專利名稱：葛根素在制備治療P2X₃受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鎮(zhèn)痛藥物用途發(fā)明領(lǐng)域，尤其是涉及可用于防治疼痛的葛根素在制備 治療P2X3受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用。
背景技術(shù)：
疼痛是大多數(shù)疾病具有的共同癥狀，是人類共有而個體差異很大的一種不愉快 的感覺。由于疼痛給人們造成極大痛苦，據(jù)2001年第二期《國際疼痛學會通迅》報道美 國106次國會通過一項決議，宣布從2001年元月一日起的十年為“疼痛控制和研究的十 年”(Decade of Pain Control and Research)。由此說明各國對疼痛研究的重視。根據(jù)疼 痛時程可將疼痛分為急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)。其中慢性痛包括炎癥 痛、神經(jīng)病理痛、癌癥痛，是臨床上常見主訴之一。由于慢性痛機理復雜，其治療成為臨床上 的難題。神經(jīng)病理痛是指由神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病所引起的疼痛綜合征，常常表現(xiàn)為自發(fā)性 的疼痛，對機械、冷、熱等傷害性剌激產(chǎn)生痛覺過敏；對非傷害性剌激產(chǎn)生觸誘發(fā)痛、痛覺倒 錯和燒灼痛等神經(jīng)病理性痛覺過敏。由于慢性痛持續(xù)時間長，對人身心健康危害較大，其研 究成為疼痛領(lǐng)域的熱點和重點。燒傷是嚴重的創(chuàng)傷，燒傷疼痛也是最嚴重的急性痛之一，燒 傷后伴隨炎癥反應導致炎癥痛。疼痛往往是燒傷患者的第一反應，一般在燒傷后最初1小 時內(nèi)，創(chuàng)面出現(xiàn)不同程度的疼痛或者沒有明顯的疼痛，此后的疼痛往往受以下因素的影響 如燒傷深度、病程進展階段、治療措施和患者的個體因素等。燒傷后疼痛是由于燒傷部位皮 膚的傷害性感受器受刺激，并伴隨著炎癥反應和神經(jīng)損傷所引起的，因此它的治療需要結(jié) 合傷害性感受處理和神經(jīng)病理處理。嘌呤類物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)作為重要的信使物質(zhì)參與痛覺信息傳遞。嘌呤 (Purine)受體分為嘌呤1和嘌呤2 (Purine LPurine 2 ;P1，P2)受體，ATP及其類似物作用 于P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯(lián)型受體(P2Y 受體)。P2X受體有七種亞型(P2U。英國“自然”雜志報道ATP作用的P2X3受體(P2X受 體的一種亞型)特異性地在感覺傳入的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元克隆表達。疼痛、傷害性剌激使 損傷細胞、應激細胞以及感覺神經(jīng)末梢本身釋放大量ATP，ATP及其作用的P2X受體涉及痛 覺及傷害性信息在初級感覺神經(jīng)元的傳遞，其中主要是同聚性P2X3受體參與初級感覺神經(jīng) 元的痛覺及傷害性信息傳遞?；蚯贸齈2X3受體的小鼠減小了對福爾馬林致痛試驗的兩 相反應。P2X3受體介導神經(jīng)病理痛的痛覺傳遞。神經(jīng)病理痛刺激時，P2X3受體和P2X3mRNA 表達增加，感覺神經(jīng)元？2&受體介導ATP激活的門控通道電流明顯增強。應用P2X3受體反 義寡核苷酸及RNA干擾技術(shù)可使炎性痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)的P2X3受體水平下調(diào)，進而明 顯減輕P2X3受體激動劑α，β-meATP和福爾馬林所致的足底傷害性反應。這些發(fā)現(xiàn)為神 經(jīng)病理痛的發(fā)病機理提供了新的依據(jù)。申請人實驗室以前的研究也顯示燒傷可導致背根感 覺神經(jīng)元？2\受體表達增加。目前國外已有研究生產(chǎn)P2X3受體拮抗劑(如R03)用于臨床 治療疼痛的報道。
3
葛根素是從豆科植物野葛及甘葛藤根中提取的一種黃酮苷，臨床上主要用于心血 管疾病和糖尿病的治療。文獻報道[周軍，方素萍，齊云，等.葛根湯對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠 關(guān)節(jié)炎液炎癥介質(zhì)的影響.中國實驗方劑學雜志，2001，7(3) =29-31.]以葛根為主藥的葛 根湯具有抗炎作用。該文獻提示從葛根中提取的葛根素可能具有抗傷害性反應和影響痛覺 的作用，但目前尚無葛根素直接具有鎮(zhèn)痛作用的報道，臨床上也無葛根素通過鎮(zhèn)痛作用機 制進行疼痛治療的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供葛根素的新用途，即葛根素在制備治療P2X3受體介導神經(jīng) 系統(tǒng)疾病藥物中的應用。葛根素可減輕神經(jīng)病理痛(慢性痛)及燙傷痛大鼠的痛(急性痛)行為反應。葛 根素在治療急性痛/慢性痛的作用機理為阻斷P2X3受體介導的疼痛信息傳遞，產(chǎn)生防治 疼痛的作用。為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面以實驗和結(jié)果來證明葛根素的用途。本發(fā)明分為葛根素對神經(jīng)病理痛作用和燒傷痛作用兩部分。一、材料和方法(一 )葛根素對P2X3受體介導神經(jīng)病理痛作用研究1.1動物和分組雄性SD大鼠，220_250g，南昌大學醫(yī)學院實驗動物科學部提供。將大鼠隨機分成5 組，每組12只。實驗分組I (假手術(shù)組)(sham) ； II (單獨葛根素組)(Puerarin) ；III (坐 骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組)(Chronic constriction injury, CCI) ；IV (坐骨神經(jīng)慢性壓迫 性損傷+葛根素組)(CCI+puerarin) ； V (正常組)(control)。葛根素注射液溶解于生理 鹽水，濃度為50mg/ml。I組每天腹腔注射生理鹽水(4ml/kg) ； II組每天腹腔注射葛根素注 射液(4ml/kg) ；III組(假手術(shù)組)切開皮膚暴露坐骨神經(jīng)，不結(jié)扎神經(jīng)即縫合皮膚。IV組 CCI術(shù)后第1天開始每天腹腔注射葛根素注射液(4ml/kg)。1.2藥物與試劑葛根素，山東方明藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號0804171)；硫噴妥鈉，上海新 亞藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號050101) ；SP試劑盒，原位雜交試劑盒及DAB試劑盒(北京 中山生物技術(shù)有限公司)；P2X3抗體購自美國CHEMIC0NINTERNATI0NAL公司。三磷酸腺 苷(adenosine 5-triphophate，ATP)，sigma, DRG 細胞外液配制，pH7. 4。α、β 亞甲三磷 酸腺苷(α，^methyleneATP, α，β-meATP) sigma, DRG 細胞外液配制，ρΗ7· 4。三硝基三 磷酸腺苷(TNP-ATP)，sigma, DRG細胞外液配制，pH7. 4。玻璃微電極所充內(nèi)液(internal solution)成份為(mmol .L_l) :KC1 140，CaCl2 1，MgCl2 2，HEPES 10，EGTA 11，ATP 4。電 極電阻2 5ΜΩ。灌流用之DRG細胞外液(external solution)成份為(mmol .L_l) =NaCl 150，KCl 5，CaCl2 2. 5，MgCl2 1，HEPES 10，D-Glucose 10。1.3主要儀器BME-403 Von Frey細絲(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；BME-410C型全 自動熱痛刺激儀(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；消毒紗布、手巾、棉簽等，碘酒及 75%酒精，手術(shù)器械包剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷、神經(jīng)剝離子等。
膜片鉗實驗裝置及相關(guān)配件CEZ-2400型全細胞膜片鉗放大器(日本 Nihon-Kohden), SBR-I型二線示波器(汕頭超聲電子儀器廠)，95-B玻璃微電極拉制儀(華 中科技大學同濟醫(yī)學院分子及細胞神經(jīng)生物學研究室)，分析天平(上海天平儀器廠)，刺 激器(SEN-7203,Nihon-Kohden,日本)，隔離器(SS-202J,Nihon-Kohden,日本)，LMS_2B 型 二道生理記錄儀(成都儀器廠)，玻璃微電極(GG-17，華西醫(yī)科大學儀器修造廠)，倒置顯微 鏡(Olympus，日本)，HY-Z調(diào)速多用恒溫振蕩器(國華電器有限公司)。1.4慢性神經(jīng)病理痛模型制作用硫噴妥鈉麻醉大鼠(30mg/kg，腹腔注射)，在無菌條件下于大鼠右大腿后外側(cè) 切開皮膚，鈍性分離出坐骨神經(jīng)，以4-0含鉻腸線輕度結(jié)扎坐骨神經(jīng)，共結(jié)扎4道，每個結(jié) 之間間隔約1mm。結(jié)扎過程中可見坐骨神經(jīng)被結(jié)扎處直徑略減小，并伴有右后肢一過性抽 動，并注意不要結(jié)扎太緊以至于完全阻斷神經(jīng)外周的血流。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，分別于術(shù)前 (Od)及術(shù)后l，3，5，7，9，ll，14d測量機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期(測定時間恒 定于每日10 00-14:00，室溫維持在22 士 0.5 °C )。1. 5神經(jīng)病理痛大鼠機械痛敏檢測用BME-403 Von Frey細絲(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)測定機械 縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。置大鼠于透明的有機玻璃箱 (22 X 12 X 22cm3)中，有機玻璃箱底為1 X Icm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實驗室飼養(yǎng)，測 試前將大鼠放在有機玻璃箱中適應15min。折力分別為0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60， 5. 00，7. 30，9. 90，20. lg，折力彡20. Ig時均記為20. Igo從最小折力開始，每根試驗10次， 直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大于5/10，即50%反應閾值(即引起10次試驗中5次反應的值。重 復三次，取其平均值)。每次刺激間隔時間至少大于15s，并待刺激引起的反應(如舔足、甩 腿等)完全消失。1. 6神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動熱痛刺激儀(中國醫(yī) 學科學院生物醫(yī)學工程研究所)照射大鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現(xiàn)抬腿回 避時間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL) 0切斷時間為30秒，以 防止組織灼傷。1. 7大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3受體的表達五組實驗大鼠于術(shù)后第14天腹腔注射硫噴妥鈉(30mg/kg)深麻醉，經(jīng)升主動脈灌 注4%多聚甲醛(0. lmol/L 8，？!17.4)，分離出大鼠1^4、1^5段01 ，取出固定，放入4%多聚 甲醛/0. ImPBS(含0. 1%DEPC)中固定2小時，用20%蔗糖脫水，在恒冷箱切片機上行冰凍 切片，厚度為15ym.放入4%的多聚甲醛中保存。每只大鼠的DRG切片隔5張取一張二步 法免疫組織化學染色測定DRG神經(jīng)元細胞P2X3受體的表達，DAB顯色。與此同時對DRG切 片進行原位雜交測定P2X3受體mRNA的表達，雜交前所用液體和器皿都經(jīng)0. 1 %的DEPC嚴 格處理。冰凍切片在0. 05%的H2O2室溫下作用30分鐘，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，胃蛋白 酶消化1-2分鐘，37°C預雜交液中孵育2小時，棄去預雜交液，轉(zhuǎn)入雜交液于水浴中37°C過 夜。次日，用梯度枸櫞酸鹽水(2XSSC，0. 5XSSC和0. 2XSSC)沖洗切片各15分鐘。入37°C封 閉液30分鐘，轉(zhuǎn)入生物素化的地高辛中37°C孵育30分鐘，0. 05%的PBS沖洗15分鐘，相 繼在SABC-POD和生物素化的過氧化物酶中各孵育30分鐘，DAB顯色。結(jié)果用圖像分析系
5統(tǒng)軟件(武漢天平影像技術(shù)有限公司，HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng))對P2X3 陽性神經(jīng)元進行灰度分析。1. 8葛根素對CCI大鼠DRG神經(jīng)元ATP或α，β -meATP激活電流的影響1. 8. 1標本制備大鼠DRG神經(jīng)元標本的分離方法概述如下將大鼠擊昏、斷頭后迅速切開背部皮 膚，沿脊柱兩側(cè)剪斷與之相連的肋骨，取出胸腰段脊柱，由脊柱正中剖開成兩半，置O2飽和 ^DMEMy^ (Dubecco's Modified Eagle's medium) ,ρΗ{|7. 40,340m0sm/ kg。由剖開的椎管內(nèi)側(cè)取出L4、L5神經(jīng)節(jié)及相連的神經(jīng)根(腹、背根)和脊神經(jīng)，在解剖顯 微鏡下用精細角膜剪及游絲鑷仔細剪除相連神經(jīng)和周圍結(jié)締組織被膜，將清除干凈的DRG 盡可能地剪碎，置培養(yǎng)瓶內(nèi)并加入 trypsin (typeIII，sigma) 0. 5g/L, collagenase (type ΙΑ, sigma) l.Og/L在恒溫振蕩水浴器(35°C，80次/分)中孵育20-30分鐘，完成后加入適量的 Soya beam trypsin inhibitor (type II _s，sigma)以終止酶的消化作用。將上述酶和機 械分離的DRG細胞轉(zhuǎn)移至35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，放在倒置顯微鏡的載物臺上換液靜置30min。然 后應用全細胞式膜片鉗技術(shù)記錄葛根素對ATP或α，β-meATP激活電流的影響。1. 8. 2全細胞膜片鉗實驗操作程序(1)仔細檢查實驗系統(tǒng)各儀器間的連接和初始設(shè)置。(2)打開電源開關(guān)。(3)電極安裝接好參比電極，充灌玻璃電極，然后將其裝于電極夾持器上。注意 電極充灌不要過滿；裝電極之前將手接觸屏蔽罩排出身體上的靜電。(4)相界電位補償和電極電阻的測量在“搜索”方式下將微電極入液，調(diào)節(jié)相界 電位補償，并根據(jù)脈沖電壓方波引起的電流響應幅值測量電極電阻。(5)細胞封接調(diào)節(jié)微操縱器使微電極尖端接近細胞表面，并對微電極內(nèi)施一負 壓，形成吉歐封接。(6)快電容補償調(diào)節(jié)快電容補償，使輸出信號中不含快電容電流成分。(7)吸破細胞膜將工作方式切換到“鉗壓”擋。在電極與細胞之間形成高阻 (I-IOGQ)封接后，進一步將膜吸穿。置鉗制電壓(H.P)于_60mV，膜電流應用低通波 (IkHz，-3dB)。(8)慢電容補償調(diào)節(jié)慢電容補償，使輸出信號中不含慢電容電流成分。串聯(lián)電阻補償調(diào)節(jié)串聯(lián)電阻補償至不產(chǎn)生震蕩為止。全細胞膜片鉗記錄所用的儀器為CEZ-2400型膜片鉗放大器(Nihon-Kohden，日 本)。在電極與細胞膜之間形成高阻(1 10GQ)封接后進一步將膜吸穿，調(diào)節(jié)電容和 串聯(lián)電阻補償。置保持電壓(holding potential, HP)于_60mV，膜電流應用低通濾波 (IkHz, -3dB)。實驗結(jié)果由二道記錄儀(LMS-2B，成都)描記。ATP濃度-效應曲線按照下 列公式繪制。I = Imax/[1+(EC50/C)n]式中C為ATP濃度，I為標準化后的ATP激活電流， Imax為標準化后的ATP激活電流最大值，EC50或Kd為ATP產(chǎn)生最大效應的半效濃度，η為 Hill系數(shù)。給藥系通過微操縱器移動快速換藥裝置的排管進行，每管直徑為0. 2mm，管口距 記錄的細胞約100 μ m。實驗中需進行藥物胞內(nèi)透析時系通過插入玻璃微電極里的微管注入 藥物。實驗在室溫20 30°C范圍進行。1. 9實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理
6
各組數(shù)據(jù)以χ士sem表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法 (LSD)行兩兩比較。用SPSS11. 0軟件包進行數(shù)據(jù)處理。P < 0. 05為差異有顯著性。( 二)葛根素對P2X3受體介導燒傷痛作用研究2. 1動物和分組雄性SD大鼠，220_250g，60只，南昌大學醫(yī)學院實驗動物科學部提供，隨機分組。 I組為足部皮膚假燙組；II組為葛根素注射+足部皮膚I度或淺II度燒傷組；III組為生理 鹽水+足部皮膚I度或淺II度燒傷組；IV組為背部皮膚假燙組，V組為葛根素注射+背部皮 膚I度或淺II度燒傷組；VI組為生理鹽水+背部皮膚I度或淺II度燒傷組。葛根素注射液 溶解于生理鹽水，濃度為50mg/ml。III組和VI組在燙傷前0. 5h尾靜脈注射4ml/kg生理鹽 水，每天1次至實驗結(jié)束；II組和V組燙傷前0. 5h尾靜脈注射葛根素注射液4ml/kg，每天 一次至實驗結(jié)束；I組和IV組(假燙組)分別將足部或背部皮膚浸在37°C溫水中8s。2. 2藥物與試劑葛根素，山東方明藥業(yè)股份有限公司(生產(chǎn)批號0804171)；乙醚，天津市大茂化 學試劑廠(生產(chǎn)批號050801)；硫噴妥鈉，上海新亞藥業(yè)有限公司(生產(chǎn)批號050101) ；SP 試劑盒，DAB試劑盒(北京中山生物技術(shù)有限公司)；P2X3抗體(CHEMICON INTERNATIONAL, 美國)；SlOO抗體(武漢博士德公司)。2. 3主要儀器BME-403 Von Frey細絲(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；BME_410C型 全自動熱痛刺激儀(中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所)；膜片鉗裝置及相關(guān)配件 CEZ-2400型全細胞膜片鉗放大器(Nihon-Kohden，日本)，SBR-I型二線示波器(汕頭超聲 電子儀器廠)，95-B玻璃微電極拉制儀(華中科技大學同濟醫(yī)學院分子及細胞神經(jīng)生物學 研究室)，分析天平(上海天平儀器廠)，刺激器(SEN-7203，Nihon-Kohden,日本)，隔離器 (SS-202J, Nihon-Kohden,日本)，LMS-2B型二道生理記錄儀(成都儀器廠)，玻璃微電極 (GG-17，華西醫(yī)科大學儀器修造廠)，倒置顯微鏡(Olympus，Japan)，HY-Z調(diào)速多用恒溫振 蕩器(國華電器有限公司)等。2. 4燒傷模型制作與確定2. 4. 1燒傷模型制作2. 4. 1. 1足部淺II度燙傷大鼠模型用乙醚麻醉大鼠后，將大鼠右后足部浸入70°C水中5s或8s，燙傷后單籠飼養(yǎng)，分 別于燙傷前(Oh)及燙傷后1，24，48，72，96，120，144h測量右后足部機械縮足反射閾值和熱 縮足反射潛伏期(室溫維持在22 士 0. 5°C )。2. 4. 1. 2背部淺II度皮膚燒傷大鼠模型用乙醚麻醉大鼠后，將大鼠背部皮膚剪去毛發(fā)后浸入70°C水中5s或8s，燙傷面積 大約30%，形成背部皮膚淺II度燒傷大鼠模型，燙傷后單籠飼養(yǎng)，創(chuàng)面暴露，不做任何處理。2. 4.2 I度和淺II度燒傷大鼠的確定I度燒傷大鼠的皮膚浸入70°C水中5s后，15分鐘左右可以觀察到有紅斑和輕微 水腫形成，病理切片HE染色證實為I度燒傷。淺II度燒傷大鼠皮膚浸入70°C水中8s后，15 分鐘左右可以觀察到有紅斑和輕微水腫形成，3小時后可以看到有水皰形成，病理切片HE 染色證實為淺II度燒傷。燒傷大鼠在處死之前沒有明顯感染發(fā)生。
2. 5足部燒傷大鼠機械痛敏測定用BME-403 Von Frey細絲測定機械縮足反射閾值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)。置大鼠于透明的有機玻璃箱(22X 12X22cm3)中，有機玻璃 箱底為IX Icm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實驗室飼養(yǎng)，測試前將大鼠放在有機玻璃箱中適 應 15min。折力分別為 0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60，5. 00，7. 30，9. 90，20. Igo 從最小 折力開始，每根試驗10次，直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大約5/10，即50%反應閾值(即引起10 次試驗中5次反應的值)。最大折力為20. lg，大于此值時記為20. lg。每次試驗至少間隔 15s，并待刺激引起的反應(如舔足、甩腿等)完全消失。2. 6足部燒傷大鼠熱痛敏測定將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動熱痛刺激儀照射大 鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL)。切斷時間為25秒，以防止組織灼傷。2. 7背部燒傷大鼠皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體表達實驗燙傷大鼠每天尾靜脈注射葛根素或生理鹽水5ml/kg，連續(xù)3天后，各組大鼠腹腔 注射硫噴妥鈉(30mg/kg)深麻醉，剪取大鼠背部燒傷皮膚，大小為1. 5-2cm2，取出固定，石蠟 包埋。免疫組化測定時橫斷切片，片厚4 μ m。二步法免疫組織化學染色，DAB顯色。每只大 鼠的皮膚隔5張取連續(xù)二張切片，一張切片做皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體表達測定，另一張切 片做皮膚神經(jīng)末梢SlOO表達測定。結(jié)果用圖像分析系統(tǒng)軟件(武漢天平影像技術(shù)有限公 司，HMIAS-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng))分析P2X3陽性神經(jīng)元灰度。2. 8實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理各組數(shù)據(jù)以χ士sem表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法 (LSD)行兩兩比較。用SPSS11. 0軟件包進行數(shù)據(jù)處理。P < 0. 05為差異有顯著性。二、結(jié)果(一 )葛根素對P2X3受體介導的神經(jīng)病理痛作用的研究結(jié)果各組大鼠術(shù)后均未見肢體運動障礙和自殘現(xiàn)象。1. 1行為學研究1. 1. 1神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏檢測坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4天后神經(jīng)病理通模型基本形成，III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損 傷組；Chronic constriction injury, CCI)和IV組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素 組；CCI+puerarin)的熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL)較 I 組(假 手術(shù)組，sham)、II組(單獨葛根素組，puerarin)和V組(正常對照組，control)顯著性下 降(ρ < 0. 01)，而I組(sham)、II組(puerarin)和V組(control)之間相比較無顯著性差 異(P > 0. 05)。IV組(CCI+puerarin)熱縮足反射潛伏期與 I 組(sham)、II 組(puerarin) 和V組(control)之間相比較仍下降(ρ < 0. 01)，但與III組(CCI)之間比較顯著性增加(ρ < 0.01)。14d后，IV組(CCI+puerarin)熱縮足反射潛伏期與V組(control)之間相比較 無顯著性意義(P > 0. 05)，而III組(CCI)仍較低(ρ < 0. 01)。見圖1。1. 1. 2神經(jīng)病理痛大鼠機械痛敏檢測坐骨神經(jīng)被結(jié)扎4d后神經(jīng)病理通模型基本形成，III組(Chronic constriction injury, CCI)和IV組(CCI+puerarin)與 I 組(sham)、II組(puerarin)和 V組(control)相比，其機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性下降(ρ
<0. 01)，而I組(sham)、II組(puerarin)和V組(control)之間相比較無顯著性差異(ρ >0.05)。坐骨神經(jīng)被結(jié)扎7d后，雖IV組(CCI+puerarin)與V組(control)相比，其機械 縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)仍低(ρ < 0.01)，但III組(CCI) 比 V組(control)的械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)更低(ρ <0.01)，而IV組(CCI+puerarin)與III組(CCI)之間比較，機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性增加(ρ < 0. 01)。見圖 2。1. 1. 3大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) Ρ2Χ3受體的表達變化術(shù)后14d，用免疫組織化學方法測定大鼠1^4、L5手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG) 2&受 體的表達。每只大鼠背根神經(jīng)節(jié)L4、L5段切片中隔5張取一張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟 件分析P2X3陽性神經(jīng)元的灰度變化。I組(假手術(shù)組，sham)、II組(單獨葛根素組， Puerarin)、III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組，CCI)、IV組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+ 葛根素組，CCI+puerarin)、V組(正常組，control)的灰度值分別為112. 52士 13. 59、 115. 35士 16. 21,169. 25士23. 46,137. 27士 17. 24,111. 12士 12. 85。I 組、II 組、V 組之間 P2X3受體表達無顯著性差異(ρ > 0. 05) ；III組DRG的P2X3受體的表達較I組、II組、V組明 顯增加(P < 0. 01) ；IV組DRG的P2X3受體的表達較I組、II組、V組高(ρ < 0. 05)，但和III 組相比仍較低(ρ < 0. 05)。見圖3。1. 1. 4大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) Ρ2Χ3受體mRNA的表達變化術(shù)后14d，采用原位雜交方法測定大鼠L4、L5段手術(shù)側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3受體 mRNA的表達。每只大鼠L4、L5背根神經(jīng)節(jié)切片中隔5張取一張切片，用圖像分析系統(tǒng)軟件 分析P2X3陽性神經(jīng)元的灰度變化。與免疫組織化學實驗結(jié)果非常相似，I組(假手術(shù)組， sham)、II組(單獨葛根素組，Puerarin)、III組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組，CCI)、IV組 (坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素組，CCI+puerarin)、V組(正常組，control)的灰度值 分別為122. 95士 15. 24,124. 28士 14. 82,185. 62士26. 48,138. 52士31. 68,123. 57士9. 65。 I組、II組、IV組、V組之間P2X3受體表達無顯著性差異(ρ > 0. 05) ；III組組DRG的P2X3受 體的表達較I組、II組、V組明顯增加(ρ < 0. 01) ；IV組DRG的P2X3受體的表達較V組低(ρ
<0. 05)。見圖 4。1.1.5葛根素對大鼠DRG神經(jīng)元ATP或α，β -meATP激活電流的影響實驗在各實驗組大鼠新鮮分離的L4/L5手術(shù)側(cè)即右側(cè)DRG細胞上進行，分離的細 胞呈圓形或橢圓形，實驗細胞胞體直徑在25-40 μ m之間。多數(shù)細胞的胞體一側(cè)可見到卷曲 的軸突殘根。實驗分為I組(假手術(shù)組，sham)、II組(單獨葛根素組，puerarin)、III組(坐骨神 經(jīng)慢性壓迫性損傷組，CCI)、IV組(坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素組，CCI+puerarin)、 V組(正常組，control)。實驗共檢測I組36個細胞，II組37個細胞，III組39個細 胞，IV組 40 個細胞，V 組 38 個細胞，其中 I 組 88. 9% (32/36)，II 組 89. 2 % (33/37)，III 組 87. 2 % (34/39)，IV 組 87. 5 % (35/40)，V 組 86. 8 % (33/38) DRG 神經(jīng)元對細胞外加 ATP (1-1000 μ mol/L)敏感。ATP-激活電流(Iatp)顯示快失敏和慢失敏兩種形式的內(nèi)向電 流(即盡管激動劑持續(xù)存在且濃度不變，但激活電流上升到達頂峰之后，其幅值隨時間呈 指數(shù)性的逐步衰減直至一穩(wěn)定值)。五組DRG神經(jīng)元Iatp的完全恢復時間均約為4-6min，
9但CCI組較其它四組DRG神經(jīng)元對同一濃度的ATP產(chǎn)生的Iatp明顯增加，且隨著ATP濃度 增加ATP-激活電流增加更明顯(P <0.05)，其它四組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。 P2X3受體激動劑α，β -meATP (10 μ mol/L)-激活電流在I、II、IV、V組產(chǎn)生極小的內(nèi)向電 流，而在CCI組為一具有明顯去敏感的內(nèi)向電流(P < 0. 01)。各組DRG神經(jīng)元ATP激活電 流效應也表明神經(jīng)病理痛大鼠DRG神經(jīng)元細胞ATP激活電流和I、II、V組比明顯增強，葛 根素用藥組和I、II、V組相比較雖然有所增加，但無顯著性差異(P > 0.05)，見圖5。( 二)葛根素對P2X3受體介導的燒傷痛作用的研究結(jié)果2. 1. 1淺II度燒傷大鼠的確定淺II度燒傷大鼠皮膚浸入70°C水中8s后，15分鐘左右可以觀察到有紅斑和輕微 水腫形成，3小時后可以看到有水皰形成，病理切片HE染色證實為淺II度燒傷，見圖6。燒 傷大鼠在處死之前沒有明顯感染現(xiàn)象。2. 1. 2燒傷大鼠皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體表達的變化應用二步法進行皮膚神經(jīng)末梢免疫組化，連續(xù)切片顯示，S-100顯色陽性神經(jīng)末 梢，同時具有？2&免疫陽性表達。在鏡下觀察，可以看到皮膚真皮層的神經(jīng)末梢主要分 布在乳頭層靠近表皮層，呈散在分布，或在毛囊、腺體附近分布，見圖7。用圖象分析軟件 對P2X3免疫陽性皮膚神經(jīng)末梢灰度值進行分析，結(jié)果表明背部皮膚假燙組、葛根素注射 +背部皮膚淺II度組和生理鹽水+背部皮膚淺II度組的灰度值分別為118. 76士 18. 48、 130. 42士 13. 35,152. 63士22. 62。生理鹽水+背部皮膚淺II度組燒傷后，皮膚神經(jīng)末梢P2X3 表達明顯升高，與背部皮膚假燙組相比較具有顯著性差異(P < 0.05)，葛根素注射+背部 皮膚淺II度組雖然仍高于背部皮膚假燙組，但顯著性低于生理鹽水+背部皮膚淺II度組(P < 0. 05)。表明葛根素可減少燙傷皮膚神經(jīng)末梢P2X3的增強表達，見圖8。2. 1. 3足部燒傷大鼠熱痛敏測定將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動熱痛刺激儀照射大 鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現(xiàn)抬腿回避時間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL)。切斷時間為30秒，以防止組織灼傷。燒傷后l、24、48、72h III (足部淺 II °C 燙傷組，superficial second degree foot burn)、IV (足部淺 II °C 贊傷 + 葛根素組，superficial second degree foot burn+puerarin)與 I (足部假燙組，sham foot burn)、II (單獨葛根素組， intraperitoneal injection of puerarin) > V ( IE常組，control)之間才目比較，III (淺 II °C燙傷組)、IV (淺II V燙傷+葛根素組)熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL)顯著性下降(ρ < 0. 01), I (足部假燙組)、II (單獨葛根素組)、V (正常 組)之間相比較無顯著性差異(p>0.05)。燒傷后24h后，IV (足部淺II°C燙傷+葛根 素組)熱縮足反射潛伏期與I (足部假燙組)、II (單獨葛根素組)、V (正常組)之間相 比較仍下降(ρ <ο.οι)，但與πι (足部淺ire燙傷組)之間比較顯著性增加(ρ<0·01)。 144h后，IV (足部淺IFC燙傷+葛根素組)熱縮足反射潛伏期基本恢復正常(ρ >0.05)， 而III (足部淺II °C燙傷組)仍較低(ρ < 0. 01)。見圖9。2. 1. 4足部燒傷大鼠機械痛敏測定用BME-403 Von Frey 細絲測定機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT) 0置大鼠于透明的有機玻璃箱(22 X 12 X 22cm3)中，有機玻璃箱底為IXlcm2的鐵絲網(wǎng)。術(shù)后大鼠放置于實驗室飼養(yǎng)，測試前將大鼠放在有機玻璃箱中適 應 15min。折力分別為 0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60，5. 00，7. 30，9. 90，20. Ig,折力 ^ 20. Ig時均記為20. lg。從最小折力開始，每根試驗10次，直至出現(xiàn)縮足反射次數(shù)大于 5/10，即50%反應閾值(即引起10次試驗中5次反應的值。重復三次，取其平均值)。每 次刺激間隔時間至少大于15s，并待刺激引起的反應(如舔足、甩腿等)完全消失。
燒傷后Ih始，III (足部淺ire燙傷組)、IV (足部淺ire燙傷+葛根素組)與
I(足部假燙組)、11 (單獨葛根素組)、V (正常組)之間相比較，III (淺ire燙傷組)、 IV (淺II °C燙傷+葛根素組)機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性下降(ρ < 0. 01)，而I (足部假燙組)、II (單獨葛根素組)、V (正常組)之 間相比較無顯著性差異(P > 0. 05)。24h后，IV (足部淺II V燙傷+葛根素組)與III (足 部淺irC燙傷組)之間比較，機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT) 顯著性增加(P < 0. 01)。72h或96h后IV (足部淺II V燙傷+葛根素組)的機械縮足反 射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)與I、II、V組之間相比較基本恢復正 常(ρ > 0. 05)，而III (足部淺IPC燙傷組)的機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)仍較低(ρ < 0. 01)。見圖 10。 2.1.5免疫組化檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) Ρ2Χ3表達變化SD大鼠(體重200士20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back burn)、II (單獨 葛根素組，Puerarin, intraperitoneal injection) JII (背部淺 II ！燙傷組，superficial second degree back burn)、IV (背部淺 II °GM傷 + 葛t艮素組，superficial second degree back burn+puerarin), V (正常對照組control)。IV (背部淺IFC燙傷+葛根素組)大 鼠，燙傷前30min和燙傷后每天腹腔注射葛根素(Puerarin，100mg/kg)，連續(xù)3天。用免疫 組織化學方法測定大鼠燙傷部背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3受體的表達。免疫組化結(jié)果經(jīng)Hmias-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)分析，結(jié)果顯示I組、
II組、III組、IV組、V組的平均光密度值分別為127. 2士3. 6902 (η = 10)、124. 2士 2. 4258 (η =10) ,158. 6 士 3· 1383 (η = 10) ,135. 9 士 4· 5227 (η = 10) ,125. 1 士 1· 8824 (η = 10)。III (背 部淺ire燙傷組)明顯高于I組、II組、IV組、V組(ρ <0.01)，I、II、V組之間？2&受體 表達無顯著性差異(P > 0. 05) ；IV (背部淺II °C燙傷+葛根素組)與I、II、V組之間P2X3 受體表達相比，雖有偏高，但其與III (背部淺irC燙傷組)比較，DRG的P2X3受體的表達量 明顯下降(P < 0.01)。見圖11。2.1.6原位雜交檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3的mRNA表達變化SD大鼠(體重200士20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back burn)、II (單獨 葛t艮素組，puerarin, intraperitoneal injection) >111 (背部淺 II °GM傷組，superficial second degree back burn)、IV (背部淺 II °GM傷 + 葛t艮素組，superficial second degree back burn+puerarin), V (正常對照組，control)。IV (背部淺II°C燙傷+葛根素組)，燙 傷前30min和燙傷后，大鼠每天腹腔注射葛根素(puerarinlOOmg/kg)，連續(xù)3天。原位雜交結(jié)果經(jīng)Hmias-2000高清晰彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)測定大鼠燙傷部背 根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3受體的表達。結(jié)果顯示，I組、II組、III組、IV組、V組的平均光密度 值分別為111. 4 士 2. 0342 (η = 10) ,105. 4 士 0. 7180 (η = 10) ,129. 1 士 1. 1494 (η = 10)、 101. 7 士 1. 7641 (η = 10)、108. 5 士 3. 5567 (η = 10)。III (背部淺 II °C 燙傷組)P2X3mRNA 表達明顯高于I組、II組、IV組、V組(ρ < 0. 05)，I、II、V組之間P2X3 mRNA表達無顯著性差 異(ρ>0·05) ； IV (背部淺irC燙傷+葛根素組)與III (背部淺irC燙傷組)比較，DRG的 P2X3 mRNA的表達量顯著性下降(ρ < 0. 01)，與I、II、V組之間比較亦較低。見圖12。2. 1. 7蛋白印跡檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)P2X3蛋白表達變化SD大鼠(體重200士20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back burn)、II (單獨 葛t艮素組，puerarin, intraperitoneal injection) >111 (背部淺 II °GM傷組，superficial second degree back burn)、IV (背部淺 II °GM傷 + 葛t艮素組，superficial second degree back burn+puerarin), V (正常對照組，control)。IV (背部淺II°C燙傷+葛根素組)，大 鼠燙傷前30min和燙傷后每天腹腔注射葛根素(puerarin，100mg/kg)，連續(xù)3天。結(jié)果通過Alpha Imager 2200圖像分析軟件讀取目的條帶在X光膠片上測得的 光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組蛋白表達量。結(jié)果 顯示，I組、II組、III組、IV組、V組的Ρ2Χ3的蛋白表達量(經(jīng)對應的β -actin標化后)分 別為0. 9895 士0. 0703 (η = 10)、0. 9744士0. 0214 (η = 10)、1. 2259 士0. 0588 (η = 10)、 0. 9286士0. 0177 (η = 10)、0. 9771 士0. 0203 (η = 10)。III (背部淺 II °C 燙傷組)P2X3 蛋白 的表達明顯高于I組、II組、IV組、V組(ρ < 0.01)，I、II、V組之間？2&蛋白的表達無顯 著性差異(ρ >0.05)，而IV (背部淺irC燙傷+葛根素組)與I、II、V組之間相比，DRG的 P2X3蛋白的表達相對量更低，但無顯著性差異(ρ >0.05)，與III (背部淺IFC燙傷組)比 較，DRG的P2X3蛋白的表達相對量明顯下降(ρ < 0. 01)。見圖13。2. 1. 8RT-PCR檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG) P2X3的mRNA表達變化SD大鼠(體重200士20g)隨機分為I (背部假燙組，sham back burn)、II (單獨 葛t艮素組，puerarin, intraperitoneal injection) >111 (背部淺 II °GM傷組，superficial second degree back burn)、IV (背部淺 II °GM傷 + 葛t艮素組，superficial second degree back burn+puerarin), V (正常對照組，control)。IV (背部淺II°C燙傷+葛根素組)，大 鼠燙傷前30min和燙傷后每天腹腔注射葛根素(puerarin，100mg/kg)，連續(xù)3天。引物設(shè)計選用β-actin作為內(nèi)參，引物序列如下Primer P2X3(產(chǎn)物長度為 519bp)S 5， -CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3，A 5’ -TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3，Primer β-actin (產(chǎn)物長度為 240bp)S 5， -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3，A 5’ -CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’采用凝膠成像系統(tǒng)讀取目的電泳條帶的斑點密度(平均光密度)掃描值，將 2&條帶與其對應的β-actin條帶的比值作為P2X3 mRNA表達的相對量。結(jié)果顯示，
I組、II組、III組、IV組、V組P2X3 mRNA表達相對量(經(jīng)對應的β -actin標化后)分 別為0. 9379 士 0. 0053 (η = 10)、0. 9513 士 0. 0049 (η = 10)、1. 0391 士 0. 0097 (η = 10)、 0. 9133 士 0. 0033 (η = 10)、0. 9517 士 0. 0085 (η = 10)。III (背部淺 II°C 燙傷組)P2X3 mRNA 的表達明顯高于I組、II組、IV組、V組(ρ <0.01), K II、V組之間P2X3 mRNA的表達無顯 著性差異(p>0.05)，而(背部淺IFC燙傷+葛根素組)與I、II、V組之間相比，DRG的 P2X3 mRNA的表達量更低，有顯著性差異(ρ < 0. 05)，與III (背部淺II °C燙傷組)比較，DRG的P2X3 mRNA的表達明顯下降(ρ < 0. 01)。見圖14。申請人:實驗室的研究發(fā)現(xiàn)葛根素可減輕神經(jīng)病理痛及燙傷痛大鼠的痛行為反應。 根據(jù)葛根素減小神經(jīng)病理痛和燒傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元Ρ2Χ3受體的表達、抑制Ρ2Χ3受 體激動劑ATP和α，β-meATP在正常大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的激活電流的研究結(jié)果，表明 葛根素減輕疼痛的作用機理是阻斷？2&受體介導的疼痛信息傳遞，具有防治疼痛的作用。 此外，由于P2X嘌呤受體涉及體內(nèi)許多生理功能和病理作用，探尋出新的嘌呤受體特異性 阻斷劑，將極大地推動嘌呤信息系統(tǒng)在體內(nèi)各種生理功能和病理作用的研究工作。


圖1為葛根素神經(jīng)病理痛大鼠熱痛敏的影響圖；圖2為葛根素神經(jīng)病理痛大鼠機械痛敏的影響圖；圖3為葛根素對神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體免疫反應性的影響圖，其中 A 假手術(shù)組；B 單獨葛根素組；C 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損 傷+葛根素組；E 正常組；圖4為葛根素對神經(jīng)病理痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表達的影響圖，其中 A 假手術(shù)組；B 單獨葛根素組；C 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損 傷+葛根素組；E 正常組；圖5為各組大鼠DRG神經(jīng)元P2X受體激動劑-激活電流圖，其中A 假手術(shù)組；B 單獨葛根素組；C 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷組；D 坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷+葛根素組； E 正常組；圖6為淺II度燒傷皮膚HE染色病理切片X40的示意圖；圖7為大鼠皮膚標本連續(xù)切片S-100和P2X3免疫組織化學照片，其中A為神經(jīng)末 梢s-100免疫陽性表達照片；B為神經(jīng)末梢P2X3免疫陽性表達照片，箭頭所指為免疫陽性神 經(jīng)末梢；圖8為燒傷大鼠皮膚神經(jīng)末梢P2X3受體免疫組化表達照片，其中A為背部皮膚假 燙組；B為葛根素注射+背部皮膚淺IPC燙傷組；C為生理鹽水+背部皮膚淺IPC燙傷組，箭 頭所指為免疫組化陽性神經(jīng)末梢；圖9為葛根素燙傷痛大鼠熱痛敏的影響圖；圖10為葛根素燙傷痛大鼠機械痛敏的影響圖；圖11為葛根素對燙傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體免疫反應性的影響圖，其中A 假燙組；B 單獨葛根素組；C 淺irC燙傷組；D 淺irC燙傷+葛根素組；E 正常組；圖12為葛根素對燙傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表達的影響圖，其中A 假 燙組；B 單獨葛根素組；C 淺II °C燙傷組；D 淺II °C燙傷+葛根素組；E 正常組；圖13為葛根素對燙傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體蛋白表達的影響圖，其中實驗 分組順序假燙組；正常對照組；淺II °C燙傷+葛根素組；淺II °c燙傷組；單獨葛根素組；圖14為葛根素對燙傷痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體mRNA表達的影響圖，其中實驗 分組順序正常對照組；淺II V燙傷+葛根素組；淺II °c燙傷組；單獨葛根素組；假燙組。
1具體實施例方式下面結(jié)合實施例并對照附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1 用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于急性痛/慢性痛治療的口服、注射或局部 (如局敷)的葛根素制劑。實施例2:用本技術(shù)領(lǐng)域公知的方法，制成適用于涉及P2X3受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的口 服、注射或局部(如局敷)的葛根素制劑。
權(quán)利要求
葛根素作為P2X3嘌呤受體拮抗劑在制備治療P2X3受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及葛根素在制藥領(lǐng)域中的新用途，即葛根素在制備治療P2X3受體介導神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用。實驗觀察到葛根素可抑制痛覺行為反應，進而應用免疫組化、原位雜交、RT-PCR及蛋白印跡等技術(shù)觀察到葛根素可抑制神經(jīng)病理痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)及燒傷模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)、感覺神經(jīng)末梢P2X3受體的mRNA和蛋白表達，用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察到葛根素可明顯減小病理痛模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元P2X3受體激動劑激活電流。實驗證實葛根素對急、慢性疼痛具有抑制作用的機理是阻斷初級感覺神經(jīng)元P2X3受體介導的痛覺信息傳遞。本發(fā)明為防治急、慢性疼痛探明新方法，同時還表明葛根素具有P2X3受體拮抗劑的作用，這將有助于P2X3受體所涉及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物防治應用。
文檔編號A61P29/00GK101972243SQ201010291470
公開日2011年2月16日 申請日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者劉雙梅, 劉晗, 張君, 徐昌水, 李桂林, 李欣, 林加日, 梁尚棟, 高云 申請人:南昌大學