專利名稱：無保護劑雙重病毒滅活制備靜注免疫球蛋白工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物制品的制備方法。特別是無保護劑雙重病毒滅活制備靜脈注射用人血免疫球蛋白。
免疫球蛋白的生產開始于1949年。靜脈注射用免疫球蛋白(IVIG)自六十年代問世至今，已陸續(xù)有12個國家的29個生產廠家的30多種IVIG制品出現在國際市場。我國1985年首次有入胎盤血IVIG問世，其制造與檢定規(guī)程已載入《中國生物制品規(guī)程》，1992年國家衛(wèi)生部批準了凍干低pH靜脈注射用人血免疫球蛋白的試生產。由于靜脈注射用免疫球蛋白注射量大且常需反復多次注射，而引起丙型肝炎流行的事例已有不少報道，越來越多的證據證明，如果生產過程中沒有病毒滅活步驟，其安全性是難以保證的。故從九十年代起，“病毒滅活”已作為IVIG生產工藝中必不可少的步驟被世界各國所規(guī)定。目前的病毒滅活方法有巴氏滅活法，即60℃10小時加熱滅活法，并在加熱過程中加入保護劑。由于艾滋病(AIDS)的快速傳播，針對人免疫缺陷病毒(HIV)又發(fā)展了用去污劑破壞病毒脂質性包膜的方法。相繼發(fā)展的還有低pH孵放法、干熱法、照射法和過濾法。以上這些病毒滅活方法雖然可以對包括HIV、人乙型肝炎病毒(HBV)、人丙型肝炎病毒(HCV)和一些常見病毒致病因子進行滅活，但不同的方法對不同的病毒的滅活能力也有一定的差異，尤其是有保護劑存在時，對病毒也有一定保護作用，制品中就可能殘存微量病毒，去污劑滅活法又存在有機溶劑殘留的問題，不但影響制品的純潔性，患者在使用中還可能出現一些不良反應。目前國內外生產的IVIG制品大都以蔗糖為保護及賦型劑的凍干制劑，在近年據文獻報道，保護劑的存在盡管對蛋白質的天然活性起一定的作用，但也會對病毒產生一定的保護作用，同時報道了數例因使用以蔗糖作為保護劑，所致急性腎功能衰竭的病例。另有不少文獻指出，凍干IVIG的臨床副作用明顯大于液體制品，因為在凍干過程中部分IVIG分子發(fā)生聚合，加之凍干制劑不利于大規(guī)模生產。
本發(fā)明的目的正是為了克服上述現有技術中的不足之處而提供一種無保護劑雙重病毒滅活制備靜注免疫球蛋白的工藝，即采用兩種不同機理的病毒滅活方法，在無保護劑條件下，以達到對病毒的完全滅活作用，使靜注免疫球蛋白更安全有效地應用于臨床。
本發(fā)明的制備工藝如下第一步巴氏滅活以Cohn’s組分II(FII)為原料用2～10倍的冰蒸餾水溶解，調節(jié)pH3.5～5.0，用0.2～2.0mmol/L醋酸，分子量10～100kDa(道爾頓)超濾膜超濾脫醇、脫鹽至電阻率≥5kΩ·cm(NaCl＜2mmol/L)，調節(jié)免疫球蛋白濃度＜2％，裝瓶，充CO2使內壓＞700Pa，在無任何保護劑條件下封口。60±1℃，10小時滅活。第二步低pH孵放處理經巴氏滅活的FII溶液用10～100kDa超濾膜切割精制，如果免疫球蛋白純度仍＜97％時，可用DEAE-Sephadx A-50凝膠吸附提高純度，然后濃縮至免疫球蛋白濃度≥5％，調pH4.1±0.3，除菌過濾，室溫放置21天，加入5％葡萄糖調節(jié)滲透壓，除菌后進行半成品理化檢查和生物學試驗。半成品檢測合格后，除菌過濾，分裝25ml/瓶或50ml/瓶，按靜脈注射用人血免疫球蛋白規(guī)程進行全面質量檢查。
為有效地保證靜注免疫球蛋白的質量及其安全性，對按上述方法生產的靜注免疫球蛋白進行了檢測(由華西醫(yī)科大學進行檢測)，采用的指示病毒為水皰性口炎病毒(VSV)，脊髓灰質炎病毒(Polio-I)，乙型腦炎病毒(Sindbis)三種，滅活病毒的方法采用了巴氏滅活法、低pH滅活法以及雙重病毒滅活法(本發(fā)明)，其結果見表1、表2、表3。
1.巴氏滅活法表1 60℃加熱對三種病毒的滅活效果滅活 VSV Polio-ISindbis時間 Log TCID50/0.1ml Log TCID60/0.1ml Log PFI/ml(小時) 對照樣品 處理樣品對照樣品 處理樣品對照樣品 處理樣品0 6 6.5 4×1051 6 4 6.5 24×1061044 6 3 6.3 -4×106＜1045 5.8 2 6.3 -4×106＜1037 5.8 1 6.3 -4×106＜10210 5.8 - 6-4×106-從表1中可見，巴氏滅活法對Polio-I病毒滅活效果相當顯著，對VSV的滅活效果次之，對Sindbis的作用較差。
2.低pH滅活法表2 pH4.0，23℃放置對兩種病毒的滅活效果時間VSV(Log.TCID50/0.1ml) Sindbis(Log PFU/ml)(天)對照樣品 處理樣品 對照樣品處理樣品0 6.5 4×1063 6.5 1 4×106＜1047 8 - 3.5×106＜10314 6 - 3.5×106＜10221 5.5 - 3.5×104-從表2中可見，VSV對pH4.0的酸環(huán)境非常敏感容易被滅活，從處理后第7天，病毒已無活性。而Sindbis病毒對pH4.0的敏感性善差，在自處理后的第21天，其病毒才被完全滅活。
3.雙重病毒滅活法表3雙重病毒滅活法(本發(fā)明)對三種病毒的滅活效果滅活VSV Polio-I Sindbis時間Log TCID60/0.1ml Log TCID50/0.1ml LogPFI/ml(小時) 對照樣品 處理樣品 對照樣品 處理樣品對照樣品 處理樣品60℃ 06 6.5 4×10656 2 6.5 - 4×106103加熱 10 6 - 6.5 - 4×106-pH4.0 7天 5.5 - 6 - 3.5×106-23℃ 14天 5.5 - 6 - 3.5X106-放置 21天 5 - 5.5 - 3.5X106-從表3中可見，巴氏滅活法10小時，三種指示病毒已被全部滅活，繼續(xù)進行低pH滅活可使制品的安全性更佳。
將本發(fā)明所制備的產品送中國藥品生物制品檢定所和中國人民解放軍艾滋病檢測確認實驗室檢測，其結果見表4、表5。
1．巴氏滅活法表4 60℃加熱對四種病毒的滅活效果VSV Polio-I HIV Sindbis時間 Log TCID50/0.1mlLog TCID60/0.1mlLog TClD50/0.1mlLog TCID50/ml(小時) 對照處理對照處理對照處理對照處理樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品樣品0 7.005.006.003.136.005.77- 6.630.5≤-0.50 ≤0.50 ≤-0.50 ≤0.50 - - - ND1 ≤-0.50 ≤0.05 ≤-0.50 ≤0.50 - - - ND4 ≤-0.50 ≤0.50 ≤-O.50 ≤0.50 - - - ND5 ≤-0.50 ≤0.50 ≤-0.50 ≤O.50 - - - -6 ≤-0.50 ≤0.50 ≤-0.50 ≤0.50 - - - ND10 ≤-0.50 ≤0.50 ≤-0.50 ≤0.50 ≤5.80 ＜2.00- -本實驗中病毒最低檢測限為≤0.50 Log TCID50/0.1ml。
Sindbis基礎病毒滴度7.70Log PFU/ml。
ND末檢測出病毒。
檢測結論對送檢樣品，經巴氏滅活法(60℃加熱10小時)處理，對指示病毒VSV、Sindbis及Polio-I滅活顯著，加熱30分鐘后，病毒滴度均降至試驗檢測限之下。病毒減少分別為VSV≥4.50-4.63，Po lio-I≥2.63-3.63，HIV≥3.77-4.17(單位Log TCID50/0.1ml)Sindbis≥6.32-6.41 Log PFU/ml，且對加熱6小時、10小時樣品盲傳3代，均為陰性。
2.低pH滅活法表5低pH室溫孵放對三種病毒的滅活效果VSV HIV*Sindbis時間Log TCID50/0.1ml Log TCID50/0.1ml Log PFU/ml(天)酸性 中性酸性 中性酸性中性0 3.88 6.385.77 6.003.757.343 3.13 6.13- - ND 7.097 1.75 5.88＜2.005.80ND 7.0914 ≤0.505.18- - ND 6.6021 ≤0.504.88- - ND 6.23本實驗中病毒最低檢測限為≤0.50 Log TCID50/0.1ml*巴氏滅活后樣品Sindbis基礎病毒滴度8.35 Log PFU/mlDN未檢測出病毒檢測結論送檢樣品在pH4.0±0.2經22-24℃孵放21天，滅活VSV≥5.88-6.63 Log TCID50/0.1ml，且經盲傳三代均無特異CPE。
綜上所述實驗結果得出結論1.巴氏滅活法60℃，10小時能滅活四種指示病毒，尤其是對VSV和Polio-I病毒更有效。
2.低pH孵放法能有效滅活VSV和Sindbis病毒。對VSV、HIV有很強的滅活作用，7天即能徹底滅活。
3.雙重病毒滅活法，巴氏滅活10小時后，再經pH4.0室溫放置21，更能穩(wěn)妥地滅活全部指示病毒，確保血液制品的安全性。
按本發(fā)明工藝制作靜注免疫球蛋白與現有技術相比具有的優(yōu)點是1.本工藝中不加任何保護劑，不但能有效殺滅病毒，保持IVIG分子的完整性和天然生物活性以及制品的純潔性和安全性，并有良好的穩(wěn)定性，制品的病毒滅活效果及全面質量標準均通過國家衛(wèi)生部的驗證和檢定達到《中國生物制品規(guī)程》95年版標準。
2.本工藝中選擇了制備IVIG液體劑型而不是凍干制劑，有利于大規(guī)模生產，其產品質量穩(wěn)定而可靠。
3.在本制品中加入5％葡萄糖以維持其溶液的等滲度，避免了一些患者在使用中出現的不良反應。
本發(fā)明以下將結合實施例作進一步詳述實施例1.無保護劑雙滅活制備靜脈注射用人血免疫球蛋白工藝，第一步巴氏滅活取FII沉淀16.5千克，加0℃的蒸餾水165升溶解，調節(jié)pH3.5，用1mmol/L醋酸100kDa超濾膜超濾脫醇、脫鹽至電阻率5kΩ·cm(NaCl 1.2mmol/L)，調節(jié)免疫球蛋白濃度＜2％，裝瓶，充CO2使內壓720Pa條件下封口。60士1℃，10小時滅活。第二步低pH孵放處理經巴氏滅活的FII溶液，100kDa超濾膜切割精制，如果免疫球蛋白純度仍＜97％時，可用DEAE-Sephadx A-50凝膠吸附提高純度，然后濃縮至免疫球蛋白濃度5％，調pH4.1，除菌過濾，放置21天，加入5％葡萄糖，除菌后送半成品做理化檢查、熱原質檢驗及無菌試驗。半成品檢測合格后，除菌過濾，分裝25ml/瓶或50ml/瓶，按靜脈注射用人血免疫球蛋白規(guī)程進行全面質量檢查。
實施例2.無保護劑雙滅活制備靜脈注射用人血免疫球蛋白工藝，第一步巴氏滅活取FII沉淀15千克，加0℃的蒸餾水150升溶解，調節(jié)pH5.0，用0.2mmol/L醋酸10kDa超濾膜超濾脫醇、脫鹽至電阻率5.2kΩ·cm(NaCl 1.8mmol/L)，調節(jié)免疫球蛋白濃度＜2％，裝瓶，充CO2使內壓700Pa條件下封口。60±1℃，10小時滅活。第二步低pH孵放處理經巴氏滅活的FII溶液，10kDa超濾膜切割精制，如果免疫球蛋白純度仍＜97％時，可用DEAE-Sephadx A-50凝膠吸附提高純度，然后濃縮至免疫球蛋白濃度5％，調pH4.1，除菌過濾，放置21天，以后操作同實施例1。
實施例3.無保護劑雙滅活制備靜脈注射用人血免疫球蛋白工藝，第一步巴氏滅活取FII沉淀16.5千克，加0℃的蒸餾水165升溶解，調節(jié)pH4.2，用2.0mmol/L醋酸50kDa超濾膜超濾脫醇、脫鹽至電阻率5.2kΩ·cm(NaCl 1.0mmol/L)，調節(jié)免疫球蛋白濃度＜2％，裝瓶，充CO2使內壓700Pa條件下封口。60士1℃，10小時滅活。第二步低pH孵放處理經巴氏滅活的FII溶液，50kDa超濾膜切割精制，如果免疫球蛋白純度仍＜97％時，可用DEAE-Sephadx A-50凝膠吸附提高純度，然后濃縮至免疫球蛋白濃度5.8％，調pH4.1，除菌過濾，放置21天，以后操作同實施例1。
權利要求
1.一種無保護劑雙重病毒滅活制備靜注免疫球蛋白工藝，其特征在于第一步巴氏滅活以Cohn’s組分II(FII)為原料用2～10倍的冰蒸餾水溶解，調節(jié)pH3.5～5.0，用0.2～2.0mmol/L醋酸，分子量10～100kDa(道爾頓)超濾膜超濾脫醇、脫鹽至電阻率≥5kΩ·cm(NaCl＜2mmol/L)，調節(jié)免疫球蛋白濃度＜2％，裝瓶，充CO2使內壓＞700Pa，在無任何保護劑條件下封口。60±1℃，10小時滅活。第二步低pH孵放處理經巴氏滅活的FII溶液用10～100kDa超濾膜切割精制，如果免疫球蛋白純度仍＜97％時，可用DEAE-Sephadx A-50凝膠吸附提高純度，然后濃縮至免疫球蛋白濃度≥5％，調pH4.1±0.3，除菌過濾，室溫放置21天，加入5％葡萄糖調節(jié)滲透壓，除菌后進行半成品理化檢查和生物學試驗。半成品檢測合格后，除菌過濾，分裝25ml/瓶或50ml/瓶，按靜脈注射用人血免疫球蛋白規(guī)程進行全面質量檢查。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物制品的制備方法。本工藝中不加任何保護劑,采用巴氏滅活與低pH孵放處理相結合的雙重病毒滅活方法,不但能有效殺滅病毒,保持免疫球蛋白分子的完整性和天然生物活性以及制品的純潔性和安全性,在工藝中選擇了制備免疫球蛋白液體劑型而不是凍干制劑,有利于大規(guī)模生產,其產品質量穩(wěn)定而可靠。在本制品中加入5%葡萄糖以維持其溶液的等滲度,避免了一些患者在使用中出現的不良反應。
文檔編號C07K1/34GK1201694SQ98112108
公開日1998年12月16日 申請日期1998年6月25日 優(yōu)先權日1998年6月25日
發(fā)明者陳愛民, 樊紹文, 周潮, 岳世韜 申請人:成都蜀陽制藥廠