專利名稱：糖鏈識別抗體及治療hiv感染疾病的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的糖鏈識別抗體，更具體地涉及屬于IgM類并且識別在HIV感染細(xì)胞中表達(dá)的糖鏈的抗體，以及涉及用于治療HIV患者的含有該抗體為有效成分的藥物。
背景技術(shù)：
1981年在圣弗蘭西斯科第一次發(fā)現(xiàn)AIDS(后天免疫缺陷綜合癥)，為同性戀男性致命的免疫缺陷疾病(Gottlieb，M．S．，Schroff，R．，等，N．Engl．J．Med．，305，1425-1430(1981))。兩年以后，法國Pasteur研究所Montanie研究小組發(fā)現(xiàn)引起AIDS的病毒(Barre-Sinoussi，F(xiàn)．，Chermann，J．C．，等，《(科學(xué)》(Science)，220，868-871(1983))。1985年，該病毒被統(tǒng)一命名為HIV(人免疫缺陷病毒)(Coffin，J．，Haase，A．，等，《(科學(xué)》(Science)，232，697(1986))。
AIDS是具有下面特征和性質(zhì)的疾病當(dāng)一個個體通過性交，輸血等感染了HIV，則該病毒破壞受感染個體的免疫功能，引起宿主，即該感染個體后天性免疫缺陷。甚至，該宿主出現(xiàn)多種癥狀，例如腹瀉和肺炎，導(dǎo)致宿主的最終死亡。
迄今為止，很多研究人員力圖開發(fā)出治療AIDS的藥物。例如，從Mitsuya等發(fā)現(xiàn)疊氮基胸苷(AZT)(Mitsuya，H．，等，《美國國家科學(xué)院院刊》(Proc．Natl．Acad．Sci．，USA．)，82，7096(1985))開始，臨床條件下已經(jīng)研究了ddI(2’，3’-二脫氧肌苷)，ddC(2’，3’-二脫氧胞苷)，和其它物質(zhì)。但是，還沒有獲得提供令人滿意效果的藥物。
盡管從HIV感染到發(fā)病的潛伏期根據(jù)個體而大大不同，但是大約感染HIV人數(shù)的50％肯定會在感染后10年內(nèi)出現(xiàn)病癥，并且?guī)缀跛械母腥净颊咴诔霈F(xiàn)病癥后1-3年內(nèi)死亡。超過40歲的成年和兒童在感染HIV后很快發(fā)展病情。解釋感染與出現(xiàn)AIDS相關(guān)綜合癥(ARC)之間的潛伏期的原因可能包括患者一般的健康狀況，遺傳素因，與其它感染疾病的并發(fā)癥，和其它依賴宿主的原因，以及感染病毒菌株間的差異。
由于灌輸血液成分而感染的情況下，大多數(shù)HIV感染個體出現(xiàn)AIDS而死亡。但是一些感染個體即使在感染10年后也不出現(xiàn)AIDS，而且另一些感染個體在出現(xiàn)AIDS之前甚至需要更長時間。這種病例分布世界各地，而且據(jù)報道5％的HIV感染個體長時間生存。HIV感染人員中長時間保持沒有癥狀的稱作長時間生存者已經(jīng)引起了很大關(guān)注，因為認(rèn)為他們提供了解釋他們對HIV病毒的抗性或防止出現(xiàn)病理癥狀的機理的線索。因此對這些長時間生存者進行了大量的研究和探討。
但是還沒有清楚地明白為什么長時間生存者盡管感染了HIV但是不出現(xiàn)AIDS的原因。因此期望澄清HIV抗性原因，并以此為基礎(chǔ)開發(fā)出治療HIV疾病的藥物。
本發(fā)明的公開本發(fā)明人研究了HIV感染人員病毒復(fù)制的靜止情況和活性情況之間的差別。在該項研究中發(fā)現(xiàn)一些感染患者攜帶的某些糖鏈的天然抗體中存在的特異性IgMs可能能解釋疾病發(fā)展的延遲。作為抗原的糖鏈據(jù)認(rèn)為不存在于處于正常環(huán)境下的人體內(nèi)，或者以有限量存在。但是當(dāng)細(xì)胞受HIV感染時，這些糖鏈出現(xiàn)在T細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的表面。(一般來說，已知當(dāng)細(xì)胞發(fā)生腫瘤或感染一種病毒時，特殊的糖鏈出現(xiàn)在這些細(xì)胞的表面)。如果屬于IgM類的這些糖鏈所屬抗體作為天然抗體存在于血清中，則抗體識別HIV感染細(xì)胞，并且與這些感染細(xì)胞結(jié)合。補體級聯(lián)在該局部位點被激活，在該位點IgM與糖抗原結(jié)合，導(dǎo)致HIV感染細(xì)胞的溶胞作用。這樣，含有上述天然IgM抗體的血清建立一個特定的環(huán)境，在該環(huán)境下HIV感染細(xì)胞不容易增殖。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)HIV感染細(xì)胞增強了補體敏感性。這些事實不僅在體外得到了證明，而且在感染了HIV且延遲出現(xiàn)AIDS的患者體內(nèi)也得到了證明。即，實際證明了這些長期生存患者出現(xiàn)屬于IgM類的與HIV感染細(xì)胞反應(yīng)的抗體。
也發(fā)現(xiàn)通常抵抗補體的細(xì)胞在神經(jīng)節(jié)四糖(Gg4)的抗體結(jié)合這些細(xì)胞后被補體溶胞。另外，屬于IgM類的具有與感染細(xì)胞結(jié)合能力的抗體減少了感染細(xì)胞，這是補體激活介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的結(jié)果，并且該抗體使HIV感染細(xì)胞出現(xiàn)了一個洞孔。于是可以知道施用屬于IgM類的并且具有與HIV感染細(xì)胞反應(yīng)性的抗體對于治療HIV攜帶者是有用的。
因此，本發(fā)明提供一種糖鏈識別抗體，其屬于IgM類并且其識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2。
本發(fā)明還提供一種治療HIV疾病(AIDS)的含有糖鏈識別抗體作為有效成分的藥物。
本發(fā)明還提供一種用糖鏈識別抗體治療HIV疾病的組合物。
本發(fā)明還提供糖鏈識別抗體的用途及治療HIV疾病的治療劑的制備方法。
本發(fā)明還提供一種治療HIV感染患者的方法，其特征在于對HIV患者施用有效量的糖鏈識別抗體。
附圖的簡要說明

圖1是表明對血清樣品No．1進行表位分析結(jié)果的圖示。
圖2是表明對血清樣品No．56進行表位分析結(jié)果的圖示。
圖3是表明含有來自健康HIV血清陰性供者的IgM的人血清對HIV感染的MOLT4細(xì)胞的溶胞能力的圖示。
圖4是表明一項試驗結(jié)果的圖示，在該項試驗中，用來自正常人血清-1(NHS-1)的IgM抗體級分分別處理神經(jīng)氨酸酶處理的MOLT4細(xì)胞，未處理的MOLT4細(xì)胞，和HIV-MOLT4細(xì)胞，然后用熒光素標(biāo)記的抗人IgM抗體免疫染色。
圖5是表明被各種糖包被的脂質(zhì)體吸收的IgM抗體殘留的溶細(xì)胞能力的結(jié)果，以及被IgM處理的靶細(xì)胞的免疫染色的結(jié)果的圖示。
圖6是表明測定HIV-感染-MOLT4細(xì)胞上補體滅活膜的表達(dá)量的流式細(xì)胞測量法的結(jié)果的圖示。
進行本發(fā)明的最佳方式這里所使用的糖鏈用本領(lǐng)域習(xí)慣縮寫代表Gg代表神經(jīng)元系列，Cer代表神經(jīng)酰胺，Gal代表半乳糖，GalNAc代表N-乙?；肴樘?，及Glc代表乳糖。本發(fā)明抗體可以從人血清中分離，或者可以通過使用Gg4Cer或GM2作為抗原產(chǎn)生抗體的常規(guī)方法制備，只要這些抗體識別Gg4Cer或GM2(神經(jīng)節(jié)苷脂GM2II3αNeuAc-GgOse3Cer)并且屬于IgM免疫球蛋白。
為了從人血清中分離本發(fā)明抗體，使用常規(guī)方法，用Gg4Cer或GM2作為抗原篩選存在的抗體。血清可以是從血清陰性HIV感染患者采集的樣品或是其它的從健康個體采集的樣品?？笹g4Cer或GM2抗體可以通過常規(guī)方法獲得，例如雜交瘤方法或者使用EB病毒無限增殖化方法。
用于篩選的技術(shù)包括常規(guī)的ELISA，RIA，熒光抗體技術(shù)，斑點免疫結(jié)合試驗，蛋白質(zhì)印跡方法，和51Cr-釋放方法。
從上述血清分離出來后，本發(fā)明抗體容易用公知的免疫球蛋白純化技術(shù)純化。這些方法的例子包括鹽沉淀，凝膠過濾，和親和層析(使用甘露聚糖柱，偶聯(lián)甘露糖聚合物來去除甘露糖結(jié)合的蛋白質(zhì)(MBP))。
本發(fā)明抗體也可以通過常規(guī)的雜交瘤方法用Gg4Cer或GM2作為抗原來制備。本發(fā)明抗體可以是單克隆或多克隆抗體，只要他們識別Gg4Cer和／或GM2并且屬于IgM類。
本發(fā)明抗體對于治療HIV疾病是有用的，這一點從下文中得到證明。
本發(fā)明人獲得了具有引起HIV-1感染的T細(xì)胞系細(xì)胞溶解能力的人血清樣品。發(fā)現(xiàn)用HIV-1的HTLV-ⅢB菌株感染的人T細(xì)胞系(MOLT4)被來自HIV血清陰性健康個體的新鮮正常人血清(NHS)溶胞，但是檢驗的大多數(shù)血清，包括HIV感染攜帶者的血清對溶解HIV感染的Molt4沒有活性。當(dāng)采集最初樣品一年后又采集新鮮樣品時，具有溶解HIV感染細(xì)胞能力的血清仍然具有相同程度的效能。通過將血清在56℃加熱30分鐘破壞NHS-1的細(xì)胞毒性能力，并且通過加入沒有溶胞的新鮮血清(NHS-5)來儲存，表明細(xì)胞溶解是由補體激活介導(dǎo)的，因為已知熱處理可以滅活補體。
血清中甘露糖結(jié)合的蛋白質(zhì)(MBP)據(jù)報道與HIV的gp41(C．F．Ebenbichler等，J．Exp．Med．，174，1417(1991))和gp120(C．Sual等，J．Immunol．Med．，152，6028(1994))反應(yīng)，從而顯示出補體活性。但是，當(dāng)用甘露聚糖柱從NHS-1中去除MBP時，不降低細(xì)胞溶解能力。
通過在TSK凝膠G3000SW柱上凝膠過濾分離NHS-1后，發(fā)現(xiàn)IgM級分具有使HIV感染MOLT4細(xì)胞(HIV-MOLT4)對于通過未溶胞的人血清例如NHS-5的細(xì)胞溶解敏感的能力。完全喪失其增敏能力的級分通過與小鼠抗人IgM單克隆抗體偶聯(lián)的親和柱而被破壞。這解釋了IgM是造成HIV-MOLT4對血清補體引起的細(xì)胞溶解敏感的原因。但是在蛋白質(zhì)印跡分析中該IgM不與HIV抗原反應(yīng)。因此本發(fā)明人推測被該抗體識別的抗原表位可能是由于HIV感染而產(chǎn)生改變的糖部分。然后本發(fā)明人試圖用神經(jīng)氨酸酶處理未感染的MOLT4細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)被處理的細(xì)胞與識別一種唾液酸糖綴合物的IgM反應(yīng)。而且用這些神經(jīng)氨酸酶處理的MOLT4細(xì)胞吸收IgM級分明顯降低了對由正常人血清引起的細(xì)胞溶解的敏感性。
IgM級分顯示出與某些糖苷的反應(yīng)性，例如Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)，其可以通過從GM1中去除唾液酸而產(chǎn)生。而且?guī)в蠫g4的脂質(zhì)體吸收了IgM對于細(xì)胞溶解的敏感能力。通過用小鼠抗Gg4單克隆抗體的免疫染色證明在HIV-MOLT4細(xì)胞上和神經(jīng)氨酸酶處理的MOLT4細(xì)胞上存在Gg4抗原識別位點。用識別GM2的抗原或HIV感染的V-937細(xì)胞的IgM也證明了這些作用。
另一方面，已知補體活性被特異性膜抑制劑抑制，所述特異性膜抑制劑是例如(1)一種衰變加速因子，其是一種膜補體抑制劑(DAF；A．Nicholson-Weller，J．Burge，D．T．Fearon，P．F．Weller，K．F．Austen，J．Immunol．，129，184(1982))，(2)膜輔因子蛋白(MCP；T．Seya，J．R．Tumer，J．P．Atkinson，J．Exp．Med．，163，837(1986))，和(3)CD59(HRF20；20KDa同源限制性酶切因子，N．Okada，R．Harada，T．Fujita，H．Okada，Int．Immunol．，1，205(1989)；A．DaVis等，J．Exp．Med．，170，637(1989))。
其中Fas抗原被表達(dá)的條件下，DAF，MCP，和CD59的表達(dá)是負(fù)調(diào)節(jié)的，而HLA-DR的表達(dá)保持不變。特則是，CD59在HIV感染的細(xì)胞上的表達(dá)不大于未感染的MILT4細(xì)胞的表達(dá)的50％。CD59表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)也可以由Northern印跡分析測定的mRNA的水平而證實。
而且，使抗補體反應(yīng)抗性由于減少的CD59表達(dá)而減弱的HIV感染的-MOLT4進行由IgM和正常人血清補體引起的選擇性細(xì)胞溶解。溶胞和未溶胞細(xì)胞之間gp120表達(dá)程度沒有不同。DAF，MCP，和特別是CD59的負(fù)調(diào)節(jié)可能作用于由被抗原-IgM配合物激活的人補體引起的HIV感染細(xì)胞的細(xì)胞溶解。而且HIV感染細(xì)胞的膜上的末端唾液酸的量的減少可能有利于補體的激活。但是HIV感染細(xì)胞，即使這些細(xì)胞結(jié)合IgG，也不被HIV-血清陰性血清補體溶胞，這可以通過熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體檢測。
對于通過典型途徑來激活補體，需要兩個IgG分子，它們以鄰近效應(yīng)相互反應(yīng)。另一方面只有一個分子IgM就足以用于補體激活。因此，補體激活通過IgM觸發(fā)比通過IgG觸發(fā)有效得多而且IgM引發(fā)的補體激活有可能通過靶細(xì)胞膜上的補體抑制分子而逃避限制性酶切，因為IgM是900kDa的大分子，與該分子結(jié)合的補體成分可能不能接近DAF，MCP，或膜上的其它補體抑制分子。另一方面，由補體激活產(chǎn)生的膜攻擊復(fù)合體結(jié)合在細(xì)胞膜的脂雙層上。CD59限制結(jié)合在這些膜上的這些抗原-IgM復(fù)合體的生成，從而防止細(xì)胞損傷。HIV感染細(xì)胞上CD59減少的表達(dá)回復(fù)細(xì)胞抗膜攻擊復(fù)合體的抗性并促進細(xì)胞溶解。
用其它T細(xì)胞系例如CEM和MT4細(xì)胞對于MOLT4細(xì)胞獲得了相同的結(jié)果。HIV感染的CEM細(xì)胞顯示出減少的CD59表達(dá)以及對于由IgM和補體引起的細(xì)胞溶解敏感。但是，在巨噬細(xì)胞系例如HIV感染的U937細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)CD59表達(dá)的減少，并且這些細(xì)胞系抵抗由IgM和補體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解。
IgM和補體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解反應(yīng)在體內(nèi)在HIV感染的T細(xì)胞的減少中起作用。如果個體具有與出現(xiàn)在HIV感染的T細(xì)胞上的糖抗原例如Gg4和GM2反應(yīng)的天然IgM抗體，則認(rèn)為HIV感染的擴展在HIV感染時被抑制。盡管HIV感染的巨噬細(xì)胞可以從涉及IgM和補體的攻擊反應(yīng)中幸存下來，但是感染的T淋巴細(xì)胞將被去除。因此，血清IgM可能是決定一些HIV攜帶者長期存活的機理的關(guān)鍵因素。事實上，當(dāng)對12個HIV感染后生存了12年或更長時間的長期存活者進行研究時，發(fā)現(xiàn)他們所有的人都擁有IgM，而在短期內(nèi)出現(xiàn)癥狀的5個人只擁有IgG而沒有IgM。
對于黑素瘤患者也發(fā)現(xiàn)了類似的IgM保護機理(Ones，P．C．，Sze，L．L．，Morton，D．L．和Irie，R．F．，J．Natl．Cancer Inst．，66，249，1980)。
如上所述，對HIV感染患者施用本發(fā)明糖鏈IgM在于體內(nèi)保留天然抗體方面將是有效的，因此在治療和防止AIDS中是有效的。
本發(fā)明IgM一般摻合到合適的藥物制劑中，一般是腸胃外制劑例如注射液，并對需要治療的患者給藥?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法獲得這些制劑，用于制劑的賦形劑是常規(guī)的，一般是例如糖，氨基酸，和蛋白質(zhì)。除了本發(fā)明IgM外，這些制劑還含有合適量的合適的添加劑，例如各種無機鹽。不同形式本發(fā)明制劑中的劑量沒有特別的限制。一般優(yōu)選確定劑量使具有活性并殺死HIV感染的細(xì)胞，因此IgM存在的量是體外對于有效成分糖鏈(IgM效能)來說在10μl／ml至50μl／ml的范圍。
因此本發(fā)明抗體對于防止和治療HIV感染患者是有用的。即當(dāng)對個體施用本發(fā)明糖鏈特異性抗體時，體內(nèi)提高了天然抗體滴度，從而提供抗AIDS的治療和預(yù)防效果。
實施例下面將通過實施例更加詳細(xì)地描述本發(fā)明。實施例1細(xì)胞的培養(yǎng)在補加有10％小牛血清(FCS)，2mM谷氨酰胺，100IU／ml青霉素和100mg／ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)一種人T細(xì)胞系的MOLT4細(xì)胞，并使沒有支原體。細(xì)胞用HTLV-ⅢV(HIV-1)感染，并在作為HIV感染的靶細(xì)胞源使用之前培養(yǎng)4星期或更長時間。通過流式細(xì)胞計量器使用單克隆抗體0．5β(即一種gp120 HTLV-ⅢV的抗體)檢測測得大于95％的細(xì)胞是HIV-env抗原(gp120)陽性，從而證明大多數(shù)細(xì)胞中成功地被HIV-1感染。
分別用51Cr標(biāo)記5×106HIV感染的MOLT4細(xì)胞和未感染的對照MOLT4細(xì)胞(正常MOLT4細(xì)胞)。標(biāo)記后將兩種細(xì)胞沖洗并懸浮于沒有RPMI1640培養(yǎng)基的血清中，濃度是2×105／ml。
100μl等份的細(xì)胞懸浮液和100μl新鮮的或熱滅活的血清置于U-底微型板的每一個孔中。血清是從4個HIV-血清陽性患者和13個健康HIV-血清陰性供者獲得的這些平板在37℃保溫1．5小時并離心。用下面的公式計算51Cr釋放到?jīng)]有細(xì)胞的上清液中的百分?jǐn)?shù)％51Cr釋放={(用新鮮血清釋放-用熱滅活血清釋放)／(用5％TritonX100釋放-用熱滅活血清釋放)}×100實施例2用神經(jīng)氨酸酶處理向100μl細(xì)胞懸浮液(2×106)中加入100μl神經(jīng)氨酸酶，并在37℃培養(yǎng)45分鐘。向2×106MOLT4，Neu-MOLT4，或HIV-MOLT4細(xì)胞小丸加入250μl來自NHS-1的IgM級分--NHS-1是具有強細(xì)胞溶解活性的血清，并在4℃培養(yǎng)30分鐘。離心后將上清液轉(zhuǎn)移到另一些試管中測定它們的增敏能力。沖洗細(xì)胞并用FITC-綴合的小鼠抗人IgM染色并在FACScan上分析。
用MOLT4，Neu-MOLT4，或HIV-MOLT4培養(yǎng)后獲得的上清液與HIV-MOLT4一起在沒有溶胞的人血清(NHS-5)存在下培養(yǎng)，以測定細(xì)胞溶解活性。
實施例3根據(jù)實施例1的描述篩選來自健康個體的95個血清樣品，其中使用用51Cr標(biāo)記的感染的MOLT4細(xì)胞作為靶細(xì)胞。作為結(jié)果，發(fā)現(xiàn)16個個體具有對于感染細(xì)胞的15％或更高的細(xì)胞溶解活性。接著通過使用感染的U937和MOLT4細(xì)胞，對兩個血清樣品進行選擇，這兩個血清樣品具有對于這兩個感染的細(xì)胞系的細(xì)胞溶解活性。收集血清的IgM級分并在下面的試驗中使用。
根據(jù)《免疫》(Immunology)，48129-140(1983)中說明的方法制備脂質(zhì)體。簡要地說，以1∶1∶0．1混合膽固醇，二肉豆蔻酰-卵磷脂，和要插入的各種脂質(zhì)中的一種，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)溶劑氯仿，從而在玻璃瓶內(nèi)表面生成一層脂質(zhì)膜。由膽固醇，二肉豆蔻酰-卵磷脂(1∶1)制備對照脂質(zhì)體。
向脂質(zhì)膜加入PBS，膜在渦流混合器中劇烈振動以形成脂質(zhì)體(多層)。向多層脂質(zhì)體加入PBS用于離心洗滌，從而獲得脂質(zhì)體懸浮液。
從得到的脂質(zhì)體懸浮液中取含有10nmol糖脂的等份并進行離心從而得到脂質(zhì)體小丸。棄除上清液。向小丸加入IgM級分(200μg／200μl)(血清陽性血清通過使用TSK-3000的凝膠過濾分級后)。攪拌混合物，并在室溫下靜置60分鐘，以吸收存在于脂質(zhì)體膜上面的糖脂的抗體。反應(yīng)后，離心混合物，沉淀脂質(zhì)體，并回收上清液。
對上述吸收過程之后IgM級分測定細(xì)胞對于HIV感染的MOLT4細(xì)胞(HIV-MOLT4)的破壞活性。簡要地說，向100μl51Cr-標(biāo)記的HIV-MOLT4(即51Cr-HIV-MOLT4，2×55／ml)或者對照情況下，向相同量的未感染的51Cr-MOLT4加入50μlIgM級分和50μl血清陰性正常人血清(作為補體來源)，其中IgM級分進行了或者沒有進行吸收過程?；旌衔镌?7℃反應(yīng)90分鐘，然后離心平板。測定釋放到上清液中的51Cr的量，測得對于細(xì)胞的破壞程度。
即在試驗中分別使用了對照脂質(zhì)體，Gg4脂質(zhì)體，和GM2脂質(zhì)體，它們是純脂質(zhì)體，脂質(zhì)體加Gg2，和脂質(zhì)體加GM2。通過使用一種類型的脂質(zhì)體，新鮮的血清，和25％IgM級分引起抗原-抗體反應(yīng)。在上清液中測得細(xì)胞的溶胞活性(細(xì)胞溶解百分率)結(jié)果見圖1和圖2。在樣品No．1和No．2兩種情況下，在“對照”和“Gg4脂質(zhì)體”中保持溶胞活性，與GM2脂質(zhì)體接觸后該活性完全消失。這些結(jié)果證明在來自正常個體的血清中，GM2是產(chǎn)生的抗HIV感染的細(xì)胞的IgM天然抗體的抗原表位。實驗實施例1來自正常血清陰性供者個體的人血清(含有IgM)對HIV-MOLT4細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用結(jié)果見圖3。x-軸代表細(xì)胞溶解百分率，y-軸代表來自供者的血清(NHS-1至NHS-13和PS-1至PS-4)。圖3附有圖(a)和(b)，它們給出血清樣品(NHS-1，NHS-5或PS-1)與HIV-MOLT4細(xì)胞反應(yīng)后進行的免疫染色的結(jié)果(x-軸熒光強度；y-軸細(xì)胞數(shù))，其中圖(a)是其中使用IgM的情況，圖(b)是其中使用IgG的情況。這些圖證明了下面的發(fā)現(xiàn)。
(A)來自健康HIV-血清陰性的13個血清樣品中，只有一個(NHS-1)引起51Cr-標(biāo)記的HIV-MOLT4細(xì)胞的細(xì)胞溶解歸因于人血清。
NHS-1顯示出43％細(xì)胞溶解這樣高的百分率，而沒有來自健康個體的其它血清(12個個體NHS-2至NHS-13)顯示出任何注意得到的細(xì)胞溶解。來自HIV-血清陽性患者的血清(PS-1至PS-4)幾乎沒有顯示出細(xì)胞溶解。
(B)HIV-MOLT4細(xì)胞與等體積血清樣品NHS-1，NHS-5或PS-1一起在室溫下培養(yǎng)30分鐘，然后沖洗細(xì)胞，并通過使用FITC-標(biāo)記的抗人IgM抗體或FITC-標(biāo)記的抗人IgG抗體免疫染色。
結(jié)果在圖3中的圖(a)和(b)中給出。用NHS-1處理的HIV-MOLT4細(xì)胞結(jié)合抗IgM抗體，而結(jié)合抗IgG抗體的PS-1不與抗IgM抗體反應(yīng)。實驗實施例2
神經(jīng)氨酸酶處理的MOLT4細(xì)胞，未處理的MOLT4細(xì)胞，或HIV-MOLT4細(xì)胞用來自NHS-1的IgM抗體級分處理，然后用熒光素標(biāo)記的抗人IgM抗體免疫染色。結(jié)果在類似于圖3中的圖(a)的圖4中給出。與HIV-MOLT4細(xì)胞反應(yīng)的IgM抗體也與神經(jīng)氨酸酶處理的HIV-MOLT4細(xì)胞反應(yīng)。
作為結(jié)果，如圖4中的圖(a)所示，來自NHS-1的IgM級分與Neu-MOLT4細(xì)胞反應(yīng)和其與HIV-MOLT4細(xì)胞的反應(yīng)一樣強。如圖4中的圖(b)所示，抗-gp120單克隆抗體(抗-gp120，0．5β)只染色HIV-MOLT4細(xì)胞。
IgM級分增敏人血清細(xì)胞溶解的能力通過用Neu-MOLT4細(xì)胞處理而被吸收，就象用HIV-MOLT4細(xì)胞處理而吸收一樣。換句話說，用吸收其細(xì)胞溶解能力的這些細(xì)胞處理的IgM級分喪失了用細(xì)胞溶解能力傳遞健康人血清(NHS-5)的效能。實驗實施例3對HIV-MOLT4有反應(yīng)性的IgM與Gg4Cer反應(yīng)。
(A)7種不同類型的下面說明的糖脂在塑料TLC平板上層析，通過使用地衣二酚-硫酸試劑和由NHS-1(a)獲得的IgM級分通過免疫染色檢測斑點，也可以使用由NHS-1獲得的IgM級分通過TLC免疫染色檢測斑點。
1．LacCer，2．Gg3Cer，3．nLc4Cer，4．Lc4Cer，5．Gb4Cer，6．Gy4Cer，7．IV3Galα-nLc4Cer．Gg4Cer明顯被染色。LacCer，Gg3Cer，和LcCer稍有染色。但是IgM級分幾乎沒有與nLc4Cer，Gb4Cer，IV3Galα-nLc4Cer，唾液基化的糖脂例如GM3，GM2，GM1，GD1a，GT1b，GQ1b，IV3NeuAcα-nLc4Cer，唾液基化的Lea和唾液基化的Lex反應(yīng)。
將Gg4Cer染色水平作為100，LacCer，Gg3Cer，nLc4Cer，Gb4Cer，和IV3Galα-nLc4Cer的染色水平分別是25．8，31．8，0，29．3，0，和24．6。
根據(jù)Okada和其它人的說明(Okada，N．，Yoshida，T．，和(Okada，H．，《自然》(Nature)，299，261(1982))制備脂質(zhì)體。IgM級分(50μg／200μl)與5nmol各種脂質(zhì)體制劑混合。離心后根據(jù)實施例2描述的方法測定上清液的細(xì)胞溶解活性。
IgM級分對于由非溶胞人血清(NHS-5)引起的HIV-MOLT4細(xì)胞的細(xì)胞溶解的能力通過用Gg4-脂質(zhì)體處理而吸收到小于一半的水平(圖5，A)。
盡管抗Gg4的小鼠單克隆抗體不與正常的MOLT4細(xì)胞反應(yīng)，但是根據(jù)流式細(xì)胞計量器測定，其更易與HIV-MOLT4和Neu-NOLT4細(xì)胞反應(yīng)(圖5，B)。實驗實施例4HIV-MOLT4細(xì)胞上CD59表述的明顯減少(A)通過流式細(xì)胞計量器測定，發(fā)現(xiàn)HIV感染的細(xì)胞上的補體調(diào)節(jié)膜因子(DAF，MCP，和CD59)的表達(dá)減少。HIV感染后Fas抗原和HLA-DR的表達(dá)保持不變(圖6)。
(B)對于補體調(diào)節(jié)膜因子的Northern印跡分析，根據(jù)Thomas，P．S．，《酶學(xué)方法》(Method Enzymol．)100，255-2(1983)的說明提取5μg來自未感染的(N)和HIV感染的(H)MOLT4細(xì)胞的全RNA，并用乙二醛變性。用CD59，DAF，MCP，和GAPDH(甘油醛-3-磷酸-脫氫酶)的cDNA片段作為探針。清楚地發(fā)現(xiàn)CD59mRNA的減少。
1×106個細(xì)胞與NHS-1在37℃培養(yǎng)30分鐘后，對HIV-MOLT4進行兩個顏色分析。通過用propiodium iodide(PI)染色測定死亡細(xì)胞數(shù)。這可以區(qū)分用PI染色的死亡細(xì)胞和不能用PI染色的存活細(xì)胞。用這些抗原的FITC標(biāo)記的單克隆抗體染色C5b-9(MAC)，CD59，和gp120。結(jié)果總結(jié)如下。
(a)與NHS-1培養(yǎng)后PI染色的細(xì)胞(死亡細(xì)胞)比PI染色的陰性細(xì)胞染色稍微強一點，后者細(xì)胞表明這些細(xì)胞被大量C5b-9處理并且沒有被殺死。
(b)在10mM EDTA存在下NHS-1不誘導(dǎo)PI陽性死亡細(xì)胞。
(c)表達(dá)減少量的CD59的細(xì)胞在用NHS-1處理后用PI染色，表明表達(dá)減少量的CD59的細(xì)胞優(yōu)先被殺死。
(d)gp120的表達(dá)在PI染色的細(xì)胞(死亡細(xì)胞)和未染色細(xì)胞(存活細(xì)胞)之間基本上相同，表明抗-gp120抗體的量和NHS-1的細(xì)胞殺傷能力不直接相關(guān)。
工業(yè)上的實用性
因為對HIV感染的個體施用糖鏈識別抗體引起補體激活介導(dǎo)的HIV感染細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用，因此本發(fā)明糖鏈識別抗體在治療和防止AIDS中是有用的。
權(quán)利要求
1．一種糖鏈識別抗體，其屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2。
2．一種治療HIV疾病的藥物，其含有屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體為活性成分。
3．權(quán)利要求2的藥物，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細(xì)胞的溶胞。
4．一種治療HIV疾病的組合物，其含有屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體。
5．權(quán)利要求4的組合物，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細(xì)胞的溶胞。
6．屬于IgM免疫球蛋白亞類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體在制備治療HIV疾病的治療劑中的用途。
7．權(quán)利要求7的用途，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細(xì)胞的溶胞。
8．一種治療HIV感染患者的方法，特征在于對所述患者施用有效量的屬于IgM類并且識別Gg4Cer(Galβ1-3 GalNAcβ1-4 Galβ1-4 GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體。
9．權(quán)利要求8的方法，其中糖鏈識別抗體通過補體激活引起HIV感染的細(xì)胞的溶胞。
10．權(quán)利要求8的方法，用于防止AIDS病癥的出現(xiàn)。
全文摘要
本發(fā)明涉及出現(xiàn)在HIV感染細(xì)胞上的屬于IgM同種型并且識別Gg4Cer(Galβ1－3GalNAcβ1－4Galβ1－4GlcβCer)或GM2的糖鏈識別抗體,并且涉及含有這些IgM的用于治療HIV疾病的藥物。
文檔編號C07K16/28GK1205642SQ9619912
公開日1999年1月20日 申請日期1996年12月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年12月18日
發(fā)明者岡田秀親, 岡田則子 申請人:大塚制藥株式會社