抗人pcsk9單克隆抗體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明為基因工程抗體藥物領(lǐng)域，特別是抗人PCSK9的單克隆抗體領(lǐng)域。本發(fā)明 涉及人源性功能性抗人PCSK9單克隆抗體，以及這類(lèi)抗體在治療人PCSK9介導(dǎo)的疾病中的 用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 心血管疾病是目前我國(guó)首位的死亡原因，其中動(dòng)脈粥樣硬化引起的心臟病、腦卒 中和外周動(dòng)脈疾病是導(dǎo)致死亡的主要原因，而低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)水平升高是動(dòng) 脈粥樣硬化性心血管疾病最大的危險(xiǎn)因素。他汀類(lèi)藥物是目前降低LDL-C最有效的藥物， 但是仍有部分患者的血脂水平未能達(dá)標(biāo)，以及有些患者不能耐受他汀類(lèi)藥物。因此，需要尋 找他汀以外的強(qiáng)效降膽固醇藥物，以降低動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]前蛋白枯草溶菌素轉(zhuǎn)化酶 9(proproteinconvertasesubtilisinkexin9， PCSK9)，又稱為神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶 1(neuralapoptosis-regulatedconvertase1， NARC-1)。PCSK9蛋白主要在肝臟中合成和分泌，PCSK9蛋白進(jìn)入血液循環(huán)后，在肝臟與低密 度脂蛋白受體（thelow-densitylipoproteinreceptor,LDLR)結(jié)合，介導(dǎo)LDLR降解，從 而降低肝臟對(duì)LDL-C的清除能力，升高血漿LDL-C水平。PCSK9基因敲除的小鼠表現(xiàn)出血漿 膽固醇水平大約降低50%，而且使他汀類(lèi)藥物降低血漿膽固醇的靈敏度變高（RashidS，et al2005，ProcNathAcadSci102:5374-5379)。
[0004] 抗PCSK9單克隆抗體可有效阻止PCSK9與LDL-R結(jié)合，從而發(fā)揮強(qiáng)效降膽固醇的 作用，可用于他汀治療未達(dá)標(biāo)或他汀不耐受的高膽固醇血癥的患者。
[0005] 目前安進(jìn)研發(fā)的PCSK9抑制劑Repatha(Evolocumab)和賽諾菲/再生元研發(fā)的 PCSK9抑制劑Praluent(Alirocumab)都已經(jīng)獲得歐洲和美國(guó)FDA的批準(zhǔn)上市，用于治療原 發(fā)性高膽固醇血癥、混合型高脂血癥和家族性高膽固醇血癥。但是本領(lǐng)域仍然需要更多適 于治療患者的改善的抗PCSK9抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種新型抗人PCSK9的單克隆抗體或其片段。由本發(fā)明涉 及的抗體基因可變區(qū)的序列，可構(gòu)建全長(zhǎng)的抗體分子作為藥物用于臨床上由人PCSK9介導(dǎo) 的疾病使用。這些適應(yīng)癥包括但不局限于下列：原發(fā)性高膽固醇血癥、混合型高脂血癥和家 族性高膽固醇血癥。
[0007] 本發(fā)明從先前構(gòu)建的大容量天然人源噬菌體抗體庫(kù)(抗人IL-17單克隆抗體，專 利申請(qǐng)?zhí)?01510097117. 0)中篩選并優(yōu)化得到了全人源抗PCSK9單克隆抗體。
[0008] 本發(fā)明的抗體為全人源的單克隆抗體，拮抗至少一種與PCSK9或其部分相關(guān)的體 外或體內(nèi)生物活性。
[0009] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體的特征在于能夠有效抑制PCSK9結(jié)合重組人LDLR胞 外區(qū)EGF-AB結(jié)構(gòu)域。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗體的特征在于對(duì)人PCSK9具有強(qiáng)結(jié)合親和力，親和 力優(yōu)于（H7B12-IgG4)或與安進(jìn)公司的同類(lèi)抗體Evolocumab以及賽諾菲公司的同類(lèi)抗體 Alirocumab相似。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體含有重鏈可變區(qū)多肽，該多肽含有3 個(gè)HCDR，其特征在于：所述HCDR1序列為GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列為SFYNGN;所述 HCDR3序列為GYVMDX4。其中X1X2X3序列為AIY、TLN或者ALY;X4為I或者F。而且其 中HCDRs序列根據(jù)Chothia定義。優(yōu)選地，本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體包含重鏈可變區(qū)多 肽，該多肽具有選自SEQIDNO:16-19的氨基酸序列。
[0012] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體含有輕鏈可變區(qū)多肽，該多肽 含有3個(gè)IXDR序列，其特征在于：所述IXDR1序列為RASQSINNWLD;所述IXDR2序列為 AASTRPS;所述LCDR3序列為QQDQDIPPT。而且其中LCDRs定義根據(jù)Chothia定義。優(yōu)選地， 本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體包含輕鏈可變區(qū)多肽，該多肽具有選自SEQIDN0:20的氨基酸 序列。
[0013] 在優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體含有（i):含HCDR1、HCDR2、和 HCDR3序列的重鏈可變區(qū)，其特征在于：所述HCDR1序列為GYX1X2X3NY;所述HCDR2序列 為SFYNGN;所述HCDR3序列為GYVMDX4 ;其中X1X2X3序列為AIY、TLN或者ALY;X4為I或 者F。而且其中HCDRs序列根據(jù)Chothia定義。（ii):含IXDR1、IXDR2、和IXDR3序列的輕 鏈可變區(qū)，其特征在于：所述IXDR1序列為RASQSINNWLD;所述IXDR2序列為AASTRPS;所述 LCDR3序列為QQDQDIPPT。而且其中LCDRs定義根據(jù)Chothia定義。
[0014] 在更優(yōu)選的實(shí)施例中，本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體的重鏈可變區(qū)序列為SEQID NO:16,輕鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO:20;或重鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO:17,輕鏈可變區(qū) 序列為SEQIDN0:20;或重鏈可變區(qū)序列為SEQIDN0:18,輕鏈可變區(qū)序列為SEQIDN0: 20;或重鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO:19,輕鏈可變區(qū)序列為SEQIDNO:20。
[0015] 本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體可包含或由完整的抗體（即全長(zhǎng))、基本上完整的抗體 或其抗原結(jié)合部分，例如Fab片段、F(ab'）2片段或單鏈Fv片段組成。
[0016] 本發(fā)明抗PCSK9單克隆抗體包括可變區(qū)和恒定區(qū)，其中抗體重鏈恒定區(qū)可以是 IgGl亞型（SeqID7)、IgG2(SeqID8)或者IgG4亞型（SeqID9)，輕鏈恒定區(qū)可以是 kappa亞型（SeqID10)或者Lambda亞型（seqID11)。
[0017] 本發(fā)明所述的單克隆抗體或其片段是全人源的。
[0018] 本發(fā)明抗體的親和力可以在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法中進(jìn)行證明。簡(jiǎn)言之，測(cè)量使用儀器 Biacore3000,將抗人Fe段的抗體偶聯(lián)至芯片CM5的表面上，稀釋抗體蛋白至合適濃度， 保證200RU左右的抗體被抗人Fc的抗體捕獲。將抗體設(shè)置一系列的濃度梯度（ex. 100nm， 50nm，25nm，12. 5nm，6. 25nm，3. 125nm，1. 5625nm，Onm)流經(jīng)固定相表面，測(cè)定各單克隆抗體 的親和力。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施例中，分析了 6種不同抗PCSK9單抗(包括4種本發(fā)明的單抗和2種對(duì) 照單抗）抑制LDLR與PCSK9結(jié)合的能力，結(jié)果是均能有效抑制LDLR與PCSK9的結(jié)合。
[0020] 本發(fā)明抗體在人血清中的穩(wěn)定性可以在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法中進(jìn)行證明。簡(jiǎn)言之，取過(guò) 濾去菌的單抗樣品，分別稀釋于200ul無(wú)菌的正常人混合血清或PBS至終濃度30ug/ml， 混勻后置37°C水浴放置12天（288小時(shí))。12天后，利用ELISA分析血清樣品（A:Ab/ normalhumanserum)，PBS樣品（B:Ab/PBS)和凍存的單抗樣品（C:Ab)與huPCSK9 的結(jié) 合，并分別比較各單抗樣品結(jié)合huPCSK9能力的變化(A/C)。結(jié)果表明本發(fā)明中的四株抗 huPCSK9單抗具有好的血清穩(wěn)定性。
[0021] 本發(fā)明抗體的抑制PCSK9誘導(dǎo)細(xì)胞表面LDLR下調(diào)的活性可以在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方 法中進(jìn)行證明。簡(jiǎn)言之，將HEK293細(xì)胞密度調(diào)整至8*10E5cells/ml，接種于24孔板 (500ul/孔)。然后在細(xì)胞中加入抗體和PCSK9,懸浮培養(yǎng)3h。然后分別收集各孔中細(xì) 胞，用 1%BSA-PBS洗滌 2 次，然后與FITC-anti-LDLR單抗（SinoBiologicalInc.Cat# 10231-R301-F)于冰上孵育45分鐘，用PBS洗滌2次后，用BD公司的AccuriC6流式細(xì)胞 儀分析FITC信號(hào)。以未處理的HEK293細(xì)胞為對(duì)照，比較各種處理后細(xì)胞表面LDLR的水平。 結(jié)果顯示本發(fā)明的抗PCSK9單抗（20ug/ml)能夠明顯抑制PCSK9誘導(dǎo)的LDLR水平下調(diào)。
[0022] 本發(fā)明抗體抑制PCSK9誘導(dǎo)細(xì)胞攝取LDL-C能力的活性可以在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法中 進(jìn)行證明。簡(jiǎn)言之，將HEK293細(xì)胞密度調(diào)整至8*10E5cells/ml，接種于24孔板（500ul/ 孔)。然后在細(xì)胞中加入PCSK9和抗體，懸浮培養(yǎng)2. 5h。然后再分別在每個(gè)孔中補(bǔ)加B0DIPY FLLDL(Invitrogen，Cat#:L3483)至終濃度6ug/ml，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)2.5h。然后分別收集 各孔中細(xì)胞，用PBS洗滌2次后，用BD公司的AccuriC6流式細(xì)胞儀分析B0DIPY信號(hào)（激 發(fā)波長(zhǎng)488nM，發(fā)射波長(zhǎng)520)。以未處理的HEK293細(xì)胞為對(duì)照，比較各種處理后細(xì)胞攝取 LDL-C的水平。結(jié)果顯示本發(fā)明的多種抗PCSK9單抗（20ug/ml)能夠明顯抑制PCSK9誘導(dǎo) 的HEK293細(xì)胞攝取LDL-C水平的下調(diào)。
[0023]
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1:單抗抑制PCSK9結(jié)合人LDLR胞外區(qū)EGF-AB結(jié)構(gòu)域。
[0025] 圖2 :抗人PCSK9單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)LDLR結(jié)合人PCSK9。
[0026] 圖3 :不同抗huPCSK9單抗在在人血清中的穩(wěn)定性分析。
[0027] 圖4 :抗PCSK9單抗抑制PCSK9誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞表面的LDLR下調(diào)（其中 anti_IL17為一株抗IL17的單抗；Aliro為抗PCSK9的對(duì)照單抗Alirocumab;Evolo為抗 PCSK9的對(duì)照抗體Evolocumab;H4H4,H7B12,H8A7,H8F4為四株抗PCSK9的單抗）。
[0028] 圖5:抗PCSK9單抗抑制PCSK9誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞攝取LDL-C能力的下調(diào)（其中 anti_IL17為一株抗IL17的單抗；Aliro為抗PCSK9的對(duì)照單抗Alirocumab;Evolo為抗 PCSK9的對(duì)照抗體Evolocumab;H4H4,H7B12,H8A7,H8F4為四株抗PCSK9的單抗）。
[0029]
【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例僅僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0031] 實(shí)施例1:各種重組蛋白的制備。
[0032] 制備抗PCSK9單抗的過(guò)程中需要用到多種不同的重組蛋白，包括人PCSK9 (huPCSK9，SeqIDNo:l)，小鼠PCSK9(moPCSK9,SeqIDNo:2 )和獼猴PCSK9(mmPCSK9, SeqIDNo:3)，人LDLR胞外區(qū)（EGF_AB，SeqIDNo:4 )，以及重組抗體。而這些蛋白都 有大量的翻譯后修飾(如：糖基化或二硫鍵等)，因而利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)將更有利 于保持重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。此外，為了方便純化，非抗體類(lèi)的重組蛋白在C端添加了His-tag(SeqIDNo:5 )或者鼠抗體的Fc段（mFc，SeqIDNo:6)。重組抗體制備時(shí)，抗 體重鏈恒定區(qū)可以是IgGl亞型（SeqIDNo:7 )，IgG2亞型（SeqIDNo:8)或者IgG4亞型 (