一種制備脂肪二酸衍生物的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種制備脂肪二酸衍生物的方法及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪二酸衍生物在第三代胰島素藥物尤其是長(zhǎng)效胰島素類似物的研究中發(fā)揮著 重要作用，甘精胰島素作為長(zhǎng)效胰島素類似物的重鎊藥物在2014年全球銷售額達(dá)到72. 79 億美元。然而，甘精胰島素難以達(dá)到平穩(wěn)地控制血糖和穩(wěn)定的藥物動(dòng)力學(xué)曲線，直接導(dǎo)致低 血糖發(fā)生率尤其是夜間低血糖發(fā)生率偏高，危及生命。
[0003] 近年來作為甘精胰島素替代藥物的長(zhǎng)效胰島素類似物的研究逐漸成為糖尿病 治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其中公開號(hào)為CN1829738、名稱為"新型胰島素衍生物"的中國(guó)發(fā)明 專利公開了脂肪二酸側(cè)鏈通過谷氨酸修飾的長(zhǎng)效胰島素類似物一一德谷胰島素；公開 號(hào)為CN102065884、名稱為"聚乙二醇化的賴脯胰島素化合物"的中國(guó)發(fā)明專利公開了 分子量約20kDa的聚乙二醇綴合的胰島素類似物；公開號(hào)WO2011/122921的PCT申 請(qǐng)公開了與免疫球蛋白Fc片段通過PEG偶聯(lián)的胰島素綴合物。Thibaudeau和Bridon 公開了血清白蛋白偶聯(lián)的胰島素綴合物（Thibaudeau和Bridon等人，Bioconjugate chemistry，2005, 16, 1000-1008)，在文章中作者聲稱該綴合物可以成為潛在的長(zhǎng)效胰島素 類似物候選藥。
[0004] 在諸多長(zhǎng)效胰島素類似物研究中，德谷胰島素半衰期最長(zhǎng)，體內(nèi)作用時(shí)間超過42 小時(shí)，同時(shí)低血糖風(fēng)險(xiǎn)尤其是夜間低血糖風(fēng)險(xiǎn)低，最有希望成為繼甘精胰島素之后的又一 重鎊藥物。德谷胰島素（Degludec，商品名為Tresiba)的分子結(jié)構(gòu)式如式I所示，其分子結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)在于長(zhǎng)鏈脂肪二酸通過一個(gè)谷氨酸分子連接在胰島素B29位賴氨酸殘基上。
[0005]
[0006] 長(zhǎng)鏈脂肪二酸衍生物的制備及修飾反應(yīng)成為了胰島素類似物制備工藝中的重要 環(huán)節(jié)。在諾和諾德公司專利號(hào)CN1829738公開的十六烷二酸一叔丁酯制備工藝中采用了 N，N-二甲基甲酰胺二叔丁基縮醛作為叔丁酯化試劑，成本高，不適合工業(yè)放大；十六烷二 酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯制備工藝中采用了 2-琥珀酰亞胺基-1，1，3, 3-四甲基脲四氟硼 酸酯（TSTU)，成本高，不適合工業(yè)化放大生產(chǎn)；同時(shí)該專利公開了十六烷二酸單甲酯衍生 物，由于該工藝制備的胰島素類似物需要在0.2MNaOH溶液中脫甲酯，容易引起胰島素肽 鏈的分解，雜質(zhì)較多，同樣難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化放大生產(chǎn)。Grinstaff和Zhang公開了 4-二甲氨 基吡啶（DMAP)催化二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)縮合十二烷二酸和叔丁醇，制備十二烷二酸一 叔丁酯的工藝（Grinstaff和Zhang等人，Bioconjugatechemistry, 2011，22 (4)，690-9)， 而用該工藝制備十六烷二酸一叔丁酯生成的副產(chǎn)物十六烷二酸N-?；灞壤撸y以和 產(chǎn)物分離，同樣不適合工藝放大生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種制備脂肪二酸衍生 物的方法。該方法操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)含量低、中間體純化容易，收率高。所制備的脂 肪二酸衍生物可以通過蛋白修飾通用技術(shù)用于長(zhǎng)效胰島素藥物如德谷胰島素的研發(fā)
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述制備脂肪二酸衍生物的方法的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種制備脂肪二酸衍生物的方法，包括如 下步驟：
[0010] (1)將如式A所示的長(zhǎng)鏈脂肪二酸和二氯亞砜反應(yīng)，得到如式B所示的帶有兩個(gè)氯 基團(tuán)的酰氯；接著將酰氯與叔丁醇反應(yīng)，得到如式C所示的帶有一個(gè)氯基團(tuán)的酯；接著用羥 基取代氯基團(tuán)，得到如式D所示的長(zhǎng)鏈脂肪二酸一叔丁酯；其中，下述反應(yīng)方程式中的m為 6~32的整數(shù)，優(yōu)選為6~9 ;
[0011]
[0012] (2)將長(zhǎng)鏈脂肪二酸一叔丁酯和N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，得到如式E所示的長(zhǎng)鏈 脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯；
[0013]
[0014] (3)將長(zhǎng)鏈脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯與L-谷氨酸-1-叔丁酯反應(yīng)，得到如 式F所示的叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu-OtBu;
[0016] (4)將叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu-OtBu與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，得到如式 G所示的叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu;
[0018] (5)將叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu中的叔丁基去除，得到如式H所 示的長(zhǎng)鏈脂肪二酸衍生物。
[0019]
[0020] 步驟（1)中所述的二氯亞砜的用量為過量，即二氯亞砜和長(zhǎng)鏈脂肪二酸的摩爾比 大于2;優(yōu)選為6~23. 6:1。
[0021] 步驟（1)中所述的叔丁醇的用量按叔丁醇與長(zhǎng)鏈脂肪二酸摩爾比為0. 6~1. 5 : 1 ;優(yōu)選為1~1. 2 :1計(jì)算；更優(yōu)選為按I. 1 :1計(jì)算。
[0022] 步驟（1)中所述的用羥基取代氯基團(tuán)是通過將所述的帶有一個(gè)氯基團(tuán)的酯與溶 劑A水溶液中的水反應(yīng)；溶劑A為N，N-二甲基甲酰胺（DMF)、乙腈、丙酮和四氫呋喃中一種 或至少兩種，優(yōu)選為N，N-二甲基甲酰胺。
[0023] 所述的溶劑A水溶液中溶劑A與水的體積比為I: 1~5,優(yōu)選為1 :2~3,更優(yōu)選 為 1 :2〇
[0024] 步驟（2)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的用量按其與所述的長(zhǎng)鏈脂肪二酸一叔丁 酯摩爾比為1~1. 2 :1計(jì)算，優(yōu)選為按1. 05 :1計(jì)算。
[0025] 步驟（3)中所述的L-谷氨酸-1-叔丁酯的用量按其與所述的長(zhǎng)鏈脂肪二酸琥珀 酰亞胺基叔丁基酯摩爾比為1~1. 5 :1計(jì)算，優(yōu)選為按1~1. 2 :1計(jì)算，更優(yōu)選為按I. 1 : 1計(jì)算。
[0026] 步驟（4)中所述的N-羥基琥珀酰亞胺的用量按其與所述的叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二酰 基-L-Glu-OtBu摩爾比為1~1. 2 :1計(jì)算，優(yōu)選為按I. 1 :1計(jì)算。
[0027] 步驟（5)中所述的將叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu中的叔丁基去除 是通過將所述的叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu與三氟乙酸反應(yīng)。
[0028] 所述的三氟乙酸的用量按其與所述的叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu 體積質(zhì)量比為3~IOmL :Ig計(jì)算；優(yōu)選為按3~5mL :Ig計(jì)算；更優(yōu)選為按5mL :Ig計(jì) 算。
[0029] 為了降低整個(gè)反應(yīng)過程的雜質(zhì)，增加產(chǎn)物的得率和提高產(chǎn)物的純度，在每得到一 個(gè)產(chǎn)物時(shí)，將未參與反應(yīng)的物質(zhì)去除。
[0030] 從而，所述的制備脂肪二酸衍生物的方法，優(yōu)選包括如下步驟：
[0031] 1)將長(zhǎng)鏈脂肪二酸和二氯亞砜反應(yīng)制備得到酰氯，二氯亞砜的用量為過量，減壓 蒸餾除去未參與反應(yīng)的二氯亞砜，加入二氯甲烷溶解酰氯；將有機(jī)堿滴加入酰氯和叔丁醇 的混合物，反應(yīng)生成帶有一個(gè)氯基團(tuán)的酯，減壓蒸餾除去溶劑后，加入預(yù)冷至〇~4°C的溶 劑A水溶液，過濾收集沉淀；將沉淀中的溶劑去除，再往沉淀中加入溶劑B提取，蒸干溶劑后 重結(jié)晶，得到長(zhǎng)鏈脂肪二酸一叔丁酯；
[0032]2)將長(zhǎng)鏈脂肪二酸一叔丁酯溶解于溶劑C中，降溫至-20°C~-KTC，加入N-羥基 琥珀酰亞胺（HOSu)和二環(huán)己基碳二亞胺（DCC)，-20°C~-10°C下繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，恢復(fù)至 15~30°C繼續(xù)反應(yīng)3~16小時(shí)，過濾除去沉淀，減壓蒸餾除去溶劑，重結(jié)晶，用溶劑D洗濾 餅，得到長(zhǎng)鏈脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯；
[0033] 3)將長(zhǎng)鏈脂肪二酸琥珀酰亞胺基叔丁基酯與L-谷氨酸-1-叔丁酯溶解在N，N-二 甲基甲酰胺中，在有機(jī)堿存在的條件下過夜攪拌，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物溶于乙酸乙 酯，并依次用鹽酸溶液、水和飽和氯化鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉干燥過濾，將濾液減壓蒸餾， 得到的油狀殘余物，為叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二?；?L-Glu-OtBu;
[0034] 4)將叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二酰基-L-Glu-OtBu溶解于溶劑E中，降溫 至-20 °C~-10 °C，加入N-羥基琥珀酰亞胺（HOSu)和環(huán)己基碳二亞胺（DCC)， 于-20°C~-KTC下繼續(xù)反應(yīng)2小時(shí)，恢復(fù)至15~30°C反應(yīng)3~16小時(shí)，過濾除去沉淀，減 壓蒸餾除去溶劑，向殘留油狀物中直接加入溶劑F析出固體，過濾收集沉淀，得到叔丁基長(zhǎng) 鏈脂肪二?；?L-Glu(OSu)-OtBu;
[0035] 5)將叔丁基長(zhǎng)鏈脂肪二酰基-L-Glu(OSu)-OtBu溶解于三氟乙酸中，15~30°C攪 拌反應(yīng)，向反應(yīng)液中加入溶劑G直接析出固體，抽濾收集固體，得到長(zhǎng)鏈脂肪二酸衍生物。
[0036] 上述反應(yīng)中所用的溶劑A-G是用于溶解或提純用的，其用量和使用次數(shù)是不限 的。但從成本和達(dá)到的效果考慮，在下面分別限定了溶劑A-G的用量。
[0037] 步驟1)中所述的將長(zhǎng)鏈脂肪二酸和二氯亞砜反應(yīng)制備得到酰氯的條件為80°C加 熱回流3小時(shí)或在DMF催化下于15~30°C反應(yīng)過夜。
[0038] 所述的在DMF催化下于15~30°C反應(yīng)過夜的操作優(yōu)選如下：將長(zhǎng)鏈脂肪二酸重 懸于二氯甲烷中，接著加入DMF和二氯亞砜，于15~30°C反應(yīng)過夜。
[0039] 步驟1)中所述的有機(jī)堿為一乙胺、二乙胺、三乙胺、二異丙基乙胺、吡啶和哌啶中 的一種或至少兩種；優(yōu)選為吡啶。
[0040] 步驟1)中所述的有機(jī)堿的摩爾用量相當(dāng)于所述的長(zhǎng)鏈脂肪二酸摩爾量的0. 6~ 1. 5倍；優(yōu)選為L(zhǎng)0~L2倍；更優(yōu)選為L(zhǎng)04~L05倍。
[0041] 步驟1)中所述的有機(jī)堿的加入時(shí)間控制在2小時(shí)以內(nèi)，否則反應(yīng)過程中會(huì)出現(xiàn)較 多雜質(zhì)，給后續(xù)純化帶來困難。
[0042]步驟1)中所述將有機(jī)堿滴加入酰氯和叔丁醇的混合物的操作條件如下：反應(yīng)溫 度為20~30°C，優(yōu)選20~25°C;反應(yīng)時(shí)間為2~16小時(shí)，優(yōu)選2