本發(fā)明涉及抗cxcl12抗體分子及其用途，并且更具體地涉及能夠抑制cxcl12的生物活性的抗cxcl12抗體分子及其用于治療癌癥的用途。
背景技術(shù)：
：c-x-c模體趨化因子12(c-x-cmotifchemokine12，cxcl12)(也被稱為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromalcell-derivedfactor1，sdf-1))是人中由cxcl12基因編碼的cxc趨化因子蛋白。已知其與兩種g蛋白偶聯(lián)受體cxcr4和cxcr7結(jié)合。其參與許多發(fā)育和生理過程，包括造血和血管發(fā)生。cxcl12通過憑借cxcr4依賴性機(jī)制從骨髓募集內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcell，epc)而在血管發(fā)生中發(fā)揮作用，使其成為致癌作用和與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的新血管形成中的重要因子。遷移是cxcl12影響腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的另一個(gè)重要方式。cxcl12還在數(shù)種癌癥的器官-特異性轉(zhuǎn)移中具有作用，其中表達(dá)受體cxcr4的癌細(xì)胞被吸引到釋放cxcl12配體的轉(zhuǎn)移靶組織。cxcl12還起募集cxcr4陽性基質(zhì)細(xì)胞的作用并且調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。例如，cxcl12可通過募集調(diào)節(jié)性t細(xì)胞來幫助形成轉(zhuǎn)移前的小生境(niche)，產(chǎn)生免疫抑制性環(huán)境(zhao等，oncoimmunology，1(2)：152-161，2012)。在前列腺癌中，癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancerassociatedfibroblast，caf)通過cxcl12來參與單核細(xì)胞募集和m2極化(comito等，oncogene，33：2423-2431，2014)。在胰腺癌模型中，高水平的cxcl12與低數(shù)量的t細(xì)胞相關(guān)，并且通過用pd-l1和cxcr4抑制劑進(jìn)行聯(lián)合治療可增強(qiáng)t細(xì)胞浸潤(rùn)。t細(xì)胞浸潤(rùn)的這種增強(qiáng)伴隨著腫瘤體積的顯著減小，突顯了cxcl12/cxcr4軸在癌癥的免疫控制中的作用(feig等，pnas，110(50)：第20212-20217頁，2013)。因此，鑒于其在腫瘤生長(zhǎng)、存活和血管發(fā)生中的作用，cxcl12/cxcr4/cxcr7途徑作為潛在的治療靶標(biāo)已引起相當(dāng)大的關(guān)注(balkwill等，seminarsincancerbiology，14：171-179，2004)。wo2008/018641(onopharmaceuticalco.ltd和medarex，inc.)公開了與sdf-1特異性結(jié)合的人單克隆抗體，并且提出其用于治療包括乳腺癌、多發(fā)性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma)在內(nèi)的多種b細(xì)胞惡性腫瘤以及自身免疫病的醫(yī)療用途。zhong等(clinicalcancerresearch，19：4433-4445，2013；doi：10.1158/1078-0432.ccr-13-0943)公開了倉(cāng)鼠單克隆抗體30d8的人源化形式，并且顯示其在體外測(cè)定中能夠與人和鼠cxcl12結(jié)合。發(fā)明概述廣泛地說，本發(fā)明基于抗cxcl12抗體分子的親和力成熟及其在基于細(xì)胞的測(cè)定中和體內(nèi)顯示抗體分子能夠抑制cxcr4誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移和/或能夠抑制vegf誘導(dǎo)的體外血管發(fā)生的功能驗(yàn)證。這些特性使得本發(fā)明的抗體分子能夠用于治療癌癥，特別是通過抑制轉(zhuǎn)移和/或腫瘤新血管形成來治療癌癥。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了分離的cxcl12抗體分子，其與人和任選地鼠cxcl12特異性結(jié)合并且抑制cxcl12介導(dǎo)的生物活性，其中所述抗體分子與具有如seqidno：24所示氨基酸序列的人cxcl12的表位結(jié)合，所述表位包含以下氨基酸：(a)p10和r12，以及任選地e15、i28、p32、n45和/或k54中的一個(gè)或更多個(gè)；或者(b)p10和q48，以及任選地k54和n45中的一個(gè)或更多個(gè)。在另一方面，本發(fā)明提供了抗cxcl12抗體分子，其包含：(a)cdr-h1，其具有seqidno：1的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：1的氨基酸序列；(b)cdr-h2，其具有seqidno：2的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：2的氨基酸序列；以及(c)cdr-h3，其具有seqidno：3的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：3的氨基酸序列；以及任選地(d)cdr-l1，其具有seqidno：4的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：4的序列；(e)cdr-l2，其具有seqidno：5的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：5的序列；以及(f)cdr-l3，其具有seqidno：6的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：6的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了抗cxcl12抗體分子，其包含：(a)cdr-h1，其具有seqidno：12的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：12的氨基酸序列；以及(b)cdr-h2，其具有seqidno：13的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：13的氨基酸序列；以及(c)cdr-h3，其具有seqidno：14的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：14的氨基酸序列；以及任選地：(d)cdr-l1，其具有seqidno：15的氨基酸序列或者帶有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：15的序列；以及(e)cdr-l2，其具有seqidno：16的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：16的序列；以及(f)cdr-l3，其具有seqidno：17的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：17的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了包含如本文中所公開的抗體分子或免疫綴合物以及可藥用賦形劑的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了如本文中所公開的抗體分子或免疫綴合物，其用于治療人體或動(dòng)物體的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了如本文中所公開的抗體分子或免疫綴合物，其用于治療cxcl12介導(dǎo)的病癥的方法。在另一方面，本發(fā)明提供了如本文中所公開的抗體分子或免疫綴合物在制備用于治療cxcl12介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了治療患有cxcl12介導(dǎo)的病癥的個(gè)體的方法，其包括向有此需要的個(gè)體施用如本文中所公開的抗體分子或免疫綴合物。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明抗體分子，其用于對(duì)患有cxcl12介導(dǎo)之病癥的患者進(jìn)行診斷或預(yù)后的方法。例如，所述方法可包括使用所述抗體來確定樣品中cxcl12的存在或量，并使cxcl12的存在或量與用cxcl12抑制劑治療患者的可能結(jié)果相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的醫(yī)療用途和治療方法中，優(yōu)選地，cxcl12介導(dǎo)的病癥是癌癥，包括癌癥和/或免疫細(xì)胞遷移和/或轉(zhuǎn)移。可使用本發(fā)明的抗體或免疫綴合物來治療的癌癥類型包括卵巢癌、乳腺癌、骨癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin’slymphoma)、眼內(nèi)淋巴瘤、濾泡中心性淋巴瘤(follicularcentrelymphoma)、cml、結(jié)直腸癌、口腔鱗狀癌(oralsquamouscarcinoma)、宮頸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎癌、例如膠質(zhì)瘤和星形細(xì)胞瘤的腦癌、橫紋肌肉瘤(rhabdmyosarcoma)、例如小細(xì)胞肺癌的肺癌、黑素瘤、例如b細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(b-cellchroniclymphocyticleukemia，b-cll)的b細(xì)胞惡性腫瘤、以及例如急性髓性白血病(acutemyeloidleukaemia，aml)和急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia)的白血病。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明可用于治療whim綜合征。在另一些用途中，類似于小分子cxcr4抑制劑(普樂沙福(plerixafor)，amd3100)的用途，本發(fā)明可用于治療其中cxcl12信號(hào)傳導(dǎo)參與例如細(xì)胞動(dòng)員(例如在例如準(zhǔn)備細(xì)胞移植時(shí)骨髓中的干細(xì)胞動(dòng)員)的病癥。現(xiàn)在將參照附圖通過舉例而非限制的方式來描述本發(fā)明的一些實(shí)施方案。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本發(fā)明的多個(gè)其他方面和實(shí)施方案對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。本文中使用“和/或”的情況被視為具體公開了各自具有或不具有另一個(gè)的兩個(gè)指定特征或要素。例如，“a和/或b”被視為分別具體公開了(i)a、(ii)b以及(iii)a和b，正如各自在本文中被單獨(dú)列出。除非上下文另外指出，否則上述特征的描述和定義不限于本發(fā)明的任何特定方面或?qū)嵤┓桨?，并且同樣地適用于所描述的所有方面和實(shí)施方案。附圖簡(jiǎn)述圖1.用于表達(dá)抗cxcl12抗體的載體系統(tǒng)。a)使用psang10-3f載體的單鏈抗體(singlechainantibody，scfv)表達(dá)。在該質(zhì)粒中，scfv基因的轉(zhuǎn)錄在噬菌體t7啟動(dòng)子的控制之下。限制性位點(diǎn)ncoi、xhoi、nhei和noti有利于將可變的重鏈(vh)和輕鏈(vl)基因亞克隆到fab和igg表達(dá)載體中。b)使用pbiocam-7載體的fab抗體表達(dá)。該質(zhì)粒包含在cmv啟動(dòng)子的控制之下的雙順反子fab表達(dá)盒。存在于重鏈基因和輕鏈基因之間的p2a序列允許通過核糖體跳讀機(jī)制來釋放其下游的抗體重多肽鏈(vh-ch1)。p2a肽在翻譯后通過弗林蛋白酶切割(furincleavage)從抗體輕鏈中除去。c)使用pbiocam1-2雙質(zhì)粒系統(tǒng)的igg表達(dá)。重鏈表達(dá)盒(vh-ch1-ch2-ch3)和輕鏈表達(dá)盒位于兩個(gè)不同的質(zhì)粒中。質(zhì)粒pbiocam-1編碼輕鏈基因，并且pbiocam-2編碼重鏈盒?？贵w基因的轉(zhuǎn)錄在兩個(gè)質(zhì)粒中的cmv啟動(dòng)子控制之下。psang10-3f和pbiocam7中與抗體基因融合的六-組氨酸(6x-his)和三-flag標(biāo)簽?zāi)軌驅(qū)崿F(xiàn)所表達(dá)抗體的純化和免疫檢測(cè)。圖2.抗-cxcl12fab和igg的sds-page分析。先導(dǎo)抗cxcl12抗體及其親本克隆在hek-293細(xì)胞中作為fab和igg表達(dá)。使用染色在還原性sds-page凝膠上使親和純化的抗體可視化?？寺?93_2d06、093_2a02、114_3h1(標(biāo)記為114_3h01)和113_1h12分別作為fab(泳道1至4)和igg(泳道5至8)上樣。一些fab制備物中vh-ch1帶的拖尾可能是由于flag標(biāo)簽的切割(這在flag標(biāo)記的蛋白質(zhì)中經(jīng)常發(fā)生)。圖3.使用spr的抗cxcl12抗體的親和力測(cè)量。a)多個(gè)濃度的先導(dǎo)和親本抗cxcl12fab與固定在鏈霉親和素芯片(用鏈霉親和素預(yù)固定的羧甲基化葡聚糖基質(zhì))上的生物素化cxcl12結(jié)合的傳感圖(sensogram)。b)使用1∶1朗繆爾結(jié)合模型(langmuirbindingmodel)確定114_3h1(標(biāo)記為114_3h01)的結(jié)合常數(shù)。親本克隆093_2d06由于其非常快的脫離速率(off-rate)而使用穩(wěn)態(tài)結(jié)合模型來計(jì)算其平衡解離常數(shù)(kd)。c)抗體113_1h12及其親本克隆093_2a02顯示出雙相結(jié)合特征(biphasicbindingprofile)。使用雙態(tài)結(jié)合模型來確定這些抗體的結(jié)合常數(shù)。biacoret100評(píng)價(jià)軟件用于所有計(jì)算。圖4.cxcl12誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞遷移。a)通過涂覆有膠原蛋白的多孔膜來分離上室中熒光標(biāo)記的人卵巢癌細(xì)胞(tov-21g)和下室中的cxcl12。通過熒光掃描來量化細(xì)胞穿過膜的遷移。b)通過滴定cxcl12(范圍為20至1200ng/ml)來確定用于誘導(dǎo)細(xì)胞遷移的最佳人cxcl12濃度。在抑制測(cè)定中選擇80ng/ml的cxcl12來刺激細(xì)胞遷移。所有誤差條均表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖5.抗cxcl12抗體對(duì)癌細(xì)胞遷移的抑制。使用熒光掃描來量化熒光標(biāo)記的tov-21g細(xì)胞向cxcl12的transwell遷移。將0.39至500nm的114_3h1(標(biāo)記為114_3h01)和113-1h12igg的滴定物與下室中的80nng/ml(10nm)人cxcl12混合以測(cè)試這些抗體對(duì)cxcl12誘導(dǎo)的遷移的影響。使用抗溶菌酶抗體(500nm)作為同種型對(duì)照。所有誤差條均表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖6.抗cxcl12抗體對(duì)血管發(fā)生的抑制。將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，huvec)平板接種在已經(jīng)在經(jīng)明膠包被的室載玻片上培養(yǎng)6天的成纖維細(xì)胞上。將這兩種細(xì)胞類型在包含vegf以及先導(dǎo)抗cxcl12抗體114_3h1和113_1h12的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)7天。與溶菌酶結(jié)合的igg(非特異性igg)用作測(cè)定的同種型對(duì)照(圖a)。在共培養(yǎng)7天之后，針對(duì)血小板/內(nèi)皮黏附分子-1(pecam-1，血管發(fā)生的標(biāo)志物)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色以通過光學(xué)顯微術(shù)使小管的形成和分支可視化。使用angiosys圖像分析軟件來計(jì)算小管總數(shù)、分支接合處數(shù)(圖6a)和總小管長(zhǎng)度(圖6b)。圖7.cxcl12抗體114_3h1和113_1h12的重鏈和輕鏈序列比對(duì)。圖8.cxcl12抗體114_3h1和113_1h12與wo2008/018641的抗體的重鏈和輕鏈序列比對(duì)的序列比對(duì)。圖9a和b.遷移蹤跡，其示出了確定抗體(人igg2形式的113_1h12(hab113)、嵌合鼠igg2a形式的113_1h12(mab113)和嵌合鼠igg2a形式的114_3h1(mab114))在人cxcl12存在下阻斷鼠轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞系(b16f10)和人卵巢癌細(xì)胞系(tov-21)的遷移的有效性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖10.基于b16f10黑素瘤細(xì)胞的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移模型細(xì)胞遷移測(cè)定的結(jié)果，b16f10黑素瘤細(xì)胞需要cxcr4以遷移到肺并開始轉(zhuǎn)移。在第0天，通過尾靜脈注射將b16f10黑素瘤細(xì)胞引入c57b1小鼠中，并在第1天開始處理。處理方案為每天兩次5mg/kg的臨床cxcr4抑制劑amd3100(普樂沙福)，或者每周兩次10、15或20mg/kg嵌合鼠igg2a形式的抗cxcl12抗體。對(duì)照組的小鼠用20mg/kg的對(duì)照抗體每周處理兩次。所有小鼠均在第14天被處死(cull)，并量化肺中轉(zhuǎn)移性集落的數(shù)量。用20mg/kg劑量的113_1h12實(shí)現(xiàn)與amd3100等效的抑制水平。圖11.體外細(xì)胞transwell遷移測(cè)定的結(jié)果，其顯示本發(fā)明的抗cxcl12抗體以scfv-fc和人igg2形式阻斷人cxcl12誘導(dǎo)的tov21g癌細(xì)胞遷移。發(fā)明詳述抗-cxcl12抗體分子除非另外說明，否則本文中根據(jù)kabat編號(hào)方案來對(duì)抗體殘基進(jìn)行編號(hào)。cxcl12的全長(zhǎng)氨基酸序列如seqidno：23所示，并且由89個(gè)氨基酸組成。用于選擇例示抗體的68個(gè)氨基酸的合成的cxcl12片段的氨基酸序列示于seqidno：24。以下實(shí)例中描述的表位作圖研究使用具有seqidno：25所示氨基酸序列的野生型成熟cxcl12多肽(其包含多組氨酸標(biāo)簽和接頭序列)。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體分子能夠與這樣的cxcl12多肽結(jié)合，所述多肽包含與如seqidno：23所示的第1至68位氨基酸具有至少90％序列同一性的多肽或其片段，其中所述片段是生物活性的。本發(fā)明的抗體分子或免疫綴合物的生物活性的實(shí)例包括與cxcl12結(jié)合以例如阻斷cxcl12與cxcr4的相互作用以及任選地還阻斷cxcl12與cxcr7的相互作用。此外，可被本發(fā)明的抗體分子或免疫綴合物抑制(拮抗)的cxcl12生物活性包括抑制vegf誘導(dǎo)的體外血管發(fā)生和/或抑制cxcl12誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移和/或擴(kuò)散和/或轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的抗體分子或免疫綴合物還可抑制cxcl12在調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)中的作用。在本文中的實(shí)例中描述了用于確定癌細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移的測(cè)定。如以下實(shí)例中詳細(xì)描述的，初級(jí)抗cxcl12抗體的體外親和力成熟以兩步進(jìn)行。首先，通過輕鏈混編(shuffling)使初級(jí)抗體序列多樣化以產(chǎn)生衍生物文庫。其次，使用經(jīng)調(diào)整的選擇和篩選操作來從輕鏈混編文庫中鑒定親和力提高的變體。使用輕鏈混編來使初級(jí)抗cxcl12抗體多樣化的基本原理如下。體內(nèi)(免疫前b-細(xì)胞庫)或體外(“mccafferty文庫”)天然免疫庫的最初多樣性來自于種系可變基因區(qū)段的組合重排。輕鏈可變區(qū)(vl)由長(zhǎng)v基因片區(qū)段和短連接(j)基因區(qū)段的組合編碼。相比之下，編碼重鏈可變區(qū)(vh)的基因由三個(gè)基因區(qū)段(v區(qū)段、j區(qū)段和多樣性(d)區(qū)段)裝配，并且因此兩條可變鏈更具多樣性。由于這種提高的多樣性，尤其是在cdr3區(qū)中，vh結(jié)構(gòu)域趨向于在抗原結(jié)合和限定表位特異性中發(fā)揮主導(dǎo)作用。由于vl結(jié)構(gòu)域也有助于精細(xì)調(diào)整結(jié)合親和力和抗體表達(dá)水平，因此重要的是在文庫中具有盡可能多的vh-vl組合以鑒定具有期望表達(dá)特性的高親和力抗體。在以下實(shí)例中，通過將20種抗cxcl12抗體的重鏈可變區(qū)與κ和λ輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的庫組合產(chǎn)生2×108的輕鏈混編文庫。因此，每個(gè)原始重鏈與約1000萬個(gè)新的輕鏈配偶體配對(duì)。在嚴(yán)格條件下進(jìn)行三輪噬菌體展示選擇以從鏈混編文庫中富集高親和力結(jié)合劑。在每一輪時(shí)通過降低抗原濃度或使用更嚴(yán)苛且更長(zhǎng)的清洗步驟來提高選擇條件的嚴(yán)格性。這樣的選擇操作有利于具有較低解離常數(shù)的抗體克隆優(yōu)先富集。親和力成熟選擇在溶液相中進(jìn)行從而允許精確控制抗原濃度，其是決定選擇的嚴(yán)格性的重要參數(shù)。該過程鑒定到兩種表現(xiàn)出最低解離常數(shù)的抗體(114_3h1和113_1h12)，其被選擇作為用于進(jìn)行詳細(xì)表征和優(yōu)化的先導(dǎo)抗體。114_3h1和113_1h12及其親本克隆(分別為093_2d06和093_2a02)的完全動(dòng)力學(xué)分析證實(shí)在輕鏈混編之后親和力提高。對(duì)于114_3h1而言，1nm的計(jì)算親和力代表比其親本抗體093_2d06(kd＝3.8μm)提高了3800倍。由于另一親本抗體093_2a02的親和力(kd＝16.7nm)在開始時(shí)相對(duì)較高，因此其子克隆113_1h12的親和力提高導(dǎo)致kd＝3.7nm。除結(jié)合和動(dòng)力學(xué)研究之外，還在基于細(xì)胞的功能測(cè)定中測(cè)試抗體分子的生物特性以確定其可能的體內(nèi)效力，因?yàn)檫@不一定與結(jié)合相關(guān)聯(lián)，尤其是如果抗體分子旨在調(diào)節(jié)復(fù)雜的生物功能。鑒于cxcl12在癌癥轉(zhuǎn)移和建立腫瘤支持性脈管系統(tǒng)中的作用，本發(fā)明抗體分子的生物特性包括抑制cxcl12誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移和/或抑制vegf誘導(dǎo)的體外血管發(fā)生?？墒褂胻ranswell遷移測(cè)定來確定抑制cxcl12誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移的生物特性，在此使用的是用于研究白細(xì)胞的趨化應(yīng)答的boyden室測(cè)定(boyden，j.exp.med.115，453-46，1962)的改進(jìn)形式，其中確定接種在上室中的熒光標(biāo)記癌細(xì)胞(例如人卵巢癌細(xì)胞tov-21g)穿過多孔膜并且進(jìn)入包含cxcl12的下室的遷移?？墒褂没诩?xì)胞的測(cè)定來確定抑制血管發(fā)生的生物特性，其中在包含抗cxcl12抗體和vegf的培養(yǎng)基中一起培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)和成纖維細(xì)胞。這兩種細(xì)胞類型在vegf存在下的相互作用導(dǎo)致形成類似于體內(nèi)小毛細(xì)管的三維管，參見hetheridge等(biochem.soc.trans.39，1597-1600，2011)。使用體外癌細(xì)胞遷移測(cè)定和血管發(fā)生測(cè)定來測(cè)試兩種先導(dǎo)抗體114_3h1和113_1h12以評(píng)價(jià)其功能特征。兩種抗體均抑制cxcl12誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞遷移，其中114_3h1表現(xiàn)超過113_1h12。對(duì)于兩種抗體而言，在該測(cè)定中觀察到的ic50與來自spr分析的計(jì)算kd值相當(dāng)。此外，抗體克隆113_1h12顯著抑制vegf誘導(dǎo)的血管發(fā)生，而抗體克隆114_3h1部分地抑制vegf誘導(dǎo)的血管發(fā)生。不希望被任何特定的理論限制，抗體特性的這種差異可以是以下事實(shí)的結(jié)果：cxcl12可以通過與cxcr4和cxcr7二者的相互作用來誘導(dǎo)血管發(fā)生。因此，可能114_3h1僅阻斷cxcl12/cxcr4相互作用，但不阻斷cxcl12/cxcr7，導(dǎo)致部分地抑制血管發(fā)生。相比之下，113_1h12可能阻斷cxcl12與cxcr4和cxcr7二者結(jié)合，導(dǎo)致更優(yōu)地抑制cxcl12誘導(dǎo)的血管發(fā)生。因此，本發(fā)明提供了基于抗體克隆113_1h12或114_3h1的抗體分子。在一方面，本發(fā)明提供了抗cxcl12抗體分子，其包含基于抗體114_3h1的cdr序列的以下至少1、2、3、4、5或6種cdr序列：(a)cdr-h1，其具有seqidno：1的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：1的氨基酸序列；和/或(b)cdr-h2，其具有seqidno：2的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：2的氨基酸序列；和/或(c)cdr-h3，其具有seqidno：3的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：3的氨基酸序列；和/或(d)cdr-l1，其具有seqidno：4的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：4的序列；和/或(e)cdr-l2，其具有seqidno：5的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：5的序列；和/或(f)cdr-l3，其具有seqidno：6的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：6的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗cxcl12抗體分子包含上文限定的全部六種cdr，其任選地具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入。在另一方面，本發(fā)明提供了抗cxcl12抗體分子，其包含基于抗體113_1h12的cdr序列的以下至少1、2、3、4、5或6種或者更多種cdr序列：(a)cdr-h1，其具有seqidno：12的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：12的氨基酸序列；和/或(b)cdr-h2，其具有seqidno：13的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：13的氨基酸序列；和/或(c)cdr-h3，其具有seqidno：14的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：14的氨基酸序列；和/或(d)cdr-l1，其具有seqidno：15的氨基酸序列或者帶有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：15的序列；和/或(e)cdr-l2，其具有seqidno：16的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：16的序列；和/或(f)cdr-l3，其具有seqidno：17的氨基酸序列或者帶有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的seqidno：17的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗cxcl12抗體分子包含上文限定的全部六種cdr(seqidno：12至17)，其任選地具有一個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入。輕鏈可變區(qū)(vl)由長(zhǎng)v基因區(qū)段和短連接(j)基因區(qū)段的組合編碼。相比之下，編碼重鏈可變區(qū)(vh)的基因由三個(gè)基因區(qū)段(v區(qū)段、j區(qū)段和多樣性(d)區(qū)段)裝配，并且因此兩條可變鏈更具多樣性。由于這種提高的多樣性，尤其是在cdr3區(qū)中，vh結(jié)構(gòu)域趨向于在抗原結(jié)合和限定表位特異性中發(fā)揮主導(dǎo)作用。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗cxcl12抗體分子，其包含與來源于不同抗體分子之輕鏈組合的如本文中所限定的例示抗體的重鏈cdr，所述cdr任選地各自具有1、2、3個(gè)或更多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入。在另一方面，本發(fā)明提供了抗cxcl12抗體，其包含：(a)vh結(jié)構(gòu)域，其包含選自以下的至少一種、至少兩種或全部三種vhcdr序列：(i)包含seqidno：1的氨基酸序列的cdr-h1、(ii)包含seqidno：2的氨基酸序列的cdr-h2、以及(iii)包含選自seqidno：3的氨基酸序列的cdr-h3；以及(b)vl結(jié)構(gòu)域，其包含選自以下的至少一種、至少兩種或全部三種vlcdr序列：(i)包含seqidno：4的氨基酸序列的cdr-l1、(ii)包含seqidno：5的氨基酸序列的cdr-l2、以及(c)包含seqidno：6的氨基酸序列的cdr-l3。在另一方面，本發(fā)明的抗體分子包含vh結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno：7所示氨基酸序列，或者與seqidno：7的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，vh序列相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或更多個(gè)替換、插入或缺失，同時(shí)抗體分子保留與cxcl12結(jié)合的特性，以及任選地一種或更多種如本文中描述的本發(fā)明抗cxcl12抗體分子的其他生物活性。優(yōu)選地，vh結(jié)構(gòu)域包含選自以下的1、2或3個(gè)cdr：(i)包含seqidno：1的氨基酸序列的cdr-h1、(ii)包含seqidno：2的氨基酸序列的cdr-h2、以及(iii)包含選自seqidno：3的氨基酸序列的cdr-h3。在另一方面，本發(fā)明的抗體分子包含vl結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno9所示氨基酸序列，或者與seqidno：9的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，vh序列相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或更多個(gè)替換、插入或缺失，同時(shí)抗體分子保留與cxcl12結(jié)合的特性，以及任選地一種或更多種如本文中描述的本發(fā)明抗cxcl12抗體分子的其他生物活性。優(yōu)選地，vl結(jié)構(gòu)域包含選自以下的1、2或3個(gè)cdr：(i)包含seqidno：4的氨基酸序列的cdrl1、(ii)包含seqidno：5的氨基酸序列的cdr-l2、以及(c)包含seqidno：6的氨基酸序列的cdr-l3。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子包含：vh結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno7所示氨基酸序列或者與seqidno：7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列；以及vl結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno9所示氨基酸序列或者與seqidno：9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗cxcl12抗體，其包含：(a)vh結(jié)構(gòu)域，其包含選自以下的至少一種、至少兩種或全部三種vhcdr序列：(i)包含seqidno：12的氨基酸序列的cdr-h1、(ii)包含seqidno：13的氨基酸序列的cdr-h2、以及(iii)包含選自seqidno：14的氨基酸序列的cdr-h3；以及(b)vl結(jié)構(gòu)域，其包含選自以下的至少一種、至少兩種或全部三種vlcdr序列：(i)包含seqidno：15的氨基酸序列的cdr-l1、(ii)包含seqidno：16的氨基酸序列的cdr-l2、以及(c)包含seqidno：17的氨基酸序列的cdr-l3。在另一方面，本發(fā)明的抗體分子包含vh結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno18所示氨基酸序列，或者與seqidno：18的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，vh序列相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或更多個(gè)替換、插入或缺失，同時(shí)抗體分子保留與cxcl12結(jié)合的特性，以及任選地一種或更多種如本文中描述的本發(fā)明抗cxcl12抗體分子的其他生物活性。優(yōu)選地，vh結(jié)構(gòu)域包含選自以下的1、2或3個(gè)cdr：(i)包含seqidno：12的氨基酸序列的cdr-h1、(ii)包含seqidno：13的氨基酸序列的cdr-h2、以及(iii)包含選自seqidno：14氨基酸序列的cdr-h3。在另一方面，本發(fā)明的抗體分子包含vl結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno20所示氨基酸序列，或者與seqidno：20的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，vh序列相對(duì)于參照序列包含一個(gè)或更多個(gè)替換、插入或缺失，同時(shí)抗體分子保留與cxcl12結(jié)合的特性，以及任選地一種或更多種如本文中描述的本發(fā)明抗cxcl12抗體分子的其他生物活性。優(yōu)選地，vl結(jié)構(gòu)域包含選自以下的1、2或3個(gè)cdr：(i)包含seqidno：15的氨基酸序列的cdrl1、(ii)包含seqidno：16的氨基酸序列的cdr-l2、以及(c)包含seqidno：17的氨基酸序列的cdr-l3。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子包含：vh結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno：18所示氨基酸序列或者與seqidno：18具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列；以及vl結(jié)構(gòu)域，其包含seqidno：20所示氨基酸序列或者與seqidno：20具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了能夠與具有如seqidno：24或25所示氨基酸序列的cxcl12的表位結(jié)合的抗cxcl12抗體分子，所述表位包含以下氨基酸：(a)p10和r12，以及任選地e15、i28、p32、n45和/或k54中的一個(gè)或更多個(gè)；或者(b)p10和q48，任選地k54和n45中的一個(gè)或更多個(gè)。例示的抗體114_3h1與表位(a)結(jié)合，抗體113_1h12與表位(b)結(jié)合。e15在參與受體或肝素結(jié)合的區(qū)域之外。所有的其他表位殘基在參與受體結(jié)合的區(qū)域之內(nèi)，其根據(jù)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)在uniprotp48061(sdf1_human)的編號(hào)為29至33、39至41、48至50、60至70)。在一方面，本發(fā)明提供了分離的抗體分子，其結(jié)合cxcl12并且包含114_3h1vh結(jié)構(gòu)域(seqidno：7)和/或114_3h1vl結(jié)構(gòu)域(seqidno：9)。優(yōu)選地，cxcl12是人cxcl12，并且任選地還是鼠cxcl12。在另一方面，本發(fā)明提供了分離的抗體分子，其結(jié)合cxcl12并且包含113_1h12vh結(jié)構(gòu)域(seqidno：18)和/或113_1h12vl結(jié)構(gòu)域(seqidno：20)。優(yōu)選地，cxcl12是人cxcl12，并且任選地還是鼠cxcl12。通常來說，vh結(jié)構(gòu)域與vl結(jié)構(gòu)域配對(duì)以提供抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，但是如以下進(jìn)一步討論的，vh結(jié)構(gòu)域單獨(dú)可用于結(jié)合抗原。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，114_3h1或113_1h12vh結(jié)構(gòu)域(seqidno：7或18)與114_3h1或113_1h12vl結(jié)構(gòu)域(seqidno：9或20)配對(duì)，使得形成包含114_3h1或113_1h12vh和vl兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一些實(shí)施方案中，使114_3h1或113_1h12vh與不同于114_3h1或113_1h12vl的vl結(jié)構(gòu)域配對(duì)。輕鏈混雜性(promiscuity)是本領(lǐng)域中公認(rèn)的?？梢詮?14_3h1或113_1h12vh或vl結(jié)構(gòu)域獲取一個(gè)或更多個(gè)cdr，并將其并入合適的框架中。這在下面進(jìn)一步討論。114_3h1vhcdrh1、h2和h3分別示于seqidno：1、2和3。114_3h1vlcdrl1、l2和l3分別示于seqidno：4、5和6。113-1h12vhcdrh1、h2和h3分別示于seqidno：12、13和14。113_1h12vlcdrl1、l2和l3分別示于seqidno：15、16和17。在一方面，本發(fā)明提供了抗cxcl12抗體，其結(jié)合cxcl12并且包含：抗體vh結(jié)構(gòu)域，其選自：114_3h1vh結(jié)構(gòu)域(seqidno：7)，以及包含具有seqidno：3之氨基酸序列的vhcdr3以及任選地一個(gè)或更多個(gè)具有選自seqidno：1和seqidno：2之氨基酸序列的vhcdr的vh結(jié)構(gòu)域；和/或抗體vl結(jié)構(gòu)域，其選自：114_3h1vl結(jié)構(gòu)域(seqidno：9)，以及包含一個(gè)或更多個(gè)具有選自seqidno：4、5和6之氨基酸序列的vlcdr的vl結(jié)構(gòu)域。在一方面，本發(fā)明提供了抗cxcl12抗體，其結(jié)合cxcl12并且包含：抗體vh結(jié)構(gòu)域，其選自：113_1h12vh結(jié)構(gòu)域(seqidno：18)，以及包含具有seqidno：14之氨基酸序列的vhcdr3以及任選地一個(gè)或更多個(gè)具有選自seqidno：12和seqidno：13之氨基酸序列的vhcdr的vh結(jié)構(gòu)域；和/或抗體vl結(jié)構(gòu)域，其選自：113_1h12vl結(jié)構(gòu)域(seqidno：20)以及包含一個(gè)或更多個(gè)具有選自seqidno：15、16和17之氨基酸序列的vlcdr的vl結(jié)構(gòu)域。如實(shí)例中所示，本發(fā)明的抗體分子可以耐受對(duì)cdr序列的許多氨基酸改變，同時(shí)保留親本抗體的特性。例如，與seqidno：1至6和12至17中的任何一個(gè)相比，抗體分子的cdr的氨基酸序列可各自包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸替換、缺失或插入。如本領(lǐng)域中公知的，cdr可以存在于一系列的不同抗體類型或框架區(qū)，其任選地涉及一個(gè)或更多個(gè)另外的序列改變以確保保留如本文中所公開抗體的有用特性。例如，圖11顯示，本發(fā)明的抗體在scfc-fv融合體和人igg2形式中具有功能性。vh和vl結(jié)構(gòu)域各自通常包含負(fù)責(zé)抗原結(jié)合散布有框架區(qū)的三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗體分子，其包含：含有分別具有seqidno：1、2和3的序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的vh結(jié)構(gòu)域；和/或含有分別具有seqidno：4、5和6的序列的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的vl結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的抗體分子，其包含：含有分別具有seqidno：12、13和14的序列的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3的vh結(jié)構(gòu)域；和/或含有分別具有seqidno：15、16和17的序列的cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3的vl結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供了scfv形式的抗cxcl12抗體分子，其與seqidno：11或seqidno：22具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。一般性地，本發(fā)明涉及能夠抑制cxcl12的生物活性的抗體分子，即本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的拮抗劑抗體分子。例如，可以在體外癌細(xì)胞遷移測(cè)定和體內(nèi)血管發(fā)生測(cè)定中確定特性。生物活性包括抑制cxcl12誘導(dǎo)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制癌細(xì)胞遷移、抑制癌細(xì)胞黏附、抑制癌癥轉(zhuǎn)移和/或血管發(fā)生，例如vegf誘導(dǎo)的血管發(fā)生。任選地，本發(fā)明的抗體分子通過結(jié)合并隔離cxcl12從而阻止其與其所存在的生物系統(tǒng)中的受體相互作用來發(fā)揮功能。抗cxcl12抗體分子的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力(表示為平衡解離常數(shù)kd)可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如表面等離子體共振(例如，使用biacore分析))來確定，例如如以下實(shí)驗(yàn)例中所述的。或者，可以使用用目的抗體的fab形式和cxcl12進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定(ria)來測(cè)量kd?？筩xcl12抗體分子對(duì)cxcl12的解離常數(shù)可以是小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm、小于10nm、或小于1nm。例如，抗體分子對(duì)cxcl12的親和力可以是1nm至20nm，例如9nm至15nm。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體分子對(duì)人cxcl12的親和常數(shù)(kd)為小于10nm，更優(yōu)選小于5nm，并且最優(yōu)選小于3nm。此外，本發(fā)明的抗體優(yōu)選地還與其他物種的cxcl12(例如鼠cxcl12)結(jié)合，使其與動(dòng)物疾病模型相容。與cxcl12結(jié)合的親和常數(shù)可使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)(例如如以下實(shí)驗(yàn)例中例示的biacorespr分析)來確定。根據(jù)上述方面或?qū)嵤┓桨钢腥我豁?xiàng)的本發(fā)明抗cxcl12抗體分子是單克隆抗體，包括嵌合抗體、人源化抗體或人抗體?？贵w分子可以是抗體片段，例如fv、fab、fab’、scfv、scfv-fc、雙鏈抗體(diabody)、或f(ab’)2完全抗體、三鏈抗體(triabody)、雙特異性抗體或嵌合抗體。根據(jù)本發(fā)明的抗體的優(yōu)選形式包括igg、scfv-fc、fab和scfv。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗cxcl12抗體分子可以是全抗體。例如，igg、iga、ige或igm或者任何同種型亞類，特別是igg1和igg4?？筩xcl12抗體分子可以是單克隆抗體?？贵w分子及其構(gòu)建和使用方法在例如hollinger&hudson，naturebiotechnology23(9)：1126-1136(2005)中描述?？贵w分子通常包含含有免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)和免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但是僅含有重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh)的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域也是可能的(例如駱駝或鯊魚抗體)。這樣的抗體包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一些情況下，可以修飾本發(fā)明的抗體分子以改變抗體分子糖基化的程度。這可以通過改變氨基酸序列使得產(chǎn)生或除去親本抗體中存在的一個(gè)或更多個(gè)糖基化位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)。特別地，當(dāng)抗體分子包含fc區(qū)時(shí)，已知改變與fc區(qū)連接的碳水化合物可以改變抗體分子的特性，特別地通過降低fc區(qū)的巖藻糖基化，可提高adcc功能。在不含污染物例如能夠結(jié)合其他多肽和/或血清組分的抗體的意義上，如本文中所描述的抗cxcl12抗體分子可以是分離的。對(duì)于大多數(shù)目的而言，單克隆抗體是優(yōu)選的，但是也可以使用多克隆抗體。產(chǎn)生抗cxcl12抗體分子的方法包括用蛋白質(zhì)或其片段免疫接種哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊或猴)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的多種技術(shù)中的任一種從經(jīng)免疫接種的動(dòng)物獲得抗體，并優(yōu)選地使用抗體與目的抗原的結(jié)合進(jìn)行篩選。例如，可以使用western印跡技術(shù)或免疫沉淀(armitage等，1992，nature357：80-82)。從動(dòng)物分離抗體和/或抗體產(chǎn)生細(xì)胞(antibody-producingcell)可伴隨處死動(dòng)物的步驟。作為用肽免疫接種哺乳動(dòng)物的替代或補(bǔ)充，可以使用例如在其表面上展示功能性免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的λ噬菌體或絲狀噬菌體從重組產(chǎn)生的所表達(dá)免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的文庫獲得蛋白質(zhì)特異性的抗體。該文庫可以是天然的，即由從未被任何蛋白質(zhì)(或片段)免疫接種的生物體獲得的序列構(gòu)建，或者可以是使用從已暴露于目的抗原的生物體獲得的序列構(gòu)建的文庫。在本發(fā)明中，可以使用實(shí)例中所描述的方法來篩選具有拮抗特性的抗cxcl12抗體的另一些實(shí)例。在產(chǎn)生和/或分離之后，可以測(cè)試抗cxcl12抗體分子的生物活性。例如，可以確定選自以下的一種或更多種生物活性：抑制cxcl12誘導(dǎo)的癌細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制癌細(xì)胞遷移、抑制癌細(xì)胞黏附、抑制癌癥轉(zhuǎn)移和/或血管發(fā)生(例如vegf誘導(dǎo)的血管發(fā)生)?？贵w分子之間的競(jìng)爭(zhēng)可以在體外容易地進(jìn)行測(cè)定，例如使用elisa和/或通過向一種抗體分子標(biāo)記特異性報(bào)道分子來測(cè)定，所述特異性報(bào)道分子可以在一種或更多種其他未標(biāo)記的抗體分子存在下被檢測(cè)到，以使得能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的抗體分子。這樣的方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是容易知曉的。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明的抗體分子的核酸分子。所述核酸分子可用于表達(dá)抗cxcl12抗體分子，例如通過將核酸序列并入具有可操作地連接至編碼抗cxcl12抗體分子之核酸以控制其表達(dá)的控制序列的表達(dá)載體中來進(jìn)行。載體可以包含其他序列，例如驅(qū)動(dòng)所插入核酸表達(dá)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子、使得抗cxcl12抗體分子作為融合體產(chǎn)生的核酸序列和/或編碼分泌信號(hào)使得在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽從細(xì)胞分泌的核酸?？梢赃x擇或構(gòu)建包含合適調(diào)節(jié)序列的合適載體，所述調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子序列、終止子片段、多聚腺苷酸化序列、增強(qiáng)子序列、標(biāo)記基因以及其他合適的序列。載體可以是質(zhì)?；蛘呤遣《荆缡删w或噬菌粒，視情況而定。更多細(xì)節(jié)參見例如molecularcloning：alaboratorymanual：第二版，sambrook等，1989，coldspringharbourlaboratorypress。currentprotocolsinmolecularbiology，ausubel等編輯，johnwiley&sons，1992中詳細(xì)描述了許多已知的核酸操作技術(shù)和方案，例如核酸構(gòu)建體的制備、誘變、測(cè)序、將dna導(dǎo)入細(xì)胞中和基因表達(dá)，以及蛋白質(zhì)分析?？筩xcl12抗體分子可以如下獲得：將載體轉(zhuǎn)化到該載體在其中具有功能的宿主細(xì)胞中，培養(yǎng)宿主細(xì)胞使得產(chǎn)生抗cxcl12抗體分子，并從宿主細(xì)胞或周圍培養(yǎng)基中回收抗cxcl12抗體分子。在本領(lǐng)域中，原核和真核細(xì)胞用于該目的的，包括大腸桿菌(e.coli)菌株、昆蟲細(xì)胞(例如用桿狀病毒轉(zhuǎn)化的)、酵母、以及例如cos或cho細(xì)胞的真核細(xì)胞。宿主細(xì)胞的選擇可用于控制在這些細(xì)胞中表達(dá)的抗cxcl12抗體分子的特性，例如控制多肽沉積在宿主細(xì)胞中的條件，或者影響例如其糖基化和磷酸化的特性。如果多肽被表達(dá)為與合適的信號(hào)前導(dǎo)肽偶聯(lián)，則其可以從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中。在通過表達(dá)產(chǎn)生之后，可以根據(jù)具體情況從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中分離和/或純化本發(fā)明的抗體分子，并隨后如所期望地使用，例如用于配制組合物，所述組合物可包含一種或更多種另外的組分，例如載體，如本申請(qǐng)其他部分所述的。因此，在另一些方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗cxcl12抗體分子的核酸；包含編碼抗cxcl12抗體分子的核酸的表達(dá)載體，所述核酸與控制序列可操作地連接以指導(dǎo)其表達(dá)；以及轉(zhuǎn)化有該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在又一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的抗cxcl12抗體分子的方法，所述方法包括培養(yǎng)宿主細(xì)胞并分離由此產(chǎn)生的抗cxcl12抗體分子。衍生化的抗體分子本發(fā)明的抗體分子還可以被衍生化以改變其特性，特別是其藥理學(xué)特性，例如半衰期(例如，延長(zhǎng)半衰期)。一個(gè)實(shí)例是使抗體分子與可用于提高多肽治療劑的半衰期或其他藥理學(xué)特性的聚(亞烷基二醇)分子，特別是聚乙二醇(peg)分子綴合。聚乙二醇化是用于改變治療性多肽(例如，肽、蛋白質(zhì)和抗體)的特性的已知策略。通常來說，使peg分子與多肽連接用于改變其構(gòu)象、靜電或疏水特性，并且導(dǎo)致改善其生物學(xué)和藥理學(xué)特性，例如提高藥物溶解度、降低劑量頻率、調(diào)節(jié)(尤其是延長(zhǎng))循環(huán)半衰期、提高藥物穩(wěn)定性以及提高對(duì)蛋白水解性降解的抗性。聚乙二醇化通過使多肽與一個(gè)或更多個(gè)peg聚合物分子綴合提高治療性多肽的分子量來起作用。這特別地適用于作為完全抗體的片段的抗體分子類型，例如fab片段。這可以通過使抗體分子中存在的合適官能團(tuán)與反應(yīng)性聚(亞烷基二醇)分子反應(yīng)來對(duì)本發(fā)明的抗體分子進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明抗體分子中可用的官能團(tuán)，可以以選擇性方式例如通過鑒定抗體分子中合適的反應(yīng)性半胱氨酸殘基來使抗體分子聚乙二醇化。聚(亞烷基二醇)分子在本領(lǐng)域中可互換地稱為聚(環(huán)氧烷烴)分子，并且為聚醚。聚(亞烷基二醇)分子可以具有支鏈、支鏈、梳形或星形結(jié)構(gòu)，并且通常是高度水溶性的。此外，堿性聚(亞烷基二醇)結(jié)構(gòu)可以提供有一個(gè)或更多個(gè)例如羥基、胺、羧酸、烷基鹵或硫醇基的反應(yīng)性官能團(tuán)以有利于聚(亞烷基二醇)分子與例如多肽的其他物質(zhì)反應(yīng)。優(yōu)選的聚(亞烷基二醇)分子包括在一個(gè)或更多個(gè)羥基位置被化學(xué)基團(tuán)(例如具有1至4個(gè)碳原子的烷基)取代的那些。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選聚(亞烷基二醇)分子是聚乙二醇(“peg”)分子，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員也能夠使用例如聚丙二醇或聚乙二醇-聚丙二醇共聚物的其他聚(亞烷基二醇)分子來衍生化本發(fā)明的抗體分子。包括peg在內(nèi)的聚(亞烷基二醇)分子的分子量通常為約400da至約80kda，更優(yōu)選約1kda至約60kda，并且更優(yōu)選約5kda至約50kda，例如分子量為10kda、20kda、30kda或40kda?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明使用的聚(亞烷基二醇)分子是本領(lǐng)域中公知的，并且可以公開獲得，例如從例如sigmaaldrich的可商購(gòu)獲得來源公開獲得。本發(fā)明還提供了免疫綴合物，其包含與一種或更多種細(xì)胞毒劑綴合的本文中描述的抗cxcl12抗體分子，所述細(xì)胞毒劑例如化學(xué)治療劑或藥物、生長(zhǎng)抑制劑、毒素(例如，蛋白質(zhì)毒素，細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶活性毒素，或者其片段)、或放射性同位素。在一方面，本發(fā)明的免疫綴合物是其中抗體與一種或更多種藥物(例如化學(xué)治療藥物)綴合的抗體-藥物綴合物(antibody-drugconjugate，adc)?？贵w部分任選地通過接頭與藥物連接。成像應(yīng)用本發(fā)明的抗體分子可被另外標(biāo)記以使其能夠與其治療用途結(jié)合或獨(dú)立于其治療用途而用于成像。用于標(biāo)記抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的，其使抗體能夠用于一系列的成像和光譜應(yīng)用。這可以用于許多不同的醫(yī)學(xué)或研究應(yīng)用，例如用于腫瘤學(xué)、心血管醫(yī)學(xué)或移植物排斥的領(lǐng)域。抗體分子用于成像的用途的一個(gè)具體實(shí)例涉及放射性核素標(biāo)記在核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)中的用途，所述核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)例如單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(singlephotonemissioncomputedtomography，spect)，其是檢測(cè)從放射性核素發(fā)射的γ射線以產(chǎn)生放射性核素在樣品或?qū)ο笾械姆植嫉亩S圖像的成像技術(shù)，以及正電子發(fā)射斷層攝影(positronemissiontomography，pet)，其是通過檢測(cè)引入到樣品或?qū)ο笾械恼娮影l(fā)射放射性核素間接發(fā)射的γ射線對(duì)的三維圖像的成像技術(shù)。具有放射性核素標(biāo)記的抗體分子也可用于其中組合成像技術(shù)的多模態(tài)研究，通過選擇在多于一種成像技術(shù)中具有活性的放射性核素或者通過用多于一種類型的標(biāo)記來標(biāo)記抗體分子。本發(fā)明的抗體分子可以用放射性核素(例如作為復(fù)合物)提供或者與可與標(biāo)記相關(guān)的第二分子(例如接頭)綴合的放射性核素標(biāo)記。用于成像技術(shù)或治療的放射性核素的實(shí)例包括：锝、錸、銅、鈷、鎵和銦的同位素，例如tc-99m、re-186、re-188、co-57、ga-67、in-111(spect)、cu-64、cu-60、cu-61、cu-62、cu-67、tc-94m、ga-68、co-55(pet)。通常來說，锝同位素用于成像目的，錸同位素用于治療目的，且銅同位素用于成像和治療二者。醫(yī)療用途已報(bào)道cxcl12通過憑借cxcr4依賴性機(jī)制從骨髓中募集內(nèi)皮祖細(xì)胞(epc)來參與血管發(fā)生，使其成為致癌作用和與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的新血管形成中的顯著因子。cxcl12還在腫瘤轉(zhuǎn)移中起作用，其中表達(dá)受體cxcr4的癌細(xì)胞被吸引到釋放配體cxcl12的轉(zhuǎn)移靶組織。因此，鑒于其在腫瘤生長(zhǎng)、存活和血管發(fā)生中的作用，cxcl12/cxcr4/cxcr7途徑作為潛在的治療靶標(biāo)已引起相當(dāng)大的關(guān)注。因此，如在balkwill等，seminarsincancerbiology，14：171-179，2004中綜述的，已經(jīng)顯示cxcl12在腫瘤的器官特異性轉(zhuǎn)移中是重要的。表達(dá)cxcl12/cxcr4的腫瘤包括卵巢癌、乳腺癌、骨癌、前列腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、眼內(nèi)淋巴瘤、濾泡中心性淋巴瘤、cml、結(jié)直腸癌、口腔鱗狀癌、宮頸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、腎癌、例如膠質(zhì)瘤和星形細(xì)胞瘤的腦癌、橫紋肌肉瘤、例如小細(xì)胞肺癌的肺癌、黑素瘤、例如b細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(b-cll)的b細(xì)胞惡性腫瘤、以及例如急性髓性白血病(aml)的白血病。已知caf分泌cxcl12，并且這在乳腺癌(orimo等，stromalfibroblastspresentininvasivehumanbreastcarcinomaspromotetumorgrowthandangiogenesisthroughelevatedsdf-1/cxcl12secretion，cell，121(3)：335-348，2005)和胰腺癌(feig等，targetingcxcl12fromfap-expressingcarcinomaassociatedfibroblastssynergizeswithanti-pd-l1immunotherapyinpancreaticcancer.p.n.a.s.，110：50：20212-20217：2013)中直接提高血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)。此外，在胰腺癌模型中，高水平的cxcl12與低數(shù)量的t細(xì)胞相關(guān)，并且通過用pd-l1和cxcr4抑制劑進(jìn)行聯(lián)合治療可提高t細(xì)胞浸潤(rùn)。t細(xì)胞浸潤(rùn)的這種提高伴隨著腫瘤體積的顯著減小，凸顯了cxcl12/cxcr4軸在癌癥的免疫控制中的作用(feig等，pnas，110(50)：第20212-20217頁，2013)。已經(jīng)顯示某些化學(xué)治療劑、抗血管發(fā)生劑和照射引起cxcl12/cxcr4的額外上調(diào)，這有助于治療后的腫瘤復(fù)發(fā)。cxcl12的水平升高觸發(fā)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員(shaked等，cancercell，14(3)：263-273，2008)和單核細(xì)胞向腫瘤募集(hughes等，cancerres，75(17)：of1-of13，2015)，其刺激腫瘤侵襲、新血管形成和轉(zhuǎn)移以及抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的抗cxcl12抗體與這些類型的cxcl12/cxcr4誘導(dǎo)劑的組合可具有臨床益處。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子或免疫綴合物可用于治療whim綜合征(疣、低丙球蛋白血癥、感染和先天性骨髓粒細(xì)胞缺乏綜合征(myelokathexissyndrome))，其是由趨化因子受體cxcr4中突變引起的以慢性非循環(huán)性中性粒細(xì)胞減少癥為特征的罕見先天性免疫缺陷病。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子或免疫綴合物可以與另外的癌癥治療聯(lián)合施用或與放射治療聯(lián)合施用。例如，本發(fā)明的抗體分子或免疫綴合物可以與化學(xué)治療劑、抗體治療、免疫調(diào)節(jié)治療、外科手術(shù)聯(lián)合施用，或者與放射治療聯(lián)合施用，或者與細(xì)胞介導(dǎo)的治療聯(lián)合施用。在一些實(shí)施方案中，抗體分子和另外的癌癥治療一起施用，任選地作為組合配方一起施用。或者，抗體分子和另外的癌癥治療可以交替施用，其中在抗體分子之前施用另外的癌癥療法，或者在抗體分子之后施用另外的癌癥治療。該組合可以根據(jù)臨床實(shí)踐施用，例如以約一周至三周的間隔施用。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子與血管發(fā)生抑制劑聯(lián)合施用?；诒景l(fā)明抗體分子的作用方式，與血管發(fā)生抑制劑的聯(lián)合治療可提供相加或協(xié)同效應(yīng)(參見liang等，cxcr4/cxcl12axispromotesvegf-mediatedtumorangiogenesisthroughaktsignalingpathway，biochem.biophys.res.commun.359(3)：716-722，2007)。本文中所使用的血管發(fā)生抑制劑包括直接或間接抑制血管發(fā)生、血管生成或不期望的血管滲透性的藥劑。應(yīng)當(dāng)理解，血管發(fā)生抑制劑包括結(jié)合并阻斷血管發(fā)生因子或其受體的血管發(fā)生活性的那些藥劑。參見例如，grothey和galanis(2009)nat.rev.clin.oncol.6(9)：507-18(例如表1列出了大分子vegf抑制劑)；ivy、wick和kaufman(2009)nat.rev.clin.oncol.6(9)：569-7(例如補(bǔ)充表1列出了小分子受體酪氨酸激酶抑制劑)。血管發(fā)生抑制劑包括靶向促血管發(fā)生生長(zhǎng)因子受體的抗體或肽-抗體融合體，例如貝伐珠單抗西妥昔單抗雷莫蘆單抗依庫克單抗(icrucumab)、humv833、2c3、阿柏西普和imc-1c11。另一些血管發(fā)生抑制劑包括小分子激酶抑制劑，例如索拉非尼舒尼替尼帕唑帕尼依維莫司aee788、aal881、aal993、zd4190、abt-869(利尼伐尼)、ptk787(瓦他拉尼)、amg706(莫特沙尼)、西地尼布(recentin)、阿西替尼凡德他尼su6668、zd1839、替拉替尼、尼達(dá)尼布丙氨酸布立尼布、bms-605541、bms-645737、cep-7055、多韋替尼、cp-547，632、e7080、gw654652、krn633、替沃扎尼(tivozanib)、osi-930、pd173074、pf-00337210、su1498、司馬沙尼(semaxanib，su5416)、su5614、su11657、su14813、tki-28、tki-31和zm323881。天然血管發(fā)生抑制劑的實(shí)例是內(nèi)皮細(xì)胞抑制素和血管抑素。用于抑制血管發(fā)生的另一些藥物包括沙利度胺、角鯊胺和血管酶(angiozyme)。貝伐珠單抗是根據(jù)presta等，(1997)cancerres.57(20)：4593-4599產(chǎn)生的重組人源化抗vegf單克隆抗體。阿柏西普是由與人igg1的fc部分融合的vegf結(jié)合部分組成的重組肽-抗體融合體。索拉非尼是阻斷受體酪氨酸激酶vegfr、pdgfr(血小板衍生生長(zhǎng)因子受體)、raf絲氨酸/蘇氨酸激酶和c-kit的多激酶抑制劑。在化學(xué)術(shù)語中，索拉非尼被命名為4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨甲?；被鵠苯氧基]-n-甲基-吡啶-2-甲酰胺，并且具有以下結(jié)構(gòu)：舒尼替尼是用于治療癌癥的小分子多靶向受體酪氨酸激酶抑制劑。其通過靶向pdgfr和vegfr來抑制細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。在化學(xué)術(shù)語中，舒尼替尼被命名為n-(2-二乙基氨基乙基)-5-[(z)-(5-氟-2-氧代-1h-吲哚-3-亞基)甲基]-2，4-二甲基-1h-吡咯-3-甲酰胺，并且具有以下結(jié)構(gòu)：帕唑帕尼是用于治療癌癥的多激酶抑制劑。已知其靶向c-kit、pdgfr和vegfr。在化學(xué)術(shù)語中，其被命名為5-[[4-[(2，3-二甲基-2h-吲唑-6-基)甲基氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基苯磺酰胺，并且具有以下結(jié)構(gòu)：依維莫司是靶向mtor(雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶標(biāo))的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在化學(xué)術(shù)語中，其被命名為二羥基-12-[(2r)-1-[(1s，3r，4r)-4-(2-羥基乙氧基)-3-甲氧基環(huán)己基]丙-2-基]-19，30-二甲氧基-15，17，21，23，29，35-六甲基-11，36-二氧雜-4-氮雜三環(huán)[30.3.1.0三十六碳-16，24，26，28-四烯-2，3，10，14，20-五酮，并且具有以下結(jié)構(gòu)：aee788是被評(píng)估用于癌癥治療的小分子藥物。其為egfr(表皮生長(zhǎng)因子受體)和vegfr兩個(gè)家族成員的組合抑制劑。在化學(xué)術(shù)語中，其被命名為6-[4-[(4-乙基哌嗪-1-基)甲基]苯基]-n-[(1r)-1-苯基乙基]-7h-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4-胺，并且具有以下結(jié)構(gòu)：ptk787(瓦他拉尼)是被開發(fā)用于治療癌癥的抑制血管發(fā)生的蛋白激酶抑制劑。其抑制vegf受體、pdgfr-β和c-kit。在化學(xué)術(shù)語中，其被命名為n-(4-氯苯基)-4-(吡啶-4-基甲基)酞嗪-1-胺，并且具有以下結(jié)構(gòu)：另外的化學(xué)治療劑的實(shí)例包括egfr途徑抑制劑，例如抗-egfr抗體或egfr激酶抑制劑，例如西妥昔單抗、帕尼單抗、易瑞沙(吉非替尼或n-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)、或特羅凱(厄洛替尼(erlitonib)或n-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺)、或其他藥劑，例如herceptintm(曲妥珠單抗)?；瘜W(xué)治療劑的另一些實(shí)例包括：烷化劑，例如順鉑、卡鉑和奧沙利鉑；蒽環(huán)類；植物生物堿，例如紫杉烷和長(zhǎng)春花生物堿；以及拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，例如伊立替康、拓?fù)涮婵?、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷；或者氟尿嘧?5fu)。在另一個(gè)可能方案中，本發(fā)明的抗體分子可以與免疫治療劑一起施用，所述免疫治療劑例如免疫途徑劑，小分子劑，或者對(duì)pd-1、pdl-1、ctla-4或ox40具有特異性的抗體。在另一個(gè)可能方案中，本發(fā)明的抗體分子可以是其中抗體分子與藥物或毒素連接的抗體-藥物綴合物。這可以進(jìn)行以使藥物或毒素定向于存在cxcl12的生物系統(tǒng)中的靶位點(diǎn)。該方法可需要工程化抗體分子以提供能夠與藥物或毒素反應(yīng)的官能團(tuán)，或者作為替代地為抗體分子提供能夠與藥物或毒素反應(yīng)的接頭基團(tuán)。在本發(fā)明的這個(gè)方面，藥物也可以是用于在患者中的位靶點(diǎn)處轉(zhuǎn)化成活性藥物的前藥。因此，本發(fā)明提供了包含與細(xì)胞毒性部分或免疫刺激性部分綴合的本發(fā)明抗體分子的免疫綴合物。舉例來說，細(xì)胞毒性部分可以是烷化劑、生物堿、鉑配位絡(luò)合物、細(xì)胞毒性肽、放射性藥劑(radioactiveagent)或能夠轉(zhuǎn)化成細(xì)胞毒性部分的前藥。在另一方面，本發(fā)明涉及抗體分子，其用于cxcl12相關(guān)病癥的診斷或預(yù)后的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子可用于鑒定作為整體考慮與更廣泛種類的患者相比可能對(duì)治療更具響應(yīng)性的患者的測(cè)定。這進(jìn)而可以使得例如使用本發(fā)明抗體分子的治療針對(duì)最可能作出響應(yīng)的那些患者，同時(shí)為治療不太可能成功的患者提供替選形式的治療。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了測(cè)定樣品中cxcl12的存在的方法，所述方法包括使樣品與本發(fā)明的抗體分子接觸，使得cxcl12與抗體分子結(jié)合以形成復(fù)合物，并檢測(cè)因此產(chǎn)生的復(fù)合物。作為替代或補(bǔ)充，所述方法還可以使用本發(fā)明的抗體分子作為用于檢測(cè)cxcl12與捕獲抗體結(jié)合的試劑。優(yōu)選地，所述方法包括使用抗體來確定樣品中cxcl12的存在或量，并使cxcl12的存在或量與用cxcl12抑制劑治療患者的可能結(jié)果相關(guān)聯(lián)。在這種情況下，抗體分子可以以elisa-型形式使用，或者以其他方式與可檢測(cè)分子連接而標(biāo)記，所述可檢測(cè)分子例如但不限于放射性或熒光標(biāo)記或者利用顯色底物的酶。在該技術(shù)中使用的放射性標(biāo)記的實(shí)例是32p、3h或14c。在該技術(shù)中使用的熒光分子的實(shí)例是綠色熒光蛋白、異硫氰酸熒光素(fitc)、異硫氰酸羅丹明(trict)cy3和cy5染料。在該技術(shù)中可使用的具有顯色底物的酶的實(shí)例是過氧化物酶、堿性磷酸酶或葡萄糖氧化酶。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是對(duì)從所述個(gè)體獲得的樣品進(jìn)行的體外方法。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述方法可包括從所討論的個(gè)體獲得樣品和/或制備用于分析的樣品的初始步驟。用于所述方法的樣品的優(yōu)選實(shí)例包括血液樣品、組織樣品或細(xì)胞樣品。存在對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的上述技術(shù)的另一些變化形式。藥物組合物本發(fā)明的抗cxcl12抗體分子或免疫綴合物可以與可藥用賦形劑一起包含在藥物組合物中?？伤幱觅x形劑可以是進(jìn)入藥物組合物中的化合物或化合物組合，其不引起二次反應(yīng)并且允許例如促進(jìn)抗cxcl12抗體分子的施用、提高其壽命和/或其在體內(nèi)的效力，或者提高其在溶液中的溶解度。這些可藥用載劑是公知的，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)抗cxcl12抗體分子的施用模式對(duì)其進(jìn)行調(diào)整。在一些實(shí)施方案中，抗cxcl12抗體分子或免疫綴合物可以以在施用前重構(gòu)的凍干形式提供。例如，凍干的抗體分子可以在施用于個(gè)體之前在無菌水中重構(gòu)并與鹽水混合?？筩xcl12抗體分子通常以藥物組合物的形式施用，所述藥物組合物可包含除抗體分子之外的至少一種組分。因此，除抗cxcl12抗體分子之外，藥物組合物還可包含可藥用的賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他材料。這樣的材料應(yīng)當(dāng)沒有毒性并且不應(yīng)妨礙抗cxcl12抗體分子的效力。載體或其他材料的確切性質(zhì)將取決于施用途徑，如以下討論的，所述施用途徑可以是通過推注、輸液、注射或任何其他合適的途徑。對(duì)于靜脈內(nèi)施用(例如通過注射)，包含抗cxcl12抗體分子的藥物組合物可以是無熱原并且具有合適ph、等張性和穩(wěn)定性的腸胃外可接受的水溶液的形式。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人員能夠很好地使用例如等張載劑(例如氯化鈉注射劑、林格注射劑、乳酸化林格注射劑)來制備合適的溶液?？梢愿鶕?jù)需要使用防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其他添加劑，包括：緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽以及其他有機(jī)酸；抗氧化劑，例如抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；對(duì)羥基苯甲酸烷基酯，例如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3’-戊醇；以及間甲酚)；低分子量多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；鹽形成性反荷離子，例如鈉；金屬絡(luò)合物(例如zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非離子型表面活性劑，例如tweentm、pluronicstm或聚乙二醇(peg)。包含抗cxcl12抗體分子的藥物組合物可以單獨(dú)施用或者與其他治療組合根據(jù)待治療的病癥同時(shí)或依次施用。如本文中所描述的抗cxcl12抗體分子可用于人體或動(dòng)物體的治療方法，其包括預(yù)防性治療(例如，在個(gè)體中病癥發(fā)生之前的治療以降低個(gè)體中發(fā)生該病癥的風(fēng)險(xiǎn)、延遲其發(fā)生、或降低其發(fā)生后的嚴(yán)重程度)。所述治療方法可包括將抗cxcl12抗體分子施用于有此需要的個(gè)體。施用通常以“治療有效量”進(jìn)行，這足以顯示對(duì)患者的益處。這樣的益處可以是至少改善至少一種癥狀。實(shí)際的施用量以及施用速率和時(shí)間過程將取決于所治療病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、被治療的具體哺乳動(dòng)物、個(gè)體患者的臨床狀況、病癥的原因、組合物的遞送部位、施用方法、施用時(shí)間表以及醫(yī)學(xué)從業(yè)者已知的其他因素。治療的處方(例如劑量決定等)在全科醫(yī)師及其他醫(yī)生的責(zé)任范圍內(nèi)，并且可取決于被治療疾病的癥狀嚴(yán)重程度和/或進(jìn)程?？贵w分子的合適劑量是本領(lǐng)域中公知的(ledermannj.a.等(1991)int.j.cancer47：659-664；bagshawek.d.等(1991)antibody，immunoconjugatesandradiopharmaceuticals4：915-922)?？梢允褂迷诒疚闹谢騪hysician’sdeskreference(2003)中指出的適于所施用藥物類型的具體劑量。抗體分子的治療有效量或合適劑量可以通過比較其體外活性和在動(dòng)物模型中的體內(nèi)活性來確定。用于將在小鼠和其他測(cè)試動(dòng)物中的有效劑量外推至人的方法是已知的。精確的劑量將取決于許多因素，包括抗體是用于預(yù)防還是用于治療、待治療部位的大小和位置、抗體的精確性質(zhì)(例如，全抗體、片段)以及任何與抗體連接的可檢測(cè)標(biāo)記或其他分子的性質(zhì)。對(duì)于全身應(yīng)用而言，典型的抗體劑量將為100μg至1g，并且對(duì)于局部應(yīng)用而言為1μg至1mg?？梢允┯贸跏驾^高的負(fù)荷劑量，隨后一個(gè)或更多個(gè)較低的劑量。通常來說，抗體將是全抗體，例如根據(jù)鉸鏈區(qū)和fc區(qū)中氨基酸序列差異的igg1、igg2、igg3或igg4同種型。這些不同的同種型影響抗體分子的體內(nèi)半衰期及其誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的能力。因此，igg同種型的選擇可用于工程化本發(fā)明抗體分子的體內(nèi)特性。對(duì)于中和可溶性抗原(例如cxcl12)，效應(yīng)子功能較不關(guān)鍵，并且因此可優(yōu)選使用缺乏效應(yīng)子功能的抗體同種型(如igg2)來確定cxcl12中和的益處，而不受宿主免疫系統(tǒng)的干擾。這是成年患者的單次治療劑量，其可以針對(duì)兒童和嬰幼兒成比例地調(diào)整，并且還可與分子量成比例地調(diào)整用于其他抗體形式。由醫(yī)師決定，治療可以以每天一次、每周兩次、每周一次或每月一次的間隔重復(fù)。治療對(duì)于皮下施用可以是每?jī)芍苤了闹埽约皩?duì)于靜脈內(nèi)施用可以是每四周至八周。治療可以是周期性的，并且施用之間的時(shí)間為約兩周或更久，例如約三周或更久、約四周或更久，或者約一個(gè)月。治療可以在外科手術(shù)之前和/或之后給予，和/或可以直接施用或施加在外科手術(shù)治療或侵入性操作的解剖部位。合適的配方和施用途徑如上所述。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)劑量，抗cxcl12抗體分子的治療效果可以持續(xù)數(shù)個(gè)半衰期。例如，單劑量的抗cxcl12抗體分子的治療效果可以在個(gè)體中持續(xù)1個(gè)月或更久、2個(gè)月或更久、3個(gè)月或更久、4個(gè)月或更久、5個(gè)月或更久、或者6個(gè)月或更久。材料和方法通過噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生cxcl12中和抗體在cxcl12上淘選抗體文庫使用含有超過100億個(gè)scfv形式的抗體克隆的“mccafferty天然抗體文庫”來分離抗cxcl12抗體，然后在基于細(xì)胞的測(cè)定中篩選所得到的抗體，以評(píng)估阻斷cxcl12-cxcr4相互作用的潛力。更詳細(xì)地，在固定在鏈霉親和素或中性親和素(neutravidin)上的生物素化cxcl12上進(jìn)行兩輪淘選。為了避免富集與鏈霉親和素或中性親和素結(jié)合的抗體克隆，采用了兩種策略。第一輪淘選使用已經(jīng)耗盡任何鏈霉親和素結(jié)合劑的噬菌體文庫在固定在鏈霉親和素上的生物素化cxcl12上進(jìn)行(稱為“去選擇(de-selection)”或“減法選擇(subtractiveselection)”)。對(duì)于第2輪，使用中性親和素(代替鏈霉親和素)來固定cxcl12。在針對(duì)cxcl12、鏈霉親和素、中性親和素和非特異性抗原(nck1)的trf結(jié)合測(cè)定中測(cè)試從第2輪淘選輸出制備的多克隆噬菌體以確定特異性富集。觀察到的結(jié)合信號(hào)是cxcl12特異性的，并且對(duì)鏈霉親和素、中性親和素和nck1沒有觀察到可檢出的結(jié)合?？筩xcl12抗體篩選對(duì)來自第2輪淘選輸出的scfv群體進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并克隆到psang10-3f表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化到bl21中。psang10-3f編碼scfv基因下游的六組氨酸標(biāo)簽(用于ni親和純化)和三-flag標(biāo)簽(用于檢測(cè))。將940個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)化體挑選到10×96孔培養(yǎng)板中，并使用自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)抗體表達(dá)。測(cè)試過夜誘導(dǎo)后分泌到培養(yǎng)物上清液中的重組單克隆抗體與cxcl12的結(jié)合。將含有分泌的scfv的培養(yǎng)物上清液用于trf結(jié)合測(cè)定，其中使用與銪綴合的抗-flag抗體檢測(cè)與生物素化cxcl12(固定在96孔板中的鏈霉親和素上)的scfv結(jié)合。信號(hào)高于1000fu(高于背景的100倍)的克隆被認(rèn)為是cxcl12結(jié)合陽性的。發(fā)現(xiàn)篩選的克隆的約24％(224/940)是cxcl12結(jié)合陽性的。精選前184個(gè)克隆用于序列分析和進(jìn)一步表征。使用4種引物通過sanger測(cè)序產(chǎn)生精選克隆的序列，并組裝每個(gè)克隆的共有序列。使用blaze抗體分析軟件分析共有序列的cdr和框架區(qū)。通過將分析集中于重鏈和輕鏈的cdr3中的變異，發(fā)現(xiàn)了118種獨(dú)特的scfv序列。在這些序列中，在其他cdr或框架殘基中存在額外的變化，提供另外38個(gè)獨(dú)特的序列，即來自所測(cè)序的184種中的156種獨(dú)特序列。對(duì)框架區(qū)的詳細(xì)分析揭示偏向于某些重鏈和輕鏈種系家族。vh3(62％)和vh1(43％)是發(fā)現(xiàn)頻率最高的重鏈家族，同時(shí)vκ1(58％)，其次是vκ2(17％)主導(dǎo)輕鏈序列。表1.初級(jí)cxcl12抗體的序列分析的快照。使用blaze軟件分析框架區(qū)和cdr區(qū)，并且基于vh和vlcdr3序列中的相似性將抗體聚類(例如，093_e11和093_e10)?？寺dvh種系vl種系vhcdr3vlcdr3093_1c03vh1_dp-5_(1-24)vλ3_3hlisgsyrledyf.........dhqawdsstg.........yv093_2g07vh3_dp-86_(3-66)vk1_dpk1_(o18、o8)easdpryyydssgyyygm.....dvqqydnlp.........lt093_2a11vh3_dp-42_(3-53)vk1_dpk4_(a20)easdpryyydssgyyygm......dvqkynsap.........rt093_2h09vh1_dp-88_(1-e)vk2_dpk1s_(a17)dyndwgaf.........elvqgthwp.........wt093_1h10vh1_dp-5_(1-24)vk1_dpk4_(a20)egydssgygarpryyyygm....dvqqsyntp.........rt093_1e11.093_1e10vh3_dp-53_(3-74)vk2_dpk18_(a17)dsldgngsgswddaf......divqgthwp.........wt093_2g12vh1_dp-5_(1-24)vλ6_6agsayvygsgsyykapyyyyygmdvqsytssn.........qv093_2b01vh3_dp-46_(3-30.3)vk1_dpk1_(o18，o8)gmgygm.........dlqqydnlp.........yt093_2f10vh3_dp-17_(3-23)vλ2_dpl10_(2b2)eggdpttpttt.........tvcsyagpft.........vi093_2f12vh3_dp-49_(3-30.5)vλ1_dpl3_(1g)ddstadl.........dyaavddslsgp.........yv鑒定阻斷cxcl12與cxcr4結(jié)合的抗體從初步篩選和序列分析鑒定到一大批獨(dú)特的cxcl12結(jié)合劑。為了鑒定阻斷cxcl12-cxcr4相互作用的抗體，建立了使用流式細(xì)胞術(shù)的基于細(xì)胞的cxcl12-cxcr4結(jié)合測(cè)定。人急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系(molt-4)被鑒定為用于cxcl2-cxcr4結(jié)合測(cè)定的理想的表達(dá)cxcr4的細(xì)胞系，因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)其是cxcr7表達(dá)陰性的。在該測(cè)定中，使用與藻紅蛋白(phycoerythrin)綴合的鏈霉親和素(鏈霉親和素-pe)檢測(cè)生物素化cxcl12與表達(dá)cxcr4的molt-4細(xì)胞的結(jié)合。然后測(cè)試抗cxcl12抗體抑制這種相互作用的能力。首先，進(jìn)行大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳測(cè)定參數(shù)(例如檢測(cè)方法、cxcl12的量、封閉劑的濃度等)，以實(shí)現(xiàn)最大測(cè)定靈敏度。測(cè)試一步結(jié)合檢測(cè)方法，并將其與兩步結(jié)合檢測(cè)方法進(jìn)行比較。一步結(jié)合檢測(cè)方法涉及利用已經(jīng)與鏈霉親和素-pe預(yù)復(fù)合的生物素化cxcl12對(duì)molt-4細(xì)胞直接染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)合。相比之下，兩步結(jié)合檢測(cè)方法涉及用生物素化cxcl12孵育molt-4細(xì)胞，洗滌，然后用鏈霉親和素-pe染色，然后進(jìn)行通過流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)合檢測(cè)。與用一步檢測(cè)方法觀察到的熒光的廣泛分布相比，兩步檢測(cè)方法產(chǎn)生了尖的熒光峰。此外，cxcl12和鏈霉親和素-pe的預(yù)復(fù)合會(huì)導(dǎo)致cxcl12分子的四聚體呈遞。這會(huì)導(dǎo)致可阻礙單體scfv對(duì)cxcl12-molt-4細(xì)胞相互作用之阻斷的親和力效應(yīng)。由于這些原因，選擇了用于檢測(cè)cxcl12結(jié)合的兩步方法用于阻斷測(cè)定。劑量響應(yīng)分析鑒定用于測(cè)定的cxcl12的最佳濃度為7.5μg/ml。將從40μg/ml開始的生物素化cxcl12的兩倍稀釋系列與表達(dá)cxcr4的molt-4細(xì)胞一起孵育。使用流式細(xì)胞術(shù)通過鏈霉親和素-pe檢測(cè)cxcl12與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)合。將每個(gè)測(cè)試樣品觀察到的平均熒光相對(duì)于cxcl12濃度作圖?；诔醪胶Y選中的重鏈cdr3序列多樣性和結(jié)合信號(hào)，在該測(cè)定中選擇來自從初步篩選中鑒定的118種抗cxcl12抗體的39個(gè)克隆用于阻斷。由這些克隆產(chǎn)生scfv抗體，并通過固定化金屬離子親和色譜進(jìn)行純化。然后，在cxcl12-molt-4細(xì)胞結(jié)合測(cè)定中測(cè)試經(jīng)純化抗體(和非特異性抗體)的阻斷活性?；赾xcl12-molt-4細(xì)胞結(jié)合的抑制百分比，選擇20種阻斷活性大于45％的抗體進(jìn)行進(jìn)一步研究(表2)。表2.來自基于細(xì)胞的cxcl12-cxcr4結(jié)合測(cè)定的前20種阻斷抗體。排名克隆id細(xì)胞結(jié)合測(cè)定中的百分比阻斷1093_1c03992093_2a02963093_2d06944093_1f01875093_2g07866093_2g10837093_1c04658093_2c02649093_2e046310093_1a106311093_1a085912093_1g075813093_2g095714093_1a095415093_1f095416093_1g105117093_2e125118093_2d055119093_2a104620093_1a1145初級(jí)抗cxcl12抗體的親和力成熟和功能表征初級(jí)抗體噬菌體展示選擇和篩選鑒定了阻斷cxcl12與cxcr4結(jié)合的數(shù)種抗體。治療應(yīng)用通常需要單克隆抗體具有低至亞納摩爾范圍的親和力以實(shí)現(xiàn)期望的臨床效力。在低嚴(yán)格條件下從“mccafferty文庫”淘選通常產(chǎn)生親和力為10nm至1μm的初級(jí)抗體。通常將這樣的抗體在體外親和力成熟，以得到用于給定應(yīng)用的足夠親和力?？贵w的體外親和力成熟可以通過模擬在體液免疫應(yīng)答期間發(fā)生的體內(nèi)過程來實(shí)現(xiàn)。對(duì)抗原刺激的初始響應(yīng)涉及從表達(dá)低親和力抗體的大且多樣化的免疫前b細(xì)胞庫中選擇抗原特異性b細(xì)胞。然后，這些初級(jí)的低親和力抗體經(jīng)歷稱為體細(xì)胞超突變的過程，其中其在重鏈和輕鏈可變區(qū)中積累點(diǎn)突變。表達(dá)高親和力抗體的b細(xì)胞與表達(dá)低親和力抗體的b細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)抗原刺激而存活并增殖。通過重復(fù)循環(huán)的體細(xì)胞高頻突變和表達(dá)較高親和力抗體的b細(xì)胞的優(yōu)先擴(kuò)增，免疫系統(tǒng)逐漸建立對(duì)入侵病原體的有效應(yīng)答。類似于體內(nèi)過程，通常使用的體外親和力成熟策略涉及兩個(gè)關(guān)鍵步驟：初級(jí)抗體序列的多樣化和使用選擇平臺(tái)(例如噬菌體展示技術(shù))的親和力提高的抗體的選擇性富集。初級(jí)抗體序列的多樣化可以通過使用隨機(jī)或靶向誘變?cè)诳勺儏^(qū)中引入突變來實(shí)現(xiàn)。或者，可以通過稱為鏈混編的方法將所選擇的重鏈或輕鏈與配偶體鏈的庫重組來產(chǎn)生重鏈和輕鏈可變區(qū)的新組合。鑒于抗體的模塊化性質(zhì)，可以通過簡(jiǎn)單的克隆容易地產(chǎn)生鏈混編文庫，因此這是選擇的用于親和力成熟初級(jí)抗cxcl12抗體的方法。由于重鏈可變結(jié)構(gòu)域通常在抗原結(jié)合和限定表位特異性中發(fā)揮主導(dǎo)作用，因此輕鏈混編優(yōu)于重鏈混編以保留初級(jí)抗體的結(jié)合表位。鏈混編文庫的構(gòu)建和在cxcl12上的嚴(yán)格噬菌體展示選擇為了產(chǎn)生輕鏈混編文庫，通過pcr擴(kuò)增前20種阻斷抗體的抗體重鏈區(qū)。將得到的pcr產(chǎn)物克隆到噬菌體展示輕鏈文庫制備物中，所述制備物包含天然λ和κ輕鏈可變區(qū)配偶體的庫(在載體psang4中)。將隨后的質(zhì)粒群體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌tg1中以產(chǎn)生含有2.6×108個(gè)scfv克隆的文庫。因此，每個(gè)原始重鏈與約1000萬個(gè)新的輕鏈配偶體配對(duì)。為了評(píng)估重鏈插入的頻率，通過菌落pcr篩選分析來自輕鏈混編文庫的20個(gè)隨機(jī)克隆。20個(gè)克隆中的19個(gè)顯示全長(zhǎng)scfv基因的存在(未示出)，表明文庫中約95％的克隆是輕鏈混編重組體。從任何文庫中成功分離高親和力抗體需要可以選擇性地富集高親和力結(jié)合劑的嚴(yán)格選擇條件?？梢允褂脺p小抗原濃度通過噬菌體選擇的迭代循環(huán)來富集具有高親和力的抗體。該方法依賴于對(duì)有限量抗原的競(jìng)爭(zhēng)和具有較低解離常數(shù)的變體的優(yōu)先富集。為了精確控制抗原濃度，在溶液相中進(jìn)行噬菌體展示選擇。允許噬菌體抗體在溶液中與生物素化抗原結(jié)合，并隨后使用經(jīng)鏈霉親和素涂覆的表面捕獲結(jié)合的噬菌體用于洗滌和洗脫。在該步驟中，可通過包括許多嚴(yán)苛且長(zhǎng)的洗滌步驟來進(jìn)一步提高選擇的嚴(yán)格性。為了從輕鏈混編文庫中分離高親和力的抗cxcl12抗體，在生物素化cxcl12上進(jìn)行三輪溶液相選擇。通過針對(duì)一定范圍的抗原濃度選擇噬菌體抗體并將輸出數(shù)與“無抗原”對(duì)照進(jìn)行比較，憑經(jīng)驗(yàn)確定每輪的最佳抗原濃度。第三輪還包括一組這樣的選擇，其中對(duì)捕獲的噬菌體-抗原復(fù)合物進(jìn)行17小時(shí)洗滌(每小時(shí)用含有0.2％tween-20的磷酸緩沖鹽水洗滌6次)以進(jìn)一步提高嚴(yán)格性。篩選用于親和力成熟的單克隆結(jié)合劑的選擇輸出對(duì)來自第3輪選擇輸出的scfv群體進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并克隆到psang10-3f表達(dá)載體中，并將得到的質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)化到大腸桿菌bl21de3細(xì)胞中。將960個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)化體挑選到10×96孔培養(yǎng)板中，并使用自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)抗體表達(dá)。在trf結(jié)合測(cè)定中篩選過夜誘導(dǎo)后分泌到培養(yǎng)物上清液中的重組單克隆抗體結(jié)合cxcl12的能力。發(fā)現(xiàn)從多個(gè)選擇輸出篩選出的48％(458/960)克隆對(duì)于cxcl12結(jié)合是陽性的。這些克隆顯示的結(jié)合信號(hào)顯著優(yōu)于從天然文庫分離的克隆的結(jié)合信號(hào)。從鏈混編選擇輸出篩選出的37％克隆顯示高于10,000個(gè)熒光單位(fu)的結(jié)合信號(hào)。相比之下，僅12％的從天然文庫分離的克隆顯示超過10,000fu的結(jié)合信號(hào)。由于在篩選中測(cè)試的克隆未對(duì)表達(dá)進(jìn)行歸一化，因此觀察到的cxcl12結(jié)合提高可以是由于提高的表達(dá)或提高的親和力。使用blaze抗體序列分析軟件分析cxcl12結(jié)合克隆。重鏈和輕鏈cdr3多樣性的分析鑒定了227個(gè)獨(dú)特的克隆。盡管在鏈混編文庫的構(gòu)建中使用了20種不同的vh基因，但在鑒定到的227個(gè)獨(dú)特克隆中僅代表了9種vh基因。在這個(gè)組中，有四個(gè)主要的克隆家族。這些來源于原始克隆093_2a02(122/227)、093_2d06(38/227)、093_2g07(24/227)和093_2a10(22/227)的vh基因。類似于從天然文庫分離的克隆，這些鏈混編克隆的vl種系使用以vκ1(63％)和vκ2(22％)種系家族為主。在初步篩選中對(duì)于特定克隆觀察的cxcl12結(jié)合信號(hào)取決于抗體表達(dá)和親和力的組合效應(yīng)。由于抗體表達(dá)在克隆與克隆之間顯著變化，所以通過其在初步篩選中的結(jié)合信號(hào)對(duì)抗體進(jìn)行排名并不一定與其親和力相關(guān)聯(lián)。因此，使用獨(dú)立于表達(dá)的二次篩選測(cè)定以鑒定具有優(yōu)異結(jié)合動(dòng)力學(xué)的高親和力抗cxcl12抗體。在該篩選測(cè)定中，使用表面等離子體共振(surfaceplasmonresonance，spr)分析前150種抗cxcl12scfv抗體的解離常數(shù)(脫離速率)?？贵w-抗原相互作用的解離常數(shù)是與濃度無關(guān)的，并且因此不需要將不同抗體表達(dá)歸一化。然而，由于scfv抗體在溶液中二聚化的傾向，單價(jià)抗體-抗原(1∶1)相互作用的精確測(cè)量是復(fù)雜的，并且常常導(dǎo)致結(jié)合常數(shù)的錯(cuò)誤測(cè)定。因此，將在scfv-spr篩選中顯示低解離常數(shù)的24種抗體的組重新形式化為fab抗體，用于進(jìn)行另一循環(huán)的“脫離速率篩選”。與scfv不同，fab抗體在單體形式是穩(wěn)定的，并且對(duì)于準(zhǔn)確的動(dòng)力學(xué)分析是最佳的。抗體克隆114_3h1(來自于093_2d06)和113_1h12(來自于093_2a02)在所測(cè)試的24種fab抗體中顯示出最佳的脫離速率(即最低解離常數(shù))。選擇這兩個(gè)克隆作為先導(dǎo)抗cxcl12抗體進(jìn)行詳細(xì)表征。這些抗體的序列提供在序列表中。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中作為fab和igg表達(dá)和純化抗cxcl12抗體直到第二循環(huán)脫離速率篩選的所有抗體工作均使用scfv形式的抗體進(jìn)行。由于在大腸桿菌中的高效表達(dá)，scfv形式非常適合于噬菌體展示選擇和隨后篩選大量克隆以鑒定一組先導(dǎo)抗體。然而，存在很多與這種形式相關(guān)的限制，使其對(duì)于下游生物物理學(xué)和生物學(xué)表征不是最佳的。例如，由于在溶液中二聚化的傾向，scfv的親和力測(cè)定很復(fù)雜。scfv分子的穩(wěn)定性差使其易于聚集和沉淀，從而限制了其長(zhǎng)期儲(chǔ)存。此外，來自大腸桿菌的scfv制備物中高水平內(nèi)毒素的存在限制了其在許多基于細(xì)胞的測(cè)定中的使用。因此，從初步篩選測(cè)定鑒定的scfv通常被重新形式化為更大且更穩(wěn)定的抗體形式，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)用于下游表征和體內(nèi)測(cè)試。將兩種先導(dǎo)抗cxcl12抗體及其親本克隆重新形式化為fab和igg。fab對(duì)于準(zhǔn)確測(cè)定結(jié)合常數(shù)是最佳的。而igg對(duì)于大部分臨床批準(zhǔn)的抗體和開發(fā)中的抗體是優(yōu)選形式。其優(yōu)異的體內(nèi)半衰期和參與宿主免疫系統(tǒng)的能力對(duì)于治療疾病(例如，癌癥)是理想的。此外，igg分子的二價(jià)性質(zhì)極大增強(qiáng)了其在體外和體內(nèi)的抗原中和能力。本發(fā)明的抗cxcl12抗體的序列可以在設(shè)計(jì)用于產(chǎn)生抗體分子的任何合適的表達(dá)系統(tǒng)中使用。該工作中討論的所有scfv抗體均由psang10-3f載體表達(dá)，其中單個(gè)t7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)通過甘氨酸-絲氨酸接頭連接的重和輕可變結(jié)構(gòu)域的表達(dá)(圖1a)。在該系統(tǒng)中，scfv基因被轉(zhuǎn)錄為單mrna并且被翻譯為單蛋白質(zhì)。相比之下，常用的哺乳動(dòng)物fab和igg表達(dá)系統(tǒng)使用單獨(dú)轉(zhuǎn)錄和翻譯重鏈和輕鏈基因的表達(dá)盒。在這里，我們使用雙順反子載體(pbiocam-7)在hek-293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)抗cxcl12fab(圖1b)。在pbiocam7中，抗體輕鏈(vl+cl)和重鏈(vh+ch)基因被編碼來自豬捷申病毒1(teschovirus-1)的“核糖體跳讀”肽(稱為p2a肽)的基因區(qū)段分隔開。該fab表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生整個(gè)fab盒(vl+cl-p2a-vh+ch)的單mrna轉(zhuǎn)錄物。然而，在翻譯期間，核糖體在p2a肽的c末端跳過甘氨酰-脯氨酰肽鍵的合成，導(dǎo)致緊鄰其下游的多肽鏈的釋放。然后，重鏈和輕鏈多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmicreticulum，er)中獨(dú)立地折疊并組裝以形成fab分子。輕鏈c末端的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)有助于從fab蛋白翻譯后去除p2a肽。為了以igg形式表達(dá)抗cxcl12抗體，使用雙質(zhì)粒系統(tǒng)，其中重鏈和輕鏈表達(dá)盒攜帶在兩個(gè)不同的質(zhì)粒上(圖1c)。在將這些質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到hek-293細(xì)胞中后，重鏈和輕鏈基因被單獨(dú)轉(zhuǎn)錄和翻譯，之后在er中組裝成igg分子。根據(jù)鉸鏈區(qū)和fc區(qū)中氨基酸序列的差異，將igg抗體分為4種同種型(igg1、igg2、igg3和igg4)。這些不同的同種型影響抗體分子的體內(nèi)半衰期及其誘導(dǎo)效應(yīng)子功能的能力。因此，可以使用igg同種型的選擇來工程化本發(fā)明抗體分子的體內(nèi)特性。對(duì)于中和可溶性抗原(例如cxcl12)，效應(yīng)子功能較不關(guān)鍵。事實(shí)上，為了確定cxcl12中和的益處而不受宿主免疫系統(tǒng)的干擾，期望具有缺乏效應(yīng)子功能的抗體用于后續(xù)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。因此，我們選擇igg2同種型，其表現(xiàn)出降低的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(antibodydependentcell-mediatedcytotoxicity，adcc)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(complementdependentcytotoxicity，cdc)。對(duì)于fab和igg表達(dá)，將先導(dǎo)抗體(114_3h1和113_1h12)及其親本克隆(093_2d06和093_2a02)的可變區(qū)亞克隆到pbiocam-7載體和igg2表達(dá)質(zhì)粒(pbiocam-1和pbiocam2-igg2)中。制備這些質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染質(zhì)量dna，并轉(zhuǎn)染到hek-293f細(xì)胞中用于瞬時(shí)抗體表達(dá)。分別使用鎳和蛋白g親和色譜方法從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(轉(zhuǎn)染后6天)純化fab和igg抗體。如圖2所示，純化的fab和igg由預(yù)期大小的重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。抗cxcl12抗體的親和力測(cè)量對(duì)先導(dǎo)抗cxcl12抗體及其親本克隆進(jìn)行全動(dòng)力學(xué)分析以確定親和力成熟后結(jié)合常數(shù)的提高。使用spr分析fab抗體與固定在鏈霉親和素芯片上的生物素化cxcl12的結(jié)合(圖3)。使用適合于每種結(jié)合相互作用的結(jié)合模型測(cè)定這些抗體的平衡解離常數(shù)(kd)(圖3b和c)。在所測(cè)試的四種抗體中，114_3h1對(duì)cxcl12的親和力最高，kd為1nm。這表明在鏈混編后，與其親本克隆093_2d06(kd＝3800nm)相比親和力提高了3800倍。093_2a02及其親和力成熟變體113_1h12二者都表現(xiàn)出雙相結(jié)合特征：初始速解離相快，然后是慢得多的第二解離相。這種結(jié)合特征通常與涉及抗體(或任何其他分析物)誘導(dǎo)的配體構(gòu)象變化導(dǎo)致兩步結(jié)合的結(jié)合相互作用相關(guān)。通過spr分析113_1h13和092_2a02的兩種不同制備物。使用這兩個(gè)蛋白質(zhì)批次獲得了類似的結(jié)果，證實(shí)所觀察到的結(jié)合特征不是人為的或特定蛋白質(zhì)制備物的問題。只有來自相同vh譜系的抗體表現(xiàn)出雙相結(jié)合的事實(shí)支持這些抗體可能具有兩步結(jié)合機(jī)制的假設(shè)。因此，使用雙態(tài)結(jié)合模型確定這些抗體的親和力(圖3c)。計(jì)算的113_1h12和093_2d06的結(jié)合親和力分別為3.7nm和16.7nm，其表明輕鏈混編后親和力提高了4.5倍。先導(dǎo)抗cxcl12抗體對(duì)癌細(xì)胞遷移的抑制表達(dá)cxcr4的癌細(xì)胞向富cxcl12環(huán)境的遷移是許多惡性腫瘤中促進(jìn)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。cxcl12/cxcr4依賴性癌細(xì)胞遷移的抑制是本發(fā)明的治療性抗cxcl12抗體分子的重要生物學(xué)特性。因此，使用transwell遷移測(cè)定測(cè)試先導(dǎo)抗體114_3h1和113_1h12阻斷cxcl12誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞遷移的能力。這里使用的transwell遷移測(cè)定是用于研究白細(xì)胞趨化應(yīng)答的boyden室測(cè)定的改進(jìn)形式。在該測(cè)定中，分析了接種在上室中的熒光標(biāo)記人卵巢癌細(xì)胞(tov-21g)穿過多孔膜并進(jìn)入含有cxcl12的下室的遷移(圖4a)。先前的研究表明，cxcl12二聚體在較高的濃度下形成，可以抑制細(xì)胞遷移。因此，憑經(jīng)驗(yàn)確定用于刺激細(xì)胞遷移的最佳cxcl12濃度(圖4b)。為了評(píng)估先導(dǎo)抗cxcl12抗體抑制cxcl12誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞遷移的能力，在上述transwell遷移測(cè)定中進(jìn)行114_3h1igg和113_1h12igg的滴定。兩種抗體均以劑量依賴性方式抑制tov-21g細(xì)胞的遷移(圖5)。114_h01和113_1h12的半數(shù)最大抑制濃度(ic50)分別為4.6(±0.5)nm和13.2(±4.1)nm。這些值與通過spr確定的平衡解離常數(shù)相一致。進(jìn)一步的重復(fù)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，證實(shí)114_h01和113_1h12的ic50值分別為5nm和9nm。先導(dǎo)抗cxcl12抗體對(duì)血管發(fā)生的抑制腫瘤的存活和增殖很大程度上依賴于提供氧和營(yíng)養(yǎng)物的充分供應(yīng)的支持性血管網(wǎng)絡(luò)。cxcl12/cxcr4軸在促進(jìn)新血管形成(血管發(fā)生)以建立腫瘤支持性血管系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。cxcl12和cxcr4與vegf(公知的促血管發(fā)生因子)形成正反饋回路。在該回路中，vegf刺激cxcl12和cxcr4二者的表達(dá)。相反，cxcl12誘導(dǎo)的cxcr4激活上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生vegf。因此，在體外血管發(fā)生測(cè)定中測(cè)試先導(dǎo)抗cxcl12抗體以評(píng)價(jià)其抑制小管形成和分支的能力。在該測(cè)定中，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)和成纖維細(xì)胞一起在含有抗cxcl12抗體和vegf的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這兩種細(xì)胞類型在vegf存在下的相互作用導(dǎo)致形成三維管，其類似于體內(nèi)小毛細(xì)血管。通過免疫組織化學(xué)在共培養(yǎng)7天后分析抗cxcl12抗體的抑制作用(圖6)。用于分析血管發(fā)生的最有價(jià)值的參數(shù)是小管長(zhǎng)度和每個(gè)小管的分支數(shù)。內(nèi)皮細(xì)胞在vegf刺激后形成長(zhǎng)的分支小管，并且這不受非特異性抗體存在的影響。利用113_1h12觀察到小管形成和分支的顯著抑制(圖6b)。與wo2008/018641的抗體的比較wo2008/018641描述了兩個(gè)抗cxcl12抗體對(duì)：1d3和1h2以及1c6和2a5。所述抗體對(duì)識(shí)別cxcl12中的共同表位。將wo2008/018641中抗體的重鏈和輕鏈的序列與本發(fā)明抗體的序列進(jìn)行比對(duì)，并且比對(duì)結(jié)果示出在圖8中。這表明與本發(fā)明的抗體114_h01和113_1h12相比，這些抗體的cdr序列中存在顯著性差異。還比較了抗體的親和力。抗體114_h01對(duì)人cxcl12的親和常數(shù)(kd)為2.4nm，且抗體113_1h12為4.2nm。這與對(duì)于wo2008/018641中抗體所報(bào)道的值進(jìn)行了比較：1d3kd＝151nm；1h2kd＝176nm；1c6kd＝3.6nm和2a5kd＝4.6nm。親和力數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的抗體114_h01和113_1h12具有與對(duì)wo2008/018641中抗體所報(bào)道的最佳結(jié)果一樣好或比其更好的親和力，盡管使用fab形式的抗體而不是igg，這通常導(dǎo)致相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)低估了本發(fā)明的抗體的親和力。表位作圖將抗體113_1h12和114_h01結(jié)合的表位與wo2008/018641中公開的四種示例性抗體結(jié)合的表位進(jìn)行比較。這些實(shí)驗(yàn)表明113_1h12與wo2008/018641的抗體1d3和1h2部分地共享表位，而114_3h1具有與wo2008/018641的抗體僅共享一個(gè)殘基的獨(dú)特表位。e15在參與受體或肝素結(jié)合的區(qū)域之外。所有的其他表位殘基都在參與受體結(jié)合的區(qū)域之內(nèi)，其根據(jù)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)在uniprotp48061(sdf1_人)的編號(hào)為29-33、39-41、48-50、60-70)。wo2008/018641公開了參與受體結(jié)合的殘基位于氨基酸殘基7-19之間。在嵌合鼠igg2a骨架中的抗cxcl12單克隆抗體的特性將113_1h12和114_3h1的可變區(qū)克隆到鼠igg2a表達(dá)系統(tǒng)中，允許用產(chǎn)生具有鼠恒定區(qū)和人可變區(qū)的嵌合抗體。這種嵌合抗體可優(yōu)選用于免疫活性動(dòng)物中的體內(nèi)測(cè)試以降低在施用全人抗體之后可能發(fā)生的針對(duì)抗體的免疫應(yīng)答。a)遷移測(cè)定使用鼠轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞系(b16f10)和人卵巢癌細(xì)胞系(tov21g)研究嵌合鼠igg2a和全人igg2形式的抗體阻斷人和鼠細(xì)胞系的細(xì)胞遷移的能力。所有抗體均以50μg/ml的濃度使用。人cxcl12配體(peprotech)以500ng/ml的濃度使用。在dmem(用于b16f10研究)或rpmi(用于tov21g研究)中制備抗體和配體。對(duì)于每個(gè)時(shí)間推移遷移測(cè)定，在蓋玻片遷移室內(nèi)的膠原蛋白-細(xì)胞混合物中使用3×106至4×106個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞懸液與膠原蛋白混合物以1(細(xì)胞)∶2(膠原蛋白)的比例組合。膠原蛋白混合物由1∶2∶15比例的碳酸氫鈉、10xmem和膠原蛋白(3mg/ml，sigma)構(gòu)成。將抗體添加到細(xì)胞-膠原蛋白混合物中，并將所得混合物插入到遷移室中，在此通過在37℃下孵育30分鐘使膠原蛋白聚合。一旦聚合，添加cxcl12配體以產(chǎn)生趨化因子梯度，并使用時(shí)間推移成像確定細(xì)胞向cxcl12的運(yùn)動(dòng)。在3.5至4小時(shí)的時(shí)間內(nèi)以1張照片/分鐘的間隔拍攝圖像。時(shí)間推移成像允許使細(xì)胞遷移蹤跡可視化，然后使用imagej軟件對(duì)其進(jìn)行分析以確定細(xì)胞遷移的程度。b16f10細(xì)胞在cxcl12和3種阻斷抗體存在下的遷移距離在圖9a和9b中示出。所有抗體(人igg2形式的113_1h12(hab113)、嵌合鼠igg2a形式的113_1h12(mab113)和嵌合鼠igg2a形式的114_3h1(mab114))在b16f10細(xì)胞中均有效地顯著阻斷細(xì)胞遷移，并且在tov-21細(xì)胞中也在一定程度上阻斷。在該測(cè)定中，人igg2形式的113_1h12(hab113)在阻斷tov21g細(xì)胞遷移方面是無活性的，而mab113是完全活性的，mab114在一定程度上介于其之間。然而，從圖5的結(jié)果我們知道，人igg2形式的113_1h12抗體可以抑制tov21g細(xì)胞系向cxcl12的遷移，因此這里的無活性結(jié)果可能是異常現(xiàn)象。這些結(jié)果總結(jié)在圖9a中。此外，所有三種抗體均有效地抑制b16f10細(xì)胞的cxcl12依賴性遷移。這在圖9b中圖示示出。因此，這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)嵌合鼠igg2a形式的抗體在體外遷移測(cè)定中發(fā)揮作用，并且能夠抑制癌細(xì)胞遷移。b)血清穩(wěn)定性測(cè)試測(cè)試嵌合鼠igg2a形式的抗體114_3h1和113_1h12的血清穩(wěn)定性。使用人血清進(jìn)行血清穩(wěn)定性測(cè)定。將抗體以100μg/ml的濃度在血清中孵育6、12、24和48小時(shí)。將含有抗體的血清在dmem或rpmi中稀釋至濃度為50μg/ml，并用于如上文a中所述的時(shí)間推移遷移測(cè)定。這些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)嵌合鼠igg2a形式的抗體在血清中在48小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定，并且在血清中48小時(shí)后在抑制cxcl12依賴性b16f10細(xì)胞遷移方面依然有活性。這證實(shí)這兩種抗體在血清中都非常穩(wěn)定。c)體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移b16f10黑素瘤細(xì)胞需要cxcr4用于遷移到肺并開始轉(zhuǎn)移。使用簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移體內(nèi)模型來評(píng)價(jià)嵌合鼠igg2a抗體干擾cxcl12并因此阻斷轉(zhuǎn)移發(fā)生的能力。在第0天，通過尾靜脈注射將b16f10黑素瘤細(xì)胞引入c57b1小鼠中，并在第1天開始處理。處理方案為每天兩次5mg/kg的臨床cxcr4抑制劑amd3100(普樂沙福)，或者每周兩次10、15或20mg/kg鼠igg2a形式的抗cxcl12抗體。對(duì)照組的小鼠用20mg/kg的鼠igg2a對(duì)照抗體每周處理兩次。所有小鼠均在第14天被處死，并通過手動(dòng)計(jì)數(shù)量化肺中轉(zhuǎn)移性集落的數(shù)量。如圖10所示，嵌合鼠114_3h1和113_1h12兩種抗體均具有抑制轉(zhuǎn)移發(fā)生的活性。特別地，抗體113_1h12的效力更高，并且在20mg/kg下產(chǎn)生的抑制與用5mg/kg的cxcr4的小分子拮抗劑amd3100觀察到的抑制等效。因此，這兩種抗體在體內(nèi)均具有抑制cxcr4依賴性肺轉(zhuǎn)移的活性。序列表抗體114_3h1seoidno：1：cdr-h1氨基酸序列(來自ab114_3h1)elsmhseqidno：2：cdr-h2氨基酸序列(來自ab114_3h1)gfdpedgetiyaqkfqgseqidno：3：cdr-h3氨基酸序列(來自ab114_3h1)rvwgsyrpndafdiseqidno：4：cdr-l1氨基酸序列(來自ab114_3h1)rasqsisdyvnseoidno：5：cdr-l2氨基酸序列(來自ab114_3h1)aastsqsseqidno：6：cdr-l3氨基酸序列(來自ab114_3h1)qqsysppytseqidno：7：vh結(jié)構(gòu)域氨基酸序列114_3h1可變重鏈qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckvsgytltelsmhwvrqapgkglewmggfdpedgetiyaqkfqgrvtmtedtstdtaymelsslgsedtavyycarrvwgsyrpndafdiwgqgtlvtvssseqidno：8：vh結(jié)構(gòu)域核酸序列＞114_3h1_vhcaggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggtttccggatacaccctcactgaattatccatgcactgggtgcgacaggctcctggaaaagggcttgagtggatgggaggttttgatcctgaagatggtgaaacaatctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccgaggacacatctacagacacagcctacatggagctgagcagcctgggatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacgcgtttgggggagttatcgccccaatgatgcttttgatatctggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaseqidno：9：vl結(jié)構(gòu)域氨基酸序列114_3h1可變輕鏈diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisdyvnwyqqkpgkapnllmfaastsqsgvpsrftgsgsgtdftltisslqpedfatyfcqqsysppytfgqgtkveikrseqidno：10：vl結(jié)構(gòu)域核酸序列＞114_3h1_vlgacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggcgacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcataagcgactatgtaaactggtatcagcagaaaccagggaaagcccccaacctcctgatgtttgctgcatccacttcgcaaagtggggtcccgtcaaggttcactggcagcggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttacttctgtcaacagagttacagtccgccctacacttttggccaggggaccaaggtggagatcaaacgtseqidno：11：1143h1scfv先導(dǎo)抗體序列＞114_3h1qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckvsgytltelsmhwvrqapgkglewmggfdpedgetiyaqkfqgrvtmtedtstdtaymelsslgsedtavyycarrvwgsyrpndafdiwgqgtlvtvssleggggsggggsgggasdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsisdyvnwyqqkpgkapnllmfaastsqsgvpsrftgsgsgtdftltisslqpedfatyfcqqsysppytfgqgtkveikraaasahhhhhhkldykdhdgdykdhdidykddddk抗體113_1h12seqidno：12：cdr-h1氨基酸序列113_1h12nygisseqidno：13：cdr-h2氨基酸序列113_1h12wisayngntnyaqklqgseqidno：14：cdr-h3氨基酸序列113_1h12aggvyydyftdyseqidno：15：cdr-l1氨基酸序列113_1h12sgsrsnigsnsvnseqidno：16：cdr-l2氨基酸序列113_1h12nnderpsseoidno：17：cdr-l3氨基酸序列113_1h12aawddslnvgelseqidno：18：vh結(jié)構(gòu)域氨基酸序列113_1h12可變重鏈evqlvqsgaevkkpgasvkvscktsgytftnygiswvrqapgqglewmgwisayngntnyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycaraggvyydyftdywgqgtmvtvssseqidno：19：vh結(jié)構(gòu)域核酸序列＞113_1h12_vhatggccgaggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaagacttctggttacacctttaccaactatggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggtaacacgaactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgcgcgagagccggcggagtctattacgattatttcacggactactggggccaggggacaatggtcaccgtctcttcaseqidno：20：vl結(jié)構(gòu)域氨基酸序列113_1h12可變輕鏈qseltqppsasgtpgqrvtiscsgsrsnigsnsvnwyqqlpgtapklliynnderpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyfcaawddslnvgelfgggtkltvlgseoidno：21：vl結(jié)構(gòu)域核酸序列＞113_1h12_vlcagtctgagctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagccgctccaacatcggaagtaattctgtaaactggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatttataataatgatgagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattatttctgtgcagcatgggatgacagcctgaatgtcggggagctattcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggtseqidno：22：113_1h12scfv先導(dǎo)抗體序列＞113_1h12_scfvevqlvqsgaevkkpgasvkvscktsgytftnygiswvrqapgqglewmgwisayngntnyaqklqgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycaraggvyydyftdywgqgtmvtvssleggggsggggsgggasqseltqppsasgtpgqrvtiscsgsrsnigsnsvnwyqqlpgtapklliynnderpsgvpdrfsgsksgtsaslaisglqsedeadyfcaawddslnvgelfgggtkltvlgaaasahhhhhhkldykdhdgdykdhdidykddddkseqidno：23：cxcl12氨基酸序列(全長(zhǎng)序列)＞sp|p48061-2|sdf1_human基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1的同種型αos＝人(homosapiens)gn＝cxcl12mnakvvvvlvlvltalclsdgkpvslsyrcpcrffeshvaranvkhlkilntpncalqivarlknnnrqvcidpklkwiqeylekalnkseoidno：24：用于抗體選擇的合成的cxcl12氨基酸序列。對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)cxcl12蛋白的第22至89位氨基酸kpvslsyrcpcrffeshvaranvkhlkilntpncalqivarlknnnrqvcidpklkwiqeylekalnkseqidno：25：用于表位作圖在大腸桿菌中表達(dá)的重組“野生型”cxcl12(包括his標(biāo)簽和接頭)kpvslsyrcpcrffeshvaranvkhlkilntpncalqivarlknnnrqvcidpklkwiqeylekalnkaaasahhhhhhkl參考文獻(xiàn)：本說明書中提到的所有文獻(xiàn)均通過引用整體并入本文。當(dāng)前第1頁12