本發(fā)明涉及包含輕鏈(lc)和重鏈(hc)的結(jié)構(gòu)域交換的抗體，其中所述lc與hc形成二聚體。
背景技術(shù)：
：：單克隆抗體已被廣泛用作治療結(jié)合劑。本文將利用完整的igg1免疫球蛋白作為實施例來解釋基本的抗體結(jié)構(gòu)。兩條相同的重(h)鏈和兩條相同的輕(l)鏈結(jié)合形成y型抗體分子。所述重鏈各有四個結(jié)構(gòu)域。氨基末端可變結(jié)構(gòu)域(vh)位于所述y的頂端。其后是三個恒定結(jié)構(gòu)域：ch1、ch2和羧基末端ch3，位于所述y的莖部的底部。短延伸、開關(guān)連接所述重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)。所述鉸鏈(hinge)將ch2和ch3(fc片段)連接到抗體的其余部分(fab片段)。在完整抗體分子中，可以通過蛋白酶切割鉸鏈產(chǎn)生一個fc片段和兩個相同的fab片段。所述輕鏈由可變的(vl)和恒定的(cl)的兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，通過開關(guān)隔開。所述鉸鏈區(qū)中的二硫鍵連接所述兩條重鏈。所述輕鏈通過額外的二硫鍵與重鏈偶聯(lián)。根據(jù)免疫球蛋白的種類，將連接asn的碳水化合物部分連接在恒定結(jié)構(gòu)域的不同位置。對于igg1，在鉸鏈區(qū)中的cys235和cys238對之間的兩個二硫鍵聯(lián)合所述兩條重鏈。所述輕鏈通過兩個額外的二硫鍵連接到重鏈上，所述兩個額外的二硫鍵在所述ch1結(jié)構(gòu)域中的cys229s和所述cl結(jié)構(gòu)域中的cys214s之間。碳水化合物部分連接到每個ch2的asn306上，在所述y的莖部上產(chǎn)生明顯的凸起。這些特征具有深遠的功能性效果。所述重鏈可變區(qū)(vh)和輕鏈可變區(qū)(vl)位于n-端區(qū)，即所述y的“頂端”，其設(shè)置為與抗原反應(yīng)。所述分子的末端是氨基酸序列的n-端的所在的一側(cè)。所述y的莖部以有效介導(dǎo)效應(yīng)子功能的方式進行延伸，例如補體的激活和與fc受體或adcc和adcp的相互作用。所述y的莖部的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域凸起，以促進與效應(yīng)蛋白的相互作用。所述氨基酸序列的c-端位于所述頂端的相對側(cè)，其可以稱為y的“末端”。在抗體中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的輕鏈，稱為λ(lambda))和κ(kappa)。給定的免疫球蛋白具有κ鏈或λ鏈，所述κ鏈或λ鏈都不是一個。在具有λ輕鏈或κ輕鏈的抗體之間沒有發(fā)現(xiàn)功能差異。抗體分子中的每個結(jié)構(gòu)域具有在壓縮的反平行β-桶狀結(jié)構(gòu)(betabarrel)中彼此緊密堆積的兩個β褶板的相似結(jié)構(gòu)。該保守結(jié)構(gòu)稱為免疫球蛋白折疊。所述恒定域的免疫球蛋白折疊含有與4條鏈的板堆積的3條鏈的板。通過每個板層的β折疊鏈之間的氫鍵、在內(nèi)部相對的片層的殘基之間的疏水鍵以及片層之間的二硫鍵來穩(wěn)定所述折疊。所述3條鏈的板包括鏈c、f和g，以及所述4條鏈的板具有鏈a、b、e和d。字母a至g表示沿著所述免疫球蛋白折疊的氨基酸序列的β折疊鏈的先后次序?？勺兘Y(jié)構(gòu)域的折疊具有9條β折疊鏈，排列成4條鏈和5條鏈的兩個板。所述5條鏈的板與恒定結(jié)構(gòu)域的3條鏈的板結(jié)構(gòu)同源，但5條鏈的板含有額外的鏈c'和c"。所述鏈(a、b、c、d、e、f、g)的其余部分具有與恒定結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白折疊中它們的對應(yīng)物相同的拓撲結(jié)構(gòu)和相似結(jié)構(gòu)。如在恒定結(jié)構(gòu)域中，二硫鍵連接相對片層中的鏈b和鏈f。輕免疫球蛋白鏈和重免疫球蛋白鏈的可變結(jié)構(gòu)域含有三個高變環(huán)或互補決定區(qū)(cdr)。v結(jié)構(gòu)域的三個cdr(cdr1、cdr2、cdr3)聚集在所述β-桶狀結(jié)構(gòu)的一個末端上。所述cdr是連接免疫球蛋白折疊的β折疊鏈b-c、c'-c"和f-g的環(huán)。所述cdr中的殘基從一個免疫球蛋白分子到下一個免疫球蛋白分子不相同，賦予每種抗體抗原特異性?？贵w分子頂端上的vl和vh結(jié)構(gòu)域緊密堆積，使得6個cdr(每個結(jié)構(gòu)域上3個)在構(gòu)建用于抗原特異性結(jié)合的表面(或空腔)上協(xié)作。因此，抗體的天然抗原結(jié)合位點由連接所述輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的鏈b-c、c'-c"和f-g以及所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域的鏈b-c、c'-c"和f-g的環(huán)組成。所述環(huán)不是天然免疫球蛋白中的cdr環(huán)，也不是由cdr環(huán)和cdr環(huán)區(qū)內(nèi)的任意相鄰的環(huán)所確定的部分抗原結(jié)合袋，其并不具有抗原結(jié)合或表位結(jié)合特異性，但是有利于整個免疫球蛋白分子和/或其效應(yīng)物或其它功能物的正確折疊，因此被稱為結(jié)構(gòu)環(huán)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻顯示，目前為了操縱現(xiàn)有的抗原結(jié)合位點，使用免疫球蛋白樣骨架，從而引入新的結(jié)合特性。在大多數(shù)情況下，所述cdr區(qū)已經(jīng)被改造用于抗原結(jié)合，換言之，在所述免疫球蛋白折疊的情況下，僅修飾天然抗原結(jié)合位點以改變其結(jié)合親和力或特異性。存在大量文獻，其描述了這種操作的免疫球蛋白的不同形式，其通常以單鏈fv片段(scfv)或fab片段的形式表達，其展現(xiàn)在噬菌體顆粒的表面或者可溶性表達于各種原核表達系統(tǒng)或真核表達系統(tǒng)中。wo2006/072620a1描述了一種工程改造免疫球蛋白的方法，其包括修飾結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)以獲得新的抗原結(jié)合位點。該方法廣泛適用于免疫球蛋白，并且可用于產(chǎn)生靶向多種抗原的免疫球蛋白的文庫。已經(jīng)表明ch3文庫可用于選擇能夠通過所述結(jié)構(gòu)環(huán)結(jié)合抗原的特異性文庫成員。在本文中，這種結(jié)構(gòu)環(huán)結(jié)合物也稱為“免疫”ch3。根據(jù)實施例，已經(jīng)工程改造了fab樣結(jié)構(gòu)，其包括免疫ch3結(jié)構(gòu)域以替代所述ch1結(jié)構(gòu)域和cl結(jié)構(gòu)域。目前正在開發(fā)特異性雙特異性抗體抗體構(gòu)建體用于改進治療。二價igg取決于其重鏈的二聚化，通過其ch3結(jié)構(gòu)域的同二聚體(homodimeric)締合介導(dǎo)。davis等(proteinengineering，design&selection2010,23(4)195-202)描述了一種異二聚體(heterodimeric)fc平臺，其通過使用鏈交換的工程改造的結(jié)構(gòu)域(seed)ch3異二聚體來支持雙特異性和不對稱融合蛋白的設(shè)計。人igg和igach3結(jié)構(gòu)域的這些衍生物產(chǎn)生互補的人seedch3異二聚體，該人seedch3異二聚體由人iga和igg序列的交替片段組成。ep1999154b1進一步描述了所述seed工程改造。wo2010/136172a1公開了三特異性抗體或四特異性抗體，其包括一個或兩個與抗體的fc部分的c-端連接的單鏈fac。peipp等人(1january2007,handbookoftherapeuticantibodies,pp171-196)提供了fc工程改造的綜述。beck等人(naturereviewsimmunology,vol.10,no.5,1may2010,pp345-352)描述了下一代治療性抗體，并且特別是指不同類型的雙特異性抗體。ridgway等人(proteinengineering,vol.9,no.7,1996,pp617-621)描述了用于重鏈異二聚化的抗體ch3結(jié)構(gòu)域的“凸起-嵌-凹孔(knobsinto-holes)”工程改造。atwell等人(journalofmolecularbiology,vol.270,no.1,1997,pp26-35)描述了促進形成穩(wěn)定的ch3異二聚體的抗體ch3結(jié)構(gòu)域的界面殘基的組合，包含“凸起(knob))”突變體和“凹孔(hole)”突變體。davis等人(proteinengineeringdesignandselection,vol.23，no.4，2010，pp195-202)和wo2007/110205a2描述了seed體以及雙特異性抗體，所述seed體是基于鏈交換的工程改造的結(jié)構(gòu)域(seed)ch3異二聚體的融合蛋白。gunasekaran等人(journalofbiologicalchemistry,vol.285，no.25，2010，pp19637-19646)描述了通過靜電轉(zhuǎn)向效應(yīng)和新的fc突變增強抗體fc異二聚體的形成以跨越fc二聚體界面進行極性充電(chargepolyrity)。vonkreudenstein等人(landesbioscience,vol.5,no.5,2013,pp646-654)描述了基于為穩(wěn)定性而工程改造的異二聚體fc的雙特異性抗體骨架。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供具有改進結(jié)構(gòu)的抗體，比如工程改造不對稱分子，例如產(chǎn)生雙特異性抗體。通過本發(fā)明的主題實現(xiàn)該目的。根據(jù)本發(fā)明提供了結(jié)構(gòu)域交換的抗體，其包含由vl-ch3組成的輕鏈(lc)和包含vh-ch3-ch2-ch3的重鏈(hc)，其中所述lc的vl-ch3與hc的vh-ch3二聚化，從而形成包括ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Φ慕Y(jié)構(gòu)域交換的lc/hc二聚體。具體地，所述抗體包括至少一個c-端延伸，其中所述延伸包括另一ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?。所述另一ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)κ翘囟ǖ囊荒┒?。例如，通過將fab片段融合到具有或不具有接頭(linker)序列的fc部分(ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?的一個或兩個ch3結(jié)構(gòu)域的c-端來延伸所述抗體。特別地，所述延伸可以包含一個或兩個fab片段，使得所述抗體包含兩個、三個或四個fab臂，其中至少一個所述fab臂包含結(jié)構(gòu)域交換。因此，至少一個fab臂包含所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?。具體地，兩個、三個或四個fab臂可以包含ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?。具體地，任一個或每個所述ch3結(jié)構(gòu)域是igg1ch3結(jié)構(gòu)域，其特征在于人igg1ch3序列或其工程改造的變體，包含一個或多個點突變，優(yōu)選至多10個點突變。具體地，所述ch2結(jié)構(gòu)域是igg2型，其特征在于人igg2ch2序列或其工程改造的變體，其包括一個或多個點突變，優(yōu)選至多10個點突變。眾所周知，任何抗體可以包含在該抗體的c-端延伸中的一個或多個結(jié)構(gòu)域交換的fab臂，例如igg抗體?？梢蕴峁┩ㄟ^fab臂延伸的抗體c-端，其中所述fab臂的vl或vh結(jié)構(gòu)域的n-端融合到具有或不具有接頭序列的抗體的fc部分的ch3的c-端。特別地，抗體可以包括一個、兩個、三個或四個fab臂，其中至少一個所述fab臂是結(jié)構(gòu)域交換的fab臂。因此，至少一個fab臂包含所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Α＞唧w地，兩個、三個或四個fab臂可以包括所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Α＞唧w地，每個所述fab臂包含由vh/vl結(jié)構(gòu)域?qū)M成的功能性抗原結(jié)合位點，該功能性抗原結(jié)合位點能夠以高親和力和kd小于10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m中任一種的靶結(jié)合。具體地，所述抗體是靶向兩種不同抗原的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體或異二聚體抗體，其中每種抗原由kd小于10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m中任一種的抗體識別。具體地，所述抗體包括鉸鏈區(qū)，優(yōu)選人鉸鏈區(qū)，例如人igg1鉸鏈區(qū)。根據(jù)一具體方面，所述抗體還包括以ch3hc/ch3hc二聚體為特征的fc區(qū)。所述fc區(qū)的特征在于fc鏈的二聚體，每個所述二聚體的特征在于包括ch2-ch3鏈，該二聚體可以是同二聚體或異二聚體，例如其中第一fc鏈與第二fc鏈在ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個點突變中不同。具體地，所述抗體僅包含一個lc/hc二聚體，其中所述hc進一步與包含ch2-ch3的fc鏈進行二聚化，從而獲得所述fc區(qū)。這種抗體的特征僅在于一個fab臂和所述fc區(qū)。根據(jù)具體方面，本發(fā)明提供了包括輕鏈(lc)和重鏈(hc)的結(jié)構(gòu)域交換的抗體，其中hc與另一hc進行二聚，從而形成hc/hc二聚體，其包括至少一個c-端延伸，其中所述延伸包括ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?。這種結(jié)構(gòu)域交換的抗體可以具體包括兩個lc和兩個hc，其中至少一個hc通過一個或兩個fab臂延伸。所述抗體具體包括至少一個至少一個fab臂和至少一個結(jié)構(gòu)域交換的fab臂，其中a)fab臂包含與vh-ch1結(jié)構(gòu)域配對的vl-cl結(jié)構(gòu)域，以形成兩個結(jié)構(gòu)域鏈的二聚體；和b)結(jié)構(gòu)域交換的fab臂包括與vh-ch3hc結(jié)構(gòu)域配對的vl-ch3lc結(jié)構(gòu)域，從而形成所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?。具體地，根據(jù)上述a)所述抗體包含一個、兩個或三個不是結(jié)構(gòu)域交換的fab臂，，以及根據(jù)上述b)所述抗體包含一個、兩個或三個結(jié)構(gòu)域交換的fab臂。圖21中示出了具體實施方案。例如，抗體的所述hc可以是vh1-ch1-ch2-ch3-vh2-ch3het、vh1-ch1-ch2-ch3(ag_seed)-vh2-ch3(凸起)、vh1-ch1-ch2-ch3(ag_seed)-vl2-ch3(凸起)、vh2-ch3het-vh1-ch1-ch2-ch3。例如，可以通過將所述結(jié)構(gòu)域交換的fab加入到天然抗體的c-端來獲得四價雙特異性抗體?；蛘?，可以通過結(jié)合異二聚體hc/hc對來獲得抗體，所述抗體對于一個靶是二價的和對于第二個靶是一價的，其中在所述對中僅一個hc具有與c-端連接的第二結(jié)構(gòu)域交換的fab。根據(jù)一具體方面，所述抗體的c-端延伸中的所述一個或多個結(jié)構(gòu)域交換的fab臂包含ch3結(jié)構(gòu)域，所述ch3結(jié)構(gòu)域被工程改造以改變ph依賴性fcrn結(jié)合。例如，所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χ械闹辽僖粋€ch3結(jié)構(gòu)域可被工程改造，以在fcrn結(jié)合位點處包括至少一個突變，來降低ph依賴性fcrn結(jié)合。ph依賴性fcrn結(jié)合的降低可以使得在ph依賴性方式下結(jié)合fcrn的結(jié)合親和力小于1-log，與在生理ph(ph7.4)下相同的結(jié)合親和力相比，優(yōu)選在ph5-6時約為相同或更小。具有降低的ph依賴性fcrn結(jié)合的ch3結(jié)構(gòu)域可以具體包括h433a突變或h435a突變中的至少一種，或同時包括h433a突變或h435a突變，其中根據(jù)kabat的eu索引進行編號。通過引入h433a突變和h435a突變(根據(jù)kabat的eu索引編號)獲得不具有天然ch3結(jié)構(gòu)域ph依賴性fcrn結(jié)合位點的ch3lc變體和ch3hc變體的具體實施方案，其是ph依賴性fcrn結(jié)合位點的一部分，所述ph依賴性fcrn結(jié)合位點來自天然ch3結(jié)構(gòu)域序列[9]，序列見圖22。提供如本文所述的ch3結(jié)構(gòu)域的突變氨基酸的編號作為對應(yīng)于kabat編號的位置。所述kabat編號最初是指天然存在的抗體的編號。在本發(fā)明的抗體中，其包括結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)，根據(jù)kabat的eu索引編號，所述ch3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸的編號具體理解為由天然存在的抗體中的所述ch3結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)確定的類似位置。具體地，所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χ械腸h3結(jié)構(gòu)域是異源的，特別是，其中在分子“外源(foreign)”的位置將ch3結(jié)構(gòu)域合并到抗體結(jié)構(gòu)中。從而，可以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域交換的抗體。在本文中所述異源ch3也稱為ch3het。因此，所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)κ翘禺愋缘漠愒炊垠w(ch3het/ch3het)，其中每個ch3het與可變結(jié)構(gòu)域n-端連接，例如其中第一ch3het抗體結(jié)構(gòu)域與vl結(jié)構(gòu)域n-端連接，從而產(chǎn)生lc，第二ch3het連接到vh結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生部分hc，其中第一ch3het和第二ch3het至少通過與所述第一和第二ch3het結(jié)構(gòu)域的β片層區(qū)接觸形成二聚體。具體地，所述第一和第二ch3het結(jié)構(gòu)域是非免疫性ch3結(jié)構(gòu)域，其在結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)中不包含抗原結(jié)合位點，比如無cdr結(jié)合位點。所述非免疫性ch3結(jié)構(gòu)域具體不包括能夠進行抗原結(jié)合的cdr樣結(jié)合位點。具體地，所述ch3het/ch3het二聚體是由氨基酸序列中彼此不同的兩個ch3結(jié)構(gòu)域組成的異二聚體，或具有相同氨基酸序列的兩個ch3結(jié)構(gòu)域的同二聚體。具體地，產(chǎn)生與抗體的全長結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)，例如igg，從而產(chǎn)生與igg相同結(jié)構(gòu)的igg樣結(jié)構(gòu)，但是通過在不同于野生型位置的位置引入另外一對ch3het結(jié)構(gòu)域進行域交換，特別是替代結(jié)構(gòu)域的ch1/cl對，該結(jié)構(gòu)域的ch1/cl對被交換成一對ch3het結(jié)構(gòu)域的域。在所述全長抗體中，fab臂中的一個或兩個可以是fab樣結(jié)構(gòu)。因此，一對或兩對lc和hc可以包含結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)包括所述ch3het/ch3het二聚體。具體地，通過fc部分的融合延伸所述(fab)2樣結(jié)構(gòu)，以獲得igg樣結(jié)構(gòu)。因此，每條所述重鏈是通過ch2-ch3結(jié)構(gòu)域序列進行c-端延伸。根據(jù)一具體實施方案，所述抗體是igg抗體，其中所述lc由vl-ch3組成，可選地，其中所述結(jié)構(gòu)域是直接連接的或者其中l(wèi)c還包括一個或多個作為抗體結(jié)構(gòu)域之間連接的接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)。根據(jù)一具體實施方案，所述抗體是igg抗體，其中所述hc由vh-ch3-ch2-ch3組成，可選地，其中所述結(jié)構(gòu)域是直接連接的或者其中hc還包括一個或多個作為抗體結(jié)構(gòu)域之間的連接點的接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)。具體地，本發(fā)明的抗體具有僅包括一個fab樣結(jié)構(gòu)和一個野生型fab結(jié)構(gòu)的igg樣結(jié)構(gòu)。因此，根據(jù)一具體實施方案，所述抗體包含或由以下組成a)一個由vl-ch3組成的lc和一由vh-ch3-ch2-ch3組成的hc，其中所述lc的vl-ch3與hc的vh-ch3進行二聚，從而形成第一lc/hc二聚體，其是包含ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Φ慕Y(jié)構(gòu)域交換的lc/hc二聚體；和b)一個由vl-cl組成的lc和一由vh-ch1-ch2-ch3組成的hc，其中所述lc的vl-ch1與hc的vh-cl進行二聚，從而形成第二lc/hc二聚體；其中所述第一lc/hc二聚體的hc與第二lc/hc二聚體的hc形成二聚體，比如形成包含ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Φ膄c部分。具體地，所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?或ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)梢园粋€或兩個工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域，以提高同源對的產(chǎn)生，比如當(dāng)通過重組表達系統(tǒng)產(chǎn)生所述分子時降低ch3二聚體錯配的可能性。具體地，通過使由vh-ch3het組成的重鏈與由vl-ch3het組成的輕鏈二聚化來獲得fab樣結(jié)構(gòu)。具體地，通過兩條重鏈的連接來連接兩個fab結(jié)構(gòu)以獲得(fab)2樣結(jié)構(gòu)，其中一個或兩個所述fab結(jié)構(gòu)是fab樣結(jié)構(gòu)。根據(jù)又一具體實施方案，所述抗體是igm抗體或ige抗體，其中所述hc由vh-ch3-ch2-ch3-ch4組成，可選地，其中所述結(jié)構(gòu)域是直接連接的或者其中hc還包含一個或多個作為抗體結(jié)構(gòu)域之間的連接的接頭區(qū)或鉸鏈區(qū)。具體地，通過fc部分的融合來延伸(fab)2樣結(jié)構(gòu)獲得所述igm樣結(jié)構(gòu)。由此，每條所述重鏈通過ch2-ch3-ch4結(jié)構(gòu)域序列在c-端延伸。具體地，所述接頭或鉸鏈區(qū)將提供hc的ch3het的c-端區(qū)和ch2結(jié)構(gòu)域的n-端區(qū)之間的連接，因此，所述抗體hc可以包括或由以下結(jié)構(gòu)組成：vh-ch3-連接-ch2-ch3。結(jié)構(gòu)域的連接特定地通過重組融合或化學(xué)連接。具體連接可以通過將一個結(jié)構(gòu)域的c-端連接到另一結(jié)構(gòu)域的n-端，例如其中敲除所述末端區(qū)中的一個或多個氨基酸殘基以縮短結(jié)構(gòu)域大小，或延伸以增加結(jié)構(gòu)域的柔性。具體地，所述縮短的結(jié)構(gòu)域序列包括c-端區(qū)和/或n-端區(qū)的缺失，例如刪除至少1、2、3、4或5個，最多6、7、8、9或10個氨基酸。具體地，可以使用連接序列，比如接頭或鉸鏈區(qū)或免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)的至少一部分，(本文連接序列也稱為“連接點(junction)”)，例如包含至少1、2、3、4或5個氨基酸，最多10、15或20個氨基酸。通過接頭的結(jié)構(gòu)域延伸可以通過源自免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的n-端區(qū)或c-端區(qū)的氨基酸序列，所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域本身位于與該結(jié)構(gòu)域相鄰的位置，例如包含所述結(jié)構(gòu)域之間的天然連接?；蛘?，所述接頭可以含有源自所述鉸鏈區(qū)的氨基酸序列。但是，所述接頭也可以是人造序列，例如由gly或ser氨基酸組成。具體地，任何所述vh或vl結(jié)構(gòu)域和ch3結(jié)構(gòu)域之間的連接點包括氨基酸序列，其是a)在人igg抗體的ch2和ch3結(jié)構(gòu)域之間的至少部分連接點，和/或b)在人igg抗體的vl和cl結(jié)構(gòu)域之間至少的部分連接點；和/或c)在人igg抗體的vh和ch1結(jié)構(gòu)域之間的至少部分連接點；和/或d)具有長度為5至20個氨基酸的人造連接序列，優(yōu)選8至15個氨基酸。根據(jù)一具體方面，任何所述ch3het結(jié)構(gòu)域是人或人源化抗體，優(yōu)選igg1并且包括識別為為seqid41的氨基酸序列，或這種ch3結(jié)構(gòu)域的功能變體，優(yōu)選地與seqid41具有至少60％序列同一性，優(yōu)選至少70％、80％、90％或95％序列同一性?；蛘?，所述ch3het結(jié)構(gòu)域是人或人源化igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige或igd抗體，或這種ch3結(jié)構(gòu)域的功能變體中的任意種，優(yōu)選與seqid42、43、44、45、46、47或48中的任一個具有至少60％的序列同一性，優(yōu)選至少70％、80％、90％或95％的序列同一性。具體地，所述抗體的任何恒定域(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或所有所述抗體結(jié)構(gòu)域)是其與相應(yīng)的人抗體結(jié)構(gòu)域具有至少60％的序列同一性的人源或其人源化的或功能活性變體，例如人igg結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一具體實施方案，包括在所述抗體中的所有結(jié)構(gòu)域具有至少60％，或至少70％、80％、90％或95％的序列同一性的人源或其人源化的或功能活性變體，優(yōu)選地其中所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的來源是igg1、igg2、igg3、igg4、igm或ige抗體中的任意種。具體地，所有的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域來源于免疫球蛋白的相同類型或亞型。根據(jù)一個方面，所述第一和/或第二ch3het結(jié)構(gòu)域來源于igg1抗體。具體地，所述第一和/或第二ch3het結(jié)構(gòu)域包括標(biāo)識為seqid41中的任一氨基酸序列，可選地，其包括一個或多個點突變，優(yōu)選1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個點突變。具體地，所述抗體包括可變結(jié)構(gòu)域以建立兩個獨立的抗原結(jié)合位點，例如通過一個fab和一個fab樣結(jié)構(gòu)，從而提供兩個fv結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)建體包括一個fab臂，其包括野生型結(jié)構(gòu)，其中vl-cl與vh-ch1進行二聚，以及第二fab樣臂包括與vh-ch3hc進行二聚的vl-ch3lc，從而將所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)饺氲剿隹贵w中。具體地，所述抗體是靶向兩種不同的抗原或抗原的兩種不同表位的雙特異性抗體。具體地，所述抗體是雙特異性抗體，其包括第一lc和第二lc，所述第一lc與第一hc配對以形成第一lc/hc二聚體，該第一lc/hc二聚體包含識別第一表位的第一結(jié)合位點，所述第二lc與第二hc配對以形成第二lc/hc二聚體，該第二lc/hc二聚體包含識別第二表位的第二結(jié)合位點，其中所述第一lc/hc二聚體或第二lc/hc二聚體是結(jié)構(gòu)域交換的。具體地，所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Φ闹辽僖粋€ch3結(jié)構(gòu)域是能夠產(chǎn)生ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域的同源對的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域。因此，所述第一ch3het結(jié)構(gòu)域和/或第二ch3het結(jié)構(gòu)域可以是能夠優(yōu)先產(chǎn)生ch3het/ch3het的同源對的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域。與天然(野生型)ch3對相比，這種同源對特異性地以較快地速率、親和力或親合力進行二聚。具體來，所述同源對以使所述修飾的ch3優(yōu)先與另一個匹配的修飾的ch3二聚(配對)的方式進行工程改造，并以較少的程度識別另一(野生型或非匹配的)ch3結(jié)構(gòu)域。根據(jù)一具體方面，所述抗體包括ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?，例如包含在hc/hc二聚物中，其中至少一個ch3結(jié)構(gòu)域是工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域，其能夠產(chǎn)生ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域的同源對。具體地，所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)τ砂?biāo)識為seqid41的氨基酸序列或其功能變體的野生型人igg1ch3結(jié)構(gòu)域組成，并且所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χ械闹辽僖粋€ch3結(jié)構(gòu)域為工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域，其能夠產(chǎn)生ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域的同源對。根據(jù)一具體實施方案，a)所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Φ闹辽僖粋€ch3結(jié)構(gòu)域是能夠產(chǎn)生ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域的同源對的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域；和b)所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)Φ闹辽僖粋€ch3結(jié)構(gòu)域是能夠產(chǎn)生ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域的同源對的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域；其中所述第一工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域和第二工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域至少一個點突變不同。具體地，所述工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域(比如任何所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域，或ch3het結(jié)構(gòu)域，或ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域，例如ch3結(jié)構(gòu)域的異二聚體對或同二聚體對的ch3結(jié)構(gòu)域，)包括標(biāo)識為seqid41的氨基酸序列或其與seqid41具有至少60％序列同一性的功能變體，該工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域包含以下一種或多種：a)一個或多個凸起突變或凹孔突變，優(yōu)選t366y/y407′t、f405a/t394′w、t366y：f405a/t394′w：y407′t、t366w/y407′a和s354c：t366w/y349′c：t366′s：l368′a：y407′v中的任意種；b)與另一個同源ch3結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸殘基共價連接的半胱氨酸殘基，從而引入結(jié)構(gòu)域間二硫鍵，優(yōu)選連接兩個ch3結(jié)構(gòu)域的c-端；c)由人iga和iggch3序列的交替區(qū)段組成的seedch3異二聚體；和/或d)排斥電荷抑制異二聚體形成的一個或多個突變，優(yōu)選k409d/d399′k、k409d/d399′r、k409e/d399′k、k409e/d399′r、k409d：k392d/d399′k：e356′k或k409d：k392d：k370d/d399′k：e356′k：e357′k中的任意種；和/或e)為異二聚體形成和/或熱穩(wěn)定選擇的一種或多種突變，優(yōu)選t350v：l351y：f405a：y407v/t350v：t366l：k392l：t394w，t350v：l351y：f405a：y407v/t350v：t366l：k392m：t394w，l351y：f405a：y407v/t366l：k392m：t394w，f405a：y407v/t366l：k3g2m：t394w，或f405a：y407v/t366l：t394w，其中是根據(jù)kabat的eu索引進行編號。在本文描述的點突變的說明書中，“斜線(slash)”將一條鏈或一個結(jié)構(gòu)域上的點突變與來自相應(yīng)對的其它鏈或其它結(jié)構(gòu)域的點突變區(qū)分開；氨基酸位置編號中的“縮進(indent)”表示異二聚體的第二鏈或二聚體?！懊疤?colon)”分別標(biāo)識其中一條鏈或結(jié)構(gòu)域上的點突變的組合?？梢允褂萌缟纤龅臑楫惗垠w形成和/或熱穩(wěn)定而選擇的任何突變或根據(jù)vonkreudenstein等人的公開內(nèi)容[8]的其它突變。優(yōu)選地，(i)凸起突變；或(ii)凹孔突變，或(iii)凸起突變和凹孔突變，其在一條鏈或一個結(jié)構(gòu)域上工程改造，并且對應(yīng)物(i)凹孔突變；或(ii)凸起突變，或(iii)凹孔突變和凸起突變，其在所述異二聚體的另一條鏈上進行工程改造。具體地，包含一個或兩個工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域的一對ch3結(jié)構(gòu)域可以包含多于一個(額外)的連接一對兩個ch3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域間二硫鍵，例如2個或3個。具體地，在各對的ch3結(jié)構(gòu)域的ch3結(jié)構(gòu)域中工程改造不同的突變(根據(jù)上述a))以產(chǎn)生匹配對，其中一個結(jié)構(gòu)域包含在β褶板區(qū)中空間修飾的接觸表面，該結(jié)構(gòu)域優(yōu)選通過互補空間修飾連接到另一個結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)接觸表面。這種空間修飾主要是由不同的氨基酸殘基和側(cè)鏈產(chǎn)生的，例如產(chǎn)生“凸起”結(jié)構(gòu)或“凹孔”結(jié)構(gòu)，其互補形成“凸起-嵌-凹孔”二聚體。根據(jù)一具體方面，一對ch3結(jié)構(gòu)域的第一ch3結(jié)構(gòu)域和第二ch3結(jié)構(gòu)域中的每一個(例如所述ch3lc/ch3hc，或第一ch3het結(jié)構(gòu)域和第二ch3het結(jié)構(gòu)域，或ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域)是具有標(biāo)識為seqid41的氨基酸序列或seqid41的功能變體的igg型，其通過摻入至少2個氨基酸長度的至少一個β折疊鏈iga區(qū)段進行工程改造以獲得鏈交換，并且其包括通過第一ch3結(jié)構(gòu)域的iga區(qū)段與第二ch3結(jié)構(gòu)域的iga區(qū)段配對的ch3結(jié)構(gòu)域的同源對。這種鏈交換的ch3結(jié)構(gòu)域具體可以包含iga和igg氨基酸序列的交替區(qū)段，例如含有至少1、2、3、4或5個不同的iga區(qū)段，每個iga區(qū)段位于不同位置，并通過非iga區(qū)段(例如igg區(qū)段)彼此分離。根據(jù)一具體方面，所述抗體是包含位于ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域的任一個中的fcγ受體結(jié)合位點和/或c1q結(jié)合位點的效應(yīng)子功能感受態(tài)抗體。具體地，所述抗體是效應(yīng)子感受態(tài)的，其包含在所述hc中和可選地在fc區(qū)中的fcγ受體結(jié)合位點。具體地，所述抗體的特征在于adcc和/或cdc活性中的任一種。根據(jù)又一個具體方面，所述抗體是效應(yīng)子-陰性(effector-negative)抗體，其包含fc片段，所述fc片段缺失了與fcγ受體和/或c1q的結(jié)合。具體地，所述效應(yīng)子陰性抗體的特征在于人igg2ch2序列或其工程改造的變體，其包括us8562986中描述的經(jīng)修飾的人igg2ch2結(jié)構(gòu)域(f296a、n297q)，其融合至c-端ch3結(jié)構(gòu)域的n-端，例如在“vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2en-ch3ag”(seqid15)中所使用的。具體地，當(dāng)用于形成沒有任何結(jié)合結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)子陰性fc區(qū)時，如用于在單價效應(yīng)子陰性抗體中包含一條鏈，所述效應(yīng)子陰性fc區(qū)包括在us8562986中描述的修飾的人igg1鉸鏈(c220s)和修飾的人igg2ch2結(jié)構(gòu)域(f296a、n297q)，與c-端ch3結(jié)構(gòu)域的n-端融合，例如在“hufc_g1hingeen-ch2en-ch3ga”(seqid16)中所使用的。具體地，所述抗體是效應(yīng)子缺陷型(本文中也稱為效應(yīng)子陰性)，其通過所述fc區(qū)明顯減少或不與fc受體或cd16a結(jié)合。具體地，所述抗體具有明顯減少的或者沒有adcc和/或cdc。具體地，所述抗體包括抗體的fc部分，所述抗體的fc部分包含在所述ch2與ch3結(jié)構(gòu)域的連接處的fcrn結(jié)合位點，和/或所述ch2結(jié)構(gòu)域的n-端區(qū)內(nèi)的fcγ受體結(jié)合位點，和/或所述ch2結(jié)構(gòu)域的n-端區(qū)的c1q結(jié)合位點。根據(jù)一具體方面，所述抗體包含位于所述ch2和/或ch3結(jié)構(gòu)域中任一個中的ph依賴性fcrn結(jié)合位點。具體地，所述fcrn結(jié)合位點以ph依賴性方式，具有結(jié)合fcrn的親和力，kd小于10-4m，或小于10-5m、10-6m、10-7m或10-8m。具體地，與在生理ph(ph7.4)下的相同結(jié)合親和力相比，以ph依賴性方式結(jié)合fcrn的結(jié)合親和力在ph5-6時至少為1-log，優(yōu)選至少為2-log或3-log。根據(jù)又一方面，工程改造所述抗體以改變ph依賴性fcrn結(jié)合。例如，工程改造所述ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χ兄辽僖粋€ch3結(jié)構(gòu)域以在所述fcrn結(jié)合位點處包括至少一個突變以降低ph依賴性fcrn結(jié)合，特別是至少一種h433a突變或h435a突變，或h433a突變和h435a突變兩種，其中根據(jù)kabat的eu索引進行編號。ph依賴性fcrn結(jié)合的降低可以使得在ph依賴性方式下結(jié)合fcrn的結(jié)合親和力小于1-log，與在生理ph(ph7.4)下相同的結(jié)合親和力相比，優(yōu)選在ph5-6時約為相同或更小。通過這種fcrn結(jié)合的調(diào)節(jié)，可以提供僅包含位于c-端ch2和ch3結(jié)構(gòu)域界面之間的(野生型)fc片段的fcrn結(jié)合位點的抗體。通過引入h433a突變和h435a突變(根據(jù)kabat的eu索引編號)獲得不具有天然ch3結(jié)構(gòu)域ph依賴性fcrn結(jié)合位點的ch3lc變體和ch3hc變體的具體實施方案，其是ph依賴性fcrn結(jié)合位點的一部分，所述ph依賴性fcrn結(jié)合位點來自天然ch3結(jié)構(gòu)域序列[9]，序列見圖22。根據(jù)具體方面，所述抗體是以下任意種a)特異性識別第一靶和第二靶的雙特異性抗體，其包括含有識別所述第一靶的結(jié)合位點的第一對重鏈和輕鏈(h1/l1)，和含有識別所述第二靶的結(jié)合位點的第二對重鏈和輕鏈(h2/l2)；或者b)通過單價結(jié)合位點特異性識別靶的單臂抗體，其包括含有識別所述靶的結(jié)合位點的一對重鏈和輕鏈(h1/l1)，其中所述重鏈(h1)與另一由恒定區(qū)組成的重鏈(h2)結(jié)合，從而形成fc區(qū)。具體地，所述單臂抗體包括h2，其是包含ch2-ch3抗體結(jié)構(gòu)域的fc鏈。所述單臂抗體的具體特征在于由ch2-ch3二聚體(同二聚體或異二聚體)組成的fc區(qū)。具體地，所述fc區(qū)的特征在于ch3hc/ch3hc二聚體。特別地，任何所述雙特異性抗體或單臂抗體的特征在于各自靶的單價結(jié)合。因此，每個雙特異抗體或單臂抗體的具體特征僅在于每個靶只有一個結(jié)合位點。例如，所述雙特異性抗體包含僅有一個識別第一靶的結(jié)合位點和僅有一個識別第二靶的結(jié)合位點。具體地，所述單臂抗體包含僅有一個識別所述靶的結(jié)合位點。具體地，所述抗體是雙特異性抗體，其中所述第一靶是cd3或cd16，以及第二靶是egfr。具體地，所述抗體是單臂抗體，其中所述靶是egfr。具體地，所述抗體是單臂抗體，其中所述靶是cd3。具體地，所述抗體是單臂抗體，其中所述靶是cd16。具體實施方案涉及本文例舉的任何抗體，或包括在實施例部分中描述的任何重鏈和輕鏈或任何一對重鏈和輕鏈。具體地，如本文所述的抗體可以包括或由在實施例部分中描述的重鏈和輕鏈組成。具體地，所述抗體提供用于醫(yī)學(xué)、診斷或分析用途。本發(fā)明進一步提供了包含本發(fā)明抗體的藥物制劑，優(yōu)選包括腸胃外制劑或粘膜制劑，可選地，含有藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明抗體的分離的核酸。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的核酸的表達盒或質(zhì)粒，和可選地表達由核酸序列編碼的抗體的其它序列，比如調(diào)節(jié)序列。具體地，所述表達盒或質(zhì)粒包含表達本發(fā)明抗體的hc和/或lc或多于一種hc和/或多于一種lc的編碼序列。例如，所述抗體可以包含兩種不同的hc和兩種不同的lc，并且使用兩種不同的hc和兩種不同的lc的編碼序列來產(chǎn)生異二聚體抗體。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)宿主細胞，其包含含有編碼本發(fā)明的抗體的一個或多個核酸分子的至少一個表達盒或一質(zhì)粒，以及任選進一步表達免疫球蛋白的序列。本發(fā)明還提供了制備根據(jù)本發(fā)明的抗體的方法，其中在產(chǎn)生所述抗體的條件下培養(yǎng)或維持根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞。附圖說明圖1：圖1a：在所述c-端ch3結(jié)構(gòu)域(即所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?中的fab臂和seed技術(shù)(ga/ag)之一具有ch3結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的示意圖。所述c-端gaseed結(jié)構(gòu)域顯示融合到天然fab結(jié)構(gòu)域，所述c-端agseed結(jié)構(gòu)域顯示融合到ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab。但是，所述天然結(jié)構(gòu)域交換的fab或ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab可以與c-端seed結(jié)構(gòu)域融合，因此在所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χg的fab的相對取向也可以逆轉(zhuǎn)(這里未示出)。1a-1：在與ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的seed技術(shù)，該ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凸起和所述fab的輕鏈元件中的凹孔。1a-2：相當(dāng)于(1a-1)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凹孔和所述fab的輕鏈元件中的凸起。1a-3：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的seed技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]正電荷變體和所述fab輕鏈元件中的負電荷變體。1a-4：相當(dāng)于(1a-3)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]負電荷變體和所述fab輕鏈元件中的正電荷變體。1a-5：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的seed技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“鏈a”[8]變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈b”變體。1a-6：相當(dāng)于(1a-5)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“鏈b”[8]變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈a”變體。1a-7：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的seed技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ag”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ga”seed變體。1a-8：相當(dāng)于(1a-7)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ga”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ag”seed變體。圖1b：在所述c-端ch3結(jié)構(gòu)域(即所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?中的fab臂和凸起-嵌-凹孔(kih)技術(shù)之一具有ch3結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的示意圖。所述c-端“凸起”結(jié)構(gòu)域顯示融合到天然fab結(jié)構(gòu)域，所述c-端“凹孔”結(jié)構(gòu)域顯示融合到ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab。但是所述天然結(jié)構(gòu)域交換的fab或ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab可以與c-端“凸起”或“凹孔”結(jié)構(gòu)域融合，因此在所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χg的fab的相對取向也可以逆轉(zhuǎn)(這里未示出)。1b-1：與ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的凸起-嵌-凹孔技術(shù)，該ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凸起和所述fab的輕鏈元件中的凹孔。1b-2：相當(dāng)于(1b-1)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凹孔和所述fab的輕鏈元件中的凸起。1b-3：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的的凸起-嵌-凹孔技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]正電荷變體和所述fab輕鏈元件中的負電荷變體。1b-4：相當(dāng)于(1b-3)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]負電荷變體和所述fab輕鏈元件中的正電荷變體。1b-5：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的的凸起-嵌-凹孔技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“鏈a”[8]變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈b”變體。1b-6：相當(dāng)于(1b-5)的的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“鏈b”[8]變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈a”變體。1b-7：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的的凸起-嵌-凹孔技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ag”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ga”seed變體。1b-8：相當(dāng)于(1b-7)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ga”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ag”seed變體。圖1c：在所述c-端ch3結(jié)構(gòu)域(即所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?中的fab臂和靜電轉(zhuǎn)向(參考文獻7)技術(shù)之一具有ch3結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的示意圖。所述c-端靜電轉(zhuǎn)向[7]正電荷變體結(jié)構(gòu)域顯示與天然fab結(jié)構(gòu)域融合，以及所述c-端負電荷變體結(jié)構(gòu)域顯示與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab融合。但是所述天然結(jié)構(gòu)域交換的fab或ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab可以與c-端正電荷變體結(jié)構(gòu)域或負電荷變體結(jié)構(gòu)域融合，因此在所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χg的fab的相對取向也可以逆轉(zhuǎn)(這里未示出)。1c-1：與ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的靜電轉(zhuǎn)向技術(shù)，該ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凸起和所述fab的輕鏈元件中的凹孔。1c-2：相當(dāng)于(1c-1)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凹孔和所述fab的輕鏈元件中的凸起。1c-3：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的靜電轉(zhuǎn)向技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]正電荷變體和所述fab輕鏈元件中的負電荷變體。1c-4：相當(dāng)于(1c-3)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]負電荷變體和所述fab輕鏈元件中的正電荷變體。1c-5：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的靜電轉(zhuǎn)向技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“鏈a”[8]變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈b”變體。1c-6：相當(dāng)于(1c-5)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“鏈b”[8]變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈a”變體。1c-7：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的靜電轉(zhuǎn)向技術(shù)，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ag”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ga”seed變體。1c-8：相當(dāng)于(1c-7)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ga”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ag”seed變體。圖1d：在所述c-端ch3結(jié)構(gòu)域(即所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?中的fab臂和工程改造的“鏈a”變體結(jié)構(gòu)域和“鏈b”變體結(jié)構(gòu)域(vonkreudenstein參考文獻8)技術(shù)之一具有ch3結(jié)構(gòu)域交換的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的示意圖。所述c-端鏈a[8]變體結(jié)構(gòu)域顯示與天然fab結(jié)構(gòu)域融合，所述c-端鏈b[8]變體結(jié)構(gòu)域顯示與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab融合。但是所述天然結(jié)構(gòu)域交換的fab或ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab可以與c-端鏈a變體結(jié)構(gòu)域或鏈b變體結(jié)構(gòu)域融合，因此在所述ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)χg的fab的相對取向也可以逆轉(zhuǎn)(這里未示出)。1d-1：與ch3的凸起-嵌入-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的鏈a變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)和鏈b變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)[8]，該ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凸起和所述fab的輕鏈元件中的凹孔。1d-2：相當(dāng)于(1d-1)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的凹孔和所述fab的輕鏈元件中的凸起。1d-3：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的鏈a變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)和鏈b變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)[8]，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]正電荷變體和所述fab輕鏈元件中的負電荷變體。1d-4：相當(dāng)于(1d-3)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“靜電轉(zhuǎn)向”[7]負電荷變體和所述fab輕鏈元件中的正電荷變體。1d-5：與ch3結(jié)構(gòu)域配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的鏈a變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)和鏈b變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)[8]，該ch3結(jié)構(gòu)域包括所述重鏈中的“鏈a”[8]變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈b”變體。1d-6：相當(dāng)于(1d-5)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“鏈b”(參考文獻8)變體和所述fab輕鏈元件中的“鏈a”變體。1d-7：與ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab配對的c-端ch3結(jié)構(gòu)域中的鏈a變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)和鏈b變體結(jié)構(gòu)域技術(shù)[8]，該ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ag”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ga”seed變體。1d-8：相當(dāng)于(1d-7)的實施例，但是是與結(jié)構(gòu)域交換的fab配對，該結(jié)構(gòu)域交換的fab包括所述重鏈中的“ga”seed[2]變體和所述fab輕鏈元件中的“ag”seed變體。圖2：圖2a：通過非還原sds-page表征結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體。用膠態(tài)藍色染色試劑盒(invitrogen)給sds-page染色。泳道1：非還原結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體1(在ch3ag-重鏈上的fab結(jié)構(gòu)域交換)。泳道2：非還原結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體2(在ch3ga-重鏈上的fab結(jié)構(gòu)域交換)。泳道3：非還原結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體3(在ch3ga-重鏈上含有ch3wt結(jié)構(gòu)域交換的fab臂)。泳道4：蛋白質(zhì)標(biāo)準品seeblueplus2預(yù)染分子量標(biāo)記物(invitrogen)。圖2b：所述結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體1的sec圖譜(參見實施例1和2)。圖2c：所述結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體2的sec圖譜(參見實施例1和2)。圖2d：所述結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體3的sec圖譜(參見實施例1和2)。圖3：圖3a：在還原或非還原的條件下通過sds-page表征所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體1(bsab1)。用膠態(tài)藍染色試劑盒(invitrogen)給sds-page染色。泳道1：蛋白質(zhì)標(biāo)準品seeblueplus2預(yù)染分子量標(biāo)記物(invitrogen)。泳道2：還原的sds-page圖譜顯示對應(yīng)于vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ag(seqid2)的h1帶，對應(yīng)于vh(2)-ch1-ch2-ch3ga(seqid4)的h2帶和對應(yīng)于vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)和vl(2)-cl(seqid3)的l1+l2帶。泳道3：非還原的sds-page圖譜顯示對應(yīng)于所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1的雙特異性抗體的主帶。圖3b：所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1的sec圖譜。圖4：所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1的facs分析。圖5：單臂抗體的示意圖，其包含融合到seedag結(jié)構(gòu)域的fab臂中的未工程改造fab結(jié)構(gòu)域或ch3結(jié)構(gòu)域交換。圖6：圖6a：在非還原和還原條件下通過sds-page表征單臂抗體，其含有所述未工程改造的fab結(jié)構(gòu)域或ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab。用膠態(tài)藍染色試劑盒(invitrogen)給sds-page染色。泳道1：蛋白質(zhì)標(biāo)準品seeblueplus2預(yù)染分子量標(biāo)記物(invitrogen)。泳道2：非還原圖譜顯示對應(yīng)于所述非工程改造的抗體(ch1/clfab)的單臂抗體主帶。泳道3：非還原圖譜顯示對應(yīng)于所述結(jié)構(gòu)域交換的fab抗體的單臂抗體主要帶。泳道4：還原圖譜顯示對應(yīng)于vh(1)-ch1-ch2-ch3ag(seqid11)的h1帶，對應(yīng)于hufc-gaseed(seqid9)的h2帶和對應(yīng)于vl(1)-cl(seqid10)的l1帶。泳道5：還原圖譜顯示對應(yīng)于vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ag(seqid2)的h1帶，對應(yīng)于hufc-gaseed(seqid9)的h2帶和對應(yīng)于vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)的l1帶。圖6b：單臂抗體的sec圖譜，所述單臂抗體含有在所述fab中未工程改造的ch1/cl結(jié)構(gòu)域或在所述fab臂中使用ch3-kih同源結(jié)構(gòu)域?qū)Φ慕Y(jié)構(gòu)域交換的fab(參見實施例6)。圖7：單臂抗體(未工程改造的fab和結(jié)構(gòu)域交換的fab)和bsab1抗原結(jié)合到egfr-陽性細胞(a431細胞)。通過流式細胞術(shù)測量細胞結(jié)合。以連續(xù)稀釋(1：3)測試所述抗體，并使用與藻紅蛋白結(jié)合的抗人fcf(ab)2第二抗體檢測結(jié)合。重復(fù)進行測量。圖8：圖8a：在還原或非還原條件下，通過sds-page表征所述結(jié)構(gòu)域交換的bsab2(抗-cd16×抗-egfrch3-kih)。用膠態(tài)藍染色試劑盒(invitrogen)給sds-page染色。泳道1：蛋白質(zhì)標(biāo)準品seeblueplus2預(yù)染分子量標(biāo)記物，(invitrogen)。泳道2：還原圖譜顯示對應(yīng)于vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ag(seqid2)的h1帶，對應(yīng)于vh(3)-ch1-ch2-ch3ga(seqid13)的h2帶，對應(yīng)于vl(3)-cl(seqid12)的l1帶和對應(yīng)于vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)的l2帶。泳道3：非還原圖譜顯示對應(yīng)于所述結(jié)構(gòu)域交換的bsab2(抗-cd16×抗-egfrch3-kih)的主帶。圖8b：所述結(jié)構(gòu)域交換的交換bsab2(抗-cd16×抗-egfrch3-kih)的sec圖譜。圖9：所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1(抗-cd3×抗-egfrch3-kih)的lc-ms分析。在測量前，樣品利用pngase進行去糖基化。去卷積和譜給出正確組裝的雙特異性抗體的質(zhì)量。圖10結(jié)構(gòu)域交換的交換雙特異性抗體bsab2(抗-cd16×抗-egfrch3-kih)的lc-ms分析。在測量前，樣品利用pngase進行去糖基化。去卷積和譜給出正確組裝的雙特異性抗體的質(zhì)量。圖11：通過lc-ms測定與2個競爭輕鏈共表達的單臂非工程化抗體的總質(zhì)量。僅發(fā)現(xiàn)正確組裝的抗體。無法檢測到錯配的mab(用箭頭標(biāo)記潛在錯配的質(zhì)量的位置)。圖12：通過lc-ms測定與2個競爭輕鏈共表達的單臂結(jié)構(gòu)域交換的抗體的總質(zhì)量。僅發(fā)現(xiàn)正確組裝的抗體。無法檢測到錯配的mab(用箭頭標(biāo)記潛在錯配的質(zhì)量的位置)。圖13：結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1和bsab2的dsc譜圖。圖14：抗體與cd16a受體的結(jié)合。利用cd16ahtrf細胞結(jié)合測定法(cisbio)測量結(jié)合。重復(fù)進行測量。圖15：在存在結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1(a)和bsab2(b)的條件下，通過效應(yīng)細胞重新定向裂解a431細胞。圖16：通過單臂抗egfrseed抗體的非還原性sds-page和sec對具有交替工程改造的fab區(qū)的結(jié)構(gòu)域交換的抗體進行生物物理學(xué)表征(a和c)，以及-通過構(gòu)域交換的抗體(抗-cd3×抗-egfr-ch3)的非還原性sds-page和sec對具有交替工程改造的fab區(qū)的結(jié)構(gòu)域交換的抗體進行生物物理學(xué)表征(b和d)。蛋白質(zhì)在expi293細胞中產(chǎn)生并通過蛋白a進行一步純化。sds-page凝膠的每條泳道裝載5μg蛋白質(zhì)，分離后用膠態(tài)藍染色試劑盒(invitrogen)給蛋白質(zhì)染色。在sds-page中變體1和變體2用1和2表示。變體1的sec曲線以黑線表示，變體2的sec曲線以虛線表示。(更多詳細信息參見實施例13)圖17：通過流式細胞術(shù)測量單臂抗體與變體1(a)和變體2(b)的交替結(jié)構(gòu)域交換的fab臂的egfr結(jié)合。以連續(xù)稀釋(1：3)測試所述抗體，并使用與藻紅蛋白結(jié)合的抗人fcf(ab)2抗體檢測結(jié)合。每個數(shù)據(jù)點代表重復(fù)的平均值。圖18：在存在具有交替工程化fab結(jié)構(gòu)域(變體1)的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的條件下，通過活化的t細胞重新定向靶細胞裂解。t細胞在培養(yǎng)基中用il-2和抗cd3igg活化24小時。在存在連續(xù)稀釋(1：4)的抗體的條件下，將受刺激的t細胞與a431細胞以10：1的e：t比共培養(yǎng)18小時。利用cytotox96非放射性細胞毒性測定法(promega)，在上清液中測量細胞裂解(ldh釋放)。每個數(shù)據(jù)點是三次平均值±sd。使用來自前述實施例的結(jié)構(gòu)域交換的bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)用于比較。圖19：單臂結(jié)構(gòu)域交換的kih抗體的表征。如在示意圖(a)中所示，這些分子在expi293細胞中產(chǎn)生并且蛋白a純化后通過sec(b)分析。變體1的sec曲線以黑線表示，變體2的sec曲線以虛線表示。圖20：通過流式細胞術(shù)測量單臂kih抗體與變體1(a)和變體2(b)的選擇性工程改造的fab區(qū)的egfr結(jié)合。以連續(xù)稀釋(1：3)測試所述抗體，并使用與藻紅蛋白結(jié)合的抗人fcf(ab)2抗體檢測與a431細胞結(jié)合的抗原。每個數(shù)據(jù)點表示單個測量。圖21：通過將ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab連接到抗體的不同位置并與工程改造的異二聚體重鏈組合而形成的多種抗體的幾個實施例的示意圖。ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab可以連接到天然抗體的不同位置或連接到工程改造的異二聚體重鏈對。如實施例所示，可以使用各種工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域以形成所述異二聚體重鏈或形成所述ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab(在此并未示出所有選項)。21-1：由具有n-端fab的天然ig抗體組成的四價雙特異性抗體，所述n-端fab由配對的vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域組成，所述vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域與ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab結(jié)合，該ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab包括vh2-ch3(凸起)和vl2-ch3(凹孔)，所述四價雙特異性抗體的vh2-ch3(凸起)的n-端連接到天然抗體的c-端。21-2：由具有n-端fab的天然ig抗體組成的四價雙特異性抗體，該n-端fab由配對的vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域組成，所述vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域與ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab結(jié)合，該ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換結(jié)構(gòu)域交換的fab包括vh2-ch3(凹孔)和vl2-ch3(凸起)，所述四價雙特異性抗體的vl2-ch3(凸起)的n-端連接到天然抗體的c-端。21-3：雙特異性抗體，n-端二價，c-端為一價，由seed技術(shù)組裝的異二聚體重鏈組成，n-端fab連接到每條重鏈，所述的每條重鏈由配對的vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域組成，所述vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域與ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab結(jié)合，該ch3的凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab由vh2-ch3(凸起)和vl2-ch3(凹孔)組成，所述雙特異性抗體的vh2-ch3(凸起)的n-端僅與一條seed重鏈中的c-端連接。21-4：雙特異性抗體，n-端為一價，c-端為二價，由seed技術(shù)組裝的異二聚體重鏈組成，n-端fab僅與一條seed重鏈連接，所述的seed重鏈由配對的vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域組成，所述vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域與ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab結(jié)合，該ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab由vh2-ch3(凸起)和vl2-ch3(凹孔)，所述雙特異性抗體的vh2-ch3(凸起)的n-端與兩條seed重鏈中的c-端連接。21-5：三特異性抗體，n-端為二價，以及c-端為2個不同的一價fab結(jié)構(gòu)域，由以seed技術(shù)組裝的異二聚體重鏈組成，n-端fab連接到由配對的vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域組成的每條重鏈，所述vh1-ch1/vl1-cl結(jié)構(gòu)域與ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab結(jié)合，所述ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab包括vh2-ch3(凸起)和vl2-ch3(凹孔)，vh2-ch3(凸起)的n-端連接到gaseed結(jié)構(gòu)域的c-端和不同的ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab，所述ch3凸起-嵌-凹孔結(jié)構(gòu)域交換的fab由vh3-ch3(凸起)和vl3-ch3(凹孔)，vl3-ch3(凹孔)的n-端連接到agseed結(jié)構(gòu)域的c-端。圖22：所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體輕鏈和重鏈的多肽序列：可變結(jié)構(gòu)域是斜體字符。ch3結(jié)構(gòu)域交換的序列加下劃線。seedch3-ga和seedch-ag結(jié)構(gòu)域用粗體標(biāo)記。引入突變形成的凸起、凹孔或其它設(shè)計用于促進ch3結(jié)構(gòu)域異二聚化的變體(在一些可能的具體實施方案的實施例中描述)以灰色和下劃線突出顯示。seqid1：vl(1)-ch3_hole(y407t)seqid2：vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3agseqid3：vl(2)-clseqid4：vh(2)-ch1-ch2-ch3gaseqid5：vh(2)-ch1-ch2-ch3agseqid6：vh(1)-ch3-knob(t366y)-ch2-ch3gaseqid7：vl(1)-ch3wtseqid8：vh(1)-ch3wt-ch2-ch3gaseqid9：hufc_gaseedseq10：vl(1)-clseq11：vh(1)-ch1-ch2-ch3agseqid12：vl(3)-clseqid13：vh(3)-ch1-ch2-ch3gaseqid14：vh(3)-ch1-ch2-ch3agseqid15：vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2en-ch3agseqid16：hufc_g1hingeen-ch2en-ch3gaseqid17：vh(3)-ch1-ch2en-ch3gaseqid18：vh(1)-ch3_knob(t366w)-ch2-ch3agseqid19：vl(1)-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid20：vh(1)-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)-ch2-ch3agseqid21：vl(1)-ch3_knob(t366w)seqid22：vh(1)-ch3(e356k，d399k)-ch2-ch3agseqid23：vl(1)-ch3(k392d，k409d)seqid24：vh(1)-ch3(k392d，k409d)-ch2-ch3agseqid25：vl(1)-ch3(e356k，d399k)seqid26：vh(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v)-ch2-ch3agseqid27：vl(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)seqid28：vh(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)-ch2-ch3agseqid29：vl(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v)seqid30：vh(1)-ch3_seed(ag)-ch2-ch3agseqid31：vl(1)-ch3_seed(ga)seqid32：vh(1)-ch3_seed(ga)-ch2-ch3agseqid33：vl(1)-ch3_seed(ag)seqid34：vh(1)-ch3(e356k，d399k)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid35：vh(1)-ch3(k392d，k409d)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid36：vh(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid37：vh(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid38：vh(1)-ch3_seed(ag)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid39：vh(1)-ch3_seed(ga)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid40：hufc_knob(t366w)人ch3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列seqid41：人igg1的ch3seqid42：人igg2的ch3seqid43：人igg3的ch3seqid44：人igg4的ch3seqid45：人iga的ch3seqid46：人igm的ch3seqid47：人ige的ch3seqid48：人igd的ch3用作在結(jié)構(gòu)域交換的fab重鏈和輕鏈元件中轉(zhuǎn)換序列側(cè)面連接交換的結(jié)構(gòu)域的n-端和c-端的實施例的氨基酸序列seqid49：人κ鏈108-111(kabateu編號)seqid50：人igg1重鏈345-348(kabateu編號)seqid51：人igg1重鏈438-444(kabateu編號)seqid52：人vhj區(qū)109-113(kabateu編號)seqid53：人ch1結(jié)構(gòu)域118-122(kabateu編號)具體實施方式本文所用的術(shù)語“抗體”定義為抗原結(jié)合多肽，其為免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子，或其它表現(xiàn)出模塊抗體形式的蛋白質(zhì)，例如由一個或多個抗體結(jié)構(gòu)域組成并具有類似于免疫球蛋白或抗體的抗原結(jié)合特性，特別是可以顯示單特異性或雙特異性或多特異性，或一價、二價或多價結(jié)合性質(zhì)的蛋白質(zhì)，例如用于抗原、效應(yīng)分子或結(jié)構(gòu)的表位的至少兩個特異性結(jié)合位點，特別是病原體來源或人結(jié)構(gòu)，如包含細胞相關(guān)蛋白或血清蛋白的自身抗原。在本文中術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”可互換使用。抗體通常由抗體結(jié)構(gòu)域組成或包括抗體結(jié)構(gòu)域，其被理解為具有或不具有接頭序列的免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域和/或可變結(jié)構(gòu)域。抗體具體理解為由具有或不具有連接序列或鉸鏈區(qū)的可變抗體結(jié)構(gòu)域和/或恒定抗體結(jié)構(gòu)域的組合組成或包括具有或不具有連接序列或鉸鏈區(qū)的可變抗體結(jié)構(gòu)域和/或恒定抗體結(jié)構(gòu)域的組合，包括可變抗體結(jié)構(gòu)域?qū)?，例如一個或兩個vh/vl對。如果包括通過環(huán)序列連接的抗體結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的至少兩個β折疊鏈組成的β桶狀結(jié)構(gòu)，則多肽理解為抗體結(jié)構(gòu)域?？贵w結(jié)構(gòu)域可以是天然結(jié)構(gòu)的或通過誘變或衍生化修飾，例如修飾抗原結(jié)合性質(zhì)或任何其它性質(zhì)，比如穩(wěn)定性或功能性質(zhì)，比如結(jié)合fc受體fcrn和/或fcγ受體。本文所用的術(shù)語“抗體”具體包含全長抗體，包含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的抗體，比如結(jié)構(gòu)域交換的抗體。具體地，抗體可以是全長抗體，例如igg類型(例如，igg1、igg2、igg3或igg4亞型)、iga1、iga2、igd、ige或igm抗體。所述術(shù)語還包含具有抗體結(jié)構(gòu)域或抗體片段的抗體衍生物或抗體組合。術(shù)語“全長抗體”可以用于指包括至少大部分所述fc結(jié)構(gòu)域的任何抗體分子，具體包含重鏈二聚體，從而至少產(chǎn)生ch3hc/ch3hc對，和通常在天然存在的抗體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的其它結(jié)構(gòu)域。本文使用的這個術(shù)語“全長抗體”強調(diào)特定抗體分子而不是抗體片段。據(jù)此，通常將抗體理解為蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)復(fù)合物)，其包含一種或多種多肽，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼。公認的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定區(qū)基因以及免疫球蛋白可變區(qū)基因。將輕鏈(lc)歸類為κ或λ。將重鏈(hc)歸類為γ、μ、α、δ或ε，其又分別依次限定免疫球蛋白類別，igg、igm、iga、igd和ige。hc或lc各自由連接彼此的至少兩個結(jié)構(gòu)域組成，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域鏈。特別理解的是，抗體hc包括vh抗體結(jié)構(gòu)域和至少一個結(jié)合所述vh的抗體結(jié)構(gòu)域c-端?？贵wlc包括vl抗體結(jié)構(gòu)域和至少一個結(jié)合所述vl的抗體結(jié)構(gòu)域。所述定義還包含可變區(qū)(例如dab、fd、v1、vk、vh、vhh)的重鏈和輕鏈的結(jié)構(gòu)域，以及完整抗體的恒定區(qū)或單個結(jié)構(gòu)域，比如ch1、ch2、ch3、ch4、cl和ck，以及由結(jié)構(gòu)環(huán)連接的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的至少兩個β折疊鏈組成的微小結(jié)構(gòu)域。通常，具有通過特定cdr結(jié)構(gòu)的抗原結(jié)合位點的免疫球蛋白能夠通過一對vh/vl結(jié)構(gòu)域的cdr環(huán)結(jié)合靶抗原。術(shù)語“抗體”應(yīng)該具體包含分離形式的抗體或免疫球蛋白，其基本上不含針對不同靶抗原的其它抗體或免疫球蛋白，和/或包括抗體結(jié)構(gòu)域的不同結(jié)構(gòu)排列。盡管如此，分離的抗體可以包含在組合制劑中，其含有分離的抗體的組合，例如與至少一種其它抗體，比如具有不同特異性的單克隆抗體或抗體片段。術(shù)語“抗體”應(yīng)該適用于動物來源的抗體或免疫球蛋白，所述動物來源包含人類，例如哺乳動物(包含人、鼠、兔子、山羊、羊駝屬(lama)、牛和馬)，或禽類(例如母雞)，其術(shù)語應(yīng)該特別包含基于動物來源的序列(例如人序列)的重組免疫球蛋白。術(shù)語“抗體”特別適用于人抗體。關(guān)于抗體或免疫球蛋白使用的術(shù)語“人”理解為包括具有衍生自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體可以包含未被人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機誘變或特定位點誘變或者通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)，例如在所述cdr中。人抗體包含從人免疫球蛋白文庫或從一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的動物分離的抗體。優(yōu)選地，人抗體選自或衍生自由iga1、iga2、igd、ige、igg1、igg2、igg3、igg4和igm組成的組。優(yōu)選地，鼠抗體選自或衍生自由iga、igd、ige、igg1、igg2a、igg2b、igg2c、igg3和igm組成的組。術(shù)語“抗體”進一步適用于嵌合(chimeric)抗體或嵌合免疫球蛋白(例如嵌合抗體)，具有不同物種來源的序列(例如鼠源和人源的序列)。關(guān)于免疫球蛋白或抗體使用的術(shù)語“嵌合(chimeric)”是指重鏈和輕鏈的每個氨基酸序列的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟ǚN類的免疫球蛋白中的相應(yīng)序列同源的那些分子，而所述鏈的剩余片段與另一物種或種類中的相應(yīng)序列同源。通常，所述輕鏈和重鏈的可變區(qū)模擬衍生自一種哺乳動物的免疫球蛋白的可變區(qū)，而所述恒定部分與衍生自另一種哺乳動物的免疫球蛋白序列同源。例如，使用來自使用從非人宿主生物體的容易獲得的b細胞或雜交瘤與源自例如人細胞制劑的恒定區(qū)組合，可以從目前已知的來源獲得可變區(qū)。術(shù)語“抗體”可進一步適用于人源化抗體或人源化免疫球蛋白。關(guān)于抗體或免疫球蛋白使用的術(shù)語“人源化”是指具有基本上衍生自非人物種的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點的分子，其中所述分子的剩余免疫球蛋白結(jié)構(gòu)基于人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)和/或序列。所述抗原結(jié)合位點可以包括融合到恒定結(jié)構(gòu)域上的完全可變結(jié)構(gòu)域，或僅包括在所述可變結(jié)構(gòu)域中移植到適當(dāng)骨架區(qū)上的互補決定區(qū)(cdr)?？乖Y(jié)合位點可以是野生型或修飾的，例如通過一個或多個氨基酸取代，優(yōu)選修飾到更接近的類似于人免疫球蛋白。某些形式的人源化免疫球蛋白保留所有cdr序列(例如含有來自小鼠抗體的所有6個cdr的人源化小鼠抗體)。其它形式具有相對于原始抗體改變的一個或多個cdr。術(shù)語“抗體”還適用于單克隆或多克隆抗體，特別是重組抗體，該術(shù)語包含通過重組方式制備、表達、產(chǎn)生或分離的所有抗體和抗體結(jié)構(gòu)，比如源自動物的抗體，例如哺乳動物(包含人)，包括來自不同來源的基因或序列，例如嵌合抗體、人源化抗體或雜交細胞衍生的抗體。進一步的實施例涉及從轉(zhuǎn)化以表達抗體的宿主細胞中分離的抗體，或從抗體或抗體結(jié)構(gòu)域的重組文庫、組合文庫中分離的抗體，或通過涉及剪接抗體基因序列到其它dna序列的任何其它手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。術(shù)語“抗體”理解為包含新的或現(xiàn)存的功能活性變體，例如天然存在的抗體。還應(yīng)當(dāng)理解，抗體的術(shù)語變體，特別是抗體樣分子的變體或抗體變體，也應(yīng)該包含這些分子的衍生物。衍生物是一種或多種抗體和/或融合蛋白的任何組合，其中所述抗體的任何結(jié)構(gòu)域或微型結(jié)構(gòu)域可以在任何位置融合到一種或多種其它蛋白質(zhì)，比如融合到其它抗體或抗體片段，而且還融合到配體、酶、毒素等。本發(fā)明的抗體可以特定地與其它肽或多肽用作分離的多肽或組合分子，例如通過重組、融合或偶聯(lián)(conjugation)技術(shù)。優(yōu)選地，所述肽與免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域序列同源，并且優(yōu)選至少5個氨基酸長，更優(yōu)選至少10個或甚至至少50個或100個氨基酸長，并且至少部分構(gòu)成所述免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)。所述抗體的衍生物也可以通過各種化學(xué)技術(shù)(比如共價偶聯(lián)、靜電作用、二硫化物鍵合等)與其它物質(zhì)締合或結(jié)合而獲得。與免疫球蛋白結(jié)合的所述其它物質(zhì)可以是脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、有機分子和無機分子或它們的任何組合(例如peg、前藥(prodrug)或藥物)。衍生物還將包括具有相同氨基酸序列的抗體，但是所述抗體完全或部分由非天然或化學(xué)修飾的氨基酸制成。在具體實施方案中，所述抗體是包含附加標(biāo)簽(tag)的衍生物，所述附加標(biāo)簽允許與生物可接受的化合物進行特異相互作用。對于本發(fā)明中使用的標(biāo)簽沒有特別的限制，只要其對免疫球蛋白與其靶的結(jié)合沒有負面影響或者可以承受負面影響。合適標(biāo)簽的實施例包含組氨酸標(biāo)簽(his-tag)、myc標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、鏈球菌標(biāo)簽(streptag)、鈣調(diào)蛋白標(biāo)簽、gst標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽和s標(biāo)簽。在另一個具體實施方案中，所述免疫球蛋白是包括標(biāo)記(label)的衍生物。本文所用的術(shù)語“標(biāo)記”是指可檢測化合物或組合物，其可直接或間接與免疫球蛋白結(jié)合以產(chǎn)生“標(biāo)記”抗體。所述標(biāo)記本身可以被檢測到，例如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記，或者在酶標(biāo)記的情況下，可以催化可檢測的底物化合物或底物組合物的化學(xué)改變。例如，抗體的衍生物是衍生自親本抗體或抗體序列，比如親本抗原結(jié)合(例如cdr)或框架(fr)序列，例如突變體或變體，該突變體或變體例如通過在硅膠(silico)或重組工程中或通過化學(xué)衍生化或合成獲得。本文所用的術(shù)語“變體”應(yīng)該具體包括本文所述的任何“突變體”、“同系物”或“衍生物”。術(shù)語“變體”應(yīng)該具體包括功能活性變體。根據(jù)本發(fā)明的抗體的功能變體在lc和hc的抗原結(jié)合和二聚化方面特別有功效，從而形成ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?。術(shù)語“變體”應(yīng)特指抗體，比如突變抗體或抗體片段，例如通過誘變方法獲得，特別是刪除、交換、將插入片段導(dǎo)入特異性抗體氨基酸序列或區(qū)段或化學(xué)衍生氨基酸序列，例如在恒定結(jié)構(gòu)域中工程改造所述抗體的穩(wěn)定性、效應(yīng)子功能或半衰期，或在可變結(jié)構(gòu)域中，以改善抗原結(jié)合特性，例如通過本領(lǐng)域可獲得的親和力成熟技術(shù)。可以使用任何已知的誘變方法，包含在所需位置的點突變，例如通過隨機化技術(shù)獲得。在某些情況下，位置是隨機選擇的，例如用任何可能的氨基酸或選擇優(yōu)選的氨基酸使所述抗體序列隨機化。術(shù)語“誘變”是指用于改變多核苷酸或多肽序列的任何現(xiàn)有公認的技術(shù)。優(yōu)選的誘變類型包含易出錯的pcr誘變、飽和誘變或其它定點誘變。本文中術(shù)語“功能變體”也稱為“功能活性變體”，例如可以包括序列，所述序列來自于通過插入、刪除或取代一個或多個氨基酸的親本序列(例如來自親本抗體)，或化學(xué)衍生氨基酸序列中的一個或多個氨基酸殘基、或在所述核苷酸序列中的核苷酸，或在所述序列的遠端中的任一個或兩個，例如在cdr或fr序列中，并且修飾不影響(特別是損害)該序列的活性。在對選擇的靶抗原具有特異性的結(jié)合位點的情況下，抗體的功能活性變體仍然具有預(yù)定的結(jié)合特異性，盡管這可以改變，例如將精準特異性改變?yōu)樘禺愋员砦?、親和力、親合力、kon或koff率等。例如，將親和力成熟抗體特別理解為功能活性變體抗體。因此，將親和力成熟抗體中的修飾的cdr序列理解為功能活性變體。與親本分子相比，所述功能活性優(yōu)選由所述變體的結(jié)構(gòu)和功能確定，例如在用于以ph依賴的方式測定結(jié)合靶抗原的特異性和/或所述分子所需的體內(nèi)半衰期和/或所述fcrn結(jié)合的測定法，例如在標(biāo)準測定中通過測量免疫球蛋白的功能性測定。當(dāng)所述抗原在細胞表面表達時，通常用elisa測定法、biacore測定法、octetbli測定法或基于facs的測定法測定抗體的抗原結(jié)合功能活性。例如，可以通過改變親本抗體的序列來獲得功能活性變體，，例如具有免疫球蛋白特異性天然結(jié)構(gòu)(比如igg1結(jié)構(gòu))的單克隆抗體，以獲得在識別靶抗原時具有相同特異性但具有不同于親本結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)的變體，例如以修飾任何免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以引入特異性突變，產(chǎn)生雙特異性構(gòu)建體，或產(chǎn)生親本分子的片段。通常，可以修飾親本免疫球蛋白或序列以產(chǎn)生變體，該變體包含抗原結(jié)合位點之外或在結(jié)合位點內(nèi)的不損害抗原結(jié)合的序列區(qū)內(nèi)的突變體，并且優(yōu)選具有類似于親本抗體的生物活性，包括結(jié)合抗原的能力，例如具有基本上相同的生物活性，如通過特異性結(jié)合測定或功能測試來確定靶向抗原。本文所用術(shù)語“基本上相同的生物活性”是指活性由與相當(dāng)?shù)幕蛴H本抗體確定的活性的至少20％、至少50％、至少75％、至少90％，例如至少100％，或至少125％，或至少150％，或至少175％，或例如高達200％的活性基本相同活性表示。本文所述的優(yōu)選變體在抗原結(jié)合方面具有功能活性，優(yōu)選具有特異性結(jié)合單個抗原的效力，而不顯著地結(jié)合不是靶抗原的其它抗原，例如kd值差異為至少2log，優(yōu)選至少3log。功能活性變體結(jié)合的抗原通常不受損害，對應(yīng)于與親本抗體或序列或包括序列變體的抗體大體基本相同的結(jié)合親和力，例如kd值差異小于2log，優(yōu)選小于3log，但是，具有甚至改善親和力的可能性，例如kd值差異至少1log，優(yōu)選至少2log。如本文所述的特異性功能變體是結(jié)構(gòu)域交換的抗體，特別是包含一個或多個工程改造的ch3het結(jié)構(gòu)域的功能變體，其包括一個或多個點突變以提高ch3het/ch3het二聚體的形成。在優(yōu)選的實施方案中，親本抗體的功能活性變體a)是所述抗體的生物活性片段，所述片段包括分子序列的至少50％，優(yōu)選至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，或至少95％，最優(yōu)選至少97％、98％或99％；b)來源于通過至少一個氨基酸取代、添加和/或缺失的抗體，其中所述功能活性變體與分子或其一部分具有序列同一性，比如至少50％序列同一性的抗體，優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，還更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選至少95％，最優(yōu)選至少97％、98％或99％；和/或c)由所述抗體或其功能活性變體組成，另外還包含與所述多肽或核苷酸序列異源的至少一個氨基酸或核苷酸。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體的功能活性變體與上述變體基本相同，但分別與其多肽或核苷酸序列不同，因為其來自不同物種的同源序列。這些稱為天然存在的變體或類似物。術(shù)語“功能活性變體”還包含天然存在的等位基因變體，以及突變體或任何其它非天然存在的變體。如本領(lǐng)域已知的，等位基因變體是(多)肽的替代形式，其特征在于具有基本上不改變多肽的生物功能的取代、刪除或添加的一個或多個氨基酸。功能活性變體可以通過多肽或核苷酸序列中的序列改變來獲得，例如通過一個或多個點突變，其中當(dāng)在本發(fā)明組合使用時，所述序列改變保留或改善未改變的多肽或核苷酸序列的功能。這樣的序列改變可以包含但不限于(保守)取代、添加、刪除、突變和插入。特異性功能活性變體是cdr變體。cdr變體包括由cdr區(qū)中的至少一個氨基酸修飾的氨基酸序列，其中所述修飾可以是氨基酸序列的化學(xué)改變或部分改變，該修飾允許變體保留未修飾序列的生物學(xué)特性。所述cdr氨基酸序列的部分改變可以是一至幾個氨基酸(例如1、2、3、4或5個氨基酸)的缺失或取代，或通過添加或插入一至幾個氨基酸，例如1、2、3、4或5個氨基酸，或通過一至幾個氨基酸(例如1、2、3、4或5個氨基酸)的化學(xué)衍生化，或它們的組合。氨基酸殘基中的取代可以是保守取代，例如，用一個疏水性氨基酸取代替代的疏水性氨基酸。保守取代是在與其側(cè)鏈和化學(xué)性質(zhì)相關(guān)的氨基酸家族內(nèi)發(fā)生的取代。這些家族的實施例是具有堿性側(cè)鏈、具有酸性側(cè)鏈、具有非極性脂肪族側(cè)鏈、具有非極性芳香族側(cè)鏈、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈、具有小側(cè)鏈、具有大側(cè)鏈等的氨基酸。點突變特別理解為多核苷酸的工程改造，導(dǎo)致不同的氨基酸在取代或交換、刪除或插入一個或多個單(不連續(xù))或雙氨基酸的氨基酸序列中表達不同于非工程改造的氨基酸序列。優(yōu)選的點突變是指具有相同極性和/或電荷的氨基酸的交換。在這方面，氨基酸是指由六十四個三重密碼子編碼的二十個天然存在的氨基酸。這20個氨基酸可分為具有中性電荷、正電荷和負電荷的氨基酸：所述“中性”氨基酸以及它們各自的三個字母和單個字母的代碼和極性如下所示：丙氨酸：(ala，a)非極性，中性；天冬酰胺：(asn，n)極性，中性；半胱氨酸：(cys，c)非極性，中性；谷氨酰胺：(gln，q)極性，中性；甘氨酸：(gly，g)非極性，中性；異亮氨酸：(ile，i)非極性，中性；亮氨酸：(leu，l)非極性，中性；甲硫氨酸：(met，m)非極性，中性；苯丙氨酸：(phe，f)非極性，中性；脯氨酸：(pro，p)非極性，中性；絲氨酸：(ser，s)極性，中性；蘇氨酸：(thr，t)極性，中性；色氨酸：(trp，w)非極性，中性；酪氨酸：(tyr，y)極性，中性；纈氨酸：(val，v)非極性，中性；和組氨酸：(his，h)極性，正(10％)中性(90％)。所述“正”電荷氨基酸是：精氨酸：(arg，r)極性，正；和賴氨酸：(lys，k)極性，正。所述“負”電荷氨基酸是：天冬氨酸：(asp，d)極性，負；和谷氨酸：(glu，e)極性，負。相對于抗體序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為候選序列中與特定多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，在比對序列并引入間隙之后，如果需要，實現(xiàn)最大百分比序列同一性，并且不考慮任何保守替換作為序列同一性的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量比對的合適參數(shù)，包括在待比較的序列全長上實現(xiàn)最大比對所需的任何算法?？贵w變體特別理解為包含具有特定糖基化模式的同系物、類似物、片段、修飾或變體，例如由糖基化工程改造產(chǎn)生，它們是功能性的并且可以用作功能等同物，例如結(jié)合特定靶并且具有功能特性?？贵w或ch3抗體結(jié)構(gòu)域可以是糖基化的或非糖基化的。例如，本文所述的重組抗體可以在合適的哺乳動物細胞中表達，以允許由表達免疫球蛋白的宿主細胞確定的分子的特異性糖基化?？贵w結(jié)構(gòu)域(特別是恒定抗體結(jié)構(gòu)域(如ch3結(jié)構(gòu)域))的術(shù)語“β褶板”或“β折疊鏈”在本文中以下列方式理解?？贵w結(jié)構(gòu)域通常包括至少兩條由兩個或三個主鏈氫鍵橫向連接的β折疊鏈，形成大體扭曲的折疊片層。β折疊鏈是通常具有3至10個氨基酸長度的單一連續(xù)延伸的氨基酸，采用這種擴展構(gòu)象并涉及與至少一條其它鏈的主鏈氫鍵，使得它們形成β片層。在所述β褶板中，大多數(shù)β折疊鏈與其它鏈相鄰排列并形成與其鄰區(qū)的廣泛的氫鍵網(wǎng)，其中一條鏈的主鏈中的n-h基與相鄰鏈的主鏈中的c＝o基形成氫鍵。抗體恒定結(jié)構(gòu)域(如ch2或ch3結(jié)構(gòu)域)的結(jié)構(gòu)與可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似，其由通過環(huán)連接的β折疊鏈組成，其中一些含有短的α-螺旋區(qū)段。所述骨架大部分是剛性的，并且所述環(huán)比較靈活，從各種fc晶體結(jié)構(gòu)的b因子可以看出?？贵wch3結(jié)構(gòu)域通常具有形成β褶板(a-b-c-d-e-f-g)的七條β折疊鏈，其中所述β折疊鏈通過環(huán)連接，三個環(huán)位于ch3結(jié)構(gòu)域的n-端的頂部(a-b、c-d、e-f)，并且另外三個環(huán)位于ch3結(jié)構(gòu)域的n-端的頂部(b-c、d-e、f-g)。ch3結(jié)構(gòu)域的“環(huán)區(qū)”是指位于β折疊鏈區(qū)之間的蛋白質(zhì)部分(例如，每個ch3結(jié)構(gòu)域包括，從n至c-端取向的七個β折疊鏈a至g)。優(yōu)選地，通過連接涉及a、b和e鏈的結(jié)合表面來產(chǎn)生一對ch3結(jié)構(gòu)域(比如ch3het/ch3het二聚體)，這里也稱為第一ch3的β褶板，該第一ch3的β褶板與第二個ch3的β片層區(qū)連接以產(chǎn)生二聚體?！癱h3結(jié)構(gòu)域”在本文中具體理解為從抗體ch3結(jié)構(gòu)域獲得的多肽，例如來自抗體的fc片段。所述fc片段可以來自igg、iga、igd、ige或igm。具體地，本文所述的ch3結(jié)構(gòu)域可以包含人igg1抗體(標(biāo)識為seqid41)、人igg2抗體(標(biāo)識為seqid42)、人igg3抗體(標(biāo)識為seqid43)，或人igg4抗體(標(biāo)識為seqid44)，或人iga抗體(標(biāo)識為seqid45)，或人igm抗體(標(biāo)識為seqid46)，或人ige抗體(標(biāo)識為seqid47)，或人igd抗體(標(biāo)識為seqid48)，或它們的功能變體(例如具有一定的序列同一性)的氨基酸序列。在本文所述的一個實施方案中，所述ch3結(jié)構(gòu)域可以包括突變，例如可以具有由異源序列取代的一條或多條β折疊鏈的至少一部分，比如包含一個或多個點突變，例如凸起突變或凹孔突變。特異性凸起突變是一個或多個氨基酸取代，以通過引入一個或多個氨基酸來增加兩個結(jié)構(gòu)域之間的接觸表面，這些氨基酸提供了另外的β折疊鏈的結(jié)構(gòu)突起(protuberance)，例如一個或多個選自由t366y、t366w、t394w、f405a組成的組的ch3凸起突變。特異性隆突修飾表示抗體的ch3結(jié)構(gòu)域中的突變t366w(根據(jù)kabat的eu索引編號)。凸起突變特異性提供了匹配(同源(cognate))表面以結(jié)合另一個抗體結(jié)構(gòu)域，例如其被修飾以摻入凹孔突變。特異性凹孔突變是一個或多個氨基酸取代，以通過引入一個或多個氨基酸來增加兩個結(jié)構(gòu)域之間的接觸表面，所述氨基酸提供了另外的β折疊鏈結(jié)構(gòu)孔穴(cave)，例如一個或多個選自由t366s、l368a和y407v組成的組的ch3凹孔突變。特異性凹孔修飾表示抗體的ch3結(jié)構(gòu)域中的任何突變t366s、l368a、y407v、y407t(根據(jù)kabat的eu索引編號)。凹孔突變特異性提供了匹配(同源(cognate))表面以結(jié)合另一個抗體結(jié)構(gòu)域，例如其被修飾以摻入凸起突變。匹配的凸起嵌凹孔突變是，例如所述ch3區(qū)對的一個ch3結(jié)構(gòu)域上的t366y和第二個ch3結(jié)構(gòu)域上匹配的y407’t，這里稱為t366y/y407’t。其它匹配突變是t366y/y407’t，f405a/t394’w，t366y：f405a/t394‘w：y407’t，t366w/y407’a，和/或s354c：t366w/y349′c：t366′s：l368′a：y407′v.特異性ch3突變包含分子間β折疊鏈交換，例如其中ch3β折疊鏈中的一個或多個片段或序列突變以摻入與原始ch3結(jié)構(gòu)域不同的抗體結(jié)構(gòu)域(例如不同類型或亞型的抗體結(jié)構(gòu)域)的片段或序列。通過鏈交換獲得特異性突變體，其中igg型的ch3結(jié)構(gòu)域含有iga型的ch3結(jié)構(gòu)域的一個或多個片段或序列。如果使兩條鏈交換的ch3結(jié)構(gòu)域突變以形成同源對，則每個ch3結(jié)構(gòu)域的iga片段或序列產(chǎn)生同源的結(jié)構(gòu)域間接觸表面，使得所述突變的ch3結(jié)構(gòu)域優(yōu)先與野生型ch3結(jié)構(gòu)域相互配對。摻入片段交換的抗體結(jié)構(gòu)域的這種修飾的具體實施例可以是鏈交換的工程改造的結(jié)構(gòu)域(seed)。這種修飾可以用于通過優(yōu)先配對所述重鏈的seed修飾的ch3結(jié)構(gòu)域來產(chǎn)生不對稱和雙特異性免疫球蛋白，特別是雙特異性抗體。這是基于在保守的ch3結(jié)構(gòu)域內(nèi)交換結(jié)構(gòu)相關(guān)的免疫球蛋白序列。在所述seedch3結(jié)構(gòu)域中來自人iga和igg的交替序列產(chǎn)生稱為ag和ga的兩個不對稱但互補的結(jié)構(gòu)域。所述seed設(shè)計允許有效產(chǎn)生ag/ga異二聚體，然而不利于agseedch3結(jié)構(gòu)域和gaseedch3結(jié)構(gòu)域的同二聚化。特異性ch3突變包含摻入半胱氨酸殘基，所述半胱氨酸殘基能夠形成二硫鍵通過另外的結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵來穩(wěn)定抗體結(jié)構(gòu)域，或通過另外的結(jié)構(gòu)域間二硫鍵來穩(wěn)定一對抗體結(jié)構(gòu)域。二硫鍵通常由兩個半胱氨酸的巰基氧化形成，從而連接s原子以在兩個半胱氨酸殘基之間形成二硫鍵。具體地，可以在c-端區(qū)或ch3結(jié)構(gòu)域的c-端插入半胱氨酸(通過另外的氨基酸或氨基酸取代)?？梢酝ㄟ^在所述ch3對之間形成二硫鍵來穩(wěn)定具有另外半胱氨酸修飾的一對ch3，從而產(chǎn)生ch3/ch3二聚體。在一些實施方案中，二硫鍵連接的免疫球蛋白或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域包括同二聚體或異二聚體，因此包括相同或不同的結(jié)構(gòu)域?qū)?。為了允許所述免疫球蛋白鏈或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的正確配對，可以具體地使用任何ch3突變，例如可以使用凸起-嵌-凹孔技術(shù)、seed技術(shù)、電荷排斥技術(shù)、二硫鍵或交叉mab技術(shù)以減少不正確相關(guān)分子的量。一“對”抗體結(jié)構(gòu)域(例如一對ch3結(jié)構(gòu)域)理解為一組兩個抗體結(jié)構(gòu)域，其中一個具有在其表面或空腔中的區(qū)域，該區(qū)域與另一個的區(qū)域特異性結(jié)合并因此與其互補。免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，特別是抗體結(jié)構(gòu)域，可通過與β褶板區(qū)的接觸而締合形成一對免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。這種結(jié)構(gòu)域?qū)σ卜Q為二聚體，例如通過靜電作用、重組融合或共價連接相關(guān)聯(lián)，將兩個結(jié)構(gòu)域置于直接的物理聯(lián)系中，例如包含固體和液體形式。本文具體描述的是ch3/ch3二聚體，其可以是由相同的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)組成的一對ch3結(jié)構(gòu)域，例如相同的氨基酸序列，即“同二聚體”，或者是任意一級、二級和三級結(jié)構(gòu)不同的一對ch3結(jié)構(gòu)域，例如其任何β折疊鏈或環(huán)區(qū)的氨基酸序列不同?？梢援a(chǎn)生特異性異二聚體以形成ch3/ch3結(jié)構(gòu)域的同源對。關(guān)于一對結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域二聚體的術(shù)語“同源”理解為具有匹配結(jié)合點或結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域，以獲得每個結(jié)構(gòu)域上的接觸表面以優(yōu)先形成一對這樣結(jié)構(gòu)域。如果將所述ch3結(jié)構(gòu)域中的至少一個修飾為優(yōu)先結(jié)合其同源ch3結(jié)合配偶體以產(chǎn)生ch3/ch3對，則特異性ch3結(jié)構(gòu)域理解為“同源”或ch3/ch3結(jié)構(gòu)域的同源對。具體地，兩個ch3結(jié)構(gòu)域可以通過匹配突變來修飾，例如凸起-嵌-凹孔突變、seed突變，用于二硫鍵形成的附加半胱氨酸殘基或使用電荷排斥技術(shù)的修飾。關(guān)于摻入免疫球蛋白的抗體結(jié)構(gòu)域的術(shù)語“異源(heterologous)”，例如異源ch3結(jié)構(gòu)域(本文也稱為ch3het)理解為包括摻入抗體或抗體hc或lc的外源ch3結(jié)構(gòu)域。通過取代現(xiàn)有或天然存在的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(例如親本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的cl、ch1或ch2結(jié)構(gòu)域)在本文中理解為“結(jié)構(gòu)域交換的”免疫球蛋白?？梢赃M一步修飾這種結(jié)構(gòu)域交換的免疫球蛋白以產(chǎn)生功能性變體，例如片段、突變體或氨基酸延伸，例如結(jié)構(gòu)域添加。在分子部分(如氨基酸、氨基酸序列或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)的上下文中，術(shù)語“外源”是指新引入的部分，其可以是天然存在的，但外源于修飾位點或天然存在部分的(功能)變體，或者可以是天然存在的部分的替代物。關(guān)于ch3結(jié)構(gòu)域的“外源”意味著所述ch3結(jié)構(gòu)域具有不同的來源和/或相同的來源(例如相同的類型或亞型，和/或相同的物種)，但是其在免疫球蛋白分子中的位置不同。例如，將另外的相同物種和免疫球蛋白類型或亞型的ch3het置于除fc的c-端抗體結(jié)構(gòu)域之外的位置。置于抗體的fab部分中的任何ch3結(jié)構(gòu)域理解為ch3het。通常，這樣的fab將包含一對ch3het/ch3het，每個ch3het與可變結(jié)構(gòu)域n-端連接。hc中ch3het的具體實施例是c-端連接到任意其他抗體結(jié)構(gòu)域，例如恒定結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選選自由ch2、ch3和ch4組成的組。因此，可以產(chǎn)生摻入ch3het結(jié)構(gòu)域的新的hc和/或lc。具體地，可以產(chǎn)生新的hc/hc對和/或hc/lc對，其包括ch3het/ch3het對，優(yōu)選是ch3het/ch3het的同源對。本文具體描述了在本發(fā)明的抗體中使用的ch3het結(jié)構(gòu)域是非免疫性的結(jié)構(gòu)域。特別理解的是，這種非免疫性的ch3結(jié)構(gòu)域不包括所述環(huán)區(qū)中的抗原結(jié)合位點。ch3結(jié)構(gòu)域不會天然地包括任何cdr環(huán)區(qū)或抗原結(jié)合位點，因此野生型ch3結(jié)構(gòu)域理解為非免疫性結(jié)構(gòu)域。一些抗體工程改造技術(shù)使抗原結(jié)合位點摻入恒定結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)中，比如ch3結(jié)構(gòu)域。恒定結(jié)構(gòu)域的這種環(huán)區(qū)稱為“結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)”，其使用抗原與恒定結(jié)構(gòu)域的一個或多個環(huán)結(jié)合。和通過與結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)相互作用能夠結(jié)合抗原的這種“免疫”ch3結(jié)構(gòu)域相反，本文所用的ch3het結(jié)構(gòu)域是非免疫性結(jié)構(gòu)域，因此在所述結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)中不包括此類抗原結(jié)合位點。在抗體的fc部分(特別是結(jié)構(gòu)域交換的免疫球蛋白)的ch2-ch3以外的位置上包含ch3het的抗體，其具體包括新型的連接，至少新的n-端與另一個結(jié)構(gòu)域連接，從而在兩個結(jié)構(gòu)域的接口處提供新的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的接頭序列是天然接頭序列，從天然存在的結(jié)構(gòu)域連接序列獲得的末端序列，例如鉸鏈序列，或天然存在的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的天然連接結(jié)構(gòu)域，例如從天然連接到ch3het結(jié)構(gòu)域的n-端的抗體結(jié)構(gòu)域獲得的1-20個，或2-10個，或3-8個氨基酸長度的c-端氨基酸區(qū)，例如ch2結(jié)構(gòu)域的c-端區(qū)，可以用作連接到n-端或連接到ch3結(jié)構(gòu)域的接頭，該ch3結(jié)構(gòu)域的1-20個，或2-10個或3-8個氨基酸長度的n-端區(qū)缺失，以提供n-端縮短的ch3序列?；蛘?，功能合適的人工序列可以用作接頭。具體地，所述ch3het結(jié)構(gòu)域的n-端可以是天然n-端或n-端縮短或延伸的ch3序列的n-端，其與c-端縮短或延伸的第二結(jié)構(gòu)域的c-端連接。關(guān)于本文所述的抗體的術(shù)語“多價”是指具有至少兩個結(jié)合位點以結(jié)合相同的靶抗原的分子，特別是結(jié)合這些靶抗原的相同或不同的表位。該術(shù)語應(yīng)該包含二價抗體或具有2價或更高化學(xué)價的分子以結(jié)合所述靶抗原，例如通過至少2、3、4個或甚至更多的結(jié)合位點。例如，二價抗體可以通過兩對vh/vl結(jié)構(gòu)域具有兩個抗原結(jié)合位點，二者結(jié)合相同的靶抗原。關(guān)于本文所述抗體的術(shù)語“多特異性”是指具有至少兩個特異性結(jié)合至少兩種不同靶抗原的結(jié)合位點的分子。該術(shù)語應(yīng)該包含雙特異性抗體或具有2種或更多種特異性的分子以結(jié)合一種以上靶抗原，例如通過至少2、3、4個或甚至更多的結(jié)合位點。例如，雙特異性抗體可以通過一對vh/vl結(jié)構(gòu)域(fv區(qū))結(jié)合一個靶抗原，以及通過第二對vh/vl結(jié)構(gòu)域(fv區(qū))結(jié)合另一個靶抗原。根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語“抗原”或“靶”應(yīng)該特別包含能夠被抗體結(jié)合位點識別的所有抗原和靶分子。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的分子靶向的抗原是那些已經(jīng)被證明是具有或能夠具有免疫或治療相關(guān)性的那些抗原或分子，特別是那些已經(jīng)測試臨床療效的抗原或分子。本文所用的術(shù)語“靶”或“抗原”特別包括選自由(人或其它動物)腫瘤相關(guān)受體和可溶性腫瘤相關(guān)抗原組成的組的分子，其為自身抗原，如位于腫瘤細胞或細胞因子或生長因子的表面上的受體，其大量存在于癌癥患者的體循環(huán)中并與此類腫瘤相關(guān)。其它抗原可以是病原體來源，例如微生物病原體或病毒病原體。所述靶抗原被認為是整個靶分子或者被認為是這種分子的片段，特別是亞結(jié)構(gòu)，例如靶的多肽或碳水化合物結(jié)構(gòu)，通常稱為“表位”，例如免疫學(xué)相關(guān)的b細胞表位、t細胞表位，也可以被天然或單克隆抗體識別。根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語“表位”特別是指可以完全構(gòu)成特異性結(jié)合配偶體或作為本發(fā)明的免疫球蛋白結(jié)合位點的特異性結(jié)合配偶體的部分分子結(jié)構(gòu)。術(shù)語表位也可以指半抗原。在化學(xué)上，表位可以由碳水化合物、肽、脂肪酸、有機物質(zhì)、生物化學(xué)物質(zhì)或無機物質(zhì)或它們的衍生物及它們的任意組合組成。如果表位是多肽，則其通常在肽中包含至少3個氨基酸，優(yōu)選8至50個氨基酸，更優(yōu)選約10-20個氨基酸。所述肽的長度的上限沒有限制，其可以幾乎包括蛋白質(zhì)的多肽序列的全長。表位可以是線性表位或構(gòu)象表位。線性表位由多肽或碳水化合物鏈的一級序列的單個片段組成。線性表位可以是連續(xù)的或重疊的。構(gòu)象表位由通過折疊多肽來形成三級結(jié)構(gòu)而組合在一起的氨基酸或碳水化合物組成，并且氨基酸不一定以線性序列彼此相鄰。具體來，表位是診斷相關(guān)分子的至少一部分，即樣品中表位的不存在或存在與患者的疾病或健康狀況或制造中的處理狀態(tài)或環(huán)境和食物狀態(tài)是定性或定量相關(guān)的。表位也可以是治療相關(guān)分子的至少一部分，即可以由改變疾病進程的特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶向的分子。如本文所用，術(shù)語“特異性”或“特異性結(jié)合”是指結(jié)合反應(yīng)，其決定了對異源群體分子感興趣的同源配體。因此，在指定條件(例如免疫測定條件)下，所述免疫球蛋白結(jié)合其特定靶并且不以顯著量與樣品中存在的其它分子結(jié)合。所述特異性結(jié)合意味著是根據(jù)所選擇的靶標(biāo)同一性，高、中或低結(jié)合親和力或親合力進行有選擇性的結(jié)合。如果結(jié)合常數(shù)或結(jié)合動力學(xué)的差異至少是10倍，優(yōu)選至少是100倍，更優(yōu)選至少1000倍，則通?？梢詫崿F(xiàn)選擇性結(jié)合。本文所用的術(shù)語“可變結(jié)合區(qū)”也稱為“cdr區(qū)”，是指具有能夠與抗原結(jié)合反應(yīng)的不同結(jié)構(gòu)的分子。那些分子可以這樣使用或整合到較大的蛋白質(zhì)中，從而形成具有結(jié)合功能的這種蛋白質(zhì)的特異性區(qū)。所述變化的結(jié)構(gòu)可以來源于結(jié)合蛋白的天然庫，如來自免疫球蛋白或抗體。所述變化的結(jié)構(gòu)也可以通過隨機化技術(shù)產(chǎn)生，特別是本文所述的那些。這些包含誘變的cdr或非cdr區(qū)(例如恒定抗體結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū))，免疫球蛋白可變域或恒定域的環(huán)區(qū)，特別是免疫球蛋白的cdr環(huán)。通常，根據(jù)本發(fā)明所述的免疫球蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)由這樣的可變結(jié)合區(qū)形成。用于本發(fā)明目的的術(shù)語“細胞毒性”或“細胞毒活性”是指針對細胞抗原的任何特異性分子，當(dāng)與抗原結(jié)合時，其激活程序性細胞死亡并觸發(fā)細胞凋亡。特異性免疫球蛋白通過其對效應(yīng)子細胞的活性起作用，導(dǎo)致激活細胞毒性t細胞或介導(dǎo)抗體依賴性細胞毒性(adcc)、補體依賴性細胞毒性(cdc)和/或細胞吞噬作用(adcp)的細胞。特異性抗體通過細胞凋亡誘導(dǎo)程序性細胞死亡和/或通過結(jié)合介導(dǎo)adcc和/或cdc活性的效應(yīng)子細胞的fc受體而殺死抗體包被的靶細胞。本發(fā)明的抗體可以具有或可以不具有fc效應(yīng)子功能。fc可以通過形成免疫復(fù)合物結(jié)合表面抗原來恢復(fù)(recruit)補體并輔助除去靶抗原或靶細胞。特異性抗體可以缺乏活性fc部分或fc效應(yīng)子功能，因此，由不含抗體fc部分或不含fcγ受體結(jié)合位點的抗體結(jié)構(gòu)域組成，或者包含缺乏fc效應(yīng)子功能的抗體結(jié)構(gòu)域，例如通過修飾來降低fc效應(yīng)子功能，特別是消除或降低adcc和/或cdc活性?？梢怨こ谈脑焯娲贵w以引入修飾增加fc效應(yīng)子功能，特別是增強adcc和/或cdc活性。這樣的修飾可以通過誘變來實現(xiàn)，例如在fcγ受體結(jié)合位點的突變或通過衍生物或試劑干擾抗體形式的adcc和/或cdc活性，從而實現(xiàn)降低或增加fc效應(yīng)子功能。術(shù)語“抗原結(jié)合位點”或“結(jié)合位點”是指參與抗原結(jié)合的抗體部分。所述抗原結(jié)合位點由所述重(“h”)和/或輕(“l(fā)”)鏈或其可變結(jié)構(gòu)域的n-端可變(“v”)區(qū)的氨基酸殘基形成。稱為“高變區(qū)”的重鏈和輕鏈的v區(qū)內(nèi)的三個高度不同的延伸插入到稱為骨架區(qū)的更保守的側(cè)翼段之間。所述抗原結(jié)合位點提供與結(jié)合的表位或抗原的三維表面互補的表面，并且所述高變區(qū)被稱為“互補決定區(qū)”或“cdr”。摻入在所述cdr中的結(jié)合位點也稱為“cdr結(jié)合位點”。術(shù)語“表達”以下列方式理解。含有表達產(chǎn)物(例如本文所述的抗體)的所需編碼序列以及控制序列(例如可操作連接的啟動子)的核酸分子可用于表達目的。用這些序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主能夠產(chǎn)生所述編碼蛋白質(zhì)。為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)化，所述表達系統(tǒng)可以包含在載體中；但是，相關(guān)dna也可以整合到宿主染色體中。具體地，所述術(shù)語是指在合適的條件下的宿主細胞和相容載體，例如用于由載體攜帶的外源dna編碼的蛋白質(zhì)的表達并引入到所述宿主細胞。編碼dna是編碼特定多肽或蛋白質(zhì)(例如抗體)的特定氨基酸序列的dna序列。啟動子dna是啟動、調(diào)節(jié)或以其它方式介導(dǎo)或控制所述編碼dna表達的dna序列。啟動子dna和編碼dna可以來自相同的基因或來自不同的基因，并且可以來自相同或不同的生物體。重組克隆載體通常包含一個或多個用于克隆或表達的復(fù)制系統(tǒng)，一種或多種用于在宿主中選擇的標(biāo)記，例如抗生素抗性和一種或多種表達盒。本文使用的“載體”定義為克隆重組核苷酸序列(即重組基因)的轉(zhuǎn)錄以及它們的mrna在合適的宿主生物體中的翻譯所需的dna序列?！氨磉_盒”是指編碼表達產(chǎn)物的dna編碼序列或dna片段，其可以在限定的限制性位點插入載體。將所述盒限制性位點設(shè)計成確保盒插入正確的讀碼框中。通常，將外源dna插入到載體dna的一個或多個限制性位點，然后由載體和可傳遞的載體dna一起攜帶到宿主細胞中。具有插入或添加的dna的片段或序列(比如表達載體)也可稱為“dna構(gòu)建體”。表達載體包括表達盒，另外通常包括宿主細胞或基因組整合位點中自主復(fù)制的起源，一個或多個可選擇標(biāo)記(例如氨基酸合成基因或賦予抗生素抗性的基因如博萊霉素(zeocin)、卡那霉素、g418或潮霉素)、多個限制酶切割位點、合適的啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止子，這些組分可操作地連接在一起。本文所用的術(shù)語“載體”包含自主復(fù)制的核苷酸序列以及整合核苷酸序列的基因組。常見類型的載體是“質(zhì)?！保渫ǔＪ请p鏈dna的獨立分子，其可以容易地接受額外的(外源)dna，并且其可以容易地引入到合適的宿主細胞中。質(zhì)粒載體通常含有編碼dna和啟動子dna，并具有一個或多個適合插入外源dna的限制性位點。具體地，術(shù)語“載體”或“質(zhì)粒”是指可以將dna或rna序列(例如外源基因)引入到宿主細胞的媒介，以便轉(zhuǎn)化所述宿主并促進所引入序列的表達(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯)。本文所用的術(shù)語“宿主細胞”是指轉(zhuǎn)化成產(chǎn)生特定重組蛋白的主體細胞，比如本文所述的抗體及其任何子代。應(yīng)當(dāng)理解，并非所有子代與親本細胞完全相同(由于有意或無意的突變或環(huán)境差異)，但是，這些術(shù)語包括這些改變的子代，只要所述子代與原始轉(zhuǎn)化細胞保持相同的功能。術(shù)語“宿主細胞系”是指用于表達重組基因以產(chǎn)生重組多肽(比如重組抗體)的宿主細胞的細胞系。本文所用的術(shù)語“細胞系”是指建立的特定細胞類型的克隆，其已經(jīng)獲得在長時間內(nèi)增殖的能力?？梢詫⑦@種宿主細胞或宿主細胞系可以保持在細胞培養(yǎng)中和/或培養(yǎng)中以產(chǎn)生重組多肽。本文關(guān)于核酸、抗體或其它化合物使用的術(shù)語“分離的”或“分離”是指已經(jīng)與其自然相關(guān)的環(huán)境充分分離的化合物，以便以“基本上純”的形式存在。“分離”并不一定意味著排除含有其它化合物或材料的人造或合成混合物，或者存在不干擾基本活性的雜質(zhì)，以及例如由于不完全的純化而存在所述雜質(zhì)。特別地，本發(fā)明的分離的核酸分子也意味著包含那些化學(xué)合成的物質(zhì)。關(guān)于本發(fā)明的核酸，有時使用術(shù)語“分離的核酸”。這個術(shù)語當(dāng)應(yīng)用于dna時，是指與其起源的生物體的天然存在的基因組中與其緊鄰的序列分離的dna分子。例如，“分離的核酸”可以包括插入到載體中的dna分子，比如質(zhì)?；虿《据d體，或整合到原核或真核細胞或宿主生物體的基因組dna中。當(dāng)應(yīng)用于rna時，術(shù)語“分離的核酸”主要指由如上定義的分離的dna分子編碼的rna分子。或者，該術(shù)語可以指已經(jīng)與在其天然狀態(tài)(即，在細胞或組織中)中與其相關(guān)聯(lián)的其它核酸充分分離的rna分子。“分離的核酸”(dna或rna)可以進一步代表通過生物或合成方法直接產(chǎn)生的分子，并且在其產(chǎn)生過程中與其它組分分離。關(guān)于多肽或蛋白質(zhì)，比如分離的免疫球蛋白，術(shù)語“分離的”應(yīng)具體指不含或基本上不含與其天然相關(guān)的材料的化合物，比如在它們的天然環(huán)境中或者在體外或體內(nèi)通過重組dna技術(shù)進行制備它們的環(huán)境(例如細胞培養(yǎng))中發(fā)現(xiàn)的其它化合物。分離的化合物可以用稀釋劑或助劑配制，并且仍然為實際目的而分離，例如，當(dāng)用于診斷或治療時，所述多肽或多核苷酸可與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合。本文所用術(shù)語“重組體”是指“由基因工程制備或其結(jié)果”?；蛘?，使用術(shù)語“工程改造”。例如，可以通過工程改造相應(yīng)的親本序列修飾已修飾的免疫球蛋白或免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以產(chǎn)生變體來產(chǎn)生工程改造的免疫球蛋白或結(jié)構(gòu)域。重組宿主特異性地包括表達載體或克隆載體，或者已被基因工程化以含有重組核酸序列，特別是使用與宿主外源的核苷酸序列。通過在宿主中表達相應(yīng)的重組核酸來產(chǎn)生重組蛋白。如本文所用的術(shù)語“重組抗體”包含免疫球蛋白，以及特別是通過重組手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體，比如(a)從動物(例如小鼠)分離的抗體，其是人免疫球蛋白基因或由其制備的雜交瘤的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體，(b)從轉(zhuǎn)化以表達抗體的宿主細胞中分離的抗體，例如來自轉(zhuǎn)染瘤的抗體，(c)從重組體、組合人抗體文庫中分離的抗體，和(d)通過涉及將人免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列的任何其它方式制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這種重組抗體包括工程改造以包含例如在抗體成熟過程中發(fā)生的重排和突變的抗體。一旦鑒定了具有所需結(jié)構(gòu)的抗體，則可以通過本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生此類抗體，例如包括雜交瘤技術(shù)或重組dna技術(shù)。在雜交瘤方法中，小鼠或其它合適的宿主動物(比如倉鼠)被免疫以產(chǎn)生淋巴細胞，所述淋巴細胞產(chǎn)生或能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)的抗體?；蛘?，淋巴細胞可以在體外免疫。然后使用合適的融合劑(如聚乙二醇)將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合以形成雜交瘤細胞。測定雜交瘤細胞生長的培養(yǎng)基，用于產(chǎn)生針對抗原的單克隆抗體。優(yōu)選地，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，例如放射免疫測定(ria)或酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)測定由雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性。例如，重組單克隆抗體可以通過使用已知的重組表達載體(例如本發(fā)明的質(zhì)粒或包括編碼所述抗體序列的核苷酸序列的表達盒)分離編碼所需抗體鏈的dna并利用用于表達的編碼序列轉(zhuǎn)染重組宿主細胞來產(chǎn)生。重組宿主細胞可以是原核細胞和真核細胞，比如上述所述的那些。根據(jù)具體方面，所述核苷酸序列可以用于基因操作來人源化抗體或提高抗體的親和力或其它特性。例如，如果所述抗體用于人類的臨床試驗和治療，則恒定區(qū)可以工程改造成更接近類似于人類恒定區(qū)以避免免疫應(yīng)答。需要基因操作所述抗體序列以獲得對靶抗原更大的親和力。可以對所述抗體進行一個或多個多核苷酸改變，并且仍然保持其與靶抗原的結(jié)合能力對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。通過各種手段產(chǎn)生抗體分子通常是很好理解的。例如，美國專利6331415(cabilly等)描述了重組產(chǎn)生抗體的方法，其中來自單個載體或單個細胞中的兩個單獨載體的重鏈和輕鏈同時表達。wibbenmeyer等人(1999，biochimbiophysacta1430(2)：191-202)和lee和kwak(2003，j.biotechnology101：189-198)描述了使用在大腸桿菌的分離培養(yǎng)物中表達的質(zhì)粒，從分別產(chǎn)生重鏈和輕鏈中的單克隆抗體的產(chǎn)生。例如，harlow等人(antibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,(1988))提供了與生產(chǎn)抗體相關(guān)的各種其它技術(shù)。使用由培養(yǎng)中的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的任何方法生產(chǎn)單克隆抗體。用于制備單克隆抗體的合適方法的實施例包含kohler等人的雜交瘤方法(1975，nature256：495-497)和人b細胞雜交瘤方法(kozbor，1984，j.immunol133：3001；和brodeuretal.1987，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications，(marceldekker,inc.,newyork),pp.51-63)。本文所述的抗體可用于施用以治療有需要的受試者。本文所用的術(shù)語“受試者”是指溫血哺乳動物，特別是人類或非人類動物。因此，術(shù)語“受試者”也可以特別指包含狗、貓、兔、馬、牛、豬和家禽的動物。特別地，本發(fā)明的抗體提供用于醫(yī)療用途以治療需要預(yù)防或治療疾病狀況的受試者或患者。術(shù)語“患者”包含接受預(yù)防性治療或治療性治療的人和其它哺乳動物受試者。因此，術(shù)語“治療”意在包含預(yù)防性治療和治療性治療。具體地，本發(fā)明的抗體以基本上純的形式提供。本文所用的術(shù)語“基本上純”或“純的”是指包括至少50％(w/w)，優(yōu)選至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物的制劑，例如核酸分子或抗體。通過適合該化合物的方法測量純度(例如色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳、hplc分析等)。本文所用的術(shù)語“治療有效量”與化合物的術(shù)語“有效量”或“足夠量”可互換使用，例如本發(fā)明的免疫球蛋白是當(dāng)對受試者施用有益的或期望的結(jié)果(包括臨床結(jié)果)時足夠的量或活性，因此有效量或其同義詞取決于其應(yīng)用的上下文。有效量意指足以治療、預(yù)防或抑制這種疾病或病癥的化合物的量。在疾病的情況下，本文所述的免疫球蛋白的治療有效量特別用于治療、調(diào)節(jié)、減弱、逆轉(zhuǎn)或影響疾病或病癥，其從所述抗體與其靶抗原的相互作用中受益。對應(yīng)于這種有效量的化合物的量將根據(jù)各種因素而變化，比如給定的藥物或化合物、藥物制劑、施用途徑、疾病或病癥的類型、被治療的受試者或宿主的特性等，但是可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)地確定。本發(fā)明的抗體可以特定地用于藥物組合物中。因此，提供了包括本文所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。這些藥物組合物可以根據(jù)本發(fā)明作為推注或輸注或通過連續(xù)輸注給藥。適于促進這種給藥方式的藥物載體是本領(lǐng)域公知的。藥學(xué)上可接受的載體通常包括與本發(fā)明提供的抗體生理上相容的任何以及所有合適的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、等滲劑和吸收延遲劑等。藥學(xué)上可接受的載體的其它實施例包括無菌水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、右旋糖(dextrose)、甘油、乙醇等，以及它們的任何組合。在這樣一個方面，抗體可以與一種或多種適合于所需給藥途徑的載體組合，抗體可以是例如與乳糖、蔗糖、淀粉、鏈烷酸的纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、阿拉伯膠(acacia)、明膠、海藻酸鈉、聚維酮(polyvinylpyrrolidine)、聚乙烯醇和任選地進一步壓片或包封用于常規(guī)給藥?？蛇x地，免疫球蛋白可溶于鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纖維素膠體溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黃蓍膠和/或各種緩沖液中。其它載體、助劑和給藥方式在制藥領(lǐng)域是眾所周知的。載體可以包括受控釋放材料或時間延遲材料，比如單獨的或具有蠟的單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，或本領(lǐng)域已知的其它材料。本領(lǐng)域已知的其他藥學(xué)上可接受的載體，例如在remington'spharmaceuticalsciences中描述。液體制劑可以是溶液、乳劑或懸浮液，并且可以包含賦形劑，例如懸浮劑、增溶劑、表面活性劑、防腐劑和螯合劑。藥物組合物，其中按本發(fā)明的抗體和一種或多種治療活性劑配制。通過將具有所需純度的所述抗體與可選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合以制備本發(fā)明的抗體穩(wěn)定制劑，以凍干制劑或水溶液的形式儲存。用于體內(nèi)給藥的制劑是特異性無菌的，優(yōu)選以無菌水溶液的形式。這很容易通過無菌過濾膜或其它方法過濾實現(xiàn)。本文公開的免疫球蛋白和其它治療活性劑也可以配制成免疫脂質(zhì)體，和/或包埋在微膠囊中。包含本發(fā)明抗體的所述藥物組合物的給藥可以以多種方式進行，包括口服給藥、皮下給藥、靜脈內(nèi)給藥、鼻內(nèi)給藥、口腔內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、粘膜給藥、局部給藥(例如凝膠、藥膏、乳液、乳膏等)，腹腔內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、肺內(nèi)給藥、陰道給藥、腸道外給藥、直腸給藥或眼內(nèi)給藥。用于腸道外給藥的示例性制劑包括那些適合于皮下注射、肌肉注射或靜脈注射，例如無菌溶液、乳液或懸浮液。本發(fā)明特別提供了在本文提供的實施例中詳述的示例性抗體。其它抗體變體是可行的，例如包括示例性免疫球蛋白的功能變體，例如其中進一步工程改造fc以改善分子的結(jié)構(gòu)和功能，或者其中產(chǎn)生的包括不同cdr結(jié)合位點或具有不同特異性的抗體，特別是其中獲得兩個不同的fv區(qū)。參考以下實施例將更充分地理解上述描述。但是，這些實施例僅代表實施本發(fā)明的一個或多個實施例的方法，并且不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例1：ch3結(jié)構(gòu)域交換的抗體的構(gòu)建、表達、純化和表征可以使用野生型ch3結(jié)構(gòu)域或各種工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域來取代所述抗體的結(jié)構(gòu)域交換的fab臂中的ch1和/或cl結(jié)構(gòu)域以形成ch3結(jié)構(gòu)域交換的抗體，然后組裝成多種構(gòu)型，如圖1部分所示。在實施例1中，編碼具有以下氨基酸特征的三種不同結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體的輕鏈和重鏈生成合成的dna：結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體1：fab臂1和相應(yīng)的工程改造的輕鏈和重鏈：將完整抗體的一個fab臂中的ch1和cl結(jié)構(gòu)域用ch3結(jié)構(gòu)域替換以產(chǎn)生vl(1)-ch3_凹孔(y407t)輕鏈(seqid1)和vh(1)-ch3_凸起(t366y)-ch2-ch3ag重鏈(seqid2)。所述vl(1)和vh(1)結(jié)構(gòu)域共同形成egfr特異性抗體hu425(馬妥珠單抗(matuzumab))1的fv。通過cκ序列rtva的4個氨基酸殘基(seqid49，r是人κ鏈的殘基108(kabateu編號))形成所述vl(1)-ch3鏈中的vl(1)結(jié)構(gòu)域到ch3結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)變，緊接著是以屬于ch3結(jié)構(gòu)域的a鏈的epqv開始的氨基酸序列(seqid50，e是人igg1重鏈的殘基345(kabateu編號))。所述ch3結(jié)構(gòu)域序列以qkslsls(seqid51，q為人igg1重鏈的殘基438(kabateu編號))終止，接著是殘基gec(代表cκ鏈的c-端殘基212-214(kabateu編號))。在vh(1)-ch3-ch2-ch3鏈中從所述vh(1)結(jié)構(gòu)域到ch3結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)變使得j區(qū)(以氨基酸序列vtvss(seqid52結(jié)束，第一個v為人vh區(qū)的殘基109)，其后是屬于人ch1結(jié)構(gòu)域的5個殘基astkg(seqid53，a是人igg1重鏈的殘基118(kabateu編號))，緊接其后是以屬于ch3結(jié)構(gòu)域的a鏈的epqv開始的氨基酸序列(seqid50，e是人igg1重鏈的殘基345(kabateu編號))。所述ch3結(jié)構(gòu)域序列以qkslsls(seqid51，q為人igg1重鏈的殘基438(kabateu編號))結(jié)束，接著是代表一部分人重鏈鉸鏈區(qū)的殘基ksc(k為人igg1重鏈的殘基218鏈(kabateu編號))。工程改造vl(1)-ch3鏈的ch3結(jié)構(gòu)域，以優(yōu)先產(chǎn)生vh(1)-ch3-ch2-ch3鏈的c-端的vh(1)結(jié)構(gòu)域的ch3結(jié)構(gòu)域的同源對，具體地，根據(jù)ridgway等1996，其含有“凹孔”突變y407t(kabateu編號)，因此該鏈更是完全命名為vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)。將vh(1)-ch3-ch2-ch3鏈中的vh(1)結(jié)構(gòu)域的c-端的ch3結(jié)構(gòu)域工程改造為優(yōu)先產(chǎn)生vl(1)-ch3鏈的ch3結(jié)構(gòu)域的同源對，具體地，根據(jù)ridgway等1996，其含有“凸起”突變t366y(kabateu編號)。工程改造的該抗體的vh(1)-ch3-ch2-ch3重鏈的c-端ch3結(jié)構(gòu)域，以優(yōu)先產(chǎn)生抗體的第二重鏈的c-端ch3結(jié)構(gòu)域的同源對。根據(jù)davis等，2010，該ch3結(jié)構(gòu)域的具體工程改造是“ag”ch3結(jié)構(gòu)域，因此，該鏈更是完全命名為vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ag(seqid2)。所得到的雙特異性抗體1(bsab1)識別兩個靶cd3×egfr，其特征在于以下重鏈和輕鏈：h1(seqid2)、h2(seqid4)、l1(seqid1)和l2(seqid3)。fab臂2和工程改造的重鏈異二聚體抗體的后半部分由以下鏈形成：輕鏈(seqid3)編碼cd3特異性抗體okt3(vl2)的vl序列，并由編碼vl(2)-cl結(jié)構(gòu)域的序列組成。重鏈(seqid4)編碼cd3特異性抗體okt3(vh2)的vh序列，并由編碼vh(2)-ch1-ch2-ch3ga結(jié)構(gòu)域的序列組成。工程改造該vh(2)-ch1-ch2-ch3ga鏈的c-端ch3結(jié)構(gòu)域以優(yōu)先產(chǎn)生所述抗體的第一重鏈(vh(1)-ch3-ch2-ch3ag)的c-端ch3結(jié)構(gòu)域的同源對。根據(jù)davis等，2010，該ch3結(jié)構(gòu)域的具體工程改造是“ga”ch3結(jié)構(gòu)域，因此該鏈命名為vh(2-ch1-ch2-ch3ga(seqid4)。結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體2將該抗體工程改造為類似于所述結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體1中的fab臂。但是，在結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體2中，將okt3fab臂與含有c-端ch3ag結(jié)構(gòu)域(vh(2)-ch1-ch2-ch3ag(seqid5))的重鏈融合，而所述結(jié)構(gòu)域交換的工程改造的hu425fab臂與含有c-端ch3ga結(jié)構(gòu)域(vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ga(seqid6))的重鏈融合。結(jié)果，這種雙特異性抗體識別靶cd3×egfr，其特征在于以下重鏈和輕鏈：h1(seqid6)、h2(seqid5)、l1(seqid1)和l2(seqid3)。結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體3將該抗體工程改造為類似于所述結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體2中的fab臂。在所述結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體3中，將okt3fab臂融合至含有c-端ch3ag結(jié)構(gòu)域的重鏈，并將所述結(jié)構(gòu)域交換的工程改造的hu425fab臂與含有c-端ch3ga結(jié)構(gòu)域的重鏈融合。但是，在結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體3中，野生型(wt)ch3結(jié)構(gòu)域c-端交換在工程改造的hu425fab臂中的vl1和vh1，而不是用在結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體1和2中配對的同源“凸起”和“凹孔”工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體3使用hu425fab臂的序列vl(1)-ch3wt(seqid7)和vh(1)-ch3wt-ch2-ch3ga(seqid8)。結(jié)果，這種雙特異性抗體識別靶cd3×egfr，其特征在于以下重鏈和輕鏈：h1(seqid8)、h2(seqid5)、l1(seqid7)和l2(seqid3)。編碼所述抗體鏈的合成dna側(cè)接有用于克隆到ptt5哺乳動物表達載體中的限制酶的序列。實施例2：用于表達人ig樣雙特異性抗體的載體構(gòu)建在下表中指定的基因序列的特定組合之后，通過在一個細胞內(nèi)表達四種不同基因的組合來產(chǎn)生實施例1中所述的三種人結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體。通過seqid1、2、3和4的共表達產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體1。通過seqid1、3、5和6的共表達產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體2。通過seqid3、5、7和8的共表達產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體3。為了表達這些序列，構(gòu)建了基于表達載體的八種不同的哺乳動物ptt5(shi等，2005)，每個載體含有以下編碼的基因之一：seqid1：vl(1)-ch3_hole(y407t)seqid2：vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3agseqid3：vl(2)-clseqid4：vh(2)-ch1-ch2-ch3gaseqid5：vh(2)-ch1-ch2-ch3agseqid6：vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3gaseqid7：vl(1)-ch3wtseqid8：vh(1)-ch3wt-ch2-ch3ga對于vl1和vh1，使用抗egfr抗體馬妥珠單抗(hu425)的可變結(jié)構(gòu)域(kim，2004)。對于vl2和vh2，使用抗cd3抗體okt3的可變結(jié)構(gòu)域(vanwauwe等，1980)。圖1a示意性地示出了使用ag和ga版本的ch3結(jié)構(gòu)域，利用鏈交換工程改造的結(jié)構(gòu)域(seed)ch3異二聚體技術(shù)實現(xiàn)兩種不同重鏈的異二聚化的幾種可能的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)(參見davis等，2010，和專利us20070287170a1)。圖1a-1具體示出了實施例1的結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體1的結(jié)構(gòu)。實施例3：雙特異性抗體的表達和表征根據(jù)標(biāo)準技術(shù)，實施例1和2中描述的結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體抗體1、2和3在哺乳動物細胞中以小規(guī)模表達。通過蛋白a親和層析純化所得蛋白質(zhì)，并通過非還原性sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)和分析尺寸排阻色譜法(sec)進行表征(圖2)。非還原性凝膠主要表現(xiàn)出具有對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域交換的抗體1和2的預(yù)期大小的分子量的單帶(圖2a)。對于所述結(jié)構(gòu)域交換的抗體3，sds-page顯示預(yù)期大小的條帶，并顯示對應(yīng)于較高分子量蛋白質(zhì)復(fù)合物的另外的帶(圖2a)。這些純化的蛋白質(zhì)進一步由分析性sec表征，其顯示在結(jié)構(gòu)域交換的抗體1、2和3的約7.5分鐘(和標(biāo)準igg抗體的預(yù)期洗脫時間相似)之后從sec柱洗脫的主峰，具有結(jié)構(gòu)域交換的抗體1和2的其它蛋白質(zhì)物種的輕微污染(圖2b和2c)和抗體3額外的峰(圖2d)。因此，使用結(jié)構(gòu)域交換的fab臂產(chǎn)生所述雙特異性抗體預(yù)期大小的蛋白質(zhì)。接下來，我們用結(jié)構(gòu)域交換的fab臂形成的各種雙特異性抗體進行廣泛的生物化學(xué)和功能表征與測試。實施例4：結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體1的大規(guī)模表達和表征結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體1和2具有相似的生物物理特性，例如相似的非還原性sds-page模式和sec譜。結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體1的表達產(chǎn)生更高的表達水平，并被選擇用于進一步表征。根據(jù)標(biāo)準技術(shù)，在哺乳動物細胞中，通過大規(guī)模共表達seqid1、2、3和4基因(300ml培養(yǎng)基)，表達結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體1。通過蛋白a親和層析純化得到的蛋白質(zhì)，該特異性結(jié)構(gòu)域交換的異二聚體雙特異性抗體的這一點將被稱為bsab1，從前面的實施例可以理解，這是由seqid1、2、3和4共表達組成的結(jié)構(gòu)域交換的抗體。通過非還原和還原sds-page以及分析性sec表征純化的bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)(圖3)。非還原的sds-page主要顯示具有對應(yīng)于bsab1的預(yù)期大小的分子量的單帶。當(dāng)樣品在sds-page之前被還原時，譜圖顯示標(biāo)記為對應(yīng)于vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ag(seqid2)的h1帶，對應(yīng)于vh(2)-ch1-ch2-ch3ga(seqid4)的h2帶和對應(yīng)于vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)和vl(2)-cl(seqid3)的l1+l2帶的帶(圖3a)。此外，由分析性sec表征的純化蛋白質(zhì)顯示出在約7.5分鐘后從柱洗脫>90％的主峰，其與標(biāo)準igg抗體的洗脫相當(dāng)(圖3b)。實施例5：雙特異性結(jié)合測定為了測試bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)與兩種抗原cd3和egfr的同時結(jié)合，首先用bsab1或?qū)φ针p特異性抗cd3抗egfr抗體沾染cd3+jurkat細胞，然后與egfr進行孵育步驟。用異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗egfr檢測抗體檢測雙特異性結(jié)合，并通過流式細胞術(shù)分析(圖4)。實施例6：產(chǎn)生和表征所述fab臂中含有ch3結(jié)構(gòu)域的單臂抗體通過三種不同基因的共表達產(chǎn)生含有ch3結(jié)構(gòu)域交換的(kih同源對)或未工程改造的fab區(qū)的單臂抗體。圖5示意性地示出了所述單臂抗體(未工程改造的和結(jié)構(gòu)域交換的)的結(jié)構(gòu)。如前所述構(gòu)建不同的基于哺乳動物ptt5的表達載體，其含有編碼每條抗體鏈的基因。通過在一個細胞內(nèi)seqid1、seqid2和seqid9(hufc_gaseed)中給出的編碼氨基酸序列的三種不同基因的共表達來產(chǎn)生人結(jié)構(gòu)域交換的單臂抗體。通過seqid9、seqid10(vl(1)-cl)和seqid11(vh(1)-ch1-ch2-ch3ag)中給出的編碼氨基酸序列的三種不同基因的共表達來產(chǎn)生未工程改造的單臂抗體。對于vl1和vh1，使用抗egfr抗體馬妥珠單抗(hu425)的可變結(jié)構(gòu)域(kim，2004)。所得的單臂抗體識別egfr，并且具體特征在于以下輕鏈和重鏈。結(jié)構(gòu)域交換的單臂抗egfr：h1(seqid2)、h2(seqid9)和l1(seqid1)。未工程改造的單臂抗egfr：h1(seqid11)、h2(seqid9)和l1(seqid10)。兩種抗體均按照標(biāo)準技術(shù)在哺乳動物細胞中表達。通過蛋白a親和層析純化所得蛋白質(zhì)，并通過非還原和還原sds-page和分析性sec進行表征(圖6)。非還原凝膠主要表現(xiàn)出對應(yīng)于所述單臂抗體的分子量的單帶。當(dāng)樣品在sds-page之前還原時，單臂抗體(ch1/cl)的譜圖顯示對應(yīng)于vh(1)-ch1-ch2-ch3ag(seqid11)的h1帶，對應(yīng)于hufc_gaseed的h2帶(seqid9)和對應(yīng)于vl(1)-cl(seqid10)的l1帶(圖6a)。結(jié)構(gòu)域交換的抗體的還原圖譜顯示對應(yīng)于vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ag(seqid2)的h1條帶，對應(yīng)于hufc_gaseed(seqid9)的h2帶和對應(yīng)于vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)的l1帶(圖6a)。當(dāng)純化的蛋白質(zhì)通過分析性sec表征時，在約8分鐘后從柱洗脫，它們都顯示主峰>90％(圖6b)。實施例7：通過流式細胞術(shù)單價結(jié)合egfr陽性細胞測試使用所述ch3結(jié)構(gòu)域交換的抗egfrfab結(jié)構(gòu)域的單臂抗體的靶結(jié)合，并與具有未工程改造的抗egfrfab(ch1/cl)的單臂抗體進行比較(參見實施例6)。另外，測試bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)的egfr靶結(jié)合。通過流式細胞術(shù)測量抗體與egfr表達的a431細胞的結(jié)合(圖7)。通過與藻紅蛋白結(jié)合的抗人fcf(ab)2第二抗體檢測與細胞結(jié)合的抗體，并使用流式細胞術(shù)分析細胞。使用程序graphpadprism從結(jié)合曲線計算細胞結(jié)合的半最大有效濃度(ec50)。單臂ch3結(jié)構(gòu)域交換的抗egfr抗體和bsab1抗體顯示與egfr陽性細胞的劑量依賴性結(jié)合，具有與對照抗體(未工程改造的fab單臂抗egfr)相似的結(jié)合特性(圖7)。所述單臂抗體的ec50在5-8nm的范圍內(nèi)。bsab1結(jié)合egfr陽性細胞的ec50為約7nm，這與對照抗體相當(dāng)(圖7)。這些結(jié)果表明，通過工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域替代ch1/cl并沒有改變相應(yīng)fab片段的抗原結(jié)合。實施例8：結(jié)構(gòu)域交換雙特異性抗體2“bsab2”(抗cd16×抗egfr)的構(gòu)建、表達、純化和表征將前面實施例中所述的和用于bsab1中的ch3結(jié)構(gòu)域交換的抗egfrfab與鼠抗cd16抗體3g8(fleit等，1982)結(jié)合以產(chǎn)生從該點命名為bsab2的新的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體(抗cd16×抗egfrch3-kih)。構(gòu)建了另外兩種基于哺乳動物ptt5的表達載體，每個載體含有以下編碼基因之一：seqid12：vl(3)-clseqid13：vh(3)-ch1-ch2-ch3ga對于vl(3)和vh(3)，使用抗cd16抗體3g8的可變結(jié)構(gòu)域(fleit等，1982)。所得到的bsab2識別出靶cd16×egfr，其具體特征在于以下重鏈和輕鏈：h1(seqid2)、h2(seqid13)、l1(seqid1)和l2(seqid12)。通過在一個細胞內(nèi)seqid1、seqid2、seqid12和seqid13中給出的氨基酸序列編碼的四種不同基因的表達來產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab2(抗cd16×抗egfrch3-kih)。通過bsab1所述的seed技術(shù)實現(xiàn)了兩種不同重鏈的異二聚化。bsab2依照標(biāo)準技術(shù)在哺乳動物細胞中表達。通過蛋白a純化而純化所得到的蛋白質(zhì)，并且在單步蛋白a純化后顯示與bsab1所示的預(yù)期大小和純度相似的均勻性。通過質(zhì)譜法來準備對bsab1和bsab2的正確組裝進行明確的生物化學(xué)驗證(參見下一節(jié)中的實施例9)，在第二純化步驟中使用制備型sec進一步純化bsab1和bsab2。作為該制備型sec純化步驟后蛋白質(zhì)純度的一個實施例，由制備型sec第二次純化后的bsab2蛋白質(zhì)通過非還原和還原sds-page和分析型sec進行表征(圖8)。非還原性凝膠主要顯示具有對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域交換的bsab2的分子量的單一帶。當(dāng)樣品在sds-page之前被還原時，譜圖顯示對應(yīng)于vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2-ch3ag(seqid2)的h1帶，對應(yīng)于vh(3)-ch1-ch2-ch3ga(seqid13)的h2帶，對應(yīng)于vl(3)-cl(seqid12)的l2帶和對應(yīng)于vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)的l1帶(圖8a)。該純化的蛋白質(zhì)通過分析性sec進一步表征，并且在約7.5分鐘后從柱洗脫顯示>90％的主峰，與結(jié)構(gòu)域交換的bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)以及標(biāo)準igg抗體的洗脫時間相似(圖8b)。實施例9：通過質(zhì)譜驗證正確的組裝直接法分析結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體為了證實在所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體中的正確鏈配對，通過液相色譜-質(zhì)譜(lc-ms)分析測量純化的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)和bsab2(抗cd16×抗egfrch3-kih)。在ms分析之前，樣品通過pngasef去糖基化。如圖9和10所示，分別檢測結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1和bsab2的148.284kda和148.050kda的單峰。這些檢測到的質(zhì)量對應(yīng)于四種不同抗體鏈的總和。在這些鏈的組裝期間，由于二硫鍵的形成、c-端賴氨酸的裂解和n-端焦谷氨酸的形成，會發(fā)生額外的質(zhì)量損失。考慮到約322kda的這些質(zhì)量損失，從計算出的平均質(zhì)量來看，結(jié)構(gòu)域交換雙特異性抗體bsab1檢測到的平均質(zhì)量的差異僅<3da，結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab2檢測到的平均質(zhì)量的差異約為12da。在任一抗體樣品(同二聚體okt3-ga計算的分子量：146.465kda和同二聚體3g8-ga計算的分子量：145.980kda)中未檢測到ga-同二聚體。這些結(jié)果表明在相同細胞中共表達的4種不同蛋白質(zhì)鏈的正確化學(xué)計量組裝用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體。通過競爭輕鏈的間接法由于應(yīng)用的lc-ms方法不能區(qū)分正確組裝的結(jié)構(gòu)域交換的抗體和具有交換的輕鏈的抗體，因此進行競爭測定。在該測定中，來自結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的輕鏈和其中一條重鏈與一個細胞內(nèi)的hufc_gaseed鏈(鉸鏈-ch2-ch3ga)共表達以形成單臂抗體。如果發(fā)生正確的輕鏈與單臂重鏈的特定配對，則只能形成具有正確輕鏈配對的fab。選擇結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1的抗體鏈作為模型。在競爭測定i(圖11)中，通過共表達編碼vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)、vl(2)-cl(seqid3)、vh(2)-ch1-ch2-ch3ag(seqid5)和hufc_gaseed(seqid9)的四種不同基因，產(chǎn)生在fab區(qū)中含有ch1/cl結(jié)構(gòu)域的單臂抗體。在競爭測定ii(圖12)中，通過共表達編碼vl(1)-ch3_knob(y407t)(seqid1)、vl(2)-cl(seqid3)、vh(1)-ch3_knob(t336y)-ch2-ch3ag(seqid2)和hufc_gaseed(seqid9)的四種不同基因，產(chǎn)生含有ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab區(qū)的單臂抗體。按照標(biāo)準技術(shù)在哺乳動物細胞中表達抗體。蛋白a純化后，所述蛋白質(zhì)通過pngasef去糖基化，隨后通過lc-ms分析。在競爭測定i和ii中分別檢測到99.521kda的主峰(圖11)和101.387kda(圖12)的主峰。這些檢測到的質(zhì)量對應(yīng)于競爭測定i中正確組裝的單臂非工程改造的抗體和競爭測定ii中的結(jié)構(gòu)域交換的單臂抗體。沒有發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于錯配變體的額外的峰。這些結(jié)果表明所述ch3結(jié)構(gòu)域交換的工程改造執(zhí)行了正確的輕鏈到重鏈的配對。實施例10：結(jié)構(gòu)域交換的抗體的熱穩(wěn)定性通過差示掃描量熱法(dsc)另外分析所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1和bsab2的穩(wěn)定性，并確定明顯轉(zhuǎn)變的解鏈溫度(參見圖13)。兩個結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體以三個明顯的轉(zhuǎn)變解折疊。在tm1＝61.3℃和tm1＝61.9℃時分別觀察到結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體1和2的第一個轉(zhuǎn)變。該轉(zhuǎn)變對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域交換的抗egfrfab結(jié)構(gòu)域的熱解折疊。對應(yīng)于ag/gaseedfc片段的解折疊，結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體1的第二個峰在tm2＝67.3℃和結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體2的第二個峰在tm2＝67.4℃。對應(yīng)于天然fab結(jié)構(gòu)域(抗cd3或抗cd16)的解折疊，結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體1的第三個轉(zhuǎn)變在tm3＝71.8℃和結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體2的第三個轉(zhuǎn)變在tm3＝71.1℃。實施例11：效應(yīng)子陰性抗體的產(chǎn)生和表征除了先前實施例中描述的雙特異性抗體和單臂抗體之外，還產(chǎn)生了以下列出的新抗體以用于下一組實驗，按照上述實施例中描述的與抗體產(chǎn)生相同的蛋白質(zhì)表達、純化和表征程序?！ぞ哂形垂こ谈脑斓膐kt3fab的單臂抗cd3融合到seedag重鏈·具有未工程改造的3g8fab的單臂抗cd16融合到seedag重鏈·具有ch3結(jié)構(gòu)域交換的(kih同源對)hu425fab的效應(yīng)子陰性(en)同種型單臂抗egfr融合到en同種型seedag重鏈，與en同種型hufc_gaseed鏈配對·如實施例8中產(chǎn)生的效應(yīng)子陰性(en)同種型結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab2(抗cd16×抗egfrch3-kih)，但使用en同種型seedag和en同種型seedga重鏈根據(jù)us8562986中所述的en人igg2變體序列產(chǎn)生效應(yīng)子陰性(en)同種型seed鏈，并且如下所述適合與seed重鏈一起使用。為了產(chǎn)生enhufc_seed鏈(其中hufc由特定的人鉸鏈-ch2-ch3序列組成)，來自enigg2變體序列(us8562986)、修飾的人igg1鉸鏈(c220s)和修飾的人igg2ch2結(jié)構(gòu)域(f296a，n297q)與seed“ag”或“ga”ch3結(jié)構(gòu)域的n-端融合(davisetal.2010)，以產(chǎn)生en同種型hufc_agseed鏈或en同種型hufc_gaseed鏈。例如，hufc_g1hingeen-ch2en-ch3ga(seqid16)。所述結(jié)構(gòu)域交換的fab不具有ch1序列，因此igg2ch1不能用于en結(jié)構(gòu)域交換的重鏈，并且不存在天然存在于野生型igg2ch1中的輕鏈共價結(jié)合位點。因此，為了產(chǎn)生所述en結(jié)構(gòu)域交換的抗egfr“ag”seed重鏈，將野生型人igg1鉸鏈序列與us8562986中描述的修飾的人igg2ch2結(jié)構(gòu)域(f296a，n297q)一起使用，如vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2en-ch3ag(seqid15)所示。該設(shè)計還用于生產(chǎn)用于雙特異性抗體“bsab2en”(見下文)的en未工程改造的3g8fabgaseed重鏈，如vh(3)-ch1-ch2-chen-ch3ga(seqid17)所示。構(gòu)建了另外的基于哺乳動物ptt5的表達載體，每個載體含有以下編碼基因之一：seqid14：vh(3)-ch1-ch2-ch3agseqid15：vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2en-ch3agseqid16：hufc_g1hingeen-ch2en-ch3gaseqid17：vh(3)-ch1-ch2en-ch3ga對于vl1和vh1，使用抗egfr抗體馬妥珠單抗(hu425)的可變結(jié)構(gòu)域(kim，2004)。對于vl2和vh2，使用抗cd3抗體okt3的可變結(jié)構(gòu)域(vanwauweetal.1980)。對于vl(3)和vh(3)，使用抗cd16抗體3g8的可變結(jié)構(gòu)域(fleitetal.1982)。通過在一個細胞內(nèi)編碼氨基酸序列的不同基因的表達來產(chǎn)生抗體。兩種不同重鏈的異二聚化通過seed技術(shù)實現(xiàn)，如之前實施例中的bsab1所述。通過共表達編碼vl(2)-cl(seqid3)、vh(2)-ch1-ch2-ch3ag(seqid5)和hufc_gaseed(seqid9)的3種不同基因，產(chǎn)生融合到seedag重鏈的未工程改造的okt3fab的單臂抗cd3。通過共表達編碼vl(3)-cl(seqid12)、vh(3)-ch1-ch2-ch3ag(seqid14)和hufc_gaseed(seqid9)的3種不同基因，產(chǎn)生融合到seedag重鏈的未工程改造的3g8fab的單臂抗cd16。通過在一個細胞中共表達編碼vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)、vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2en-ch3ag(seqid15)和hufc_g1hingeen-ch2en-ch3ga(seqid16))的3種不同基因產(chǎn)生單臂細胞效應(yīng)子陰性(en)結(jié)構(gòu)域交換的抗egfr。所得的單臂en抗體識別egfr，其具體特征在于以下輕鏈和重鏈：h1(seqid15)、h2(seqid16)和l1(seqid1)。通過在一個細胞中共表達編碼vl(1)-ch3_hole(y407t)(seqid1)、vh(1)-ch3_knob(t366y)-ch2en-ch3ag(seqid15)、vl(3)-cl(seqid12)和vh(3)-ch1-ch2en-ch3ga(seqid17)的4種不同基因產(chǎn)生效應(yīng)子陰性(en)同種型結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab2(抗cd16×抗egfrch3-kih)，其從此稱為“bsab2en”。所得到的enbsab2識別靶cd16×egfr，其具體特征在于以下重鏈和輕鏈：h1(seqid15)、h2(seqid17)、l1(seqid1)和l2(seqid12)。許多抗體效應(yīng)子功能是通過抗體的fc部分的結(jié)合位點，由結(jié)合免疫細胞上的fcγ受體的抗體介導(dǎo)。具體實施例是效應(yīng)子功能抗體依賴性細胞毒性(adcc)，其通過抗體的fc部分中的fcγ受體結(jié)合位點，由抗體與免疫效應(yīng)子細胞上的cd16a(fcγiiia)結(jié)合介導(dǎo)。效應(yīng)子陰性同種型抗體缺乏通過它們的fc結(jié)合cd16a。通過cd16a細胞結(jié)合測定試劑盒(cisbio)，測定抗體與cd16a受體(fcγiiia)的結(jié)合(圖14)。在該測定中，測試抗體競爭熒光標(biāo)記的人igg與cd16a的結(jié)合的能力。如果未標(biāo)記的測試抗體與cd16a結(jié)合，則其將與標(biāo)記的igg的結(jié)合競爭，并且該競爭將降低測量的結(jié)合信號。預(yù)期具有抗cd16fab臂的效應(yīng)性抗體通過抗cd16fab臂和該抗體的fc部分中的fcγ受體結(jié)合位點結(jié)合cd16a受體。效應(yīng)子陰性同種型抗體不會通過fc部分中的fcγ受體結(jié)合位點結(jié)合cd16a。正如預(yù)期的那樣，單臂結(jié)構(gòu)域交換的en抗egfr抗體沒有檢測到與cd16a受體結(jié)合，導(dǎo)致測量信號沒有降低(圖14，倒三角形)。其它抗體顯示與cd16a受體的劑量依賴性結(jié)合，導(dǎo)致用不同的半最大抑制濃度(ic50)抑制測量信號。具有未工程改造的ch1/clfab或結(jié)構(gòu)域交換的ch3-kihfab的單臂抗egfr抗體觀察到最弱的cd16結(jié)合(圖14，菱形)。它們的結(jié)合在23-71nm范圍內(nèi)。正如預(yù)期的那樣，所述bsab2和單臂抗cd16抗體顯示出與cd16a最強的結(jié)合(圖14，分別為圓形和三角形)。bsab2的結(jié)合范圍為0.3nm，單臂抗cd16抗體的結(jié)合范圍為0.1nm。與bsab2相比，bsab2的效應(yīng)子陰性igg2變體、“bsab2en”(圖14，正方形)顯示較弱的cd16結(jié)合(ic50約3.6nm)，但與單價抗egfr抗體相比具有更強的結(jié)合。這些結(jié)果表明，bsab2能夠通過抗cd16fab臂和抗體fc部分中的fcγ受體結(jié)合位點結(jié)合cd16a受體，而bsab2en仍然可以結(jié)合cd16a，但是僅通過抗cd16fab臂介導(dǎo)仍具有較弱的結(jié)合。此外，該單抗cd16fab臂結(jié)合cd16a的bsab2en強于與cd16a的結(jié)合，僅通過單價抗egfr抗體的fc的fcγ受體的結(jié)合位點發(fā)生。實施例12：結(jié)構(gòu)域交換的抗體的功能活性為了測試所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1和bsab2的功能細胞毒性，將活化的原代t細胞或nk細胞與egfr-過表達的a431細胞在存在系列稀釋的抗體下孵育。通過乳酸脫氫酶(ldh)釋放測量細胞裂解，細胞死亡指示劑在細胞裂解后釋放到上清液，在e：t比為10：1的效應(yīng)細胞和靶細胞共同培養(yǎng)后，使用cytotox96非放射性細胞毒性測定(promega)。對活化的t細胞進行18小時的共培養(yǎng)，對nk細胞進行4小時的共培養(yǎng)。在存在所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1的條件下，檢測到活化的t細胞對靶細胞a431的劑量依賴性重定向細胞裂解(如圖15a所示)。正如預(yù)期的那樣，單臂抗cd3抗體、單臂結(jié)構(gòu)域交換的抗egfr抗體和陰性對照單臂抗cd16抗體未顯示靶細胞的重定向t細胞裂解。只有結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1顯示高達50％的細胞裂解，計算的ec50值在0.1-0.3nm。這種重定向的t細胞裂解證明了結(jié)合域交換的雙特異性抗體bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)的兩個臂都是功能性的，并且同時使2個靶cd3和egfr接合以重定向t細胞裂解a431靶細胞。通過重定向的nk細胞，結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab2(抗cd16×抗egfrch3-kih)及其效應(yīng)子陰性(en)變體bsab2en都顯示a431細胞的劑量依賴性細胞裂解(圖15b)。兩種變體能夠溶解高達50％的所述靶細胞。bsab2en的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性en變體的計算ec50值為37pm，效應(yīng)子陽性bsab2變體的ec50值為10pm。相比之下，單臂結(jié)構(gòu)域交換的抗egfr抗體也顯示劑量依賴性靶細胞裂解，這是由于通過單臂抗體的fc段中的fcγ受體結(jié)合位點nk細胞的自然接合，即使它沒有抗cd16臂。由于缺乏由效應(yīng)子陰性igg2變體同種型fc結(jié)合的fcγ受體和缺乏抗cd16臂，單臂效應(yīng)子陰性抗egfr抗體沒有顯示細胞裂解。正如預(yù)期的那樣，所述陰性對照抗cd3抗體也沒有顯示細胞裂解。通過效應(yīng)子陰性變體結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab2en(抗cd16×抗egfrch3-kih)對a431細胞的重定向的nk細胞裂解顯示bsab2的兩個臂都是功能性的，并且同時使2個靶cd16和egfr接合以重定向nk細胞來溶解a431靶細胞。總之，這些結(jié)果表明，以所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體形式產(chǎn)生的雙特異性抗體，其可以同時使兩個靶與每個fab臂接合，并且證明這些抗體依賴于與2個不同靶結(jié)合的生物學(xué)功能。實施例13：工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域的組合實施例如圖1部分所示，存在許多使用不同工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域以形成結(jié)構(gòu)域交換雙特異性抗體的組合和變化。下面是列出了在fc(即ch3hc/ch3hc結(jié)構(gòu)域?qū)?和ch3結(jié)構(gòu)域交換的fab(即ch3lc/ch3hc結(jié)構(gòu)域)中工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域的組合的幾個可能實施例的總結(jié)表，參見圖1a-1d。用選擇性的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域替換單臂抗體的一個fab臂中的ch1/cl結(jié)構(gòu)域。這些替代的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域通常用于實施異二聚體fc分子中的重鏈異二聚化。作為模型，選擇抗egfrhu425fab結(jié)構(gòu)域用于vh(1)和vl(1)。合成編碼替代的ch3結(jié)構(gòu)域的dna序列，以及構(gòu)建不同的基于哺乳動物ptt5的表達載體，每個載體含有以下編碼的基因之一：“kih2”ch3結(jié)構(gòu)域(ridgway等(1996)，atwell等(1997))變體1：seqid18：vh(1)-ch3_knob(t366w)-ch2-ch3agseqid19：vl(1)-ch3_hole(t366s，l368a，y407v變體2：seqid20：vh(1)-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)-ch2-ch3agseqid21：vl(1)-ch3_knob(t366w)“電荷對”ch3結(jié)構(gòu)域(gunasekaran等，(2010)變體1：seqid22：vh(1)-ch3(e356k，d399k)-ch2-ch3agseqid23：vl(1)-ch3(k392d，k409d)變體2：seqid24：vh(1)-ch3(k392d，k409d)-ch2-ch3agseqid25：vl(1)-ch3(e356k，d399k)“不對稱”ch3結(jié)構(gòu)域(vonkreudenstein等，(2013))變體1：seqid26：vh(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v)-ch2-ch3agseqid27：vl(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)變體2：seqid28：vh(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)-ch2-ch3agseqid29：vl(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v“seed”ch3結(jié)構(gòu)域(davis等，(2010))變體1：seqid30：vh(1)-ch3_seed(ag)-ch2-ch3agseqid31：vl(1)-ch3_seed(ga)變體2：seqid32：vh(1)-ch3_seed(ga)-ch2-ch3agseqid33：vl(1)-ch3_seed(ag)在哺乳動物細胞中產(chǎn)生單臂抗體和雙特異性抗體(抗cd3×抗egfr)。對于具有替代的ch3結(jié)構(gòu)域的單臂結(jié)構(gòu)域交換fab抗體，表達了編碼上述列表中除了hufc_ga(seqid9)之外的2個氨基酸序列的3個基因。除了seqid3和seqid4中給出的2個氨基酸序列之外，通過表達編碼上述列出的2個氨基酸序列的4個基因，產(chǎn)生含有這些替代的ch3交換的結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體。蛋白質(zhì)通過標(biāo)準方法從細胞培養(yǎng)基中通過蛋白a純化，并通過sds-page和分析性sec表征。具有替代的ch3結(jié)構(gòu)域的單臂抗體非還原的sds-page主要顯示具有對應(yīng)于結(jié)構(gòu)域交換的單臂抗體的分子量的單帶(圖16a)。觀察到變體1和變體2之間沒有顯著性差異。hu425ch3-不對稱(azymmetric)變體顯示在約90kda的主帶中完全組裝的單臂抗體的不同遷移率。分析性sec顯示了所有變體約7.9分鐘的保留時間的主峰以及不同程度的附加峰(圖16c)。在所述抗體的fab臂和fc區(qū)均含有ch3-seed結(jié)構(gòu)域的單臂抗體，高分子量物種的附加峰(保留時間為6.7分鐘)最為突出。這表明當(dāng)在抗體的結(jié)構(gòu)域交換的fab臂和fc區(qū)中使用相同的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域時，存在更多的錯配機會。替代的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體非還原性sds-page主要顯示了替代的ch3結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的一條主帶，具有不同程度的次帶(圖16b)。在sec分析中，所有樣品均顯示出保留時間為約7.5分鐘的主峰，保留時間為約8分鐘的側(cè)峰(圖16d)。存在不同程度的另外的高分子量物種。含有替代的ch3結(jié)構(gòu)域的單臂結(jié)構(gòu)域交換的抗體的結(jié)合測定使用流式細胞術(shù)測試包括替代的結(jié)構(gòu)域交換的fab結(jié)構(gòu)域(變體1和2)的單臂抗體的抗原結(jié)合。將egfr過表達的a431細胞與連續(xù)稀釋的測試抗體(1：3)一起孵育，并使用與藻紅蛋白結(jié)合的抗人fcf(ab)2第二抗體檢測與抗原的結(jié)合。包括替代的結(jié)構(gòu)域交換的fab結(jié)構(gòu)域(變體1和2)的單臂抗體顯示出與含抗體的非工程改造的fab相似的抗原結(jié)合性質(zhì)(圖17a和b)。所有樣品的egfr結(jié)合的ec50范圍為2-4nm。結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的功能活性由于比得上蛋白質(zhì)特性或變體1和變體2，選擇結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的變體1來測試功能活性。在存在連續(xù)稀釋的測試抗體(1：4)的條件下，將活化的t細胞與egfr過表達的a431細胞共培養(yǎng)。在e：t比為10：1的效應(yīng)子細胞和靶細胞共同培養(yǎng)18小時后，使用cytotox96非放射性細胞毒性測定(promega)，通過ldh釋放測量細胞裂解。具有替代的ch3結(jié)構(gòu)域(抗cd3×抗egfr)的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體通過預(yù)刺激的t細胞重定向egfr過表達細胞的裂解(圖18)。與之前的實施例進行比較，還包含所述結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體bsab1(抗cd3×抗egfrch3-kih)。這種重定向的t細胞裂解證明了具有替代的ch3結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)域交換的雙特異性抗體的兩個臂是功能性的，并且同時使2個靶cd3和egfr接合以重定向t細胞來裂解a431靶細胞。實施例14：異二聚體kih抗體中結(jié)構(gòu)域交換的fab的工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域的組合的實施例用替換的ch3結(jié)構(gòu)域替換單臂kih抗體中的chl/cl結(jié)構(gòu)域。除了kih結(jié)構(gòu)域交換之外，這些替代的ch3結(jié)構(gòu)域與實施例13中使用的相同。圖19a示意性地示出了fab臂中具有結(jié)構(gòu)域交換的單臂kih抗體的結(jié)構(gòu)。作為模型，選擇抗egfrhu425fab結(jié)構(gòu)域用于vh(1)和vl(1)。合成編碼替代的ch3結(jié)構(gòu)域的dna序列，構(gòu)建六種不同的基于哺乳動物ptt5的表達載體，每個載體含有以下編碼的基因之一：seqid34：vh(1)-ch3(e356k，d399k)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid35：vh(1)-ch3(k392d，k409d)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid36：vh(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407vseqid37：vh(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid38：vh(1)-ch3_seed(ag)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid39：vh(1)-ch3_seed(ga)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)通過共表達編碼3種不同抗體鏈的3種不同基因產(chǎn)生單臂結(jié)構(gòu)域交換的kih抗體。hufc_knob(t366w)(seqid40)與這兩個基因共表達：示例性單臂抗體的特征在于由seqid40標(biāo)識的重鏈h2和以下h1/l1鏈對中的任一個：電荷對ch3結(jié)構(gòu)域(gunasekaran等，(2010)變體1：seqid34：vh(1)-ch3(e356k，d399k)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid23：vl(1)-ch3(k392d，k409d)變體2：seqid35：vh(1)-ch3(k392d，k409d)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid25：vl(1)-ch3(e356k，d399k)不對稱ch3結(jié)構(gòu)域(vonkreudenstein等，(2013))變體1：seqid36：vh(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid27：vl(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)變體2：seqid37：vh(1)-ch3(t350v，t366l，k392l，t394w)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid29：vl(1)-ch3(t350v，l351y，f405a，y407v)seedch3結(jié)構(gòu)域(davis等，(2010))變體1：seqid38：vh(1)-ch3_seed(ag)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid31：vl(1)-ch3_seed(ga)變體2：seqid39：vh(1)-ch3_seed(ga)-ch2-ch3_hole(t366s，l368a，y407v)seqid33：vl(1)-ch3_seed(ag)在哺乳動物細胞中產(chǎn)生單臂結(jié)構(gòu)域交換的kih抗體。蛋白質(zhì)通過標(biāo)準方法從細胞培養(yǎng)基中通過蛋白a純化，并用sec表征。分析性sec顯示保留時間為約7.9分鐘的主峰，保留時間為約8.3分鐘的附加峰(圖19b)。此外，對于含有所述ch3-不對稱的單臂結(jié)構(gòu)域交換抗體，觀察到高分子量物種的附加峰(保留時間為7.4分鐘)。此外，含有ch3-seed的單臂結(jié)構(gòu)域交換抗體在高分子量物種的5.7分鐘和6.8分鐘時顯示額外的峰。使用如先前實施例中所述的流式細胞術(shù)，進一步測試這些蛋白質(zhì)與egfr陽性細胞的結(jié)合(圖20a和b)。雖然對于不同的單臂結(jié)構(gòu)域交換的kih抗體獲得了不同的sec譜圖，但是與實施例6和7中所述的單臂結(jié)構(gòu)域交換抗體相比，觀察到相似的抗原結(jié)合，所計算的所有抗體的ec50值范圍為3-5nm?？傊瑢嵤├?3和14表明，可以使用工程改造的ch3結(jié)構(gòu)域的不同組合來形成結(jié)構(gòu)域交換的抗體。參考文獻1.kollmannsbergerc，schittenhelmm，honeckerf，tillnerj，weberd，oechslek，kanzl，bokemeyerc.aphaseistudyofthehumanizedmonoclonalanti-epidermalgrowthfactorreceptor(egfr)antibodyemd72000(matuzumab)incombinationwithpaclitaxelinpatientswithegfr-positiveadvancednon-small-celllungcancer(nsclc).annoncol.2006jun；17(6)：1007-13.epub2006mar13.pubmedpmid：165338732.davisjh，aperloc，liy，kurosawae，lany，lokm，hustonjs.seedbodies：fusionproteinsbasedonstrand-exchangeengineereddomain(seed)ch3heterodimersinanfcanalogueplatformforasymmetricbindersorimmunofusionsandbispecificantibodies.proteinengdessel.2010apr；23(4)：195-202.doi：10.1093/protein/gzp094.epub2010feb4.pubmedpmid：20299542.3.ridgwayjb，prestalg，carterp.′knobs-into-holes′engineeringofantibodych3domainsforheavychainheterodimerization.proteineng.1996jul；9(7)：617-21.pubmedpmid：8844834.4.shic，shinyo，hansonj，cassb，loewenmc，durochery.purificationandcharacterizationofarecombinantg-protein-coupledreceptor，saccharomycescerevisiaeste2p，transientlyexpressedinhek293ebna1cells.biochemistry.2005dec6；44(48)：15705-14.pubmedpmid：16313173.5.kimt.technologyevaluation：matuzumab，merckkgaa.curropinmolther.2004feb；6(1)：96-103.pubmedpmid：15011787.6.vanwauwejp，demeyjr，goossensjg.okt3：amonoclonalanti-humantlymphocyteantibodywithpotentmitogenicproperties.jimmunol.1980jun；124(6)：2708-13.pubmedpmid：6966296.7.gunasekarank，pentonym，shenm，garrettl，fortec，woodwarda，ngsb，bornt，retterm，manchulenkok，sweeth，foltzin，wittekindm，yanw.enhancingantibodyfcheterodimerformationthroughelectrostaticsteeringeffects：applicationstobispecificmoleculesandmonovalentigg.jbiolchem.2010jun18；285(25)：19637-46.doi：10.1074/jbc.m110.117382.epub2010apr16.pubmedpmid：20400508.8.vonkreudensteints，escobar-carbrerae，lariopi，d′angeloi，braultk，kellyj，durochery，baardsnesj，woodsrj，xiemh，girodpa，suitsmd，boulangermj，poohdk，nggy，dixitsb.improvingbiophysicalpropertiesofabispecificantibodyscaffoldtoaiddevelopability：qualitybymoleculardesign.mabs.2013sep-oct；5(5)：646-54.doi：10.4161/mabs.25632.epub2013jul8.pubmedpmid：23924797.9.martinwl，westap，jr.，ganl，bjorkmanpj.crystalstructureat2.8aofanfcrn/heterodimericfccomplex：mechanismofph-dependentbinding.molcell2001apr；7(4)：867-77.pubmedpmid：11336709.10.fleithb，wrightsd，unkelessjc.humanneutrophilfcgammareceptordistributionandstructure.proc.natl.acad.sci.u.s.a198279.10：3275-79.11.atwells，ridgway，jbb，wellsja，carterp.stableheterodimersfromremodelingthedomaininterfaceofahomodimerusingaphagedisplaylibrary.j.mol.biol.1997270.1：26-35.當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12