抗tace抗體分子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】在本領(lǐng)域中第一次公開了抗TACE(ADAM17)抗體，其能夠結(jié)合TACE，并能夠拮抗一種或多種其生物活性，特別是以一種跨結(jié)構(gòu)域結(jié)合方式結(jié)合TACE，其中催化結(jié)構(gòu)域和富含半胱氨酸/解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(Dis-Cys)的殘基均參與抗體結(jié)合TACE，有助于提高抗體結(jié)合的特異性和/或有助于提高對(duì)TACE生物活性的抑制。公開了抗體的治療應(yīng)用，特別是治療癌癥。
【專利說明】抗TACE抗體分子及其應(yīng)用
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及抗TNF-CI轉(zhuǎn)化酶(TACE)抗體分子及其應(yīng)用，更具體地，涉及能夠通過結(jié)合其催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域抑制TACE生物活性的抗TACE抗體分子。
[0002]發(fā)明背景
[0003]TNF-a轉(zhuǎn)化酶(TACE)(也稱作解聯(lián)蛋白樣金屬蛋白酶17 (ADAM17))，是一種膜結(jié)合的金屬蛋白酶，負(fù)責(zé)切割多種病理學(xué)上有意義的底物。TACE最初被鑒定為負(fù)責(zé)溶解膜關(guān)聯(lián)的前體TNF-a (該過程后來被稱為“胞外域脫落”)的酶，現(xiàn)已經(jīng)被證明能夠切割多種類型的底物，例如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)配體、細(xì)胞外Notch、細(xì)胞表面受體和粘附分子。因?yàn)榈鞍姿馇懈钍窃S多這些底物不可或缺的激活事件，所以TACE已經(jīng)被視為用于治療癌癥和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的引人注意的治療祀標(biāo)。TACE的作用在Murphy (Nature ReviewsiCancer, 8(12):929-941, 2008)中有綜述。
[0004]人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到TACE調(diào)節(jié)TNF- a的作用以及因此抑制TACE作為炎癥疾病治療策略的潛在應(yīng)用性有一段時(shí)間了，并且許多公司已經(jīng)試圖開發(fā)TACE的小分子抑制劑。然而，金屬蛋白酶家族高度保守，開發(fā)選擇性的小分子抑制劑已經(jīng)被證明具有非常大的挑戰(zhàn)。先前使用更廣譜的金屬蛋白酶抑制劑的試驗(yàn)已經(jīng)被證明具有組織毒性，因此人們期待能夠生產(chǎn)該家族的選擇性抑制劑，見 Moss 等(Nature Clinical Practice, 4 (6): 300-309，2008)。
[0005]開發(fā)選擇性TACE抑制劑的一個(gè)替代性策略是利用一般可以通過抗體實(shí)現(xiàn)的選擇性。然而，盡管可以結(jié)合TACE的抗體已經(jīng)有報(bào)道并且在商業(yè)上可得，但是迄今為止，這些中幾乎沒有一個(gè)具有拮抗活性。例如，盡管W096/041624公開了 TACE酶的鑒定，并提出產(chǎn)生了抗TACE抗體，但是在該專利申請(qǐng)中并沒有公開抗體，更沒有公開具有特定的功能性質(zhì)的抗體，例如拮抗抗體。這進(jìn)一步意味著，開發(fā)基于抗體的能夠阻斷TACE活性的治療劑本【技術(shù)領(lǐng)域】仍然是一個(gè)未解決的問題。
發(fā)明概要
[0006]從廣義上說，本發(fā)明是基于如下的認(rèn)識(shí)，即用于產(chǎn)生抗體的整體多結(jié)構(gòu)域途徑可以用于特異性抑制復(fù)合體蛋白酶，例如TACE。這種認(rèn)識(shí)隨后被用于產(chǎn)生能夠抑制TACE的抗體分子，而且該抗體分子是本領(lǐng)域中第一個(gè)能夠發(fā)揮TACE的一種或多種生物活性的拮抗劑的功能的抗體。
[0007]不希望受限于任何特定的理論，本發(fā)明人相信，本發(fā)明的抗體分子具有獨(dú)特的抗體結(jié)合模式，即它以跨結(jié)構(gòu)域結(jié)合(cross domain binding)方式與TACE結(jié)合。如實(shí)施例中支持的，這意味著催化結(jié)構(gòu)域和富含半胱氨酸/解聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)域(Dis-Cys)的殘基均參與了抗體與TACE的結(jié)合，有助于提高抗體結(jié)合的特異性和/或有助于提高對(duì)TACE生物活性的抑制。
[0008]本發(fā)明的抗體分子是根據(jù)發(fā)明人的如下認(rèn)識(shí)設(shè)計(jì)的:在完整的ADAM胞外域中，催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域在空間上相互關(guān)聯(lián)，并且特別地，TACE的“C-形”意味著TACE的非催化性羧基端Dis-Cys結(jié)構(gòu)域部分地阻礙大分子接近氨基端催化結(jié)構(gòu)域。這進(jìn)一步導(dǎo)致本發(fā)明人得出結(jié)論，即選擇性TACE抑制劑可以利用這種空間上相連的多結(jié)構(gòu)域拓?fù)鋵W(xué)來以廣泛地拮抗催化結(jié)構(gòu)域，同時(shí)從局部的Dis-Cys殘基獲得額外的特異性。
[0009]如將下面更詳細(xì)介紹的，本發(fā)明人利用ADAM多結(jié)構(gòu)域拓?fù)鋵W(xué)，第一次分離出了一種抑制性人抗體(Dl)，該抗體排他性地通過其可變重鏈(Vh)結(jié)構(gòu)域與TACE非催化區(qū)的結(jié)合。然后使用D1-Vh偏倚的scFv噬菌體展示文庫(kù)選擇性分離了一種新的能夠同時(shí)結(jié)合TACE催化結(jié)構(gòu)域的可變輕鏈(\)。最終的“跨結(jié)構(gòu)域”(cross-domain)人抗體(D1(A12))是第一個(gè)整體性ADAM胞外域抑制劑，是迄今為止描述的最有選擇性的強(qiáng)細(xì)胞表面TACE抑制劑。
[0010]因此，在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種分離的抗體分子，其特異結(jié)合TNF-a轉(zhuǎn)化酶(TACE)并抑制TACE的生物學(xué)功能。如上面解釋的，本發(fā)明人相信，本發(fā)明的抗體分子能夠通過結(jié)合TACE的催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域二者來抑制TACE的生物活性。例如，本發(fā)明的抗體優(yōu)選能夠抑制TACE對(duì)底物的切割?？贵w的其它特征和性質(zhì)在下面描述。
[0011]在第一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括如本文中公開的抗體分子和藥學(xué)可接受的賦形劑。
[0012]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種如本文中公開的抗體分子，供在治療人或動(dòng)物的方法中使用。
[0013]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種如本文中公開的抗體分子，供在治療TACE介導(dǎo)的疾病的方法中使用。
[0014]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了本文中所公開的抗體分子制造用于治療TACE介導(dǎo)的病癥的藥物的用途。
[0015]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了一種治療具有TACE介導(dǎo)的病癥的個(gè)體的方法，包括向有該需要的個(gè)體施用如本文中公開的抗體分子。
[0016]在本發(fā)明的醫(yī)學(xué)使用`和治療方法中，優(yōu)選的TACE介導(dǎo)的病癥是癌癥、免疫相關(guān)疾病或銀屑病，更具體地是癌癥如腦癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或結(jié)直腸癌，免疫相關(guān)疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，或基于炎癥或變應(yīng)性的疾病如哮喘。
[0017]在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異性結(jié)合ADAM家族金屬蛋白酶的抗體分子的方法，其中抗體能夠通過結(jié)合金屬蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域二者來抑制ADAM家族金屬蛋白酶的蛋白酶活性，該方法包括:
[0018](a)鑒定包含能夠結(jié)合包含催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域的ADAM家族金屬蛋白酶多肽的可變重鏈結(jié)構(gòu)域的抗體，其中所述催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合于ADAM家族金屬蛋白酶的抑制劑；
[0019](b)鑒定包含能夠結(jié)合分離的ADAM家族金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的抗體；和
[0020](c)產(chǎn)生抗體分子，其包含在步驟(a)中鑒定的可變重鏈結(jié)構(gòu)域和在步驟(b)中鑒定的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。ADAM家族金屬蛋白酶的描述及其序列和結(jié)構(gòu)的參考見Murphy等Nature Reviews: Cancer, 8:929-941，2008。其描述了 ADAM家族金屬蛋白酶如何共享一個(gè)共同的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包括Dis-Cys和催化結(jié)構(gòu)域。ADAM家族金屬蛋白酶及它們的替代名稱的實(shí)例包括，但不僅限于，ADAM8 (Ms2, CD156a)，ADAM9 (Meltrin- y，MDC9)，ADAMlO (Kuzbanian, MADM, sU17)，ADAMl2(Meltrin-a )，ADAMl5(Metargidin, MDCl5)，ADAMl7(TACE)，ADAM19(Meltrin-^，MADDAM)，ADAM28(MDCL, eMDCII, TECADAM)和 ADAM33。
[0021]現(xiàn)在參考附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行描述，這些描述是示例性的，不構(gòu)成限定。然而，基于本公開，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以顯見本發(fā)明的各個(gè)其他方面和實(shí)施方案。
[0022]在本文中所使用的，“和/或”是指在具體公開兩個(gè)特定特征或組分的每一個(gè)時(shí)，可以有或者沒有另一個(gè)。例如，“A和/或B”應(yīng)被看作如下的特定公開的每一個(gè):(i)A，(ii)B和(iii)A和B，如同本文中單獨(dú)提出每一個(gè)那樣。
[0023]除非上下文中明確指出，否則上面提出的特征的描述和定義并不限制本發(fā)明的任何特殊方面或?qū)嵤┓桨福⒖梢酝鹊貞?yīng)用于所描述的所有方面和實(shí)施方案。
[0024]附圖簡(jiǎn)述
[0025] 圖1.實(shí)驗(yàn)概況。(A)人TACE胞外域由氨基端金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域(亮紅色)和羧基端非催化Dis-Cys結(jié)構(gòu)域(亮藍(lán)色)構(gòu)成(1-TASSER模型)。我們利用這一多結(jié)構(gòu)域拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，使用兩步抗體噬菌體展示開發(fā)了第一個(gè)真實(shí)的特異性ADAM抑制劑。(B) (i)首先，在第一抗體噬菌體展示選擇中使用小分子抑制劑CT1746封閉TACE胞外域的催化位點(diǎn)。這防止選擇結(jié)合催化性裂口(cleft)表位的抗體，因?yàn)檫@樣的抗體會(huì)與非靶標(biāo)金屬蛋白酶交叉反應(yīng)。(ii)第一次篩選揭示了抑制性scFv抗體克隆D1。該scFv通過其可變重鏈(Vh)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域。(iii)產(chǎn)生一個(gè)D1-Vh偏倚性抗體噬菌體展示文庫(kù)，以便引入新的可變輕鏈(新VJ同時(shí)保持由D1-Vh提供的TACE特異性。第二次篩選在沒有CT1746存在下進(jìn)行，以便讓新\鏈能不受干擾地接近TACE催化位點(diǎn)。(iv)第二次篩選鑒定了數(shù)個(gè)能夠結(jié)合分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域的新' ScFv0由于通過D1-Vh結(jié)合Dis-Cys結(jié)構(gòu)域，這些“跨結(jié)構(gòu)域”抗體保持其對(duì)TACE的嚴(yán)格特異性。D1-Vh-新scFv克隆A12 (下文稱作Dl (A12))對(duì)TACE胞外域顯示最高的親和性，因此是迄今為止描述的最強(qiáng)的選擇性細(xì)胞表面ADAM抑制劑。
[0026]圖2.ScFv Dl是一個(gè)Vh依賴的TACE胞外域抑制性人抗體。(A)將重組人TACE胞外域(Arf5-Arg651)與滴定濃度的人DlscFv或天然TACE抑制劑N-TMP-3的N端片段預(yù)溫育。隨后在淬滅熒光肽切割測(cè)定中測(cè)量TACE蛋白水解活性。Dl抑制TACE胞外域蛋白水解，其強(qiáng)度與 N-TMP-3 相當(dāng)(IC5QD1=5.4(±0.4)nM; (IC50?^3=3.2 (±0.2)nM))。(B)固定化的TACE胞外域和催化結(jié)構(gòu)域(Arg215-Ser474)用滴定濃度的scFv Dl和抗催化結(jié)構(gòu)域兔多克隆抗體pAb33進(jìn)行探測(cè)。盡管具有抑制TACE介導(dǎo)的肽水解能力，但是DlscFv不能結(jié)合分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域。(C)我們先前描述了蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)如何能夠重排TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域的二硫鍵。TACE催化結(jié)構(gòu)域抗體pAb33和scFv A9的結(jié)合不受PDI處理TACE胞外域的影響。對(duì)比地，Dis-CysscFv D3和scFv Dl在PDI處理后喪失了全部的免疫活性(*)。(D) scFv DlCDR 的互補(bǔ)位掃描誘變(Paratope scanning mutagenesis)顯不,Vh結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)TACE胞外域結(jié)合。對(duì)比地，DIVl結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥ACE胞外域的結(jié)合而言似乎幾乎完全不必要。
[0027]圖3.通過Vl交換誘導(dǎo)TACE催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合。(A)將scFv Dl的Vh結(jié)構(gòu)域克隆到幼稚人\噬菌體展示文庫(kù)中，并在不存在CT1746的條件下(溶液和固相遴選)，針對(duì)滴定濃度的生物素化TACE胞外域進(jìn)行再次遴選。將選出的scFv克隆到FLAG標(biāo)記的表達(dá)載體中，并篩選TACE胞外域結(jié)合。對(duì)最好的30個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序，以除去重復(fù)(剩余21個(gè))，單獨(dú)表達(dá)，親和純化，并定量地[IOnM]再次就TACE胞外域和催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合進(jìn)行篩選。對(duì)于許多克隆，新\結(jié)構(gòu)域使得對(duì)TACE催化結(jié)構(gòu)域的獨(dú)立結(jié)合變得容易了。D1-Vh-新克隆“A12”(*)(下文稱作D1(A12))對(duì)兩個(gè)抗原均顯示最高的親和性。(B)與scFv Dl不同，scFv Dl (A12)對(duì)TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域的PDI調(diào)變大體耐受(=)。這種行為與針對(duì)TACE催化結(jié)構(gòu)域表位的抗體相似。(C)對(duì)與分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域和完整胞外域相互作用的N-TIMP-3(催化裂口結(jié)合抑制劑)和Dl (A12) FAb (跨結(jié)構(gòu)域結(jié)合抑制劑)進(jìn)行的表面等離子體共振(SPR)動(dòng)力學(xué)分析。盡管N-TIMP-3的深度催化裂口焦點(diǎn)(catalytic cleftfocus)支持其與分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域具有優(yōu)良的結(jié)合(KDGat=211(±32)pM)，
[0028]其與完整胞外域的結(jié)合被額外存在的非催化TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域嚴(yán)重破壞(KDEct°=7，221 (±84) pM) ( A KD=KDCat/KDEcto=0.03)。對(duì)比地，跨結(jié)構(gòu)域 Dl (Al2) FAb 對(duì)完整胞外域的親和性(KDEet°=461(±65)pM)比分離的催化結(jié)構(gòu)域(KDGat=5，210(±102)pM)(AKd=IL 3)高>10倍。(D)反轉(zhuǎn)D1(A12)ELISA研究產(chǎn)生了相當(dāng)于>10倍的親和力差異(EC50D1(A12):Ecto=920(±19)pM;EC50D1(A12):Cat=ll，120(±94)pM) ( A EC50111 (A12) =EC50111 (A12):Cat/EC50D1(A12):Ecto=12.1)。全部土 代表 SD。
[0029]圖4.Dl (A12)互補(bǔ)位掃描誘變。(A)將延伸到@ _碳之外的所有Dl (Al2) scFv互補(bǔ)位殘基均個(gè)別地突變成丙氨酸(n=30)，在大腸桿菌中表達(dá)，并親和純化。通過淬滅熒光肽測(cè)定在溶液中確定每個(gè)突變體針對(duì)完整TACE胞外域(IC5(lErt°)和分離的催化結(jié)構(gòu)域(IC5(leat)的IC5tl值。此外，使用相同的程序同時(shí)計(jì)算“野生型”Dl(A12)scFv IC50(IC50ffT)對(duì)TACE胞外域(IC5(1Ert°:WT)和催化結(jié)構(gòu)域(IC5(1eat:WT)的IC5tl值。為每個(gè)突變體和抗原計(jì)算吉布斯自由能(A AG)的隨后變化(A AG=+RTln(IC5qaiVIC5cT))。盡管許多突變體均被證明對(duì)兩種抗原的Dl (A12) IC5Owt不利，但是有數(shù)個(gè)突變體似乎特異性改變了與TACE胞外域(*)或催化結(jié)構(gòu)域(=)的結(jié)合。與scFv Dl (圖1(C))的互補(bǔ)位突變相關(guān)聯(lián)的是，Dl (A12)可變重鏈(Vh)內(nèi)數(shù)個(gè)殘基對(duì)IC5QEet°:WT有貢獻(xiàn)。有趣的是，殘基SH31，YH32和SH52㈩(Kabat編號(hào))僅支持IC5QEet°:WT，并且對(duì)于實(shí)現(xiàn)1(:5(^:"似乎是相對(duì)不必要的。對(duì)比地，數(shù)個(gè)可變輕鏈(Vl)殘基顯著地支持 IC5QGat:WT(Q`L27，SL28, IL29, SL91 和 FL92 (=))，但對(duì)于實(shí)現(xiàn) IC5(lEet°:WT 似乎是相對(duì)不必要的。當(dāng)定位到Dl (A12)Fv模型上時(shí)(26)(采用Y軸右側(cè)詳細(xì)描述的顏色)，顯示IC5tl抗原偏好的殘基聚集在互補(bǔ)位的極性端(白色虛線)。(B)通過固相ELISA計(jì)算對(duì)每個(gè)互補(bǔ)位突變體的EC5tl值，并用于計(jì)算A AG(A AG=+RTln(EC5(lAla/EC5(lWT)。與(A)描述的圖譜呼應(yīng),殘基 SH31, YH32 和 SH52 ⑷支持 EC5QEet():WT，殘基 QL27, SL28, IL29, SL91 和 FL92 (=)支持EC50Cat:ffT0除了顯示特異性抗原EC5tl偏倚的殘基之外，⑶R-H3內(nèi)所有的丙氨酸突變均破壞了與兩種抗原的結(jié)合。
[0030]圖5.Dl (Al2)是TACE胞外域蛋白水解的強(qiáng)抑制劑。(A)將IOOnM TACE完整胞外域或分離的催化結(jié)構(gòu)域與5 ii M GST-TNF- a和滴定濃度的Dl (A12) FAb混合。37° C溫育后，將每個(gè)反應(yīng)用SDS-PAGE解析，考馬斯藍(lán)染色，并通過光密度分析定量各個(gè)條帶。來自三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的定量結(jié)果顯示為50 ii M CT1746 (CT)金屬蛋白酶抑制劑對(duì)照的百分比。Dl (A12)FAb抑制了 TACE胞外域?qū)χ亟MTNF-a的剪切(IC5QEet°=73.9 (±3.2)nM)，也抑制了對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域?qū)χ亟MTNF-a的剪切，但強(qiáng)度稍弱(IC5QGat=124.7(±6.2)nM)。⑶將重組人TACE胞外域和催化結(jié)構(gòu)域分別與滴定濃度的Dl (A12)FAb和催化裂口聚焦的TACE抑制劑N-TIMP-3預(yù)溫育。隨后用淬滅熒光肽剪切測(cè)定法測(cè)量蛋白水解活性。Dl (Al2) FAb抑制TACE催化結(jié)構(gòu)域蛋白水解的強(qiáng)度與N-TMP-3相當(dāng)。然而，當(dāng)將全長(zhǎng)重組人TACE胞外域與兩種抑制劑預(yù)溫育時(shí)，Dl (Al2) FAb證明比N-TMP-3 (=)強(qiáng)>5倍。(C)使用已知表達(dá)TACE底物的癌細(xì)胞(T0V21G: TNF- a，IGROVl: TGF- a，PC3: AREG)和穩(wěn)定過表達(dá)HB-EGF-堿性磷酸酶的HeLa細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞表面TACE活性。每個(gè)細(xì)胞系用PMA刺激，隨后用各種濃度的Dl (A12)人IgGl，N-TIMP-3或?qū)φ杖搜獫{IgG預(yù)處理I小時(shí)。來自條件化培養(yǎng)基的可溶TACE產(chǎn)物通過夾心式ELISA或堿性磷酸酶活性進(jìn)行定量。Dl (Al2) IgGl 一貫地抑制細(xì)胞表面TACE活性，比N-TMP-3(*)強(qiáng)大約5倍或者更強(qiáng)。細(xì)胞表面TACE抑制與(B)中的酶學(xué)數(shù)據(jù)正相關(guān)(即*~=)。全部IC5tl數(shù)據(jù)見附表1。
[0031]圖6.預(yù)測(cè)的TACE胞外域拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)⑷TACE胞外域(構(gòu)建體Arg651)的一維表征，顯示了信號(hào)肽(S;白色)、前結(jié)構(gòu)域(pro domain)(綠色)、弗林蛋白酶剪切位點(diǎn)(空心箭頭)、催化結(jié)構(gòu)域(紅色)、鋅絡(luò)合組蛋白和解聯(lián)蛋白-富半胱氨酸(Dis-Cys)結(jié)構(gòu)域(藍(lán)色)的相對(duì)定位。⑶TACE同源物的三維展示，采用(A)中列舉的顏色系統(tǒng)。ADAM同源物拉塞爾氏蜂蛇毒金屬蛋白酶(Russell’ s Viper Venom metalloprotease) (RVV-X)的晶體結(jié)構(gòu)報(bào)告了催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域之間的緊密空間關(guān)聯(lián)。結(jié)合較早前的血管細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白(VAP)晶體圖，該結(jié)構(gòu)證據(jù)支持如下的觀點(diǎn)，即ADAM為“C形”。更近些時(shí)候的非催化人ADAM22胞外域結(jié)構(gòu)(與羧基端EGF氧結(jié)構(gòu)域(黃色)競(jìng)爭(zhēng))繼續(xù)支持了這種觀點(diǎn)。(C)TACE的結(jié)構(gòu)同源物建模(Edwards et al，2008)顯示，完整胞外域很可能以類似的“C形”存在。這些模型提示，Dis-Cys結(jié)構(gòu)域阻礙大分子接近TACE催化位點(diǎn)，其方式與RVV-X和ADAM22相似。Dis-Cys結(jié)構(gòu)域和催化性裂口之間的緊密關(guān)聯(lián)可以解釋為什么完整TACE胞外域的蛋白水解比分離的催化結(jié)構(gòu)域低~10倍。而且，該拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)還解釋為什么TACE(和許多其它金屬蛋白酶)的天然蛋白抑制劑，金屬蛋白酶3的組織抑制子(TMP-3)，對(duì)暴露的TACE催化結(jié)構(gòu)域的抑制比對(duì)“受保護(hù)的”(guarded)完整胞外域顯著更好。
[0032]圖7.抗TACE胞外域人scFv抗體的分離。(A)經(jīng)過兩輪針對(duì)生物素化TACE胞外域(用CT1746)的溶液相噬菌體展示選擇之后，將洗脫的噬菌粒群體轉(zhuǎn)移到PSANG10-3F載體中，并在大腸桿菌中表達(dá)各個(gè)scFvs。對(duì)每個(gè)抗體進(jìn)行針對(duì)TACE胞外域(無CT1746)和BSA的ELISA篩選。結(jié)果表示為兩種抗原之間的倍數(shù)差異(AA450=A450tage/A450bsa)。分離所有AA450 3 10的克隆(虛線)，測(cè)序以排除重復(fù)，分別表達(dá)，并通過親和色譜進(jìn)行純化。此外，還開發(fā)了一個(gè)陰性對(duì)照克隆(B9)。(B)針對(duì)TACE胞外域的滴定ELISA顯示EC5tl值范圍是ll-420nM。(C)與500nM的純化前導(dǎo)抗體預(yù)溫育的InM的重組TACE胞外域的淬滅熒光(QF)肽活性揭示，數(shù)種scFv具有一些抑制能力(*)。(D)為了研究QF肽抑制到細(xì)胞表面TACE抑制的因果關(guān)系(translation)，將過表達(dá)帶堿性磷酸酶(AP)標(biāo)簽的HB-EGF的HeLa細(xì)胞與500nM的每種scFv預(yù)溫育，并用PMA刺激。使用PBS和內(nèi)源TACE抑制劑HMP-3的氨基端結(jié)構(gòu)域，N-TIMP-3 (NT3)，分別作為陽性和陰性對(duì)照。TACE介導(dǎo)的HB-EGF脫落通過測(cè)定條件化培養(yǎng)基中的AP活性(顯示為A405)加以測(cè)量。盡管在(C)中鑒定了數(shù)種重組TACE胞外域抑制劑，但是僅有scFvDl(**)似乎在細(xì)胞表面上保持其抑制能力。全部土代表SD0
[0033]圖8.DlscFv對(duì)TACE有選擇性。(A)將50nM固定化的人TACE胞外域、人TACE催化結(jié)構(gòu)域、小鼠TACE胞外域、人ADAMlO胞外域、人ADAM12胞外域和BSA分別與IOOnM DlscFv、抗TACE催化結(jié)構(gòu)域多克隆(pAb28233)和抗-ADAM10多克隆(pAbl0956)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。盡管各ADAM抗原之間具有緊密的序列同源性，但是DlscFv似乎對(duì)人TACE胞外域具有完全的選擇性。(B)重組人ADAMlO胞外域與滴定濃度的人DlscFv或小分子金屬蛋白酶抑制劑CT1746預(yù)溫育。隨后在淬滅熒光肽切割測(cè)定中測(cè)量ADAMlO蛋白水解活性。結(jié)果表示為未處理對(duì)照的百分比。盡管CT1746快速抑制ADAMlO蛋白水解，但是scFv Dl沒有效果。全部土代表SD。[0034]圖9.Dl (Al2)與N-TMP-3共享一個(gè)共同表位。⑷將IOOnM TACE胞外域固定在ELISA平板上并用各種濃度的Dl (A12)單價(jià)FAb預(yù)溫育。隨后通過測(cè)定N-TMP-3結(jié)合監(jiān)測(cè)TACE活性位點(diǎn)的可接近性。D1(A12)以1:1摩爾比阻斷接近TACE胞外域活性位點(diǎn)。⑶翻轉(zhuǎn)探針方向(即用各種濃度的N-TMP-3預(yù)溫育TACE，并用Dl (Al2) FAb進(jìn)行檢測(cè))產(chǎn)生了相似的結(jié)果。全部土代表SD。
[0035]圖10.Dl (Al2) IgGl和FAb對(duì)細(xì)胞表面TACE的抑制。為了研究Dl (Al2) IgGl的二價(jià)性質(zhì)是否影響其TACE抑制強(qiáng)度，在PMA刺激的HeLa堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記HB-EGF測(cè)定中比較IgGl和單價(jià)FAb的滴度(titration)。Dl (Al2) FAb顯示與IgGl具有相當(dāng)?shù)囊种谱V。這提示，每個(gè)IgGl只有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)抑制細(xì)胞表面TACE。全部土代表SD。
[0036]圖ll.Dl(A12)是一種選擇性TACE抑制劑。(A) 50nM固定的人TACE胞外域、人TACE催化結(jié)構(gòu)域、小鼠TACE胞外域、人ADAMlO胞外域、人ADAM12胞外域和BSA分別用IOOnMDl(A12)FAb、抗TACE催化結(jié)構(gòu)域多克隆(pAb28233)和抗-ADAMlO多克隆(pAbl0956)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。盡管ADAM抗原之間具有緊密的序列同源性，但是Dl (Al2) FAb似乎完全選擇性地針對(duì)人TACE胞外域。(B)將重組人ADAMlO胞外域與滴定濃度的人Dl (A12) FAb或小分子金屬蛋白酶抑制劑CT1746預(yù)溫育。隨后在淬滅熒光肽切割測(cè)定中測(cè)量ADAMlO蛋白水解活性。盡管Dl (Al2) FAb部分結(jié)合TACE催化結(jié)構(gòu)域，但它對(duì)ADAMlO活性沒有影響。(C)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染帶堿性磷酸酶標(biāo)簽的HB-EGF的MCF7細(xì)胞為區(qū)分ADAMlO和TACE細(xì)胞表面脫落活性提供了一種有用的模型。用非靶向性、ADAMlO或TACE siRNA處理后的MCF7乳腺癌細(xì)胞裂解物的Western印跡分析。⑶PMA刺激的MCF7細(xì)胞導(dǎo)致TACE依賴的HB-EGF-AP脫落。(E)伊屋諾霉素刺激MCF7細(xì)胞導(dǎo)致HB-EGF-AP發(fā)生ADAMlO依賴的脫落。(F)在MCF7乳腺癌細(xì)胞中，Dl (Al2) IgGl僅抑制TACE介導(dǎo)的PMA刺激的HB-EGF-AP脫落。對(duì)于細(xì)胞測(cè)定，使用單因素方差分析(one-way AN0VA)檢驗(yàn)來比較對(duì)照細(xì)胞(例如非靶向性siRNA)與可變量(例如 PMA 刺激的)。P-值:*=〈()? 05，**=〈()? 01，_=〈()? 001。全部 ± 代表 SD。
[0037]圖12.PC3細(xì)胞以~10%匯合率接種并在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)24小時(shí)。每8小時(shí)向培養(yǎng)基中添加200nM Dl (A12) IgGl或等體積的PBS。匯合率用IncuCyte來測(cè)量。Dl (Al2)IgGl的TACE抑制嚴(yán)重阻礙了 PC3細(xì)胞的無血清增殖。誤差線代表S.D.。
[0038]圖13.將包含內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系的多細(xì)胞三維球狀體(spheroid)在I型膠原中與330nM Dl (A12) IgGl或等體積PBS溫育。溫育36小時(shí)后，對(duì)用綠色CMFDA CellTracker染料預(yù)染色的內(nèi)皮細(xì)胞成像，并定量?jī)?nèi)皮細(xì)胞芽體形成(endothelial cell sprout formation)以確定總長(zhǎng)出(total outgrowth)和芽體數(shù)目(number of sprouts)。這兩個(gè)參數(shù)均顯示:當(dāng)TACE被Dl (A12)抑制時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞芽體形成降低。白色誤差線對(duì)應(yīng)于IOOii m。
[0039]圖14.重組TACE胞外域單獨(dú)或者與IOOnM pAb28233 (抗催化結(jié)構(gòu)域多克隆抗體)預(yù)溫育I小時(shí)。用淬滅熒光肽測(cè)定檢測(cè)隨后的蛋白水解活性。盡管pAb28233與TACE催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，但它并不抑制TACE活性。[0040]圖15.重組TACE胞外域單獨(dú)或者與IOOnM mAb4.1 (抗催化結(jié)構(gòu)域單克隆抗體)預(yù)溫育I小時(shí)。用淬滅熒光肽測(cè)定檢測(cè)隨后的蛋白水解活性。盡管mAb4.1與TACE催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，但它并不抑制TACE活性。
[0041]圖16.抗TACE抗體Dl (Al2)使KrasWT和KrasMT結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療處理敏感。
[0042]圖17.抗TACE抗體在體外消除(abrogate)結(jié)直腸癌異種移植物(H630)生長(zhǎng)。
[0043]圖18.監(jiān)測(cè)結(jié)直腸癌異種移植物中潛在TACE底物的血漿水平。
[0044]圖19.在IGROVl卵巢癌異種移植物模型中檢測(cè)抗-TACE抗體。
[0045]圖20.在IGROVl卵巢癌異種移植物模型中監(jiān)測(cè)潛在TACE底物的血漿/腹水(ascite)水平。
[0046]圖21.單次劑量10mg/kg 1.p.后，抗TACE抗體Dl (Al2)在裸鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，N=2或者更多小鼠。誤差線代表平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
[0047]詳細(xì)說明
[0048]杭ATCE杭體分子
[0049]除非特別指出，否則本文中抗體殘基的編號(hào)是根據(jù)Kabat編號(hào)體系。TACE的結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域在圖6中給出，TAC E的氨基酸序列如ID NO: 19所示。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體分子能夠結(jié)合如下的TACE多肽，其包含與SEQID NO: 19所示的氨基酸215-651具有至少80%序列同一性的多肽，或其片段，其中該片段具有生物活性。
[0050]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子包含一個(gè)或多個(gè)如下的⑶R序列:
[0051](a)具有SEQ ID NO:1氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的CDR-Hl ;和/或
[0052](b)具有SEQ ID NO:2氨基酸序列，或者SEQ ID N0:2氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的CDR-H2 ;和/或
[0053](c)具有SEQ ID NO:3氨基酸序列，或者SEQ ID N0:3氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的CDR-H3 ;和/或
[0054](d)具有SEQ ID NO:4氨基酸序列，或者SEQ ID N0:4氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的CDR-Ll ;和/或
[0055](e)具有SEQ ID NO:5氨基酸序列，或者SEQ ID N0:5氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的CDR-L2 ;和/或
[0056](f)具有SEQ ID NO:6氨基酸序列，或者SEQ ID N0:6氨基酸序列中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失或插入的⑶R-L3。
[0057]特別地，實(shí)施例中的數(shù)據(jù)顯示，根據(jù)本發(fā)明的抗體分子通Svh結(jié)構(gòu)域外緣(outskirt)上的殘基與TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域相互作用，并通過Vlj結(jié)構(gòu)域中的選定的殘基與催化結(jié)構(gòu)域相互作用。這進(jìn)一步意味著，該抗體分子優(yōu)先包含⑶R-H1，⑶R-H3，⑶R-Ll和CDR-L3。
[0058]如實(shí)施例中所示，本發(fā)明的抗體分子可以耐受CDR序列中的多個(gè)氨基酸改變，而仍然保持親本抗體的性能。作為實(shí)例，與SEQ ID NO: 1-6中任一個(gè)相比，抗體分子每一個(gè)⑶R的氨基酸序列均可以包含1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)氨基酸替換、缺失或插入。如實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)所支持的，CDR中的如下氨基酸殘基優(yōu)選得到保留，即它們不會(huì)是任何氨基酸替換、缺失或插入的對(duì)象:[0059]CDR-Hl: SH31 和 YH32 ;和 / 或
[0060]CDR-H2: SH52, SH56 和 YH58
[0061 ] CDR-H3:PH98, YH100, TH100B 和 WH100D
[0062]CDR-Ll:QL27, SL28, IL29 和 YL32
[0063]CDR-L2: HL49 和 DL50
[0064]CDR-L3:SL91, FL92 和 IL94
[0065]其中殘基的編號(hào)根據(jù)Kabat編號(hào)。如本領(lǐng)域眾所周知地，CDR可以存在于多種不同的抗體類型或框架區(qū)中，任選地涉及一種或多種其他的序列改變，以確保保持如本文公開的抗體的有用性質(zhì)。
[0066]VH和VL結(jié)構(gòu)域分別典型地包含三個(gè)負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的補(bǔ)體決定區(qū)(OTR)，它們中間被框架區(qū)隔開。在一個(gè)示例實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的抗體分子包含如下的VH結(jié)構(gòu)域，其包含分別具有SEQ ID NO: 1，2和3序列的⑶R-H1，⑶R-H2和⑶R-H3，和/或如下的VL結(jié)構(gòu)域，其包含分別具有SEQ ID NO:4, 5和6序列的CDR-LI, CDR-L2和CDR-L3。
[0067]優(yōu)選地，抗體分子包括與SEQ ID NO: 7的氨基酸序列有至少80%，更優(yōu)選地90%，更優(yōu)選地至少95%氨基酸同一性的VH結(jié)構(gòu)域，和/或與SEQ IDNO: 9的氨基酸序列有至少80%，更優(yōu)選地90%，更優(yōu)選地至少95%氨基酸同一性的VL結(jié)構(gòu)域。
[0068]本發(fā)明還提供了一種IgG形式的抗體分子，其包含如SEQ ID NO: 15中的氨基酸20起往后所示的重鏈氨基酸序列，以及如SEQ ID NO: 16中的氨基酸21起往后所示的輕鏈氨基酸序列。
[0069]本發(fā)明還提供了一種Fab形式的抗體分子，其包括如SEQ ID No:ll所示的重鏈氨基酸序列和如SEQ ID NO: 12所示的輕鏈氨基酸序列。
[0070]一般地，本發(fā)明涉及能夠抑制TACE生物活性的抗體分子，即本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的拮抗劑抗體分子。作為實(shí)例，這包括能夠抑制TACE剪切底物活性的抗體分子，無論是天然存在的底物，例如在細(xì)胞表面上存在的底物，還是在體外剪切測(cè)定中的合成底物，例如發(fā)突光底物甲氧香豆素基乙基-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu- 二硝基苯二氨基丙?；?Ala-Arg-NH2。在一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)中，TACE或其生物活性片段在可以發(fā)生底物剪切的條件下與底物接觸。然后可以添加抗體分子，確定它們是否能夠抑制TACE對(duì)底物的剪切。用于實(shí)施體外測(cè)定的條件實(shí)例在下面的實(shí)施例中提供。在下面實(shí)施例中描述了一種基于細(xì)胞的脫落測(cè)定，并使用Willems等(2010)描述的測(cè)定法。
[0071]關(guān)于TACE抑制的水平，還可能使用上面描述的測(cè)定對(duì)其進(jìn)行定量。例如，本發(fā)明抗體分子對(duì)TACE的抑制可以和已知的TACE抑制劑，例如蛋白N-T MP-3 (登錄號(hào)AAB34532)，例如全長(zhǎng)或成熟N-TMP-3，進(jìn)行比較。優(yōu)選地，在相同的測(cè)定條件下，本發(fā)明的抗體分子抑制TACE的能力比N-TMP-3高至少2倍，更優(yōu)選地高至少5倍。
[0072]并且/或者，本發(fā)明的抗體分子可以具有一種或多種其他的性質(zhì)，例如提高它們與TACE相互作用的親和力或特異性的性質(zhì)。例如，成熟ADAM胞外域含有一個(gè)球狀金屬蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)二硫鍵依賴的解聯(lián)蛋白-富含半胱氨酸(Dis-Cys)結(jié)構(gòu)域,和在一些情況下，一個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域(圖6(A))。盡管大多數(shù)ADAM催化結(jié)構(gòu)域似乎共享同源的結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)，但是在非催化的Dis-Cys結(jié)構(gòu)域中普遍具有顯著的序列變異(特別是在“超變”區(qū)(HVR)中(13))。因此，優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體分子對(duì)完整TACE胞外域(即催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域)相比于對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域具有親和力偏好，從而有助于避免和具有相似的催化結(jié)構(gòu)域的近緣ADAM家族蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，相比于對(duì)，對(duì)完整的胞外域的親和力偏好較之分離的催化結(jié)構(gòu)域?yàn)橹辽?倍，更優(yōu)選至少5倍，最優(yōu)選至少10倍?？贵w分子的親和力偏好可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中加以確定。
[0073]抗-TACE抗體分子的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力(表示為平衡解離常數(shù)Kd)可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以確定，例如表面等離子體共振，例如使用BIAcore測(cè)定。
[0074]抗TACE抗體分子對(duì)TACE的解離常數(shù)可以小于50nM，小于40nM，小于30nM，小于20nM，小于10nM，或小于InM。例如，抗體分子對(duì)TACE的親和力可以為l_20nM，例如9_15nM。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體分子的親和力常數(shù)(Kd)小于IOnM,更優(yōu)選地小于5nM，最優(yōu)選地小于2nM。結(jié)合TACE或TACE胞外域和/或TACE催化結(jié)構(gòu)域的親和力常數(shù)可以用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)加以確定，例如Biacore SPR分析,如下面實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中舉例說明的。
[0075]抗TACE抗體分子可以包括任何包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的多肽或蛋白，其，包括Fab, Fab2, Fab3, scFv,雙抗體(diabody),三抗體(triabody),四抗體(tetrabody),迷你抗體(minobody)，和單結(jié)構(gòu)域抗體，以及任何同種型或亞類的完全抗體。抗體分子和用于構(gòu)建和使用它們的方法在例如 HolIiger&Hudson, Nature Biotechnology23 (9): 1126-1136 (2005)中有描述。
[0076]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中,抗TACE抗體分子可以是完整抗體(whole antibody)。例如IgG，IgA, IgE或IgM或任何同種型亞類，特別是IgGl和IgG4?？筎ACE抗體分子可以是單克隆抗體。抗TACE抗體分子可以是嵌合、人源化或人抗體。
[0077]本文中所述的抗TACE抗體分子可以是分離的，即沒有污染物，例如能夠結(jié)合其它多肽和/或血清組分的抗體。對(duì)于大部分目的而言單克隆抗體均是優(yōu)選的，盡管也可以采用多克隆抗體。`
[0078]用于產(chǎn)生抗TACE抗體分子的方法包括用蛋白或其片段免疫哺乳動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、家兔、馬、山羊、綿羊或猴)?？贵w可以用各種本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)從被免疫動(dòng)物獲得，并進(jìn)行篩選，優(yōu)選地使用抗體與興趣抗原的結(jié)合。例如，可以使用Western印跡技術(shù)或免疫沉淀(Armitage et al.，1992，Nature357:80-82)。從動(dòng)物分離抗體和/或產(chǎn)抗體細(xì)胞可以伴隨處死動(dòng)物的步驟。
[0079]作為用肽免疫動(dòng)物的替代或補(bǔ)充，可以從重組產(chǎn)生的表達(dá)免疫球蛋白可變域的文庫(kù)(例如使用在其表面上展示功能性免疫球蛋白結(jié)合域的X噬菌體或絲狀噬菌體產(chǎn)生的)獲得特異針對(duì)某種蛋白的抗體。文庫(kù)可以是幼稚的，即是從未經(jīng)任何所述蛋白(或片段)免疫過的生物體獲得的序列構(gòu)建的，或者可以是用從曾暴露于感興趣的抗原的生物體獲得的序列構(gòu)建的。
[0080]在本發(fā)明中，實(shí)施例所述方法可以用于篩選具有拮抗性質(zhì)的抗TACE抗體的其他實(shí)例。在產(chǎn)生和/或分離之后，可以對(duì)抗TACE抗體分子的生物活性進(jìn)行測(cè)試。例如，可以確定抗體抑制TACE底物切割的能力。
[0081]抗體分子通常包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)，盡管抗原結(jié)合區(qū)也可能僅包含重鏈可變區(qū)(VH)(例如駱駝源或鯊魚抗體)。這些抗體均包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0082]抗體分子之間的競(jìng)爭(zhēng)可以在體外容易地進(jìn)行測(cè)定，例如使用ELISA和/或在抗體分子上標(biāo)記特異性報(bào)告分子，其能夠在一種或多種其它非標(biāo)記抗體分子的存在下被檢測(cè)，從而能夠鑒定結(jié)合相同表位或重疊表位的抗體分子。這些方法對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而H是容易知曉的。
[0083]衍生化抗體分子
[0084]本發(fā)明的抗體分子可加以衍生化以改變其性質(zhì)，尤其是其藥理性質(zhì)。一個(gè)實(shí)例是抗體分子與聚(亞烷基二醇)分子偶聯(lián)，特別是聚乙二醇(PEG)分子，其可以用于提高多肽治療的半衰期或其它藥理性質(zhì)。PEG化是用于修飾治療多肽，例如肽、蛋白質(zhì)和抗體，性質(zhì)的已知策略。一般地，將PEG分子附著于多肽用于改變其構(gòu)象、等電點(diǎn)或疏水性質(zhì)，并可以提高其生物和藥理性質(zhì)，例如提高藥物溶解性，減少劑量頻率，調(diào)節(jié)(特別是提高)循環(huán)半衰期，增加藥物穩(wěn)定性，和增強(qiáng)對(duì)蛋白水解的耐受。PEG化通過將多肽與一個(gè)或多個(gè)PEG聚合物分子偶聯(lián)增加治療多肽的分子量發(fā)揮作用。這特別可用于完整抗體片段(例如Fab片段)的抗體分子類型。
[0085]這可以通過使抗體分子中存在的合適功能基團(tuán)與反應(yīng)性聚(亞烷基二醇)分子反應(yīng)，從而對(duì)本發(fā)明的抗體分子實(shí)施該方法。根據(jù)本發(fā)明抗體分子中可得的功能基團(tuán)，有可能以選擇性的方式將抗體分子PEG化，例如通過鑒定抗體分子中合適的反應(yīng)性半胱氨酸殘基。聚(亞烷基二醇)分子在本領(lǐng)域可以和聚(烷基氧化物)分子互換使用，并且是聚酯。聚(亞烷基二醇)分子可以具有線性、分支、梳狀或星形結(jié)構(gòu)，并且一般是高度水溶性的。此外，基本聚(亞烷基二醇)結(jié)構(gòu)可以被提供一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)性功能基團(tuán)，例如羥基、氨基、羧酸、鹵代烷基或硫醇，以方便聚(亞烷基二醇)分子與其它物質(zhì)例如多肽的反應(yīng)。優(yōu)選的聚(亞烷基二醇)分子包括在一個(gè)或多個(gè)羥基位置被化學(xué)基團(tuán)(例如具有1-4個(gè)碳原子的烷基)取代的分子。根據(jù)本發(fā)明使用的優(yōu)選的聚(亞烷基二醇)分子是聚乙二醇(〃PEG〃)分子，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠用其它聚(亞烷基二醇)分子，例如聚丙二醇或聚乙烯-聚丙烯二醇共聚物，對(duì)本發(fā)明的抗體分子進(jìn)行衍生化。聚(亞烷基二醇)分子(包括PEG)的分子量通常為大約400Da-大約80kDa ，更優(yōu)選地大約IkDa-大約60kDa，更優(yōu)選地大約5kDa_大約50kDa，例如分子量為lOkDa，20kDa, 30kDa或40kDa?？梢员景l(fā)明使用的聚(亞烷基二醇)分子是本領(lǐng)域眾所周知的，并可通過公共渠道獲得，例如從商業(yè)來源如SigmaAldrich獲得。
[0086]成像應(yīng)用
[0087]本發(fā)明的抗體分子可以額外地加以標(biāo)記，以使它們能夠與其他治療應(yīng)用聯(lián)合或獨(dú)立地用于成像。用于標(biāo)記抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，能夠使抗體用于多種成像或光譜學(xué)應(yīng)用。這可能在許多不同的醫(yī)學(xué)和研究應(yīng)用中有用，例如在癌癥、心血管醫(yī)學(xué)或移植物排斥領(lǐng)域。
[0088]使用抗體分子成像的一個(gè)具體實(shí)例涉及使用核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)中的放射性核素標(biāo)記，例如單光子發(fā)射型計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)(SPECT)，一種檢測(cè)從放射性核素發(fā)射的Y射線以便產(chǎn)生樣品或?qū)ο篌w內(nèi)放射性核素分布的二維圖像的成像技術(shù)，和正電子成像術(shù)(PET)，這是一種檢測(cè)從被引入到樣品或?qū)ο篌w內(nèi)的發(fā)射正電子的放射性核酸間接發(fā)射的Y射線對(duì)產(chǎn)生三維圖像的成像技術(shù)。具有放射性核素標(biāo)記的抗體分子還可用于組合了成像技術(shù)的多模態(tài)研究，或者通過選擇在超過一種成像技術(shù)中活躍的放射性核素或者通過用超過一種類型的標(biāo)簽標(biāo)記抗體分子來進(jìn)行。
[0089]本發(fā)明的抗體分子可以用放射性核素標(biāo)記，放射性核素例如作為絡(luò)合物提供的，或者與第二分子，例如能夠與標(biāo)簽關(guān)聯(lián)的接頭偶聯(lián)。用于成像技術(shù)或治療的放射性核酸的實(shí)例包括锝、錸、銅、鈷、鎵和銦同位素如 Tc-99m，Re-186, Re-188, Co-57, Ga-67, In-111 (SPECT)，Cu-64, Cu-60, Cu-61, Cu-62, Cu-67, Tc_94m, Ga-68, Co-55 (PET)。一般地，使用锝同位素用于成像目的，錸同位素用于治療目的，銅同位素同時(shí)用于成像和治療。
[0090]醫(yī)學(xué)用涂
[0091]TACE已被報(bào)道具有多種底物，包括許多與癌癥相關(guān)聯(lián)的底物(見Murphy，2008,表I)。結(jié)果，使用本發(fā)明抗體治療性抑制TACE可以是一種靶定TACE介導(dǎo)的病癥和疾病，例如癌癥、免疫相關(guān)疾病或銀屑病，的有用方法。具體地，本發(fā)明的抗體分子可用于治療腦癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎細(xì)胞癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌，或免疫相關(guān)的疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0092]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體分子可以和化療劑或放射療法聯(lián)合施用。額外化療劑的實(shí)例包括EGFR通路抑制劑，例如抗EGFR抗體或EGFR激酶抑制劑如西妥昔單抗(cetuximab)、帕尼單抗(panitumumab)、易瑞沙(Iressa)(吉非替尼(gefitinib)或(N- (3-氯-4-氟-苯基)-1-甲氧基-6- (3-嗎啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)(N_ (3_chloro-4-fluoro-phenyl)-7-methoxy-
[0093]6_ (3-morpholin-4-ylpropoxy) quinazolin-4-amine)、或特羅凱(Tarceva)(埃羅替尼(erlitonib)或N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)]喹唑啉-4-胺(N-(3-ethynylphenyl) -6, 7-bis (2-methoxyethoxy) quinazolin-4-amine))，或其它試劑例如Herceptin?(曲妥珠單抗(trastuzumab))。進(jìn)一步的化療劑實(shí)例包括燒化劑,例如順鉬、卡鉬和奧沙利鉬、蒽環(huán)類、植物生物堿如紫杉烷類和長(zhǎng)春花生物堿，和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑如伊立替康、拓?fù)涮婵怠策灌?、足葉乙甙、磷酸依托泊苷、替尼泊苷，或氟尿嘧啶(5FU)。
[0094]另一種可能性是，本發(fā)明的抗體分子可以是抗體-藥物綴合物，其中抗體分子與藥物或毒素連接?？梢赃@樣做以將藥物或毒素定位到生物系統(tǒng)中存在TACE的靶位點(diǎn)。該方法可以包括工程改造抗體分子，以提供能夠與藥物或毒素反應(yīng)的功能基團(tuán)，或者，使抗體分子具有能夠與藥物或毒素反應(yīng)的接頭基團(tuán)。在本發(fā)明的這個(gè)方面中，藥物還可以是前藥，用于在患者體內(nèi)的靶位點(diǎn)處轉(zhuǎn)變成活性藥。
[0095]關(guān)于TACE和底物/疾病聯(lián)系的藥物開發(fā)努力見Moss2008綜述(PM18414459)。
[0096]在大多數(shù)比較腫瘤與正常組織(oncomine)的研究中，已知TACE被過表達(dá)。TACE已被報(bào)道在多種癌癥中過表達(dá)，包括腦癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌(Murphy，2008，表2)。這意味著，這些病癥可以潛在地用本發(fā)明的抗體分子治療。此外，TACE的底物已經(jīng)與癌癥相關(guān)聯(lián)，并且包括HB-EGF，雙調(diào)蛋白，調(diào)蛋白，TNFa，TGFa ,notch, MICA和MICB。然而，應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明的抗體分子還可以用于如下情況，其中TACE僅以“正常的”生理水平表達(dá)，取決于TACE在該疾病發(fā)生中的作用。進(jìn)一步，本發(fā)明的抗體分子還可以通過抑制機(jī)體內(nèi)除疾病組織和細(xì)胞之外的細(xì)胞和組織中TACE的功能來實(shí)現(xiàn)治療用途，所述細(xì)胞和組織中TACE活性可以導(dǎo)致配體釋放，后者進(jìn)而作用于癌細(xì)胞。一個(gè)這樣的實(shí)例是基質(zhì)細(xì)胞，其可以在腫瘤中發(fā)現(xiàn)，但是自身不是“癌”細(xì)胞。
[0097]HB-EGF - (Yotsumoto2010PM20499311)，TACE 配體 HB-EGF 是用于治療乳腺癌的靶標(biāo)，并潛在克服對(duì)曲妥珠單抗的耐受。
[0098]雙調(diào)蛋白_Kenny2007顯示TGF a和AREG在癌細(xì)胞中被下調(diào)，并且這可以克服惡性表型。Willmarth2008，PM18437539，綜述了 AREG作為乳腺癌的靶標(biāo)。
[0099]在不依賴雄激素的前列腺癌中還與AREG，HB-EGF, TGF a的過表達(dá)相關(guān)聯(lián)(Torring2000, PM10769639)。
[0100]TGF a - Kenny2007,同樣地 Borrel 1-Pages2003 (PM12606576)，TACE 是釋放 TGF a必需的，并且TGF a釋放是激活EGFR必需的。
[0101]調(diào)蛋白-在NSCLC中通過Her3受體參與自分泌環(huán)。RNAi實(shí)驗(yàn)顯示，調(diào)蛋白的釋放受到 TACE 的驅(qū)動(dòng)(Zhou2006, PM16843264)。
[0102]MICA和MICB -這些是自然殺傷系統(tǒng)受體如NKG2D的配體，并可能是TACE的底物。由于TACE活性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面上缺失這些免疫刺激分子，可能有助于它們逃逸自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性(Waldhauer2008PM18676862)。
[0103]因?yàn)門ACE能夠控制EGF家族配體的釋放，已經(jīng)有人提出，TACE抑制策略可能可以和EGFR通路的抑制劑如EGFR抗體(例如西妥昔單抗、潘尼單抗)和EGFR激酶抑制劑(例如易瑞沙、特羅凱)聯(lián)合使用。
[0104]Merchant2008 (PM18281553)證明，TACE抑制與EGFR通路抑制劑在結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCA-7)中具有協(xié)同作用。
[0105]RankL(也稱作TRANCE)是另一種受TACE調(diào)節(jié)的配體。見PM10224132，其公開了 RANKL脫落受到TACE的調(diào)節(jié)的證據(jù)，PM20166980提供了靶定RANKL的一般性綜述，并可用于多發(fā)性骨髓瘤，和PM19714603，其描述了在多發(fā)性骨髓瘤中測(cè)試針對(duì)RANKL的療法(denosumab)的具體實(shí)例。
[0106]巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)受體是另一種受TACE調(diào)節(jié)的配體(PM19762488)。
[0107]TACE抑制還可以和其它受ErbB驅(qū)動(dòng)的腫瘤的抑制劑聯(lián)合使用。例如，已經(jīng)有報(bào)道，TGFa能夠阻礙赫賽汀(曲妥珠單抗)下調(diào)Her2的能力，并且抑制TACE能夠減少TGF a，并與赫賽汀治療具有協(xié)同作用(Valabrega2005，PM15735715)。
[0108]此外，后來人們描述了 TACE的這樣一種作用，其中TACE的誘導(dǎo)與化療耐受/放療耐受有關(guān)，并且抑制TACE可以用于和化療和放療聯(lián)合使用(Kyula2010PM20570921)。
[0109]TACE活性的調(diào)節(jié)可能在炎癥疾病，例如關(guān)節(jié)炎，中是重要的，其中TACE靶蛋白如TNFa，L-選擇素和可溶IL6受體與疾病密切聯(lián)系，并且抑制TACE活性可能在治療上是有用的(Moss2008 綜述，PM18414459)TACE 作為 RA 的一個(gè)靶標(biāo)。
[0110]抑制TACE還被提出作為治療卒中(Lovering2005，PM15857301)和糖尿病(Serino2007, PM17646208)的一種治療策略。
[0111]在氣道炎癥模型中抑制TACE已知是治療基于炎癥或變應(yīng)性的疾病(如哮喘)的一種策略(Trifilief et al2002, PMl 1934805)。
[0112]藥物纟目合物
[0113]本發(fā)明的抗TACE抗體分子可以和藥學(xué)可接受的賦形劑一起包含在藥物組合物中。
[0114]藥學(xué)可接受的賦形劑可以是加入藥物組合物中的化合物或化合物組合，其不會(huì)引起副反應(yīng)，并且方便例如抗TACE抗體分子的施用、增加其在機(jī)體內(nèi)的半衰期和/或效力，或者提高其在溶液中的溶解性。這些藥學(xué)可接受的媒介是眾所周知的，并可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)抗TACE抗體分子的給藥方式進(jìn)行適應(yīng)性修改。[0115]在一些實(shí)施方案中，抗TACE抗體分子可以用凍干的形式提供，在給藥前重新構(gòu)建。例如，凍干的抗體分子可以在無菌水中重新構(gòu)建，并在施用給個(gè)體之前與鹽溶液混合。
[0116]抗TACE抗體分子通常以藥物組合物的形式施用，其除了抗體分子之外還包含至少一種組分。因此，除了抗TACE抗體分子之外，藥物組合物可以包括藥學(xué)可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的材料。這些材料應(yīng)當(dāng)是無毒的，并且不應(yīng)干擾抗TACE抗體分子的效力。載體或其它材料的確切性質(zhì)取決于給藥的途徑，其可以是藥丸、灌注、注射或其它合適的途徑，如下面討論的。
[0117]對(duì)于靜脈內(nèi)給藥，或者通過注射，包含抗TACE抗體分子的藥物組合物可以處于非腸道可接受的水溶液形式，其沒有熱原并具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員能夠使用例如等滲媒介制備合適的溶液，例如氯化鈉注射液、林格氏液注射液、乳酸林格氏注射液。防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或添加劑可以根據(jù)需要使用，包括緩沖劑如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑如抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六烴季銨氯化物；苯扎氯銨；芐索氯銨；苯酚，丁基或芐醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯類，如甲基或羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3’ -戊醇；和間甲酚)；低分子量多肽；蛋白質(zhì)如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖，雙糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，如EDTA ;糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽的反離子，如鈉；金屬配合物(例如鋅蛋白復(fù)合物);和/或非離子表面活性劑，如 TWEEN?、PLUR0NICS? 或聚乙二醇(PEG)。
[0118]包含抗TACE抗體分子的藥物組合物可以單獨(dú)施用或者與其它治療聯(lián)合施用，同時(shí)或順次，取決于所治療的疾病。
[0119]本文中所述的抗TACE抗體分子可以用于人或動(dòng)物的治療，包括預(yù)防性治療(在個(gè)體中發(fā)生疾病之前的治療，用于降低該個(gè)體中疾病發(fā)生的危險(xiǎn)；延遲其發(fā)生；或在發(fā)生后降低其嚴(yán)重性)。治療方法可以`包括向有需要的個(gè)體施用抗TACE抗體分子。
[0120]給藥通常以足以對(duì)患者顯示益處的“治療有效量”給藥。這些益處可以是至少減緩至少一種癥狀。實(shí)際的給藥量、給藥速度和時(shí)間周期取決于所治療疾病的特性和嚴(yán)重程度，所治療的特殊哺乳動(dòng)物，個(gè)體患者的臨床條件，疾病的原因，輸送組合物的位置，給藥方法，給藥時(shí)間表和醫(yī)療從業(yè)人員已知的其它因素。治療的處方，例如診斷決定等，是一般從業(yè)者和其它醫(yī)生的責(zé)任范圍，并可以取決于癥狀的嚴(yán)重性和/或所治療疾病的進(jìn)程。合適的抗體分子劑量是本領(lǐng)域眾所周知的(Ledermann J.A.et al.(1991) Int.J.Cancer47:659-664;Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody, Immunoconjugates andRadiopharmaceuticals4:915-922)。對(duì)于所用藥物類型而言合適的具體劑量可以在本文中指出或者在Physician’s Desk Reference (2003)中指出。治療有效量或合適劑量的抗體分子可以通過比較其體外活性和在動(dòng)物模型體內(nèi)的活性加以確定。將小鼠和其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的有效劑量換算成人的劑量的方法是已知的。確切劑量取決于多種因素，包括抗體是用于預(yù)防還是用于治療，所處理區(qū)域的大小和位置，抗體確切性質(zhì)(例如完全抗體、片段)和附著在抗體上的任何可檢測(cè)標(biāo)簽或其它分子的性質(zhì)。
[0121]典型的抗體劑量范圍，對(duì)于系統(tǒng)應(yīng)用是IOOii g-lg，對(duì)于局部應(yīng)用是Iii g-lmg。可以施用最初較高的負(fù)荷劑量，隨后是一次或多次較低的劑量。通常，抗體是完全抗體，例如IgGl或IgG4同種型。這是成年患者單次治療的劑量，其可以對(duì)孩童和嬰兒按比例調(diào)整，還可以根據(jù)分子量的比例對(duì)其它抗體形式進(jìn)行調(diào)整。治療可以每天重復(fù)I次、每周2次、每周I次、每月I次，取決于醫(yī)生的判斷。治療可以每2-4周皮下施用I次，和每4-8周靜脈內(nèi)施用I次。治療可以是周期性的，給藥之間的周期為大約2周或更長(zhǎng)，例如大約3周或更長(zhǎng)，大約4周或更長(zhǎng)，或者大約每月I次。治療可以在手術(shù)之前和/或之后施用，和/或可以直接施用或應(yīng)用于手術(shù)治療或侵入性操作的解剖位置處。合適的劑型和給藥途徑如上所述。
[0122]在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，抗TACE抗體分子的治療效果可以持續(xù)數(shù)個(gè)半衰期，這取決于劑量。例如，抗TACE抗體分子單次劑量的治療效果可以在個(gè)體內(nèi)持續(xù)I個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，2個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，3個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，4個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，5個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間，或者6個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。
[0123]材料和方法
[0124]重組人TACE成熟的重組TACE胞外域(Arg215-Arg651)在桿狀病毒感染的sf9細(xì)胞中表達(dá)，并如Milla et al.(28)所述地進(jìn)行純化。TACE的成熟催化結(jié)構(gòu)域(Arg215-Val477-GlySer-His6)使用相同的桿狀病毒系統(tǒng)制備，并使用固定化金屬親和色譜(IMAC)純化。
[0125]選擇抑制性抗TACE胞外域人ScFv抗體重組人TACE胞外域(Arg215-Arg651)用N-琥珀酰亞胺生物素(Invitrogen AL-OI)以1:1的比例生物素化，并在淬滅熒光肽剪切測(cè)定(見下文)中檢查野生型活性，并在50 ii M CT1746(24)存在下暴露于McCafferty (23)的人scFv噬菌體展示文庫(kù)。經(jīng)過兩輪溶液相篩選之后，將洗脫的單克隆scFv群體克隆到pSANG10-3F(29)中并轉(zhuǎn)化到 BL21 (DE3)RIPL 大腸桿菌(Stratagene230280)中。從大腸桿菌周質(zhì)分離各個(gè)scFv克隆，并在沒有CT1746的條件下進(jìn)行針對(duì)固定化重組TACE胞外域的ELISA篩選。詳盡的篩選細(xì)節(jié) 在先前已有描述(19，23)。在初始篩選之后，在500mL自誘導(dǎo)(30)搖瓶培養(yǎng)物中表達(dá)14個(gè)單獨(dú)的抗TACE scFv克隆，并通過IMAC純化周質(zhì)級(jí)分。對(duì)純化的scFv，在淬滅熒光肽測(cè)定(見下文)中篩選其對(duì)重組TACE的抑制，和在PMA刺激的HB-EGF堿性磷酸酶測(cè)定(見下文)中篩選其對(duì)細(xì)胞表面TACE的抑制。
[0126]淬滅熒光肽剪切測(cè)定在50mM Tris-HCl, IOmM CaCl2, 0.05%Brij35, 1%DMS0, pH7.4中將重組人TACE催化結(jié)構(gòu)域和TACE胞外域稀釋到InM，并在室溫下與滴定濃度的抑制劑預(yù)溫育4小時(shí)。溫育后，將每個(gè)反應(yīng)分到96孔黑色Microwell平板(Nunc237105)的200 ii L技術(shù)四分組(technical quadruplet)中，并向每個(gè)孔添加發(fā)突光底物甲氧香ii 素基乙基-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu- 二硝基苯二氛基丙酸基-Ala-Arg-NH2 (PeptidesInternational SM0-3670-PI)(終濃度=1 u M)。在 Tecan Infinite-200 中，每隔 30 秒在320nm激發(fā)熒光，并在405nm記錄發(fā)光(37 °C，2000秒)。將各個(gè)讀數(shù)相對(duì)僅有底物的對(duì)照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并匯總以產(chǎn)生每個(gè)變體的平均趨勢(shì)。用GraphPad Prism計(jì)算每個(gè)反應(yīng)的線性回歸斜率(AFU sec—1)，將蛋白水解活性表示為未處理對(duì)照的斜率百分比(％AFU sec—1)。最終的結(jié)果代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
[0127]ScFv DIVl-交換將TACE抑制性scFv Dl的Vh結(jié)構(gòu)域克隆到由McCafferty開發(fā)的天然人輕鏈(入和K)噬菌體展示文庫(kù)中，并對(duì)所得的文庫(kù)(下文稱作D1-Vh-新文庫(kù))的隨機(jī)克隆進(jìn)行PCR篩選，評(píng)估Vh插入率(全部scFv的86%)。將滴定濃度(0.01nM, 0.1nM, InM和 IOnM)的 1:1 生物素化 TACE 胞外域(無 CT1746)暴露于 D1-Vh-新文庫(kù)進(jìn)行兩輪溶液相篩選。此外，針對(duì)固定在鏈親和素包被的免疫管(Immuno-Tubes)(Nunc444202)上的生物素化TACE胞外域進(jìn)行相同的滴定篩選(固相篩選)。經(jīng)過兩次選擇各兩輪之后，將洗脫的單克隆scFv群體單獨(dú)克隆到PSANG10-3F中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL2KDE3)中。從大腸桿菌周質(zhì)總共分離了超過1，000個(gè)單獨(dú)的scFv克隆，并針對(duì)固定化的重組TACE進(jìn)行ELISA選擇。從全部10個(gè)選擇中，將最好的24個(gè)克隆單獨(dú)表達(dá)在50mL自誘導(dǎo)搖瓶培養(yǎng)物中，并通過IMAC(Satorius VS-MCMINI24)純化周質(zhì)級(jí)分。對(duì)滴定濃度的所有成熟scFvs (包括原始DlscFv)針對(duì)IOOnM TACE胞外域和催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行ELISA篩選，以鑒定雙結(jié)合物(dual binder)。
[0128]互補(bǔ)位丙氨酸掃描誘變通過同源建模(26)鑒定Dl (A12)互補(bǔ)位殘基，并使用定點(diǎn)突變(Stratagene200521)產(chǎn)生各個(gè)丙氨酸突變體。將純化的重組scFv進(jìn)行8_點(diǎn)熒光計(jì)量滴定(8-point f luorometric titration) ([TACE] =InM)(如上)和 16-點(diǎn)滴定ELISA ([TACE] =5OOnM)。用 GraphPad Prism 計(jì)算 Dl (Al2) (WT)和每種丙氨酸突變體(Ala)的IC5tl和EC5tl值。使用如下公式計(jì)算吉布斯自由能變化(A A G): A A G=+RTln (Ala/WT)。
[0129]重組Dl (Al2)人FAb的表達(dá)將Dl (Al2)的Vh和\結(jié)構(gòu)域克隆到基于pET22b (+)的新型人FAb表達(dá)載體中(分別在人ChI和Cf K的上游)。在5L臺(tái)式發(fā)酵罐中將轉(zhuǎn)化的BL21(DE3)RIPL大腸桿菌培養(yǎng)到0D_>40，用IOmM IPTG誘導(dǎo)，再經(jīng)過4小時(shí)后收集。通過滲壓休克分離周質(zhì)級(jí)分，通過蛋白G親和色譜(GE17-0404-01)純化人FAb。
[0130]表面等離子體共振(SPR)使用胺、醛或生物素偶聯(lián)將TACE固定在Biacore SPR芯片上會(huì)使蛋白快速變性(僅暴露線性表位)。這可以解釋為什么沒有使用TACE的SPR實(shí)驗(yàn)報(bào)道。為了避免這個(gè)問題，將是單價(jià)Dl (Al2) FAb或N-TMP-3均用胺偶聯(lián)到CM5芯片(GEHealthcare)(~200響應(yīng)單位(RU))上，并注射滴定濃度的TACE。結(jié)果代表每個(gè)濃度變體三個(gè)減去空白的技術(shù)重復(fù)的平均值。所有實(shí)驗(yàn)均在Biacore TlOO (GE Healthcare)上實(shí)施，在 37°C下,流速為 40 u L/sec。結(jié)合常數(shù)用 Biacore TlOOEvaluation Software 軟件計(jì)算(1:1 結(jié)合模型；Rmax〈200RU;tc>lxl08;Chi2〈0.5RU2)。
[0131]重組D1(A12)人IgGl的表達(dá)將D1(A12)的Vh和Vl結(jié)構(gòu)域克隆到新型pBudCE4.1 (Invitrogen V532-20)人IgGl表達(dá)載體中(k -變異體)，并使用Fugene6 (Rochel 1988387001)轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293群體在10層HYPERFlasks (Corningl0030)中生長(zhǎng)至最大匯合,通過蛋白-L親和色譜(Pierce89929)從條件培養(yǎng)基中純化人IgGl。用Melon凝膠技術(shù)(PierCe45206)除去痕量的牛血清蛋白，并將最終的Dl (A12)人IgGl的緩沖液交換為無菌PBS。
[0132]TNF- a切割測(cè)定將重組人TACE與滴定濃度的Dl (Al2) FAb (稀釋于50mMTris-HCl, IOmM CaCl2, 0.05%Bri j35, 1%DMS0, pH7.4 中)合并，并立即添加到 5 y MGST-TNF- a (31)。每個(gè)反應(yīng)在37°C下溫育，用12%SDS_PAGE分離，考馬斯藍(lán)染色，并通過密度測(cè)定(ImageQuant TL (GE Healthcare))定量各個(gè)條帶。
[0133]TACE細(xì)胞表面脫落測(cè)定對(duì)于所有的脫落測(cè)定，將4xl04個(gè)細(xì)胞/孔(置于300 U L培養(yǎng)基中)接種在48孔板中36個(gè)小時(shí)，用無血清培養(yǎng)基清洗3次，并與Dl (A12)人IgGl, N-TIMP-3或?qū)φ杖搜獫{IgG (R&D Systemsl-OOl-A)(在無血清培養(yǎng)基中稀釋)預(yù)溫育I小時(shí)。每個(gè)孔用100 u g/mL12-豆蘧酸-13-乙酸佛波醇(PMA)刺激，并在I小時(shí)后收集上清。通過夾心式ELISA(R&DSystem Duoset)定量可溶的TNF-a，TGF-a和雙調(diào)蛋白，HG-EGF堿性磷酸酶的測(cè)定如Willems et al(2010)所述。
[0134]結(jié)果
[0135]抗TACE胞外域抑制性人抗體的分離盡管大多數(shù)TACE藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目均集中在抑制分離的催化結(jié)構(gòu)域的蛋白水解活性上，但是本發(fā)明人有目的地選擇拮抗完整的胞外域(即催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域)。根據(jù)最近的結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展和先前的生化觀察，發(fā)明人提出如下假說:選擇性靶定完整TACE胞外域的非催化區(qū)會(huì)產(chǎn)生更特異的細(xì)胞表面抑制劑。為此，將重組人TACE胞外域生物素化，檢查野生型活性，并暴露于幼稚的人scFv抗體噬菌體展示文庫(kù)(23)進(jìn)行兩輪溶液相選擇。因?yàn)橄惹爸苯影卸ń饘俚鞍酌复呋稽c(diǎn)的嘗試會(huì)導(dǎo)致非期望的交叉反應(yīng)(例如TIMPs，前結(jié)構(gòu)域和SMI)，我們?cè)谧畛踹x擇期間用廣譜金屬蛋白酶抑制劑CT1746 (24)阻斷了 TACE催化裂口(圖1(B))。因此，所得的TACE胞外域抗原不會(huì)選擇這樣的抗體:其針對(duì)的表位依賴于催化位點(diǎn)深處的殘基。經(jīng)過ELISA篩選(圖7(A))之后，對(duì)隨后的陽性scFv克隆進(jìn)行測(cè)序以排除重復(fù)，在大腸桿菌中表達(dá)并親和純化(固定化金屬親和色譜(IMAC))，用于功能表征。盡管根據(jù)阻礙TACE淬滅熒光(QF)肽蛋白水解的能力鑒定了數(shù)個(gè)抑制性抗體(圖7 (C))，但是當(dāng)針對(duì)HB-EGF的細(xì)胞表面脫落進(jìn)行測(cè)試時(shí)，只有scFv Dl仍保持該抑制性譜(圖7(D))。詳盡的QF肽分析顯示，scFv Dl抑制TACE胞外域的強(qiáng)度(IC5(I=5.4(±0.4)nM)與天然TACE氨基酸結(jié)構(gòu)域抑制劑TMP-3，N-TMP-3(IC5(i=3.2(±0.2)nM)相似(圖 2(A))。然而，與 N-TMP-3 不同，scFv Dl不結(jié)合TACE的分離催化結(jié)構(gòu)域(圖2(B))。我們先前已經(jīng)顯示，蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)能夠改變TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域的三維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(19)。與Dis-Cys結(jié)合scFv D3的方式相似，TACE胞外域的PDI調(diào)變會(huì)嚴(yán)重干擾scFv Dl免疫反應(yīng)性(圖2(C))。同時(shí)考慮到缺少對(duì)分離催化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，這個(gè)觀察結(jié)果提示，scFv Dl主要結(jié)合非催化的TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域。單個(gè)scFv Dl補(bǔ)體決定區(qū)(OTR)環(huán)的丙氨酸掃描誘變顯示，scFv Dl的可變重鏈(Vh)殘基主要負(fù)責(zé)TACE胞外域結(jié)合。相反，可變輕鏈(')的⑶R環(huán)似乎對(duì)活性Dl互補(bǔ)位沒有顯著貢獻(xiàn)(圖2(D))。盡管有保守的互補(bǔ)位，scFv Dl似乎完全選擇針對(duì)人TACE(圖
8)?？傊覀兊贸鼋Y(jié)論，scFv Dl是一種選擇性的Vh依賴的抑制性抗體，其主要結(jié)合非催化的TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域。
[0136] 通過'交換引入催化結(jié)構(gòu)域因?yàn)閟cFv Dl通過其Vh結(jié)構(gòu)域與非催化區(qū)結(jié)合，但與催化位點(diǎn)足夠接近以至于能夠阻斷小肽水解，所以我們認(rèn)為，當(dāng)前沒有被討論的\結(jié)構(gòu)域非?？拷黅ACE催化結(jié)構(gòu)域。而且，我們進(jìn)一步假設(shè)，非功能的DlVf⑶R可以被工程化引入TACE催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合。為了探究這一觀點(diǎn)，將D1-Vh結(jié)構(gòu)域克隆到幼稚的(naive)人'噬菌體展示文庫(kù)中，并將最終的“D1-Vh-新文庫(kù)”針對(duì)滴定濃度的生物素化TACE胞外域進(jìn)行嚴(yán)格的再選擇。因?yàn)镈1-Vh通過Dis-Cys結(jié)合已經(jīng)是完全的TACE選擇性(圖8)，所以我們從全部D1-Vh-新選擇中除去CT1746，以提供可以不受干擾地接近TACE催化位點(diǎn)的新結(jié)構(gòu)域。所得的篩選方案有利于全部D1-Vh-新scFv保持TACE選擇性(通過D1-Vh與胞外域Dis-Cys區(qū)結(jié)合)，同時(shí)使新結(jié)構(gòu)域暴露于先前不可接近的催化裂口表位(由于不存在小分子拮抗劑)(圖1 (B))。
[0137]經(jīng)過兩輪液相和固相選擇后，對(duì)超過1000個(gè)D1-Vh-新scFv再次篩選TACE胞外域結(jié)合。分離出最好的30個(gè)克隆，測(cè)序除去重復(fù)，將它們?cè)诖竽c桿菌中單獨(dú)表達(dá)并親和純化。然后對(duì)D1-Vh-新前導(dǎo)scFv ELISA篩選它們同時(shí)結(jié)合完整TACE胞外域和分離的催化結(jié)構(gòu)域的能力(圖3 (A))。如預(yù)期地，在不存在CT1746的條件下嚴(yán)格選擇針對(duì)TACE的新鏈產(chǎn)生了多個(gè)D1-Vh-新scFv變異體，它們能夠獨(dú)立地結(jié)合分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域和完整的胞外域。前導(dǎo)scFv “A12”(下文稱作D1(A12))對(duì)兩種抗原具有最高的親和力，并被用于進(jìn)一步的分析。
[0138]Dl (Al2) - TACE相互作用的動(dòng)力學(xué)表征先前的篩選ELISA提示，D1-Vh-新-Vl克隆D1(A12)可以同時(shí)獨(dú)立地結(jié)合TACE胞外域和分離的催化結(jié)構(gòu)域。此外，與親本scFv Dl相比，D1(A12)對(duì)TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域的PDI調(diào)變高度耐受(圖3(B))?？傊?，這些結(jié)果提示，D1(A12)表位含有來自TACE的催化結(jié)構(gòu)域的殘基以及Dis-Cys結(jié)構(gòu)域的殘基。為了表征兩種相互作用的動(dòng)力學(xué)，將Dl (A12)重新構(gòu)建成單價(jià)人FAb，胺偶聯(lián)于CM5Biacore芯片，并注射滴定濃度的TACE胞外域或分離的催化結(jié)構(gòu)域。表面等離子體共振(SPR)顯示，D1(A12)對(duì)完整TACE胞外域的親和常數(shù)(Kd)為461 (±65)PM，但對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域僅為 5，210(±102)pM(AKD=KDCat/KDErt()=lL 3)(圖 3(C))。盡管 N-TMP-3 的深催化裂口焦點(diǎn)支持與分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域的良好結(jié)合(KDGat=211 (±32)pM)，但是在額外存在非催化TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域時(shí)，與完整胞外域的結(jié)合被嚴(yán)重干擾(KDEet°=7，221 (±84)pM)(DKD=KDCat/KDEcto=0.03)。通過反向滴定ELISA也觀察到了相當(dāng)?shù)?gt;10倍的EC5tl差異(圖3(D)) ( A EC50=EC50Cat/EC50Ecto=12.1)。因此D1(A12)是第一種對(duì)完整的胞外域顯示出相比于分離的催化結(jié)構(gòu)域的親和性偏好的ADAM抑制劑。這種親和性親和性的差異與Dl (A12)表位的通過“兩步”噬菌體展示篩選產(chǎn)生的多結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)相關(guān)聯(lián)。
[0139]Dl (Al2)互補(bǔ)位掃描誘變Dl (Al2)是一種抑制性TACE人抗體，對(duì)完整胞外域的親和性比對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域有>10倍的親和性偏好。因?yàn)樽畛醯腄lscFv不與TACE催化結(jié)構(gòu)域反應(yīng)，但通過交換可有效引入催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合，所以我們提出假設(shè)，原始D1-Vh內(nèi)的殘基與TACE Dis-Cys相互作用，且新-A12-'內(nèi)的殘基與催化結(jié)構(gòu)域相互作用。為了詳盡地表征該D1(A12)互補(bǔ)位,將延伸超過(6-碳(extending beyond the ^ -carbon)的所有殘基均單獨(dú)突變成丙氨酸(n=30)，在大腸桿菌中表達(dá)，并親和純化。為每種突變體的溶液相QF肽計(jì)算針對(duì)完整TACE胞外域(IC5(lEc;t°)和分離的催化結(jié)構(gòu)域(IC5(leat)的IC5>=60)。此外，同時(shí)使用相同的程序計(jì)算“野生型"D1 (A12) scFv針對(duì)TACE胞外域(IC5QEet°:WT=0.89( + 0.04)nM)和催化結(jié)構(gòu)域(IC5(lGat:WT=2.3(±0.09)nM)的IC5tl(IC5(IWT)。隨后為每種突變體和抗原計(jì)算吉布斯自由能變化(A AG) (A AG=+RTln(IC50aiVIC5Owt))(圖 4(A))。與 scFv Dl 的⑶R突變(圖2(D)) —致，許多D1(A12)VH殘基對(duì)1(:5(^°:"有貢獻(xiàn)。有趣的是，⑶R-Hl殘基SH31和YH32，和CDR-H2殘基SH52 (Kabat編號(hào))似乎僅對(duì)IC5(lEet°:WT有貢獻(xiàn)，而對(duì)獲得IC50Cat:ffT幾乎完全不必要。相反，CDR-Ll殘基QL27, SL28和IL29,和CDR-L3殘基SL91和FL92僅似乎對(duì)IC5(lGat:WT有貢獻(xiàn)，而對(duì)獲得IC5(lEet°:WT幾乎完全不必要。為了與該溶液相分析對(duì)應(yīng)，對(duì)所有互補(bǔ)位突變體也計(jì)算了固相ELISA EC5tlA AG值(圖4(B))。盡管它們的方法學(xué)完全不同，但是溶液相和固相Dl (A12)互補(bǔ)位△ AG分布卻相當(dāng)相似(胞外域相關(guān)性=0.86 ±0.05; R2=0.91)(催化結(jié)構(gòu)域相關(guān)性=0.82 ±0.06; R2=0.86)。這種一致性提示，D1(A12)結(jié)合是TACE抑制的一個(gè)直接代替(directproxy)。重要的是，Vh殘基SH31，YH32，和SH52重復(fù)了其偏好胞外域的行為，而\殘基QL27，SL28, IL29, SL91和FL92則繼續(xù)對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合起貢獻(xiàn) 。
[0140]當(dāng)作圖到Dl (A12) Fv羅塞塔抗體模型(Rosseta antibody model)上時(shí)(26),顯不任一抗原偏倚性的殘基聚集在互補(bǔ)位的極性末端。此外,CDR-H3代表互補(bǔ)位核心內(nèi)的一個(gè)雙重重要性中間區(qū)域?？傊?這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示,Dl (A12)藉由Vh結(jié)構(gòu)域的外緣(outskirt)上的殘基與TACE Dis-Cys結(jié)構(gòu)域相互作用，并且藉由\結(jié)構(gòu)域內(nèi)的選定殘基與催化結(jié)構(gòu)域排他性地相互作用。
[0141]Dl (Al2)與TMP-3共享一個(gè)表位已知外源金屬蛋白酶抑制劑TMP-3緊密對(duì)接在分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域的催化裂口內(nèi)。不幸的是，TMP-3還結(jié)合許多金屬蛋白酶的催化位點(diǎn)，因此限制了其作為靶向治療劑的用處。因?yàn)镈1(A12)部分結(jié)合TACE催化結(jié)構(gòu)域，我們假設(shè)，它可能與TMP-3共享一個(gè)重疊的表位。為了研究這個(gè)觀點(diǎn)，將TACE胞外域固定在免疫吸收板(immunosorp plate)上,封閉表面,每個(gè)孔用滴定濃度的單價(jià)Dl (A12)人FAb或?qū)φ杖搜獫{IgG溫育。隨后用N-TMP-3探測(cè)顯示，Dl (Al2)FAb劑量依賴地干擾N-TMP-3結(jié)合TACE胞外域(圖9(A))。通過反轉(zhuǎn)Dl (A12)和N-HMP-3的方向觀察到了相似的行為(圖9(B))。兩種方法均指示，Dl (A12)和N-TMP-3以1:1的主探針:TACE胞外域摩爾比干擾結(jié)合。盡管它們具有實(shí)質(zhì)上不同的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，但是我們認(rèn)為，D1(A12)與內(nèi)源TACE抑制劑TMP-3至少共享部分表位。
[0142]Dl (Al2)強(qiáng)烈抑制完整TACE胞外域通過使用兩步抗體噬菌體展示探究ADAM多結(jié)構(gòu)域拓?fù)鋵W(xué)，我們工程化了第一個(gè)對(duì)完整胞外域的親和性比對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域的親和性顯著更高的ADAM拮抗劑。因?yàn)樵摲椒ǖ淖罱K目的是開發(fā)優(yōu)秀的TACE抑制劑，我們對(duì)將這種提高的胞外域親和性轉(zhuǎn)化為抑制潛力進(jìn)行了表征。這是本領(lǐng)域中首次報(bào)道一種針對(duì)TACE的拮抗性抗體，盡管TACE的克隆已經(jīng)在W096/041624中公開。
[0143]單價(jià)DI (A12) FAb證明能夠抑制大分子GST-TNF- a底物被TACE胞外域和分離的催化結(jié)構(gòu)域蛋白水解(圖5(A))。與先前的親和數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，Dl (A12)FAb對(duì)TACE胞外域活性的抑制比對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域活性的抑制更強(qiáng)烈(IC5(lErt°=73.9 (± 3.2)nM; IC5QGat=124.7(±6.2)nM)。而且，在全面的QF肽分析中，Dl (Al2) FAb仍保持這一強(qiáng)烈的抑制能力(圖5 (B))。Dl (A12) FAb抑制分離的TACE催化結(jié)構(gòu)域的能力與天然的前導(dǎo)TACE抑制劑N-TMP-3 相似(A I C5Q=IC5(lGat:N-TIMp-3/IC5QGat:D1_=L 35)。然而，當(dāng)用完整 TACE胞外域?qū)嵤┫嗤臏y(cè)定時(shí)，Dl (Al2)比 N-TMP-3 好 >5 倍(A IC50=IC50Ecto:mimp^3/IC50Ect0:1)1 (A12) =5.75)。
[0144]因?yàn)橐种仆暾鸗ACE胞外域的理由是產(chǎn)生一種優(yōu)秀的細(xì)胞表面TACE抑制劑，D1(A12)被重新構(gòu)建成人IgGl，并在多個(gè)基于癌細(xì)胞的脫落測(cè)定中與N-TMP-3進(jìn)行比較(圖5(C))。在4種人癌細(xì)胞系上研究了 Dl (A12) IgGl對(duì)4種不同TACE配體的脫落的影響。有趣的是，Dl (A12)和N-TIMP-3的QF-肽TACE胞外域抑制分布在所有四種細(xì)胞表面脫落測(cè)定中幾乎相同地重現(xiàn)。無論底物、細(xì)胞系或TACE表達(dá)水平，Dl (Al2)人IgGl抑制細(xì)胞表面TACE活性的能力一律比N-TMP-3高5倍。用單價(jià)Dl (A12)FAb獲得了相似的抑制譜(圖
9)——提示每個(gè)IgG只有一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域結(jié)合細(xì)胞表面TACE。ELISA、QF肽和細(xì)胞表面脫落測(cè)定還確認(rèn)了 D1(A12)特異性靶定TACE，而不靶定與之緊密相關(guān)的蛋白酶(圖10)。由于只有TACE胞外域存在于細(xì)胞表面，所以這些數(shù)據(jù)綜合起來證明了特異性靶定完整TACE胞外域的拮抗價(jià)值。
[0145]表S1.Dl (A12) IC50數(shù)據(jù).(A)來自圖9⑶的IC5tl值。(B)來自圖9的IC5tl值。此外，描述了來自TNFRla脫落的結(jié)果。全部土代表SD。
[0146]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的抗體分子，其特異性結(jié)合TNF-a轉(zhuǎn)化酶(TACE)并抑制TACE的生物活性。
2.權(quán)利要求1的抗體分子，其中所述抗體通過與TACE的催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域二者結(jié)合來抑制TACE的生物活性。
3.權(quán)利要求1或2的抗體分子，其中抗體分子能夠抑制TACE對(duì)底物的切割。
4.權(quán)利要求3的抗體分子，其中切割是在體外底物切割測(cè)定中確定的，并且所述底物是合成底物。
5.權(quán)利要求3的抗體分子，其中切割是在基于細(xì)胞的脫落測(cè)定中確定的，并且所述底物附接于細(xì)胞表面。
6.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中在相同的測(cè)定條件下，所述抗體分子是比N-TIMP-3至少?gòu)?qiáng)2倍的TACE抑制劑。
7.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中抗體分子對(duì)完整TACE胞外域相比于對(duì)分離的催化結(jié)構(gòu)域有至少2倍的親和性偏好。
8.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其能夠結(jié)合如下的TACE多肽，所述TACE多肽包括與SEQ ID NO: 19所示的氨基酸215-651具有至少80%序列同一性的多肽。
9.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子包含具有SEQID NO:1的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:l中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的CDR-Hl。
10.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子包含具有SEQID NO:2的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:2中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的CDR-H2。
11.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子包含具有SEQID NO:3的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:3中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的CDR-H3。
12.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子包含具有SEQID N0:4的氨基酸序列、或者具有SEQ ID N0:4中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的CDR-Ll。
13.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子包含具有SEQID NO:5的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:5中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的CDR-L2。
14.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子包含具有SEQID NO:6的氨基酸序列、或者具有SEQ ID NO:6中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列的CDR-L3。
15.權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的抗體分子，其中所述抗體分子的CDR的氨基酸序列與SEQID NO: 1-6中任一個(gè)相比包含I, 2，3，4，5，6，7，8，9或10個(gè)氨基酸替換、缺失或插入。
16.權(quán)利要求9-14中任一項(xiàng)的抗體分子，其中所述抗體分子的CDR的序列中的氨基酸替換、缺失或插入保留如下的氨基酸殘基:
CDR-Hl:SH3I 和 YH32
CDR-H2:SH52, SH56 和 YH58CDR-H3:PH98, YH100, THlOOB 和 WHlOOD
CDR-Ll:QL27, SL28, IL29 和 YL32
CDR-L2:HL49 和 DL50
CDR-L3:SL91，F(xiàn)L92 和 IL94 其中殘基根據(jù)Kabat編號(hào)進(jìn)行編號(hào)。
17.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的抗體分子，包含:VH域，其包含分別具有SEQID NO:1, 2和3的序列的CDR-Hl，CDR-H2和CDR-H3 ;和/或VL域，其包含分別具有SEQ ID NO:4，5和6的序列的 CDR-LI，CDR-L2 和 CDR-L3。
18.權(quán)利要求17的抗體分子，包含:VH域，其與SEQID NO: 7的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性，和/或VL域，其與SEQ ID NO:9的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一丨I"生。
19.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子是完全抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv、雙抗體或三抗體。
20.前述任一權(quán)利要求的抗體分子，其中所述抗體分子是人抗體、人源化抗體、雙特異性抗體或嵌合抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)的抗體分子，其是完整抗體。
22.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的抗體分子和藥學(xué)可接受的賦形劑。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的抗體分子，供在治療人或動(dòng)物體的方法中使用。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的抗體分子，供在治療TACE介導(dǎo)的病癥的方法中使用。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的抗體分子制造用于治療TACE介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。
26.一種治療患有TACE介導(dǎo)的病癥的個(gè)體的方法，包括向有該需要的個(gè)體施用根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的抗體分子。
27.權(quán)利要求23-26中任一項(xiàng)的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中所述TACE介導(dǎo)的病癥是癌癥、免疫相關(guān)疾病、銀屑病或基于炎癥或變應(yīng)性的疾病例如哮喘。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中所述癌癥是腦癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或結(jié)直腸癌。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中所述免疫相關(guān)疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
30.根據(jù)權(quán)利要求23-29中任一項(xiàng)的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中抗體與化療劑聯(lián)合施用，或與放療聯(lián)合施用。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中所述化療劑是烷化劑例如順鉬、卡鉬和奧克賽鉬，蒽環(huán)類抗生素，植物生物堿例如紫杉烷類和長(zhǎng)春花生物堿，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑例如伊立替康、拓?fù)涮婵?、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷，或氟尿嘧?5FU)。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中所述抗體與EGFR通路抑制劑聯(lián)合施用。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中所述EGFR通路抑制劑是抗EGFR抗體或EGFR激酶抑制劑。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中所述EGFR通路抑制劑是西妥昔單抗、帕尼單抗、易瑞沙(吉非替尼或(N (3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6- (3-嗎啉-4-基丙氧基)-喹唑啉-4-胺)，或特羅凱(埃羅替尼或N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺)。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的用于治療方法的抗體、用途或方法，其中抗體與曲妥珠單抗聯(lián)合施用。
36.一種用于產(chǎn)生特異性結(jié)合ADAM家族金屬蛋白酶的抗體分子的方法，其中所述抗體能夠通過結(jié)合所述金屬蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域和Dis-Cys結(jié)構(gòu)域二者來抑制該ADAM家族金屬蛋白酶的蛋白酶活性，該方法包括: (a)鑒定包含可變重鏈結(jié)構(gòu)域的抗體，所述可變重鏈結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合包含所述催化結(jié)構(gòu)域和所述Dis-Cys結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶多肽，其中所述催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合于ADAM家族金屬蛋白酶的抑制劑； (b)鑒定包含可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的抗體，所述可變輕鏈結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合所述ADAM家族金屬蛋白酶的分離的催化結(jié)構(gòu)域；和 (c)產(chǎn)生包含步驟(a)中鑒定的可變重鏈結(jié)構(gòu)域和步驟(b)中鑒定的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的抗體分子。
37.權(quán)利要求36的方法，其中ADAM家族金屬蛋白酶是TNF-a轉(zhuǎn)化酶(TACE)。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK103492413SQ201280016562
【公開日】2014年1月1日 申請(qǐng)日期:2012年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月1日
【發(fā)明者】G.墨菲, C.泰普, J.麥卡弗蒂 申請(qǐng)人:癌癥研究技術(shù)有限公司