專(zhuān)利名稱(chēng)：源自記憶b細(xì)胞的人單克隆抗體的快速表達(dá)克隆的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)大體上涉及不利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)來(lái)產(chǎn)生人單克隆抗體(mAb)的方法，以及使用該抗體來(lái)治療或預(yù)防疾病(例如病原體、如人類(lèi)免疫缺陷病毒的感染)的方法。
背景技術(shù)：
雖然經(jīng)過(guò)20多年的努力人類(lèi)免疫缺陷病毒-1型(HIV-I)疫苗仍然是難以獲得的，但是它仍是唯一最有希望阻止疫情的措施[1’2]。近期基于5型腺病毒(Ad5_)載體的細(xì)胞免疫(CTL)疫苗的失敗和早期膜蛋白(gpl20)亞單位疫苗的失敗也反映了這個(gè)任務(wù)的困難度[2]。由于這些失敗，研究重點(diǎn)又回到研究某些能自發(fā)地控制感染病毒的HIV-I感染者群體的保護(hù)性體液反應(yīng)及其抗原表位。這些群體包括保持穩(wěn)定的CD4T淋巴細(xì)胞數(shù)量的多年不發(fā)病的長(zhǎng)期不進(jìn)展者(LTNP)[3]，以及罕見(jiàn)病毒控制者(EC)[4]即在申請(qǐng)人的研究組里稱(chēng)為的天然病毒抑制者(NVQ [5]，這類(lèi)人感染者無(wú)需抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療就可以自發(fā)地將病毒復(fù)制控制在極低的水平。最近的幾項(xiàng)研究試圖識(shí)別在某些罕見(jiàn)的HIV感染者的血漿或血清中發(fā)現(xiàn)的具有高中和活性的抗膜蛋白抗體的抗原表位[6’7]。然而，體液中抗體的特異性有可能因HIV包膜蛋白的高度易變而隨著時(shí)間發(fā)生明顯改變和/或減少[8]，特別是在抗原血癥起限制作用的情況下。因此，在慢性HIV-I型感染者體液中的抗體的特異性不大可能完全體現(xiàn)出早期急性感染階段的病毒所誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體特性。此外，在急性感染的關(guān)鍵時(shí)期發(fā)生的可能的關(guān)鍵抗體反應(yīng)可能無(wú)法通過(guò)在病毒載量已經(jīng)下降到檢測(cè)下限后進(jìn)行的血清樣本分析而檢測(cè)到。例如，有文獻(xiàn)顯示EC具有比慢性進(jìn)展者更低的HIV-I特異性抗體的滴度 [9’1(1]。因此，需要采取新的方法來(lái)評(píng)估HIV感染個(gè)體中的現(xiàn)在和過(guò)去的免疫反應(yīng)，以尋找新的有益于治療的抗體。同樣的問(wèn)題對(duì)于已經(jīng)感染了其他病原體或有自身免疫性疾病的個(gè)體來(lái)說(shuō)也是很重要的。一旦這種抗體被鑒定，就需要有一種可靠的方法來(lái)進(jìn)行制備，優(yōu)選將其制成供人類(lèi)使用的完全人抗體。有五種通用方法來(lái)分離人單克隆抗體，它們都存在各種的技術(shù)性缺陷，使它們難以與用來(lái)制備小鼠單克隆抗體的原Kohler-Milstein的雜交瘤技術(shù)相比。這些方法包括雜交瘤細(xì)胞法_、利用Epstein-Ban 病毒(EBV)的B細(xì)胞轉(zhuǎn)化、噬菌體展示 [42]、酵母展示[43]和小鼠單克隆抗體的“人源化”[44]。由于缺乏適用的人細(xì)胞融合受體細(xì)胞， 用常規(guī)的雜交瘤細(xì)胞法分離人單克隆抗體已被證明非常艱難，雖然這種方法已被證實(shí)是可能成功的(參見(jiàn)最近一個(gè)令人關(guān)注的例子。EBV轉(zhuǎn)化已被證明具有同樣困難，但其原因不同。EBV轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系往往是遺傳不穩(wěn)定的，由此產(chǎn)生的高克隆損失率使得這種方法非常麻煩。最近公布了一種改進(jìn)的EBV轉(zhuǎn)化方法，該方法使用EBV來(lái)從免疫的記憶B細(xì)胞(Bfcffl)中轉(zhuǎn)化富集的BMa/26]。這種方法適用于多種免疫原，但它需要健康的Bfcm，而這在如 HIV-I感染的慢性感染過(guò)程中經(jīng)常是缺乏的[18]。噬菌體和酵母展示技術(shù)克服了這些問(wèn)題， 但這些方法在篩選過(guò)程中依賴(lài)于Fab片段或單鏈Fv (scFv)片段，從而無(wú)法通過(guò)諸如病毒中和的功能分析來(lái)進(jìn)行篩選。噬菌體展示還存在這樣的問(wèn)題，即它對(duì)可以穩(wěn)定地表達(dá)為重組噬菌體的抗體特性有未知的結(jié)構(gòu)性限制[46]。最后，可以通過(guò)移植編碼人抗體可變區(qū)基因上的抗原結(jié)合區(qū)的基因片段來(lái)“人源化”小鼠單克隆抗體。這是一個(gè)高度繁瑣的勞力密集的工作，超出了大多數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室的所能達(dá)到的水平。因此，需要有一種新的方法來(lái)快速克隆全長(zhǎng)的人單克隆抗體以解決這些問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所提供的方法可用于快速克隆全長(zhǎng)的人單克隆抗體，其可用于治療疾病和病癥，如病原體感染、癌癥以及自身免疫性疾病。在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備特異性結(jié)合特定的已知抗原的單克隆抗體的方法。該方法包括如下步驟(a)從一個(gè)已接觸過(guò)該特定已知抗原的動(dòng)物中獲取血液樣本；(b)從該血液樣本中分離出記憶B細(xì)胞；(c)在一定條件下培養(yǎng)所分離出的記憶B細(xì)胞一定時(shí)間，直到所述記憶B細(xì)胞分化為能穩(wěn)定生產(chǎn)單克隆抗體的漿細(xì)胞；(d)確定漿細(xì)胞是否能產(chǎn)生特異性結(jié)合該特定已知抗原的單克隆抗體；(e)如果漿細(xì)胞能產(chǎn)生特異性結(jié)合該特定已知抗原的單克隆抗體，則從漿細(xì)胞中分離出總RNA，而如果漿細(xì)胞不產(chǎn)生該單克隆抗體，則重復(fù)步驟(b)-(d)，直到所分離出的多個(gè)記憶B細(xì)胞被鑒定為可分化成能穩(wěn)定產(chǎn)生單克隆抗體的漿細(xì)胞；(f)使用在步驟(e)中分離出的總RNA來(lái)制備總RNA中的編碼抗體重鏈可變區(qū)(VH)的mRNA分子的cDNA和編碼抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的mRNA分子的cDNA ； (g)將VH鏈cDNA克隆到真核表達(dá)載體，并將VL鏈cDNA克隆到真核表達(dá)載體；(h)選擇包含VH鏈cDNA的表達(dá)載體制備VH鏈微型庫(kù)，并選擇包含VL鏈cDNA的表達(dá)載體制備VL鏈微型庫(kù)；(i)用包括來(lái)自VH鏈微型庫(kù)的VH鏈cDNA的表達(dá)載體的混合物和包括來(lái)自VL鏈微型庫(kù)的VL鏈cDNA的表達(dá)載體的混合物共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在一定條件下使共轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許這些細(xì)胞能穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體；(j)確定共轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生特異性結(jié)合該特定已知抗原的單克隆抗體；(k)鑒定編碼有如步驟(j)中單克隆抗體的VH鏈的VH鏈cDNA，其包括步驟⑴用從VH鏈cDNA微型庫(kù)中獲得的特定VH鏈cDNA表達(dá)載體和包括來(lái)自VL鏈微型庫(kù)的VL鏈cDNA表達(dá)載體的混合物共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在一定條件下使該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成能穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的克??；(ii)確定該克隆是否產(chǎn)生特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體；(iii)如果該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生了特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體，則繼續(xù)進(jìn)行步驟(k)之(iv)，而如果該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞不產(chǎn)生單克隆抗體，則使用不同的特定VH鏈cDNA表達(dá)載體來(lái)重復(fù)步驟 (k)之⑴和步驟(k)之(ii)，直到特定VH鏈cDNA表達(dá)載體被鑒定為可產(chǎn)生單克隆抗體； (iv)鑒定產(chǎn)生單克隆抗體的VH鏈cDNA，并選擇用來(lái)制備產(chǎn)生特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體的克隆的VH鏈cDNA表達(dá)載體；(1)鑒定編碼如步驟(k)中的單克隆抗體的VL 鏈的VL鏈cDNA，包括步驟⑴用在步驟(k)之(iv)中鑒定的VH鏈cDNA的表達(dá)載體和選自VL鏈微型庫(kù)的特定VL鏈cDNA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在一定條件下使該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成能穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體的克??；(ii)確定該克隆是否產(chǎn)生特異性地結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體；(iii)如果該克隆產(chǎn)生了特異性地結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體，則繼續(xù)進(jìn)行步驟(1)之(iv)，而如果該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞不產(chǎn)生單克隆抗體，則用不同的特定VL鏈cDNA的表達(dá)載體重復(fù)步驟(1)之(i)和步驟(1)之(ii)，直到特定的VL鏈cDNA表達(dá)載體被鑒定出產(chǎn)生單克隆抗體；(iv)鑒定編碼單克隆抗體的VL鏈的VL鏈cDNA，并選擇用于制備產(chǎn)生單克隆抗體的克隆的VL鏈cDNA表達(dá)載體；以及(m)用步驟(k)之(iv)所鑒定的VH鏈cDNA的表達(dá)載體和用步驟⑴之(iv) 所鑒定的VL鏈cDNA的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以制備能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體。在上述方法中，VL鏈可以是V κ鏈或V λ鏈。宿主細(xì)胞例如可以是細(xì)菌細(xì)胞、273Τ細(xì)胞或中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞，而真核表達(dá)載體例如可以是IgGl、κ或γ真核表達(dá)載體。 在上述方法中，VH鏈cDNA和VL鏈cDNA可以被克隆到相同的表達(dá)載體中。該特定已知抗原可以是來(lái)自病原體如病毒、細(xì)菌、朊病毒、真菌、酵母菌或寄生蟲(chóng)的抗原。例如，該病原體可以是人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-I或HIV-2。在上述方法中，分離出的記憶B細(xì)胞例如可以約100個(gè)記憶B細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)。從中獲得B記憶細(xì)胞的動(dòng)物可以是以前曾以針對(duì)病原體的疫苗免疫的方式暴露于病原體，或該動(dòng)物可以是以前曾自然地被病原體感染。在某些例子中，該動(dòng)物將被人類(lèi)免疫缺陷病毒感染，并且該動(dòng)物將能夠自發(fā)地控制病毒。從中獲取B記憶細(xì)胞的動(dòng)物可以患有可針對(duì)自體抗原產(chǎn)生抗體的自身免疫性疾病，這種疾病是選自包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、1型糖尿病、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥和重癥肌無(wú)力的集合體中的一種。這些自身抗體可用作自身免疫性疾病的治療標(biāo)靶。從中獲取B記憶細(xì)胞的動(dòng)物在獲取B記憶細(xì)胞之時(shí)或在之前患有腫瘤或癌癥。B記憶細(xì)胞如任其成長(zhǎng)為可產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞，則可以產(chǎn)生特異性結(jié)合腫瘤或癌細(xì)胞的抗體?？乖梢允前妓衔?、脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、肽、核酸和小分子(有機(jī)和無(wú)機(jī))的集合體中的一種。動(dòng)物可以是人，在這種情況下，單克隆抗體是完全人單克隆抗體。在第二方面，本發(fā)明提供了用上述方法分離的單克隆抗體。該單克隆抗體可具有可變重鏈(VH)的第三互補(bǔ)決定區(qū)，其包括由從SEQ ID NO 73到SEQ ID NO :115中的至少一個(gè)氨基酸序列。該單克隆抗體可具有可變輕鏈(VL)的第三互補(bǔ)決定區(qū)，其包括由從SEQ ID NO 116到SEQ ID NO :163中的至少一個(gè)氨基酸序列。在第三方面，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防由個(gè)體中的人類(lèi)免疫缺陷病毒造成的感染的方法，包括對(duì)個(gè)體施用由上述方法分離出來(lái)的單克隆抗體。在第四方面，本發(fā)明提供了一種鑒定用于治療或預(yù)防由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV) 感染引起的疾病的治療用單克隆抗體的方法。該方法包括(a)從其本身是HIV的精英控制者天然病毒抑制者的動(dòng)物中獲得血液樣本；(b)確定該血液樣本中是否包含任何結(jié)合特定已知病原體的抗體；(c)從血液樣本中分離記憶B細(xì)胞；(d)在一定條件下培養(yǎng)多個(gè)分離出的記憶B細(xì)胞達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許記憶B細(xì)胞分化為能穩(wěn)定生產(chǎn)單克隆抗體的漿細(xì)胞；(e)確定漿細(xì)胞是否產(chǎn)生特異性結(jié)合HIV的單克隆抗體；(f)將由漿細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體與血液樣本中的抗體進(jìn)行比較；以及(g)如果由漿細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體與血液樣本中的抗體不同，則鑒定并選擇由漿細(xì)胞產(chǎn)生的該不同的單克隆抗體。可以用如上述第一方面所述方法中的步驟(e)到(m)選擇上述步驟(g)中的漿細(xì)胞來(lái)制備能穩(wěn)定地產(chǎn)生該不同的單克隆抗體的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞克隆。在第五方面，本發(fā)明提供了一種在動(dòng)物目前尚未有特異性結(jié)合特定已知抗原的體液抗體時(shí)確定動(dòng)物是否曾被暴露于特定已知抗原下的方法。該方法包括(a)從動(dòng)物中獲得血液樣本；(b)從血液樣本中分離記憶B細(xì)胞；(c)在一定條件下培養(yǎng)分離出的記憶B細(xì)胞達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許記憶B細(xì)胞分化為能穩(wěn)定生產(chǎn)單克隆抗體的漿細(xì)胞；以及(d)確定漿細(xì)胞是否產(chǎn)生特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體，其中該單克隆抗體的產(chǎn)生表明該動(dòng)物曾暴露在該特定已知抗原下，無(wú)該單克隆抗體產(chǎn)生則表明動(dòng)物可能沒(méi)有暴露于該特定已知抗原下。該抗原可以是病原體如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)的抗原。


本發(fā)明將以示例的方式并通過(guò)非限制性地結(jié)合附圖部分予以說(shuō)明，其中圖1是抗HIV-I包膜蛋白的血漿抗體的特異性的檢測(cè)。其中A)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)檢測(cè)針對(duì)FLSC、gpl20Ba_L和gpl40Ba_L的血漿抗體，以對(duì)數(shù)標(biāo)度顯示半飽和結(jié)合滴度。B)在存在亞抑制濃度的s⑶4的條件下，通過(guò)對(duì)HIV-27312A_v434M中和活性的增強(qiáng)來(lái)檢測(cè)NVS供體的血漿中的CD4i抗體。示出了 IC90滴度，虛線(xiàn)是檢測(cè)極限。C)上排圖顯示了通過(guò)針對(duì)bl2單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA (左)、針對(duì)s⑶4-Ig的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA (中) 和針對(duì)結(jié)合到細(xì)胞表面CD4的gpl20-Ig的抑制(右)所檢測(cè)的血漿中CD4bs抗體的結(jié)果。 下排圖顯示了通過(guò)針對(duì)17b單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA (左)、針對(duì)ED47單克隆抗體的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA (中)和針對(duì)結(jié)合到細(xì)胞表面CCR5的FLSC-Ig的抑制(右)所檢測(cè)的血漿中⑶4i 抗體的結(jié)果。NVS5、NVS9和NVSlO的結(jié)果分別以圓圈、方塊和三角形標(biāo)識(shí)。圖2是HIV-I包膜蛋白特異性BMem的鑒定。對(duì)100個(gè)BMem/孔刺激2周，并利用抗 κ和抗λ抗體的混合物通過(guò)ELISA從上清液中篩選出總的⑶4i、⑶4bs和“其它”的HIV-I 包膜蛋白特異性的BMem。A)NVSlOBmem培養(yǎng)上清液的典型ELSIA數(shù)據(jù)。B)三個(gè)NVS供體中的 HIV-I包膜蛋白特異性的BMem以頻率/百萬(wàn)總BMem表示。檢出限為10個(gè)前體/百萬(wàn)BMem。 C)在一個(gè)餅圖中顯示了供體NVS5、NVS9和NVSlO中每一個(gè)的⑶4i (藍(lán)色)、⑶4bs (紅色) 和“其它”特異性(黃色)的Bfcm百分比。圖3顯示了三個(gè)⑶4i單克隆抗體的分離。如材料與方法部分中所述地從NVS5的 CD4i抗體陽(yáng)性孔中克隆出三個(gè)單克隆抗體。圖中示出了單克隆抗體對(duì)于FLSC(實(shí)心符號(hào)) 以及對(duì)于gpl20Ba<(空心符號(hào))的選擇性活性的ELISA曲線(xiàn)。圖4顯示了 NVS5、NVS9和NVSlO的病毒載量及⑶4計(jì)數(shù)。所有供體都有穩(wěn)定的 CD4計(jì)數(shù)(圓圈，細(xì)胞/ml)。病毒載量(方形)的檢出限為75拷貝/ml。在NVSlO的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(三角形)處采用敏感度較低的病毒載量檢測(cè)(< 400拷貝/ml)。箭頭指示為這項(xiàng)研究取樣的時(shí)間點(diǎn)。圖5顯示了采用ELISA法鑒定⑶4i和⑶4bs單克隆抗體(mAb)。依照示例部分中所述的三種模式的HIV-I包膜蛋白ELISA法來(lái)檢測(cè)代表性的⑶4i和⑶4bs單克隆抗體。A)右、中、左圖分別顯示出對(duì)于⑶4i單克隆抗體(17b，ED47，A32)、⑶4bs單克隆抗體 (bl2，M14，s⑶4-Ig)和單克隆抗體2G12的結(jié)果。還顯示了對(duì)于FLSC(實(shí)心符號(hào))和對(duì)于 gpl20Ba_L(空心符號(hào))的反應(yīng)性的ELISA曲線(xiàn)。B)顯示了在0. 1 μ g/ml下用于所有這些代表性單克隆抗體的ELISA法的OD值。CD4i單克隆抗體是通過(guò)其與FLSC的強(qiáng)鍵結(jié)合和與 gpl20Ba_L或gpl40Ba_L的弱鍵結(jié)合進(jìn)行鑒定，而⑶4bs單克隆抗體是通過(guò)其與gpl20Ba_L或 gpl40Ba_L的強(qiáng)鍵結(jié)合和其與FLSC的弱鍵結(jié)合的比較進(jìn)行鑒定。除了⑶4i和⑶4bs外的單克隆抗體被標(biāo)記為“其他”類(lèi)。其中一個(gè)“其他”單克隆抗體2G12同樣很好地結(jié)合FLSC和 gpl20Ba_L,因此可用來(lái)標(biāo)化ELISA法。圖6是用來(lái)鑒定分泌抗包膜蛋白抗體的漿細(xì)胞的步驟的示意圖。圖7是顯示了查找正確的VH-VL基因?qū)Φ膹?fù)雜性的示意圖。圖8是顯示了用來(lái)自VH(重鏈可變區(qū))和VL(輕鏈可變區(qū))微型庫(kù)的cDNA混合物(池)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染的示意圖。圖9顯示了如何鑒定制備抗包膜蛋白抗體的VH鏈cDNA的示意圖。圖10顯示了如何鑒定制備包膜蛋白抗抗體的VL鏈cDNA的示意圖。圖11是顯示了用本發(fā)明所述的方法利用從人Bfcm細(xì)胞中克隆得到的抗HIV-I gpl20抗體的抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)檢測(cè)的圖。
具體實(shí)施例方式申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)，記憶B細(xì)胞(BmJ分析可以用來(lái)鑒定針對(duì)特定已知抗原的已過(guò)抗體反應(yīng)。這種抗體反應(yīng)往往不能通過(guò)同期血漿抗體樣本的分析來(lái)檢測(cè)。申請(qǐng)人的研究結(jié)果表明，通過(guò)Bfcm分析單克隆抗體的多樣性對(duì)將針對(duì)特定病原體或抗原的抗體特異性和保護(hù)免疫相關(guān)聯(lián)的血清學(xué)研究形成了補(bǔ)充。因此，本發(fā)明的某些實(shí)施例涉及一種方法，用于鑒定特異性結(jié)合由已知曾經(jīng)在過(guò)去暴露于抗原的動(dòng)物產(chǎn)生的已知抗體的單克隆抗體，但是該單克隆抗體目前在從動(dòng)物中獲得的同期血清樣本中無(wú)法檢測(cè)出來(lái)。使用這種方法，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，屬于感染了 HIV-I的罕見(jiàn)病毒控制者(EC)或天然病毒抑制者(NVQ的某些個(gè)體具有能夠產(chǎn)生在同期血清樣本中無(wú)法檢出的抗包膜蛋白單克隆抗體的Bfcm。新近發(fā)現(xiàn)的抗包膜蛋白單克隆抗體具有治療意義，因?yàn)樗鼈兪怯赡懿唤柚幬镏委煴憧勺晕铱刂茲撛谥旅?HIV-I感染的罕見(jiàn)人群產(chǎn)生的。特別是，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)抗原CD4i的單克隆抗體治療HIV-I感染時(shí)特別有用。這種抗體包括陽(yáng)-11、陽(yáng)-12、陽(yáng)-13、1713』047和A32(詳見(jiàn)下文)。該新方法可用于制備針對(duì)可產(chǎn)生抗原、即能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)的任何分子的單克隆抗體。在申請(qǐng)人的研究過(guò)程中，申請(qǐng)人不僅鑒定出新的治療用抗體，還開(kāi)發(fā)出一種無(wú)需使用雜交瘤細(xì)胞融合、噬菌體展示或EBV轉(zhuǎn)化就可制備特異性結(jié)合已知抗原的完全人單克隆抗體的新方法。一些實(shí)施例涉及這種新方法以及用這種方法重組單克隆抗體，特別是下面介紹的新發(fā)現(xiàn)的抗HIV包膜蛋白單克隆抗體。其他一些實(shí)施例涉及一種方法，用于在動(dòng)物目前還不能產(chǎn)生特異性結(jié)合已知抗原的抗體時(shí)確定該動(dòng)物是否曾經(jīng)接觸或感染已知抗原。早期急性HIV-I感染的關(guān)鍵窗口期內(nèi)的抗病毒抗體反應(yīng)性質(zhì)對(duì)于疫苗和藥物設(shè)計(jì)都很重要，但在本質(zhì)上是難以評(píng)估的。一旦慢性感染已形成，特別是在復(fù)制和抗原血癥受到自然過(guò)程或藥物干預(yù)限制的條件下，抗體特異性有可能明顯改變。因此，過(guò)去的反應(yīng)不太可能在現(xiàn)在的樣本中反映出來(lái)。幾個(gè)研究組正在試圖通過(guò)建立網(wǎng)絡(luò)跟蹤高危個(gè)體以期在急性感染后的最短時(shí)間內(nèi)獲得樣本來(lái)克服這種限制。但是，這些努力面臨許多實(shí)際上的和后勤上的限制，特別是在資源匱乏的環(huán)境中。長(zhǎng)壽命的Bfcm提供了在宿主的大部分壽命期內(nèi)產(chǎn)生的抗體特異性的歷史檔案[11]。 例如，Bfcm在接種牛痘疫苗后能持續(xù)50年[12]。相比之下，體液中抗體通常會(huì)在抗原清除后衰減。例如，多達(dá)一半的接種者在接種乙肝(HBV)疫苗后幾年之內(nèi)會(huì)失去保護(hù)性抗體[13]。 另一方面，在缺乏抗體時(shí)HBV特異性BMem可以持續(xù)，并為在暴露于HBV或疫苗下時(shí)的快速保護(hù)性抗體反應(yīng)創(chuàng)造條件[14_17]。這些研究為Bfcm提供了先前抗體反應(yīng)的高度穩(wěn)定記錄的方面提供了強(qiáng)有力的綜合性證據(jù)。由于Bfcm可以在宿主的大部分壽命時(shí)間內(nèi)持續(xù)，可推理認(rèn)為他們可以提供這種早期反應(yīng)的記錄，并可提供一個(gè)新窗口，通過(guò)其可將抗體特異性與申請(qǐng)人的NVS人群中的病毒控制機(jī)制相關(guān)聯(lián)。HIV-I感染者體內(nèi)的BMem細(xì)胞的分析本質(zhì)上很困難，因?yàn)镠IV-I發(fā)病機(jī)理包含可以擴(kuò)展至體液免疫的嚴(yán)重的免疫功能障礙[18’w]。幸運(yùn)的是，可以維持一個(gè)相對(duì)完整的免疫系統(tǒng)的EC或NVS提供了一個(gè)可在感染期內(nèi)由HIV-I包膜蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫的檔案進(jìn)行調(diào)查的機(jī)會(huì)。因此，申請(qǐng)人采用一個(gè)本地NVS人群[5]，針對(duì)gpl20和⑶4bs上的兩個(gè)被高度保護(hù)性的交叉反應(yīng)性中和標(biāo)靶以及包含CD4誘導(dǎo)的(CD4i)抗原決定族的輔助受體結(jié)合位點(diǎn)來(lái)將存檔的Bfcm特異性和同期血漿抗體反應(yīng)來(lái)進(jìn)行比較并對(duì)照[2°_23]。NVS志愿者在確定申請(qǐng)人的NVS人群里的抗包膜蛋白抗體反應(yīng)的研究的早期階段，申請(qǐng)人觀察到在特異性結(jié)合HIV-I包膜蛋白表位的血漿抗體和Bfcm之間的特異性存在明顯不一致性。對(duì)三名志愿者NVS5、NVS9和NVSlO進(jìn)行了更詳細(xì)的研究以探索這一觀察結(jié)果。每個(gè)志愿者的臨床特征見(jiàn)表1。自診斷之日起至今的時(shí)間NVS9(53歲的非裔美國(guó)男性，危險(xiǎn)因素靜脈注射吸毒)是5年，NVSlO (57歲的非裔美國(guó)女性，危險(xiǎn)因素性行為)是13年，而 NVS5(50歲的非裔美國(guó)女性，危險(xiǎn)因素性行為)是17年。這些個(gè)體在此期間沒(méi)有接受過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療。總B細(xì)胞和Bfcm頻率在正常范圍內(nèi)[19]，表明了這些人沒(méi)有整體免疫失調(diào)(見(jiàn)表1)。無(wú)法檢測(cè)到的病毒載量以及正常的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)也支持這一點(diǎn)。在全部試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，NVS9和NVSlO將病毒復(fù)制抑制到檢測(cè)不到的水平(< 75拷貝/毫升血漿)(圖 4)。相比之下，NVS5在第一個(gè)三年觀察期內(nèi)曾出現(xiàn)高達(dá)約300拷貝/毫升血漿的低水平病毒的瞬態(tài)峰值，在隨后的約四年內(nèi)被控制到檢測(cè)不到的水平(圖4)。有趣的是，在樣本被采集用于這里披露的研究后不久，就出現(xiàn)了約100拷貝/毫升血漿的病毒峰值。如下面所討論的，這可能是很重要的，因?yàn)镹VS5是三個(gè)志愿者中唯一具有明顯的中和抗體滴度的。這可能反映出在診斷后的17年，NVS5成為本發(fā)明研究的三個(gè)NVS志愿者中受感染時(shí)間最長(zhǎng)的。重要的是，在整個(gè)觀測(cè)時(shí)間，所有三個(gè)供體都具有正常范圍內(nèi)的穩(wěn)定的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù) (圖幻?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，在沒(méi)有抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的情況下，這三個(gè)NVS志愿者維持無(wú)法檢測(cè)到的病毒載量多年，而且就總表型而言，他們的淋巴細(xì)胞亞群是正常的。表1三個(gè)NVS供體的特征
權(quán)利要求
1. 一種用于制備特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體的方法，包括步驟(a)從一個(gè)已接觸過(guò)所述特定已知抗原的動(dòng)物中獲取血液樣本；(b)從所述血液樣本中分離出記憶B細(xì)胞；(c)在一定條件下培養(yǎng)所分離出的記憶B細(xì)胞一定時(shí)間，以允許所述記憶B細(xì)胞分化為能穩(wěn)定生產(chǎn)單克隆抗體的漿細(xì)胞；(d)確定所述漿細(xì)胞是否能產(chǎn)生特異性結(jié)合所述特定已知抗原的單克隆抗體；(e)如果所述漿細(xì)胞能產(chǎn)生特異性結(jié)合所述特定已知抗原的所述單克隆抗體，則從所述漿細(xì)胞中分離出總RNA，而如果所述漿細(xì)胞不產(chǎn)生所述單克隆抗體，則重復(fù)步驟 (b)-(d)，直到所分離出的記憶B細(xì)胞被鑒定為分化成能穩(wěn)定產(chǎn)生所述單克隆抗體的漿細(xì)胞；(f)使用在步驟(e)中分離出的總RNA來(lái)制備總RNA中的編碼抗體重鏈可變區(qū)(VH)的 mRNA分子的cDNA和編碼抗體輕鏈可變區(qū)(VL)的mRNA分子的cDNA ；(g)將VH鏈cDNA克隆到真核表達(dá)載體，并將VL鏈cDNA克隆到真核表達(dá)載體；(h)選擇包含VH鏈cDNA的表達(dá)載體制備VH鏈微型庫(kù)，并選擇包含VL鏈cDNA的表達(dá)載體制備VL鏈微型庫(kù)；(i)用包括來(lái)自VH鏈微型庫(kù)的VH鏈cDNA的表達(dá)載體的混合物和包括來(lái)自VL鏈微型庫(kù)的VL鏈cDNA的表達(dá)載體的混合物共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在一定條件下使共轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許這些細(xì)胞能穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體；(j)確定所述共轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生特異性結(jié)合所述特定已知抗原的單克隆抗體； (k)鑒定編碼了如步驟(j)中單克隆抗體的VH鏈的VH鏈cDNA，其包括步驟 (i)用從VH鏈cDNA微型庫(kù)中獲得的特定VH鏈cDNA表達(dá)載體和包括來(lái)自VL鏈微型庫(kù)的VL鏈cDNA表達(dá)載體的混合物共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在一定條件下使該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成能穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的克?。?( )確定該克隆是否產(chǎn)生特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體；(iii)如果該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)生了特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體，則繼續(xù)進(jìn)行步驟(k)之(iv)，而如果該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞不產(chǎn)生單克隆抗體，則使用不同的特定VH鏈cDNA表達(dá)載體來(lái)重復(fù)步驟(k)之(i)和步驟(k)之(ii)，直到特定VH鏈cDNA表達(dá)載體被鑒定為可產(chǎn)生單克隆抗體；(iv)鑒定產(chǎn)生單克隆抗體的VH鏈cDNA，并選擇用來(lái)制備產(chǎn)生特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體的克隆的VH鏈cDNA表達(dá)載體；(1)鑒定編碼了如步驟(k)中的單克隆抗體的VL鏈的VL鏈cDNA，包括步驟 (i)用在步驟(k)之(iv)中鑒定的VH鏈cDNA的表達(dá)載體和選自VL鏈微型庫(kù)的特定 VL鏈cDNA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，并在一定條件下使該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以允許該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成能穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體的克??；( )確定該克隆是否產(chǎn)生特異性地結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體； (iii)如果該克隆產(chǎn)生了特異性地結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體，則繼續(xù)進(jìn)行步驟 (1)之(iv)，而如果該共轉(zhuǎn)染細(xì)胞不產(chǎn)生單克隆抗體，則用不同的特定VL鏈cDNA的表達(dá)載體重復(fù)步驟⑴之⑴和步驟⑴之(ii)，直到特定的VL鏈cDNA表達(dá)載體被鑒定出產(chǎn)生單克隆抗體；(iv)鑒定編碼單克隆抗體的VL鏈的VL鏈cDNA，并選擇用于制備產(chǎn)生單克隆抗體的克隆的VL鏈cDNA表達(dá)載體；以及(m)用步驟(k)之(iv)鑒定的VH鏈cDNA的表達(dá)載體和用步驟⑴之(iv)鑒定的VL 鏈cDNA的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以制備能夠產(chǎn)生特異性結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體的宿主細(xì)胞，從而產(chǎn)生結(jié)合特定已知抗原的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述特定已知抗原是病原體的抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述病原體是人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于動(dòng)物被人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染，并能自發(fā)地控制病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述動(dòng)物是人，而所述單克隆抗體是完全人單克隆抗體。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述方法分離的單克隆抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單克隆抗體，其特征在于所述單克隆抗體是完全人單克隆抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的單克隆抗體，其特征在于重鏈可變區(qū)(VH)的第三互補(bǔ)決定區(qū)包含SEQ ID NO 73到SEQ ID NO :115中的至少一個(gè)氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的單克隆抗體，其特征在于輕鏈可變區(qū)(VL)的第三互補(bǔ)決定區(qū)包含SEQ ID NO 116到SEQ ID NO :163中的至少一個(gè)氨基酸序列。
10.一種鑒定用于治療或預(yù)防由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的疾病的治療用單克隆抗體的方法，包括(a)從其本身是HIV的罕見(jiàn)病毒控制者或天然病毒抑制者的動(dòng)物中獲得血液樣本；(b)確定該血液樣本是否包含任何結(jié)合特定已知病原體的抗體；(c)從血液樣本中分離記憶B細(xì)胞；(d)在一定條件下培養(yǎng)分離出的記憶B細(xì)胞一定時(shí)間，以允許記憶B細(xì)胞分化為能穩(wěn)定生產(chǎn)單克隆抗體的漿細(xì)胞；(e)確定漿細(xì)胞是否產(chǎn)生特異性結(jié)合HIV的單克隆抗體；(f)將由漿細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體與血液樣本中的抗體進(jìn)行比較；以及(g)如果由漿細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體與血液樣本中的抗體不同，則鑒定并選擇由漿細(xì)胞產(chǎn)生的該不同的單克隆抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于用如權(quán)利要求1所述方法中的步驟(e) 到(m)選擇步驟(g)中的漿細(xì)胞，并制備能穩(wěn)定地產(chǎn)生該不同的單克隆抗體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞克隆。
全文摘要
本發(fā)明提供了無(wú)需利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)的人單克隆抗體的制備方法，采用所述的方法制備的抗體，以及采用該抗體治療和預(yù)防病癥(如人類(lèi)免度缺陷病毒的病原體感染)的方法。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102272158SQ200980154443
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2009年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者喬治·K·劉易斯, 管永軍 申請(qǐng)人:喬治·K·劉易斯, 管永軍