不同程度的抗原性； 6，不同的PEG化模式可能導(dǎo)致不同的清除率；
7，不同的清除機(jī)制需要不同程度的PEG連接和/或不同的PEG連接位點(diǎn)；
8，不同的PEG化模式可能導(dǎo)致不同的半衰期以滿足蛋白質(zhì)在生理環(huán)境下發(fā)揮其功能
3的要求。因此，蛋白質(zhì)的PEG化是不可預(yù)測(cè)的。另外，Clark等(Journal of Biological Chemistry, 1996，271 (36) :21969-21977)也公開了 PEG化后蛋白質(zhì)功能的不可預(yù)測(cè)性的例證。因此，本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期努力，發(fā)現(xiàn)某些FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式將導(dǎo)致 FGF-21本身的蛋白活性極大降低，甚至蛋白功能消失，而必須采用一些經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的 FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式才能具有原有蛋白功能，不大幅降低原有蛋白活性，從而可以調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝，用于實(shí)際的II型糖尿病等治療用途中。當(dāng)然，這些經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式仍舊保留了 PEG化本身的優(yōu)點(diǎn)，如熱穩(wěn)定性好、抗酶解能力高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、免疫原性低和安全性好等。另外，這些經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的FGF-21的非定點(diǎn)PEG化模式，產(chǎn)物均一性好、分離純化工藝簡(jiǎn)單，尤其還可以方便地回收未與PEG綴合的 FGF-21。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種熱穩(wěn)定性好、抗酶解能力高、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、免疫原性低和安全性好的FGF-21的修飾物，其不大幅降低原有未修飾的蛋白活性，從而具有FGF-21蛋白功能，可以調(diào)節(jié)血糖、血脂代謝。本發(fā)明另一個(gè)要解決的技術(shù)問題還在于提供上述修飾物的制備方法，其產(chǎn)物均一性好、分離純化工藝簡(jiǎn)單，尤其還可以方便地回收未與PEG綴合的FGF-21。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物，也即聚乙二醇(簡(jiǎn)稱為PEG)與人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21 (簡(jiǎn)稱為FGF-21)的綴合物，所述修飾物的活性是等摩爾量的未綴合的FGF-21的活性的40%以上，優(yōu)選70%以上，更優(yōu)選80%以上。其中優(yōu)選的連接基團(tuán)是馬來酰亞胺或丁醛，更優(yōu)選其中的聚乙二醇是甲(氧)基聚乙二醇(簡(jiǎn)稱為mPEG)，這樣聚乙二醇一端的羥基被甲基封閉，只有一端可以連接到連接基團(tuán)上并進(jìn)而連接到FGF-21上，從而不形成多個(gè)FGF-21蛋白的交聯(lián)形式的產(chǎn)生，防止FGF-21 交聯(lián)凝集而變性。因此，在本發(fā)明的綴合物優(yōu)選是由FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺綴合而成的，或者是由FGF-21與mPEG- 丁醛綴合而成的。其中，mPEG-馬來酰亞胺是mPEG與連接基團(tuán)馬來酰亞胺結(jié)合的物質(zhì)，mPEG-丁醛是mPEG與連接基團(tuán)丁醛結(jié)合的物質(zhì)，這些物質(zhì)都可以從市場(chǎng)渠道購(gòu)買。更優(yōu)選在本發(fā)明的綴合物中，mPEG的分子量介于4kDa_22kDa，如5kDa、10kDa、 15kDa、或20kDa。也優(yōu)選本發(fā)明的綴合物是由包括以下步驟的制備方法制備而得的
(1)FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺或mPEG- 丁醛混合，避光反應(yīng)后，終止反應(yīng)；
(2)將步驟(1)中的反應(yīng)產(chǎn)物a^phedaxG_25柱除鹽，然后上樣于QAE-kphadex A50陰離子交換柱并用含200mM NaCl的PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰。優(yōu)選其中FGF-21與 mPEG-馬來酰亞胺或mPEG-丁醛的摩爾比介于1 8-1 65，如1 10、1 20,1 30、或 1 60 ；也優(yōu)選其中步驟(1)和/或(2)的pH介于5. 5-9. 5，如6、7、8、或9。為了在制備的綴合物的同時(shí)回收未修飾的FGF-21，節(jié)約生產(chǎn)成本，在上述制備步驟之后還可以加上以下回收步驟(3)用含500mM NaCl的PB緩沖液洗脫步驟(2)中的QAE-S^hadex A50陰離子交換柱，收集洗脫峰，得未修飾的FGF-21。


圖ι為修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE分析圖，其中M為分子量標(biāo)記，E為未修飾的FGF_21，A為實(shí)施例三的修飾的FGF-21和回收的未修飾的FGF-21的混合樣品，B為實(shí)施例七的修飾的 FGF-21和回收的未修飾的FGF-21的混合樣品，C為實(shí)施例八的修飾的FGF-21和回收的未修飾的FGF-21的混合樣品，D為實(shí)施例九的修飾的FGF-21和回收的未修飾的FGF-21的混
合樣品。圖2顯示了 20KdPEG修飾對(duì)FGF-21在大鼠血清中熱穩(wěn)定性的影響，在上的曲線表示PEG修飾的FGF-21隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而保留的活性百分比，在下的曲線表示未經(jīng)PEG修飾的FGF-21隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而保留的活性百分比，結(jié)果表明FGF21經(jīng)PEG修飾后熱穩(wěn)定
性顯著提高。圖3顯示了 20Kd PEG修飾對(duì)FGF-21抗胰蛋白酶解能力的影響，實(shí)心表示PEG修飾的FGF-21隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，空心柱表示未經(jīng) PEG修飾的FGF-21隨保溫時(shí)間的延長(zhǎng)而在胰蛋白酶溶液中保留的活性百分比，結(jié)果表明表明FGF21經(jīng)PEG修飾后抗胰蛋白酶穩(wěn)定性顯著提高。圖4顯示了 20Kd PEG修飾后的FGF21對(duì)II型糖尿病大鼠模型的血糖水平的影響， 斜狀柱表示給藥前的II型糖尿病大鼠血糖水平，黑色實(shí)心柱表示給藥后的II型糖尿病大鼠血糖水平，結(jié)果顯示PEG-FGF21對(duì)II型糖尿病具有潛在的治療作用。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例所用的試劑均為現(xiàn)有技術(shù)，如，F(xiàn)GF-21為SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；帶有活性接頭分子的PEG可購(gòu)自美國(guó)Shearwater公司。實(shí)施例一聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液(10mM，PH=6. 0)中的10mgFGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量5000Da)以摩爾比1 10混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入IM 甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G_25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=6. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例二聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOml PB緩沖液(10mM，PH=7. 0)中的IOmg FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量IOOOODa)以摩爾比1 20混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。
2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G_25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=7. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施三聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液(10mM，PH=8. 0)中的IOmg FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量20000Da)以摩爾比1 :30混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入IM 甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=8. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施四聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液(10mM，PH=9. 0)中的IOmg FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量15000Da)以摩爾比1 :60混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入IM 甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=9. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施五聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液PB緩沖液(10mM，PH=6. 0)中的IOmg FGF-21與 mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量5000Da)以摩爾比1 :30混合，放置于4°C，避光反應(yīng)4小時(shí)。 加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=6. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadexA50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施六聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液(10mM，PH=6. 0)中的IOmg FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量IOOOODa)以摩爾比1 30混合，放置于25°C，避光反應(yīng)4小時(shí)。加入 IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=6. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施七聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液(10mM，PH=7. 0)中的IOmg FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量20000Da)以摩爾比1 30混合，放置于25°C，避光反應(yīng)4小時(shí)。加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=7. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例八聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOml醋酸鈉緩沖液(20mM，PH=6. 0)中的IOmg FGF-21與 mPEG-丁醛(PEG分子量20000Da)以摩爾比1 30混合，放置于25°C，避光反應(yīng)4小時(shí)。 加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1.5cm)除鹽采用20mM醋酸鈉緩沖液(pH=6. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min 流速上樣，20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；過kphedax G-25柱除鹽后，上 QAE-Sephadex A50陰離子交換柱用20mM醋酸鈉緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰， 即為FGF-21的PEG修飾物；用含500mM NaCl的IOmM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例九聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOml醋酸鈉緩沖液(20mM，PH=6. 0)中的IOmg FGF-21與 mPEG-丁醛(PEG分子量20000Da)以摩爾比1 10混合，放置于25°C，避光反應(yīng)4小時(shí)。 加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1.5cm)除鹽采用20mM醋酸鈉緩沖液(pH=6. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min 流速上樣，20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；過kphedax G-25柱除鹽后，上 QAE-Sephadex A50陰離子交換柱用20mM醋酸鈉緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰， 即為FGF-21的PEG修飾物；用含500mM NaCl的IOmM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min， 收集洗脫峰，得未修飾FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例十聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOml醋酸鈉緩沖液(20mM，PH=7. 0)中的10mgFGF-21與mPEG-丁醛(PEG分子量5000Da)以摩爾比1 20混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1.5cm)除鹽采用20mM醋酸鈉緩沖液(pH=7. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min 流速上樣，20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；過kphedax G-25柱除鹽后，上 QAE-Sephadex A50陰離子交換柱用20mM醋酸鈉緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰， 即為FGF-21的PEG修飾物；用含500mM NaCl的IOmM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min， 收集洗脫峰，得未修飾FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例i^一聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOml醋酸鈉緩沖液(20mM，PH=8. 0)中的IOmg FGF-21與 mPEG-丁醛(PEG分子量10000Da)以摩爾比1 30混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1.5cm)除鹽采用20mM醋酸鈉緩沖液(pH=8. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min 流速上樣，20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；過kphedax G-25柱除鹽后，上 QAE-Sephadex A50陰離子交換柱用20mM醋酸鈉緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰， 即為FGF-21的PEG修飾物；用含500mM NaCl的IOmM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min， 收集洗脫峰，得未修飾FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例十二聚乙二醇-FGF-21的制備
81、修飾反應(yīng)將溶解于IOml醋酸鈉緩沖液(20mM，PH=9. 0)中的IOmg FGF-21與 mPEG- 丁醛(PEG分子量20000Da)以摩爾比1 60混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。 加入IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G_25柱 (20cmX 1.5cm)除鹽采用20mM醋酸鈉緩沖液(pH=9. 0)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min 流速上樣，20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；過kphedax G-25柱除鹽后，上 QAE-Sephadex A50陰離子交換柱用20mM醋酸鈉緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的20mM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰， 即為FGF-21的PEG修飾物；用含500mM NaCl的IOmM醋酸鈉緩沖液洗脫，流速為lml/min， 收集洗脫峰，得未修飾FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例十三聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液(10mM，PH=9. 0)中的IOmg FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量15000Da)以摩爾比1 65混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入 IM甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=9. 5)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例十四聚乙二醇-FGF-21的制備
1、修飾反應(yīng)將溶解于IOmlPB緩沖液(10mM，PH=6. 0)中的10mgFGF-21與mPEG-馬來酰亞胺(PEG分子量5000Da)以摩爾比1 8混合，放置于4°C，避光反應(yīng)2小時(shí)。加入IM 甘氨酸Iml終止修飾反應(yīng)。2、修飾產(chǎn)物的分離純化將步驟1中的反應(yīng)液，過kphedax G-25柱 (20cmX 1. 5cm)除鹽采用IOmM PB緩沖液(pH=5. 5)平衡柱至基線平穩(wěn)后，lml/min流速上樣，IOmM PB緩沖液洗脫，收集第一個(gè)洗脫峰；akphedax G-25柱除鹽后，上QAE-kphadex A50陰離子交換柱用IOmM PB緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，將除鹽后收集到的蛋白上樣，用含200mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，即為FGF-21的PEG 修飾物；用含500mM NaCl的IOmM PB緩沖液洗脫，流速為lml/min，收集洗脫峰，得未修飾 FGF-21蛋白。然后，將FGF-21的PEG修飾物按前述步驟過kphedax G-25柱除鹽后，即得 FGF-21的PEG修飾物純品。實(shí)施例十五聚乙二醇-FGF-21的SDS-PAGE分析
將上述實(shí)施例三、七和十收集到的修飾純品，采用SDS-PAGE電泳法檢測(cè)，分離膠12%， 濃縮膠5%。電泳結(jié)束后，將膠體放入裝有50ml固定液的培養(yǎng)皿中(甲醇16ml，甲醛20 μ 1， 重蒸水2細(xì)1)，在搖動(dòng)下固定10-30分鐘；取出膠體，水洗兩次，每次5分鐘；再放入0. 02%的硫代硫酸鈉溶液中，1分鐘；水洗兩次，每次20秒；放入裝有30ml左右的0. 的硝酸銀溶液中，在搖動(dòng)下染色10-30分鐘；取出膠體，水洗一次，加入小體積的硫代顯影液(無水碳酸鈉1. 5g, 2%硫代硫酸鈉200 μ 1，甲醛25 μ 1 )，再轉(zhuǎn)入30_50ml的硫代顯影液中，緩慢搖動(dòng)至足夠的顯影強(qiáng)度。結(jié)果如圖1所示，根據(jù)圖像分析，純度均達(dá)到95%以上。實(shí)施例十六聚乙二醇-FGF-21的促進(jìn)糖吸收水平檢測(cè)
小鼠3T3-L1細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)和維持3T3-L1成纖維細(xì)胞 (即前脂肪細(xì)胞)。用脂肪細(xì)胞分化液進(jìn)行分化，當(dāng)脂肪細(xì)胞分化成功后，用KRPH緩沖液 (15 mmol/L Hepes, 118 mmol/L NaCl, 4. 8 mmol/L KCl, 1. 2 mmol/L MgS04, 1. 3 mmol/ L CaC12, 1.2 mmol/L KH2P04, 0.1% BSA, pH 7. 4)稀釋未修飾的 FGF-21 (對(duì)照)禾口 PEG-FGF-21，用不同摩爾濃度的蛋白作用細(xì)胞M小時(shí)，用KRPH緩沖液洗2次，每孔加入 KRPH緩沖液100微升[含100 μ mol/L 14C標(biāo)記的2-脫氧-D-葡萄糖(中國(guó)同位素公司)]。在37。C反應(yīng)1小時(shí)后，加入Cytochlasin B (20 μ mol/L, Sigma)終止反應(yīng)。用小容量液體閃爍計(jì)數(shù)器檢測(cè)葡萄糖吸收效率。結(jié)果表明，F(xiàn)GF-21經(jīng)PEG修飾后，實(shí)施例一、 三、七和十一收集到的修飾純品的生物活性保存率均達(dá)到40%以上，其中實(shí)施例一制備的 PEG-FGF-21的生物活性保存率可達(dá)到82%，實(shí)施例三制備的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物(即PEG-FGF-21)的生物活性保存率可達(dá)到72. 3%。實(shí)施例十七聚乙二醇-FGF-21的熱穩(wěn)定性研究
取大鼠血液，4°C、8000 r/min離心，取上清制得大鼠血清，分別取含等物質(zhì)量FGF-21 和PEG-FGF-21各0.6 ml，與大鼠血清2. 4 ml混勻，37°C保溫；分別于2、4、8、M和48 h取樣，-20°C保存，以空白大鼠血清作為對(duì)照，采用上述實(shí)施例十三描述的方法法測(cè)定各樣品生物活性，并以修飾前蛋白(FGF-21)為對(duì)照，以如下反應(yīng)條件獲得的PEG-FGF-21為例， 計(jì)算活性保存率。結(jié)果如圖2所示修飾產(chǎn)物PEG-FGF-21在37°C保溫96小時(shí)后，實(shí)施例三制備的PEG-FGF-21活性保存率為70. 8%，而未修飾的FGF-21活性保存率25. 1%，前者在大鼠血清中熱穩(wěn)定性明顯高于后者。實(shí)施例十八聚乙二醇-FGF-21的抗酶解能力檢測(cè)
分別取含等物質(zhì)量的FGF-21和實(shí)施例三制備的PEG-FGF-21各0. 4 ml，與2 mmol/L胰蛋白酶溶液0.4 ml混勻，最終蛋白與胰蛋白酶的物質(zhì)量比為100 1，37°C保溫，于0、1、5、 10、15、20、40和60 min取混合樣0. 1 ml，立即與無血清RPMI 1640培養(yǎng)基混勻(樣品體積 培養(yǎng)基體積=1 10)，以終止胰蛋白酶的作用。將處理后的各樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，并將獲得的凝膠采用凝膠掃描分析，觀察蛋白質(zhì)被胰蛋白酶的降解情況。結(jié)果如圖3所示，表明保溫20min后，修飾產(chǎn)物 PEG-FGF-21的含量與酶解前相比仍然存留35. 6%，而未修飾產(chǎn)物基本被完全降解，由此可見，修飾后的FGF-21抗胰蛋白酶水解能力明顯增加。實(shí)施例十九聚乙二醇-FGF-21降低II型糖尿病大鼠血糖水平檢測(cè)
取Wistar大鼠64只，其中8只給予正常飲食，其余56只給予連續(xù)兩個(gè)月過量飲食并形成肥胖大鼠，將56只肥胖大鼠每只注射35 mg/kg的STZkti^ptozotocin)，以構(gòu)建 II型糖尿病大鼠模型，將II型糖尿病大鼠模型分成4組，第一組給予1X 10_8mol/kg濃度的 PEG-FGF21 (低劑量組)；第一組給予2 X 10_8mOl/kg濃度的PEG-FGF21 (中劑量組)；第一組給予4X10_8mOl/kg濃度的PEG-FGF21 (高劑量組);第四組為注射0. 9% (w/w) NaCl的生理鹽水對(duì)照組。每天給藥連續(xù)一周后大鼠胃部取血，采用臨床化學(xué)分析儀檢測(cè)大鼠血液中的血糖水平。結(jié)果表明，相比于給藥前，無論是低劑量、中劑量還是高劑量組，PEG-FGF21均能有效的降低II型糖尿病大鼠模型的血糖水平；而生理鹽水對(duì)照組，相比給藥前，血糖水平反而升高，這充分說明了 PEG-FGF21對(duì)II型糖尿病具有潛在的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物，所述修飾物的活性是等摩爾量的未綴合的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的活性的40%以上，優(yōu)選70%以上，更優(yōu)選80% 以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物，其特征在于是由人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21與mPEG-馬來酰亞胺綴合而成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物，其特征在于是由人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21與mPEG- 丁醛綴合而成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物，其特征在于其中mPEG的分子量介于4kDa-22kDa，優(yōu)選為5kDa、lOkDa、15kDa、或20kDa。
5.一種權(quán)利要求1所述的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺或mPEG- 丁醛混合，避光反應(yīng)后，終止反應(yīng)；(2)將步驟(1)中的反應(yīng)產(chǎn)物a^phedaxG_25柱除鹽，然后上樣于QAE-S印hadex A50 陰離子交換柱并用含200mM NaCl的PB緩沖液洗脫，收集洗脫峰；上述所有步驟中，PH介于5. 5^9. 5，優(yōu)選為6、7、8、或9。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物的制備方法，其特征在于其中FGF-21與mPEG-馬來酰亞胺或mPEG-丁醛的摩爾比介于1 8 1 65，優(yōu)選為 1 10、1 20、1 30、或 1 60。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物的制備方法，其特征在于還包括步驟(3)用含500mM NaCl的PB緩沖液洗脫步驟(2)中的QAE-S印hadex A50陰離子交換柱，收集洗脫峰，得未修飾的FGF-21。
8.人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物在制備用于調(diào)節(jié)糖、脂代謝的藥物中的應(yīng)用，優(yōu)選用于調(diào)節(jié)糖代謝的藥物是用于預(yù)防或治療II型糖尿病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)修飾物領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明公開了人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的聚乙二醇化學(xué)修飾物，所述修飾物的活性是等摩爾量的未綴合的FGF-21的活性的40%以上。本發(fā)明還公開了該修飾產(chǎn)物的制備方法，其不但能制備該修飾產(chǎn)物，而且還能夠回收未修飾的FGF-21。另外，本發(fā)明還公開了該修飾產(chǎn)物在制備用于調(diào)節(jié)糖代謝的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/18GK102406943SQ201010291928
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月26日
發(fā)明者倪春燕, 馮文科, 葉朝輝, 孫傳傳, 李校堃, 王會(huì)巖, 王曉杰, 陸美斐, 黃志峰 申請(qǐng)人:浙江格魯斯特生物科技有限公司, 溫州醫(yī)學(xué)院