專利名稱：一種抗人baff單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體，特別涉及一種抗人BAFF單 克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，包括其氨基酸序列及其核苷酸序列。
背景技術(shù)：
自身免疫性疾病(autoimmune diseases)是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo) 致自身組織損害所引起的疾病，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。常見的自身免疫性疾病有系 統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、口眼干燥綜合征(SS)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)等。針對自身免疫性疾 病的治療手段目前仍處于研究和探索階段，主要依賴藥物如免疫抑制劑、理療及外科治療 等手段，但是毒副作用較大且無法根治。因此結(jié)合基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)的靶向抗體 藥物治療正成為新興研究領(lǐng)域，有望為包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡在內(nèi)的自身免疫性疾病治療提 供新的策略。B淋巴細(xì)胞刺激因子(B cell activating factor, BAFF)是1999年發(fā)現(xiàn)的新分 子，屬于腫瘤壞死因子超家族成員(TNFSF)。BAFF分子在B細(xì)胞發(fā)育、功能調(diào)節(jié)和自身免 疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，BAFF缺陷或過量表達(dá)均能引起機體免疫失衡，從而誘發(fā) 多種疾病，且可能與某些自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。實驗表明(Yoshimoto K et al,Int Immunol. 18(7) :1189_96.)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、口眼干燥綜合征和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病人 血清中sBAFF水平明顯升高，進(jìn)一步實驗證實了 BAFF分子過表達(dá)密切參與了系統(tǒng)性紅斑狼 瘡、口眼干燥綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展?；趯AFF 分子結(jié)構(gòu)及其在生理和病理條件下所起作用的認(rèn)識，人們已開始嘗試以BAFF及其受體作 為靶點進(jìn)而阻斷BAFF的生物學(xué)活性來合理設(shè)計治療某些相關(guān)疾病的新措施，為自身免疫 性疾病的治療提供新方法或新型藥物。目前阻斷BAFF生物學(xué)活性的制劑主要有抗BAFF抗體和BAFF的可溶型受體兩 大類，其中抗 BAFF 抗體包括 lymphostat-B、EGFP/scFv F8、anti-BAFFscFv、anti-BAFF scFv-Fc等，但是前三類抗體只能識別游離BAFF，不能識別細(xì)胞膜上的BAFF ；后一類抗體雖 然對游離的BAFF和細(xì)胞膜上的BAFF都能識別但是親和力較低，阻礙其進(jìn)一步應(yīng)用。因此 制備新型的BAFF治療性抗體具有十分重要的理論和實際意義?？贵w單體分子是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)，通過鏈間二 硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。H鏈和L鏈包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可變區(qū) (V區(qū))由高變區(qū)/互補決定區(qū)(HVR/CDR)和骨架區(qū)(FR)組成；靠近C端為恒定區(qū)(C區(qū))。 重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)形成的蛋白質(zhì)折疊是抗原結(jié)合部位，其中的CDR/HVR 是抗體與抗原決定基互補結(jié)合的部位，C區(qū)引發(fā)抗原抗體識別后的反應(yīng)?？贵w根據(jù)FR/C區(qū) 不同可分為人源、鼠源等，鼠源性抗體在人體內(nèi)使用時具有免疫原性，易引起人體的免疫反 應(yīng)，這些免疫反應(yīng)可引起對鼠源性抗體的清除以及免疫復(fù)合物介導(dǎo)的超敏反應(yīng)。為了克服 鼠源性抗體的缺陷，需要構(gòu)建特異性的嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體等基因工程抗體。在構(gòu)建特異性的嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體等基因工程抗體過程中，最為重要的是獲得具有良好特異性、親和力和中和活性的鼠源性親本抗體，克隆其輕鏈和重鏈 可變區(qū)基因，然后將可變區(qū)基因克隆入相應(yīng)載體構(gòu)建相應(yīng)的基因工程抗體重組DNA，進(jìn)而表 達(dá)各種類型的基因工程抗體。因此，篩選出特異性的鼠源性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆， 從中克隆出抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，分析其氨基酸序列，是進(jìn)一步構(gòu)建高親和力、特 異性和具有中和活性的基因工程抗體的前提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，包 括其基因及其氨基酸序列，為構(gòu)建高親和力、特異性和中和活性的抗人BAFF嵌合或人源化 基因工程抗體提供支持。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，輕鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū) (CDR)序列分別為CDR1:Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr ；CDR2 :Arg-Met-Ser ；CDR3 :Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr ；重鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列分別為CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp ；CDR2 :IIe-Ser-Ser-Gly-Gly-Ser-Tyr-Thr ；CDR3 :Ala-Ser-Asp-Gly-Val-Trp-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr。所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。所述的編碼輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可變區(qū)的基因 序列如SEQ ID NO. 4所示。抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)應(yīng)用于以人BAFF分子為靶點的基因 工程抗體或疫苗的制備。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果1、本發(fā)明所述的抗人BAFF單克隆抗體被命名為FMMU-BAFF-4，該抗體是具有高 度特異性的抗人BAFF單克隆抗體；經(jīng)過間接ELISA檢測、流式細(xì)胞儀檢測證實單克隆抗體 FMMU-BAFF-4具有高效價，能夠與BAFF分子具有高的親和力；而且與可溶性的和細(xì)胞表面 表達(dá)的BAFF分子能夠特異性的結(jié)合。2、本發(fā)明克隆了單克隆抗體FMMU-BAFF-4的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因和氨基酸序 列，序列分析證實了該抗體序列的惟一性。3、分析獲得輕鏈、重鏈可變區(qū)的⑶R區(qū)，在此基礎(chǔ)上為構(gòu)建高親和力的抗人BAFF 嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。


圖1是單克隆抗體FMMU-BAFF-1 7與sBAFF的間接ELISA檢測結(jié)果圖；圖2是FMMU-BAFF-1 7單克隆抗體與轉(zhuǎn)染BAFF-YFP質(zhì)粒的293T細(xì)胞表面BAFF分子結(jié)合的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果圖，其中，圖2a為陰性對照結(jié)果圖，圖2b為空白對照，圖2c 為單抗檢測結(jié)果圖；圖3是FMMU-BAFF-4單克隆抗體輕鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測結(jié)果圖；圖4是FMMU-BAFF-4單克隆抗體重鏈可變區(qū)基因同源性序列檢測結(jié)果圖；圖5是FMMU-BAFF-4單克隆抗體輕鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢測結(jié)果圖；圖6是FMMU-BAFF-4單克隆抗體重鏈可變區(qū)氨基酸同源性序列檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式可變區(qū)基因的完整核苷酸序列，尤其是其功能性片段的核苷酸序列(如CDR等) 以及抗體可變區(qū)的氨基酸序列，是嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體構(gòu)建的基礎(chǔ)。為此，申 請人用重組人BAFF免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗人BAFF單克隆抗體，克隆并從中篩選出 能分泌特異性的人BAFF單克隆抗體FMMU-BAFF-N0. 4的雜交瘤細(xì)胞株，純化制備了該單克 隆抗體并驗證了其高親和性和特異性。并克隆該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變 區(qū)基因序列和氨基酸序列，以及可變區(qū)的CDR序列；并確認(rèn)氨基酸序列和基因序列的惟一 性。所述的單克隆抗體可變區(qū)基因序列如SEQ IDN0.3和SEQ ID NO. 4所示；所述的單克隆 抗體可變區(qū)氨基酸序列如SEQ IDN0. 1和SEQ ID NO. 2所示。下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明 具體按以下步驟實施1、小鼠抗人BAFF分子單克隆抗體的制備1. 1單克隆抗體的制備、純化重組人BAFF分子委托武漢三鷹生物技術(shù)有限公司制備。按單克隆抗體制備方法(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實驗技術(shù)第一版，P9-17)，用重組人 BAFF免疫BALB/c小鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)，初次免疫，使用福氏完全佐劑， 后續(xù)免疫使用福氏不完全佐劑，每次間隔3周，均為皮下多點注射，共免疫4次。末次免疫 7-10天后采血測其效價，檢測免疫效果。間隔2-3周后，經(jīng)靜脈注射抗原再加強免疫，3天 后處死動物取脾進(jìn)行細(xì)胞融合；具體過程為取對數(shù)生長的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0計數(shù)，同時制備免疫脾細(xì)胞懸 液。將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按1 10比例混合，在50ml塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗 一次，1200rpm離心8min，然后棄上清，輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略為松動，在室溫下 融合，制備雜交瘤細(xì)胞株；融合后細(xì)胞懸液加入含有飼養(yǎng)細(xì)胞(正常BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)的96孔板， 37°C,5% 0)2孵箱培養(yǎng)；待克隆出現(xiàn)后，間接ELISA檢測，挑選陽性克隆。對含有陽性克隆 孔的細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化，直至獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株(體外 連續(xù)培養(yǎng)超過6個月)。在獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株后，按小鼠腹水制備方法 制備包含單克隆抗體的腹水(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實驗技術(shù)第一版，P9-P17)；腹水經(jīng)40%飽 和硫酸銨沉淀后，采用Protein A親和層析法純化。1. 2抗人BAFF單克隆抗體高親和力測定實驗按照上述單克隆抗體的制備過程，申請人構(gòu)建了 7株能夠分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為雜交瘤細(xì)胞FMMU-BAFF-1 7，其對應(yīng)分泌的抗體分別命名為單克隆抗體 FMMU-BAFF-1 7 ； 對于制備的小鼠抗人BAFF單克隆抗體FMMU-BAFF-1 7，用IgG業(yè)類檢測 試劑盒(美國Sigma公司)檢測其單克隆抗體的IgG亞類，并用間接ELISA方法測定 FMMU-BAFF-1 7雜交瘤細(xì)胞株的腹水效價(包被抗原為重組人BAFF蛋白，待測樣品為 1 X 101 109系列梯度稀釋的腹水，檢測抗體為羊抗鼠-HRP酶標(biāo)記抗體，底物使用ABTS)， 以篩選對BAFF高親和力的單抗；具體的腹水效價檢測如表1所示，其中，單抗FMMU-BAFF-4 效價最高，腹水效價為1 X 10_7，而一般采用間接ELISA檢測腹水效價達(dá)1 X 10_5以上的抗體 即可使用。表1鼠源性抗人BAFF單抗單克隆抗體FMMU_BAFF_1 7的特性篩選鑒定 1. 3抗人BAFF單克隆抗體與sBAFF分子的特異性結(jié)合而對于單抗的特異性結(jié)合來說，在具有與抗原高親和力的基礎(chǔ)上，其特異性的識 別和結(jié)合更為重要，尤其是與細(xì)胞表面的活性分子的結(jié)合所反應(yīng)的對抗原的特異性的結(jié)
1=1 o本發(fā)明首先以hlgG作為對照，在ELISA板孔中直接包被可溶性BAFF (sBAFF)，比較 7株抗BAFF抗體與sBAFF的特異性結(jié)合；具體操作步驟如下1)包被用pH 9. 0,0. 05M碳酸鹽包被緩沖液稀釋sBAFF，同時包被hlgG作為陰 性對照，包被濃度為5 u g/ml，每孔加入0. 1ml，4°C過夜；次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖 液洗3次，每次3min ；2)加樣加1 500稀釋的7株抗BAFF抗體于上述已包被的反應(yīng)孔中，置37°C 孵育lh，然后洗滌；3)加酶標(biāo)抗體于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋(1 1000)的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠 抗體0. 1ml，37 °C孵育lh，洗滌；
4)加底物液顯色于各反應(yīng)孔中加入新鮮配制的ABTS底物溶液0. lml，37°C孵育 10 30min ；5)終止反應(yīng)于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05ml ；6)結(jié)果測定在ELISA讀數(shù)儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔0D值。結(jié)果如圖1所示，橫坐標(biāo)為7株抗BAFF抗體，縱坐標(biāo)顯示7株抗BAFF抗體與包被 分子結(jié)合的0D值，反應(yīng)與sBAFF分子的結(jié)合情況；以與hlgG分子的結(jié)合作為對照，比較7株 單抗與sBAFF分子的特異性結(jié)合，通過0D值的變化來體現(xiàn)與sBAFF分子結(jié)合的特異性。從 圖中可以很明顯地看出單抗FMMU-BAFF-4與sBAFF分子結(jié)合的特異性在所有單抗中最高， 能夠與sBAFF分子特異性結(jié)合。1. 4抗人BAFF單克隆抗體與細(xì)胞表面BAFF分子的結(jié)合本發(fā)明以IgGl作為陰性對照，用流式細(xì)胞術(shù)(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實驗技術(shù)，第一 版，P78-89)檢測抗人BAFF單克隆抗體FMMU-BAFF-1 7與轉(zhuǎn)染人BAFF-YFP質(zhì)粒的293T 細(xì)胞系(Transfecting-293T-cells)細(xì)胞表面表達(dá)的BAFF分子的結(jié)合。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果如圖2所示圖2a為IgGl陰性對照，圖2b顯示BAFF-YFP 質(zhì)?？筛咝мD(zhuǎn)染293T細(xì)胞，圖2c中NO. 1 7分別表示單抗FMMU-BAFF-1 7與轉(zhuǎn)染 BAFF-YFP質(zhì)粒的293T細(xì)胞表面BAFF分子的特異性結(jié)合，橫坐標(biāo)為黃色熒光蛋白熒光強 度，表示BAFF-YFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率；縱坐標(biāo)為BAFF-PE的熒光強度，表示7株抗體與轉(zhuǎn)染 BAFF-YFP質(zhì)粒的293T細(xì)胞表面BAFF分子的特異性結(jié)合能力。從圖2中可以看出，與其他 株單抗相比，NO. 4和No. 7所示的檢測結(jié)果在右上角的區(qū)域具有明顯的熒光強度，這表明單 抗FMMU-BAFF-4和FMMU-BAFF-7可特異性識別轉(zhuǎn)染BAFF-YFP質(zhì)粒的293T細(xì)胞系細(xì)胞表面 BAFF分子，單抗FMMU-BAFF-4和FMMU-BAFF-7具有與細(xì)胞表面BAFF分子特異性結(jié)合的能 力。通過以上檢測表明，單克隆抗體FMMU-BAFF-4具有高效價，能夠與BAFF分子具有 高的親和力；而且與可溶性的和細(xì)胞表面表達(dá)的BAFF分子能夠特異性的結(jié)合。而對于其他 株的單克隆抗體不能同時滿足這些條件(如表1所示)。2、BAFF輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆2. 1分泌FMMU-BAFF-4單抗的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)按常規(guī)方法復(fù)蘇(細(xì)胞培養(yǎng)，第一版，P88)雜交瘤細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37°C，5% C02孵箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。 2. 2總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成采用TRIZOL Reagent (購自美國GIBC0公司)提取總RNA，具體操作步驟按說明書 進(jìn)行；cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國GIBC0公司，在得到總RNA后按產(chǎn)品說明書進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。2.3PCR法擴增VL和VH基因PCR法擴增試劑盒購自Takara公司，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng) 體積50 iil，反應(yīng)條件為:94°C溫育5min ；94°C變性45s，63°C退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán) 30次；72°C延伸lOmin ；VL、VH的正、反向引物核苷酸序列為VlF :gatgt gagct cgtga tgacc cagac tccVlB :gcgcc gtcta gaatt aacac tcatt cctgt tgaa
VhF :tgagg agacg gtgac cgtgg tccct tggcc ccaga ggtgc aactg cagca gtcagVhB :aggts marct gcags agtcw gg(IUB 標(biāo)準(zhǔn)兼并堿基代碼s:c/g ；m:a/c ；r:a/g ；w:a/t)2. 4PCR擴增產(chǎn)物的克隆和篩選 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用小量膠回收試劑盒(購自美國Axygen公司) 回收抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)片段，用simple pMDIST試劑盒(購自日本Takara公司)將該 片段按說明書插入simple pMDIST載體中。轉(zhuǎn)化W.coli XL-10 (購自北京中國普通微生物 菌種保藏中心)，在Amp抗性LB瓊脂培養(yǎng)平皿中37 °C培養(yǎng)過夜。挑取LB瓊脂培養(yǎng)平皿中克隆，在Amp抗性LB培養(yǎng)基中37°C搖菌過夜，以1 yl菌 液為模板，通過上述針對輕鏈、重鏈可變區(qū)設(shè)計的引物，用PCR法篩選重組陽性E. coli克 ??；輕鏈用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I，重鏈用Sal I和EcoR I限制性核酸內(nèi)切酶(購自 Takara公司)消化篩選重組陽性克隆(酶切得到重鏈片段約375bp，輕鏈片段約750bp)。將所獲得重組陽性E. coli克隆搖菌，菌體送交南京金斯瑞生物科技有限公司完 成基因序列測定，輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，重鏈可變區(qū)的基因序列如 SEQ ID NO. 4 所示。3輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列及同源性分析3. 1確定測序無誤后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行核苷酸序列同源 性分析(Blastn)分析結(jié)果表明，單抗輕鏈可變區(qū)基因與小鼠雜交瘤4-1D2免疫球蛋白輕鏈基因部 分序列同源性最高，同源性為332/336，同源性百分比為98%，(如圖3所示)；單抗重鏈可 變區(qū)基因與小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)部分mRNA(IGHV-A2Al gene)同源性最高，同源性為 305/320，同源性百分比為95% (如圖4所示)。3. 2將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，F(xiàn)MMU-BAFF-4單克隆抗體輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 1，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在 non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF 蛋白質(zhì) 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析結(jié)果表明，單抗輕鏈氨基酸序列與酯水解抗體Ms6_12Fab復(fù)合物高清晰度晶 體結(jié)構(gòu) A 鏈(pdb 11MJJ | A)、L 鏈(pdb 11MJJ | L)、L 鏈(1. 22 埃晶體結(jié)構(gòu) pdb 11MJU | L)同源性 最高，同源性為106/112，同源性百分比為94% (如圖5所示)；單抗重鏈氨基酸序列與小 鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(gb|AA018975.1|)同源性最高，同源性為97/106，同源性百分 比為91% (如圖6所示)。編碼mAb的輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因核苷酸序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列同源性分 析結(jié)果表明末發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同的序列。3. 3利用IMGT/V-QUEST分析可變區(qū)結(jié)構(gòu)，確定⑶R區(qū)將測序所得抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，在IMGT/V-QUEST網(wǎng)站(http//imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest)分析，得出其 CDR 區(qū)。輕鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列，如SEQ ID NO. 1劃線部分所示，具體 為CDR1:Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr ；
CDR2 :Arg-Met-Ser ；CDR3 :Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr ；重鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(⑶R)序列，如SEQ ID NO. 2劃線部分所示，具體 為CDR1:Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp ；CDR2 :IIe-Ser-Ser-Gly-Gly-Ser-Tyr-Thr ；CDR3 :Ala-Ser-Asp-Gly-Val-Trp-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr。4.基因工程抗體設(shè)計基于抗人BAFF單克隆抗體的克隆、純化以及序列分析，設(shè)計構(gòu)建以下生物制品(1)抗人BAFF單鏈抗體的構(gòu)建將本發(fā)明的單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因插入表達(dá)載體pCONTAB 5E中， 獲得的單鏈抗體基因轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，通過誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，制備對自身免疫性疾病有潛 在治療作用的單鏈抗體。(2)人源化抗體的構(gòu)建將本發(fā)明的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的CDR區(qū)移植到人源可變區(qū)的FR中，形 成CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)也稱重構(gòu)抗體(reshapingantibody)或人源化 抗體(humanized antibody) 0利用⑶R移植技術(shù)改造抗體，可以獲得保持鼠源性親本mAb 的特異性，同時更加接近人抗體的新型抗體，用于制備對自身免疫性疾病有潛在治療作用 的人源化抗體。(3)根據(jù)本發(fā)明的基因序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對人BAFF功能表位的 如人鼠嵌合抗體、Fab抗體、疫苗或其他生物制品。
權(quán)利要求
一種抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(CDR)序列分別為CDR1Lys-Ser-Leu-Leu-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr；CDR2Arg-Met-Ser；CDR3Met-Gln-His-Leu-Glu-Tyr-Pro-Phe-Thr；重鏈可變區(qū)的3個互補決定區(qū)(CDR)序列分別為CDR1Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Asp；CDR2IIe-Ser-Ser-Gly-Gly-Ser-Tyr-Thr；CDR3Ala-Ser-Asp-Gly-Val-Trp-Tyr-Ala-Met-Asp-Tyr。
2.如權(quán)利要求1所述的抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其特征在于， 所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如權(quán)利要求1所述的抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其特征在于，編 碼輕鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，編碼重鏈可變區(qū)的基因序列如SEQ ID NO. 4 所示。
4.權(quán)利要求1或3所述的抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)應(yīng)用于以人 BAFF分子為靶點的基因工程抗體或疫苗的制備。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人BAFF單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，該抗人BAFF單克隆抗體為FMMU-BAFF-4，其單克隆抗體可變區(qū)基因序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；其單克隆抗體可變區(qū)氨基酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明用重組人BAFF免疫BALB/c小鼠，制備小鼠抗人BAFF單克隆抗體，克隆并從中篩選出能分泌特異性的人BAFF單克隆抗體FMMU-BAFF-NO.4的雜交瘤細(xì)胞株，并克隆該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列，以及可變區(qū)的CDR序列；并確認(rèn)氨基酸序列和基因序列的惟一性。
文檔編號C07K16/24GK101851291SQ20101010843
公開日2010年10月6日 申請日期2010年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者宋朝君, 肖黎明, 金伯泉, 陳麗華, 龔玖瑜 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)