本發(fā)明涉及單域重鏈抗體技術(shù)(又稱為納米抗體技術(shù))，以及基因工程抗體技術(shù)，特別是涉及針對免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)Fc段(fragment crystalline，F(xiàn)c)的單域重鏈抗體或多肽。
技術(shù)背景
重鏈抗體(Heavy-chain antibody)是一種天然缺失輕鏈，僅由重鏈組成的抗體，存在于駱駝、鯊魚等動物中。單域重鏈抗體(又稱為納米抗體，VHH抗體，variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，下同)是指僅由重鏈抗體可變區(qū)(Variable region)組成的基因工程抗體。與普通抗體相比，單域重鏈抗體具有分子量小，穩(wěn)定性高，水溶性好等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)診斷和檢測、藥物研發(fā)等領(lǐng)域。
免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)由兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。每條鏈都含有可變區(qū)(variable region，V區(qū))和恒定區(qū)(constant region，C區(qū))，其中可變區(qū)提供抗原結(jié)合位點和特異性，恒定區(qū)構(gòu)成免疫球蛋白的框架，具有生物效應(yīng)功能。用木瓜蛋白酶消化IgG，可將其分成3個功能區(qū)，即2個相同的抗原結(jié)合片段(fragment antigen binding，F(xiàn)ab)和一個可結(jié)晶片段(fragment crystalline，F(xiàn)c)。Fc段位于恒定區(qū)，由兩條重鏈羧基端的一半組成。由于Fc段遠離抗原結(jié)合部位，因此提供了一個與抗體結(jié)合而不影響抗原抗體反應(yīng)的區(qū)域，是最有效的二抗試劑結(jié)合的表位區(qū)。
目前，已有針對IgG Fc段的多克隆抗體、單克隆抗體等傳統(tǒng)抗體的公開報道。與單域重鏈抗體相比，傳統(tǒng)抗體存在生產(chǎn)成本較高，制備過程繁瑣等缺點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明之目的是提供針對免疫球蛋白G的Fc段的單域重鏈抗體(包括含有所述單域重鏈抗體全部或部分功能區(qū)域的蛋白質(zhì)或多肽)及其氨基酸序列，可被用于制備檢測或純化、富集IgG的試劑和工具。
本發(fā)明提供一種針對免疫球蛋白G的Fc段的單域重鏈抗體(即本發(fā)明一種免疫庫來源的特異性識別免疫球蛋白Fc段的納米抗體)，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。
其氨基酸序列的IMGT編號和結(jié)構(gòu)域的劃分包括四個框架區(qū)(Framework region,FR)和三個互補決定區(qū)(Complementarity-determining region,CDR)?；パa決定區(qū)主要負責抗原的識別，框架區(qū)結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，主要起著維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。
本發(fā)明提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。
本發(fā)明還提供一個核酸分子，其特征是編碼SEQ ID NO.:1部分結(jié)構(gòu)域，通過遺傳密碼子可以隨時獲得該核酸分子的具體序列。可以為SEQ ID NO.:2核酸分子。
本發(fā)明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通過合適的表達系統(tǒng)進行表達以得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)或多肽。這些表達系統(tǒng)包括細菌，酵母菌，絲狀真菌，動物細胞，昆蟲細胞，植物細胞，或無細胞表達系統(tǒng)。
本發(fā)明還提供一種載體，包含所述核酸序列。由于遺傳密碼子具有簡 并性，該核酸序列可以根據(jù)不同的應(yīng)用目的而不同。
本發(fā)明還提供一種宿主細胞，包括所述蛋白質(zhì)或表達載體。
本發(fā)明還提供了一種純化或檢測免疫球蛋白G的方法，其特征是含有上述蛋白質(zhì)或多肽?；诒景l(fā)明提供的蛋白質(zhì)或多肽與免疫球蛋白G特異性結(jié)合的能力，建立免疫球蛋白G的純化或檢測方法。其中，優(yōu)選的方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，熒光免疫法(Fluoroimmunoassay，F(xiàn)IA)，免疫芯片法和親和層析法。
本發(fā)明所提供的氨基酸序列可以作為前體，通過隨機或定點突變技術(shù)進行改造，能夠獲得性質(zhì)(水溶性、穩(wěn)定性、親和力以及特異性等)更好的突變體，用來發(fā)展進一步用于醫(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)的蛋白質(zhì)或多肽。
本發(fā)明還涉及前述針對免疫球蛋白G Fc段的納米抗體在免疫檢測、富集以及純化中的應(yīng)用。這些免疫檢測指的是非疾病診斷治療目的的免疫檢測。
本發(fā)明還涉及針對免疫球蛋白G的Fc段的免疫親和吸附材料，包括載體，搭載在載體上的配基，其特征在于該材料以針對免疫球蛋白G的Fc段的納米抗體作為配基，所述針對免疫球蛋白G的Fc段的納米抗體具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。
本發(fā)明中所敘述的一些術(shù)語具有如下含義：
同源性：描述兩個或更多氨基酸序列的相似程度，第一個氨基酸序列和第二個氨基酸序列之間同源性的百分比可以通過【第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中相應(yīng)位置處的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的數(shù)量】除 以【第一個氨基酸序列中氨基酸總數(shù)】再乘以【100％】來計算，其中第二氨基酸序列中的某個氨基酸的缺失、插入、替換或添加(與第一氨基酸相比)被認為是有差別。備選地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹配的計算機運算程序如NCBI Blast獲得。
結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位，通常具有一定的功能。
IMGT編號：IMGT數(shù)據(jù)庫(The International ImMunoGeneTics Database)中的一種已經(jīng)標準化的抗體氨基酸序列編號方法。具體編號方法可以參考文獻(Ehrenmann,F.,Q.Kaas,et al.(2010)."IMGT/3Dstructure-DB and IMGT/DomainGapAlign:a database and a tool for immunoglobulins or antibodies,T cell receptors,MHC,IgSF and MhcSF."Nucleic Acids Res 38(Database issue):D301-307.Lefranc,M.P.,C.Pommie,et al.(2003)."IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains."Dev Comp Immunol 27(1):55-77.)中的描述。
密碼子(codon)：又稱為三聯(lián)體密碼(triplet code)，指對應(yīng)于某種氨基酸的核苷酸三聯(lián)體。在轉(zhuǎn)譯過程中決定該種氨基酸插入生長中多肽鏈的位置。
本發(fā)明提供了從免疫文庫中獲取的識別IgG Fc段的單域重鏈抗體，該單域重鏈抗體經(jīng)過了親和力成熟，具有更高的親和力，識別位點是Fc的優(yōu)勢抗原表位。
具體實施方式
下面通過單域中鏈抗體的制備、分析以及應(yīng)用，對本發(fā)明作進一步說明，這些具體實施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
實施例1：
抗Fc單域重鏈抗體免疫文庫的構(gòu)建
取300μg Fc重組蛋白(該蛋白可通過商業(yè)途徑獲得)與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝(Lama pacos)進行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150μg Fc重組蛋白與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接ELISA法測定血清效價，選擇血清效價最高的樣品分離淋巴細胞，提取RNA。
RNA的提取參照TAKARA公司RNAiso試劑說明書進行。以RNA為模板，oligo dT為引物，參照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA第一鏈。
采用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶，經(jīng)巢式PCR獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪PCR分別以引物AlpVh-LD和CH2-R擴增cDNA，反應(yīng)條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個循環(huán)，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。
將第一輪PCR產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的DNA片段，作為第二輪PCR的模板，分別用引物AlpVh-SfiI和AlpVHHR1-NotI，AlpVh-SfiI和AlpVHHR2-NotI，進行擴增，反應(yīng)條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個循環(huán)，98℃，10s，68℃，40s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)DNA片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存?zhèn)溆?。將噬菌粒pHEN1和PCR擴增產(chǎn)物分別用Sfi I、Not I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連 接。
表1文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物
注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識別序列
連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10μL無菌水，分十次進行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1。取10μL電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h，采用引物M13-R和pHEN-R進行菌落PCR，計算庫容；其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×YT培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)12～16h。用10mL，2×YT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度15～30％甘油，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
根據(jù)計算的庫容量結(jié)果，接種10倍庫容量的活細胞于20mL的2×YT(含2％葡萄糖，100μg/mL氨芐青霉素)，30℃，220r/min培養(yǎng)至OD600達0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃，220r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50mL的2×YT(含100μg/mL氨芐青霉素和50μg/mL卡那霉素)重懸沉淀，30℃，220r/min過夜培養(yǎng)后，3000g離心取上清，加入5×PEG/NaCl溶液，冰上放置1h或4℃過夜，12000rpm 離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(PBS，0.01M，pH 7.4)，即得到抗Fc的單域重鏈抗體免疫文庫，取10μL測定滴度，其余分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例2：
抗IgG Fc段單域重鏈抗體的淘選與鑒定
采用固相親和淘選的方法從抗Fc的單域重鏈抗體免疫文庫中淘選針對IgG Fc段的單域重鏈抗體。采用親和層析法純化小鼠血清，得到IgG溶液。用PBS稀釋IgG溶液至50～100μg/mL，每孔加入100μL，4℃，包被過夜；吸出包被液，PBS洗板3次，每孔加入300μL 3％BSA-PBS，37℃，封閉2h；PBS洗板6次，加入100μL噬菌體抗體庫(約含2×1011CFU)，37℃，孵育1.5h；吸出未結(jié)合的噬菌體，用PBST(含0.5％Tween-20)洗板5次(逐輪增加1次)，再用PBS洗板10次(洗板次數(shù)逐輪增加5次)；以100μL洗脫液(甘氨酸-鹽酸，pH 2.2)洗脫吸附在酶標孔中的噬菌體，用50μL Tris-HCl(1mol/L，pH 8.0)中和洗脫物，取10μL用于滴度測定，其余洗脫物擴增后用于下一輪淘選。
經(jīng)三輪淘選后，采用輔助噬菌體KM13對隨機挑取的單克隆進行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接ELISA測定噬菌體顆粒的結(jié)合活性實驗設(shè)定陽性對照、陰性對照及背景對照，具體加樣步驟見表2。
表2間接phage-ELISA加樣表
將ELISA陽性克隆X送生物技術(shù)服務(wù)公司進行序列測定，得到插入片段的DNA序列，其編碼針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體，具體如下(SEQ ID NO.:2)：
CAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAACCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGTTATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGGCTCGAGTGGGTCTCAGATATTAATAGTGGTGGTGGTAGCACAGACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCCCTAGGGCGTAACCGGGTAGCGACTAGGAGGTCGAATGACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCAGCA
依據(jù)DNA測序結(jié)果及密碼子表可獲得針對免疫球蛋白Fc段的單域重鏈抗體的氨基酸序列(SEQ ID NO.:1)：
QLQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYVMSWVRQAPGKGLEWVSDINSGGGSTDYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCALGRNRVATRRSNDYWGQGTQVTVSA
本發(fā)明提供的從免疫文庫中獲取的識別IgG Fc段的單域重鏈抗體，該單域重鏈抗體經(jīng)過了親和力成熟，經(jīng)對照試驗，相比常規(guī)的從天然抗體文庫中分離獲取的單域重鏈抗體具有更高的親和力，識別位點是Fc的優(yōu)勢抗原表位。
實施例3：
抗IgG Fc段單域重鏈抗體在大腸桿菌中表達與純化。
編碼抗IgG Fc段單域重鏈抗體的DNA片段的獲?。?.采用限制性內(nèi) 切酶SfiI/NotI，雙酶切噬菌粒pHEN-X，瓊脂糖凝膠電泳回收抗IgG Fc段單域重鏈抗體基因；2.直接將抗IgG Fc段單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務(wù)公司進行化學(xué)合成；3.設(shè)計特異性引物，通過PCR技術(shù)從羊駝(Lama pacos)來源的cDNA庫中擴增。
將得到的抗IgG Fc段單域重鏈抗體基因片段克隆至表達載體pRXS，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗IgG Fc段單域重鏈抗體的大腸桿菌表達質(zhì)粒，命名為pRXS-X。
將表達質(zhì)粒pRXS-X轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21，挑取單菌落進行誘導(dǎo)表達。將單菌落接入4mL LBA(Luria-Bertani broth with 100μg/mL ampicillin)液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)12h；以1％培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mL LBA液體培養(yǎng)基中，37℃、250r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.5(約需2.5～3h)，加入終濃度0.1mM的IPTG，30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。
誘導(dǎo)培養(yǎng)物8000r/min離心，在細胞沉淀中加入20mL磷酸緩沖液(pH 7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細胞沉淀；在細胞沉淀中加入10mL相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細胞破碎處理，超聲破碎條件為200W，破碎2s，間歇3s，共240個循環(huán)，在4℃下對細胞破碎物12000r/min離心20min，取上清進行親和層析純化和SDS-PAGE電泳分析，或在上清中加入終濃度30％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。
通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件(如宿主菌、表達載體、誘導(dǎo)培養(yǎng)時間、溫度以及IPTG濃度等)，可以進一步提高目的蛋白(單域抗體)表達量，為大量制備抗IgG單域抗體提供了途徑。
實施例4：
抗IgG Fc段單域重鏈抗體的融合表達。
將抗IgG Fc段單域重鏈抗體基因克隆至融合表達載體pAP，經(jīng)PCR和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗IgG Fc段單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達質(zhì)粒，命名為pAP-X。
堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無機磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號標簽用于ELISA、免疫印跡、組織化學(xué)等檢測方法。融合表達質(zhì)粒pAP-X將抗IgG Fc段單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的N端，參考實施例3中的表達方法，可以在大腸桿菌中表達、純化出融合蛋白AP-X。
實施例5：
基于抗IgG Fc段單域重鏈抗體的IgG檢測方法。
基于直接酶聯(lián)免疫吸附試驗的原理，建立檢測IgG的方法。采用親和層析純化血清或腹水得到IgG溶液，或者購買商業(yè)化IgG產(chǎn)品；融合蛋白AP-X的制備參照應(yīng)用實例3，顯色試劑為分析純對硝基苯磷酸二鈉(pNPP·2Na)。
檢測步驟包括，(1)抗原包被：用10mM磷酸緩沖液(pH 7.4)將IgG稀釋至5μg/mL，100μL/孔，包被于酶標板，4℃過夜，含0.5％Tween-20(W/V)的磷酸緩沖液洗板5次，拍干板條，加入3％脫脂牛奶(W/V)，300μL/孔，37℃封閉2h。(2)結(jié)合：磷酸緩沖液洗板3次后，加入倍比稀釋的融 合蛋白AP-X，100μL/孔，水平方向輕輕混勻，37℃溫育30min。(3)取出溫育后板條，磷酸緩沖液洗板5次，拍干，加入100μL/孔pNPP顯色液，37℃避光顯色5min。(4)加入50μL/孔終止液(2M H2SO4)，酶標儀讀數(shù)。
實施例6
抗Fc單域重鏈抗體用于親和純化材料的制備
將本發(fā)明重組表達的抗IgG Fc段單域重鏈抗體與固相載體瓊脂糖偶聯(lián)，具體方法如下：
將CNBr活化的瓊脂糖干膠用0.1M HCl洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌10次，加入抗IgG Fc段單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球)，室溫反應(yīng)4h，使抗IgG Fc段單域重鏈抗體與CNBr活化的瓊脂糖凝膠微球共價偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖液(10mM，Na2HPO4，pH 7.4)洗滌2次后，加入封閉液室溫反應(yīng)2h以封閉未反應(yīng)的活性基團。用5被膠體積的磷酸緩沖液(10mM，pH 7.4)和醋酸緩沖液(0.1M，pH 4.0)交替洗滌3次，得到共價偶聯(lián)了抗IgG Fc段單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。
固相載體材料不限于瓊脂糖凝膠，也可以選用硅球、納米磁珠等。