專利名稱：Her2/neu的人單克隆抗體的制作方法
背景技術(shù)：
生長因子和它們的同源受體調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，生長因子受體結(jié)構(gòu)、功能和表達的變化與細胞轉(zhuǎn)化和癌發(fā)生有關(guān)。一些已知的原癌基因編碼一種生長因子或一種生長因子受體，如編碼血小板源生長因子(PDGF)B鏈的c-sis和編碼表皮生長因子(EGF)受體的c-erbB。癌基因neu，也被稱作ERBB2或HER-2，與一些人體腺癌特別是乳腺和卵巢腫瘤的惡變有關(guān)。(1，2)C-erbB-2基因的蛋白產(chǎn)物p185HER2(HER2/neu)是一種與EGF受體同源的跨膜蛋白酪氨酸激酶受體，并且被認為在細胞生長和分化中起重要作用。一些模型提示p185HER2的癌基因型有跨膜突變，這會增加二聚化和內(nèi)化的能力，也會增加酪氨酸激酶的活性。(3，4，5)HER2/neu是治療人癌癥，特別是乳腺癌的候選治療目標。(6)與生長因子受體結(jié)合并調(diào)節(jié)其功能的抗體在免疫治療以及人腫瘤診斷和預后中有潛在的應用價值。HER2的單克隆抗體已經(jīng)被開發(fā)并證實有抗癌作用且在培養(yǎng)物和動物模型中抑制腫瘤細胞生長。(2，7，8)例如，在neu轉(zhuǎn)化的細胞中，轉(zhuǎn)化表型的保持要求細胞表面表達p185neu，抗p185neu抗體的體內(nèi)治療可以抑制neu轉(zhuǎn)化細胞接種小鼠的腫瘤生長。(9)而且，用他莫昔芬和HER2/neu抗體結(jié)合治療雌激素受體(ER)和HER2/neu受體陽性的人乳腺癌細胞與單介質(zhì)治療相比作用有所增加。(8)因此，需要開發(fā)針對HER2/neu的改良策略并提供比目前人癌癥治療更安全、毒性更小的替代方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了特異性與HER2/neu受體結(jié)合的分離人單克隆抗體，及包含一種或幾種該抗體結(jié)合的組合物。在某些實施方案中，人抗體的特征也在于以高親和性與HER2/neu受體結(jié)合，以及抑制表達HER2/neu細胞的生長和/或介導在人效應細胞存在時表達HER2/neu細胞(體外和體內(nèi))的殺滅。因此，本發(fā)明的人單克隆抗體可以作為體內(nèi)和體外的診斷或治療試劑。
本發(fā)明的分離人抗體包括多種抗體同種型，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。典型地說，它們包括IgG1(例如IgG1k)和IgM同種型。這些抗體可以是全長(如IgG1或IgG4抗體)或可以僅包括一個抗原結(jié)合部位(如Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或一個單鏈Fv片段)。在一種實施方案中，人抗體為重組人抗體。在另一種實施方案中，人抗體由包括一個從轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠得到的B細胞與永生化細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因小鼠有一個包含一個人類重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人類輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。在具體的實施方案中，抗體由這里提到的3.F2，1.D2，2.E8，1.B10和3.B4的雜交瘤產(chǎn)生。
在另一種實施方案中，本發(fā)明的人抗HER2/neu抗體的特征可以在于下列的一種和多物種性a)對HER2/neu受體的特異性；b)對HER2/neu的親和性，親和常數(shù)至少為107M-1左右，優(yōu)選為109M-1左右，更優(yōu)選為1010M-1到1011M-1左右或更高；c)與HER2/neu的締合常數(shù)(Kassoc)最少為103左右，更優(yōu)選為104左右，最優(yōu)選為105M-1S-1左右；d)從HER2/neu的解離常數(shù)(Kdis)為10-3s-1左右，優(yōu)選為10-4s-1左右，更優(yōu)選為10-5s-1左右，最優(yōu)選為10-6s-1左右；e)調(diào)理表達HER2/neu的細胞的能力。
f)在約10ug/ml或更少的濃度(如體外)下，人效應細胞存在時具有抑制表達HER2/neu的細胞(如腫瘤細胞)生長和/或介導對該細胞的吞噬及殺滅的能力。
g)與HER2/neu結(jié)合后被HER2/neu表達細胞內(nèi)化的作用。
在一種實施方案中，本發(fā)明的分離人抗體與HER2/neu抗原以至少107M-1左右，優(yōu)選為109M-1左右，更優(yōu)選為1010到1011M-1左右的親和常數(shù)結(jié)合，并且可以在IC50為1×10-7M左右或更低時，或在10ug/ml或更低的濃度下體外抑制表達HER2/neu細胞的生長和/或介導人效應細胞如多型核細胞(PMNs)或γ干擾素誘導的巨噬細胞對HER2/neu表達細胞的吞噬和殺滅。在某些實施方案中，本發(fā)明的人抗HER2/neu抗體的特征在于在5-10ug/ml左右，優(yōu)選1-5ug/ml左右或更優(yōu)選0.5-1ug/ml的濃度下體外抑制表達HER2/neu細胞的生長和/或介導表達HER/neu的細胞的細胞裂解和殺滅。
另一方面，本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分的核酸分子。因此，包括本發(fā)明的抗體編碼核酸的重組表達載體和用這種載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞，以及通過培養(yǎng)這些宿主細胞產(chǎn)生抗體的方法也包含在本發(fā)明中的范圍中。
另一方面，本發(fā)明提供了從可以表達各種與HER2/neu特異結(jié)合的人單克隆抗體同種型(如IgG，IgA和/或IgM)的轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中得到的分離B細胞。優(yōu)選地，分離B細胞從用HER2/neu抗原的純化或富集制劑和/或表達HER2/neu受體的細胞免疫過的轉(zhuǎn)基因非人動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因非人動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠，有一個包括人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。然后分離B細胞被永生化，提供HER2/neu的人單克隆抗體來源(如雜交瘤)。
因此，本發(fā)明也提供了可以產(chǎn)生與HER2/neu特異性結(jié)合的人單克隆抗體的雜交瘤。在一種實施方案中，雜交瘤包含了一個從轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的與永生化細胞融合的B細胞，轉(zhuǎn)基因小鼠有一個包含一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。轉(zhuǎn)基因非人動物可以用HER2/neu抗原的純化或富集制劑和/或表達HER2/neu受體的細胞免疫，產(chǎn)生生成抗體的雜交瘤。本發(fā)明的具體雜交瘤包括3.F2，1.D2，2.E8，1.B10和3.B4。
而另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠(這里也稱作″HuMab″)，它表達與HER2/neu特異性結(jié)合的單克隆抗體。在一種特定的實施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物是轉(zhuǎn)基因小鼠，它有一個包含一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。轉(zhuǎn)基因非人動物可以用HER2/neu抗原的純化或富集制劑和/或表達HER2/neu受體的細胞來免疫。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多種HER2/neu受體的人單克隆抗體(如IgG，IgA和/或IgM)。同種型轉(zhuǎn)換可以通過經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換完成。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生特異性與HER2/neu反應的人單克隆抗體的方法。在一種實施方案中，此方法包括用HER2/neu抗原和/或表達HER2/neu受體的細胞的純化或富集制劑來免疫有一個包含一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠。然后獲得動物的B細胞(如脾B細胞)并與骨髓瘤細胞融合形成無限增殖的，分泌抗HER2/neu的人單克隆抗體的雜交瘤。
本發(fā)明的分離抗HER2/neu人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部位可以由另一種功能分子如另一種肽或蛋白(如Fab’片段或ScFv抗體或腫瘤配體)衍生或與其聯(lián)接。例如，本發(fā)明的一種抗體或抗原結(jié)合部位位可以與一種或多種其它分子實體如另一種抗體(如雙特異性或多特異性抗體)進行功能性聯(lián)接(如通過化學偶聯(lián)、基因融合、非共價締合或其它方式)。所以，另一方面，本發(fā)明的特征在于包括至少一個對HER2/neu有第一結(jié)合特異性和對Fc受體，如人FcγRI(CD64)或人Fcα(CD89)受體有第二結(jié)合特異性的雙特異性或多特異性分子。在一種實施方案中，這些雙和多特異性分子進一步包括了一個腫瘤配體，如表皮生長因子。因此，本發(fā)明的多特異性分子也包括三特異性、四特異性和其它多特異性分子。
在一種特定的實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含至少一個人抗體或其片段(如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或單鏈Fv)，這種雙和三特異性分子可以包括多個人抗體部分或其片段(如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)v或單鏈Fv)和/或也包含“嵌合的”或“人源化”的抗體部分或片段(如有一個可變區(qū)域，或至少一個互補決定區(qū)(CDR)由非人抗體(如鼠科動物)衍生，剩下的部分為人源性的“人源化”抗體)。
總的說來，本發(fā)明的雙和多特異性分子包括至少一個抗體或其片段，與Fc受體如人IgG受體即Fcγ受體(FcγR)，如FcγRI(CD64)，F(xiàn)cγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，或人FcαR(CD89)結(jié)合。優(yōu)選的Fc受體包括高親和性的FcγRI受體和FcαR受體(CD89)。FcαRI受體和FcγRI受體是本發(fā)明中應用的優(yōu)選觸發(fā)受體，因為它們(1)主要在免疫效應細胞如單核細胞、多型核細胞、巨噬細胞核樹突細胞中表達；(2)以高水平表達(如每個細胞5,000-100,000)；(3)細胞毒活性的介導物(如ADCC，吞噬)；(4)介導針對抗原，包括自身抗原的抗原呈遞過程的增強。在一種優(yōu)選實施方案中，雙特異性和多特異性分子在受體免疫球蛋白(如IgG或IgA)結(jié)合點之外的位點與Fc受體結(jié)合。因此，雙特異性和多特異性分子的結(jié)合不被生理水平的免疫球蛋白阻斷。
另一方面，本發(fā)明的特征在于與治療部分如細胞毒藥物、酶活性毒素或其片段、放射性同位素或小分子抗癌藥結(jié)合的人抗HER2/neu抗體或其片段。
另一方面，當前發(fā)明提供了包括表達Fc受體的效應細胞如巨噬細胞或激活的多型核細胞的目標特異性效應細胞，以及本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子。
另一方面，本發(fā)明提供了組合物，如藥物和診斷組合物，它包含中可藥用的載體和至少一個特異性與HER2/neu結(jié)合的本發(fā)明的單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。在一種實施方案中，組合物包含人抗體或其抗原結(jié)合部分的結(jié)合，優(yōu)選為每個抗體或抗原結(jié)合部分與獨特的表位結(jié)合。例如，包含介導在效應細胞存在時高效殺滅靶細胞的人單克隆抗體的制藥組合物可以與另一種抑制表達HER2/neu細胞生長的人單克隆抗體結(jié)合。所以，此組合物提供了適應提供最大治療益處的多種治療方法。包含至少一個本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原決定部位和至少一個本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子的結(jié)合的組合物，如制藥組合物，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
而另一方面，本發(fā)明提供了用本發(fā)明中的抗體或其抗原結(jié)合部位(或雙特異性或多特異性抗體)，通過抑制靶細胞生長和/或誘導人效應細胞如人多型核細胞對靶細胞的吞噬和殺滅，來抑制表達HER2/neu的細胞增值和/或分化的方法。在一種實施方案中，此方法包括在人效應細胞存在下，在體內(nèi)或體外將表達HER2/neu受體的細胞與本發(fā)明的一種或幾種人單克隆抗體組合或其抗原結(jié)合部位接觸。此方法可以在如體外或來自體內(nèi)的培養(yǎng)物(如包含表達HER2/neu受體和效應細胞的培養(yǎng)物)中應用。例如，一種包含表達HER2/neu受體和效應細胞的樣品可以在體外培養(yǎng)，并與本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部位(或本發(fā)明的雙特異性或多特異性抗體)組合。另外，此方法也可以在受試者中使用，如作為體內(nèi)(如治療或預防)方案的一部分。
對于體內(nèi)方法，抗體或其抗原結(jié)合部位(或本發(fā)明的雙特異性或多特異性抗體)可以用于有HER2/neu相關(guān)疾病的受試者從而誘導表達HER2/neu受體的細胞的生長抑制、吞噬和/或殺滅。在一種實施方案中，可以額外給予受試者調(diào)節(jié)，如促進或抑制Fc受體如Fcα受體或Fcγ受體表達或活性的介質(zhì)，如給予受試者細胞因子。在有雙特異性和多特異性分子的治療中使用的優(yōu)選細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
本發(fā)明的分離人單克隆抗體組合物也可以用于與其它已知的治療如抗癌治療結(jié)合。
可以用本發(fā)明的方法和組合物治療(如改善)或預防的疾病包括但不局限于腫瘤發(fā)生性疾病。這些腫瘤發(fā)生性疾病包括腺癌，如唾液腺、胃和腎、乳腺癌、肺癌、鱗狀細胞癌和卵巢癌。
而另一方面，本發(fā)明為在體外或體內(nèi)檢測樣品中的HER2/neu抗原，如進行診斷HER2/neu相關(guān)疾病提供了方法。在一種實施方案中，它通過在允許抗體和HER2/meu形成復和物的條件下，將被檢驗樣品和對照樣品與本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部位位(或雙特異性或多特異性分子)接觸而完成。然后檢測(如用ELISA)兩種樣品中絡(luò)和物的形成，樣品之間絡(luò)和物形成的統(tǒng)計學顯著差異提示檢驗樣品中HER2/neu抗原的存在。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點由下面的具體描述和權(quán)利要求顯而易見。
附圖簡述

圖1是將neo盒定向插入μ1外顯子的SmaI位點的示意圖。A描繪了μ基因座的基因組結(jié)構(gòu)，涂黑的方塊表示μ外顯子。B是導向載體CmD的示意圖。C描繪了被定向的μ基因座，其中neo盒已經(jīng)插入到μ1中。
圖2，A是描繪從三種雜交瘤培養(yǎng)物1.D2，2.E8和3.F2中得到的抗HER2/neu抗體與重組HER2/neu的結(jié)合的柱形圖，由ELISA法測量；B是描繪純化抗HER2/neu抗體3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4與從腫瘤細胞脫落的HER2/neu抗原結(jié)合的柱形圖，由ELISA法測量。
圖3，A-C比較了純化人抗HER2/neu單克隆抗體(1.D2，2.E8，3.F2，1.B10和3.B4)與SKBR-3(A和B)和BT-474(C)腫瘤細胞的結(jié)合，由流式細胞儀檢測。
圖4比較了純化人抗HER2/neu單克隆抗體F(ab’)2片段(3.F2和2.E8)與腫瘤細胞(SKBR-3，BT-474和A431)的結(jié)合，由流式細胞儀檢測。
圖5，A和B描繪了純化人抗HER2/neu單克隆抗體(1.D2，2.E8，3.F2，1.B10和3.B4)對SKBR-3腫瘤細胞生長的抑制，由細胞密度測量。
圖6描繪了純化人抗HER2/neu單克隆抗體F(ab’)2片段(3.F2和2.E8)對SKBR-3腫瘤細胞生長的抑制，由細胞密度測量。
圖7，A和B描繪了純化人抗HER2/neu單克隆抗體(1.D2，1.B10，3.B4，3.F2和2.E8)和它們的F(ab’)2片段對BT-474腫瘤細胞生長的抑制，由細胞密度測量。
圖8，A和B描繪了純化人抗HER2/neu單克隆抗體(1.D2，2.E8和3.F2)介導的單核細胞對SKBR-3腫瘤細胞的抗體依賴性細胞裂解(A)；或在純化人人抗HER2/neu單克隆抗體(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4)存在下γ干擾素誘導的巨噬細胞對SKBR-3腫瘤細胞的抗體依賴性細胞裂解(B)，由Cr51釋放測量。
圖9描繪了人抗HER2/neu×抗CD89雙特異性分子(14.1×3.F2)介導的多型核細胞對SKBR-3和BT-474腫瘤細胞的抗體依賴性細胞裂解，由Cr51釋放測量。
圖10描繪了人抗HER2/neu×抗CD89雙特異性分子(14.1×3.F2)介導的單核細胞對SKBR-3和BT-474腫瘤細胞的抗體依賴性細胞裂解，由Cr51釋放測量。
圖11描繪了人抗HER2/neu×抗CD89雙特異性分子(14.1×3.F2)介導的全血對BT-474腫瘤細胞的抗體依賴性細胞裂解，由Cr51釋放而測量。
圖12是雙特異性單鏈融合分子，931和934及其母體HuMab的示意圖。931和934(w/EGF)結(jié)構(gòu)是用14.1和3F2的可變輕鏈和重鏈區(qū)產(chǎn)生。
圖13是化學結(jié)合的雙特異性分子的示意圖，由14.1和3F2(抗HER2)的Fab’段組成，作為陽性對照。
圖14(a)是表示用流式細胞儀分析所測量的在轉(zhuǎn)染瘤上清液中表達的融合蛋白931和934的篩選(結(jié)合)測定的柱形圖。轉(zhuǎn)染(931&934)和未轉(zhuǎn)染(NSO)上清液與SKBR-3或A431腫瘤細胞系一起孵育。融合蛋白的結(jié)合通過用與藻紅素結(jié)合的山羊抗人IgGfab-2染色來檢測。圖14(b)是表示融合蛋白931和934的ADCC分析的柱形圖。鉻釋放分析采用16-18小時的孵育期，效應細胞(單核細胞，PMN)與靶細胞(SKBR-3，A431)的比例為100∶1。用轉(zhuǎn)染(931&934)和未轉(zhuǎn)染(NSO)上清液介導特異裂解，檢測腫瘤細胞殺滅。
圖15(a)表示單鏈融合蛋白931和934與U937細胞的結(jié)合(用流式細胞儀測量)。一種不與U937細胞結(jié)合的抗EGF-R mAb 425的fab’片段，作為陰性對照。圖13所示的化學聯(lián)接的雙特異性分子(14.1×3.F2)作為陽性對照。圖15(b)表示單鏈融合蛋白931和934與SKBR-3細胞的結(jié)合(用流式細胞儀測量)。14.1 fab-2作為陰性對照。圖13所示的化學聯(lián)接的雙特異性分子(14.1×3.F2)再次作為陽性對照。
圖16表示單鏈融合蛋白934與A431細胞的結(jié)合(用流式細胞儀測量)。除使用了過度表達EGF-R的A431腫瘤細胞外，試驗方法與圖15所示相同。與EGF融合的包含14.1的sFv片段的融合蛋白作為陽性對照，14.1 fab-2作為陰性對照。
圖17表示PMN(效應細胞)通過單鏈融合蛋白931介導的對SKBR3(圖17(a))和BT474(圖17(b))腫瘤細胞的細胞毒作用。鉻釋放分析采用16-18小時的孵育期，效應細胞與靶細胞的比例為100∶1。每個實驗中14.1 fab-2都作為陰性對照。
圖18表示單核細胞(效應細胞)通過單鏈融合蛋白931介導的對SKBR3(圖18(a))和BT474(圖18(b))腫瘤細胞的細胞毒作用。鉻釋放分析采用16-18小時的孵育期，效應細胞與靶細胞的比例為100∶1。每個實驗中14.1 fab-2都作為陰性對照。
發(fā)明詳述本發(fā)明為治療和診斷以HER2/neu生長因子受體(這里稱作″HER2/neu″)和/或相關(guān)受體的表達，特別是過度表達為特征的疾病提供了新穎的基于抗體的治療方法。本發(fā)明的治療使用與出現(xiàn)在HER2/neu上的表位相結(jié)合的分離人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。在一種實施方案中，人抗體在非人轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生，可以通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多種HER2/neu的人單克隆抗體同種型(如IgG，IgA和/或IgE)。因此，本發(fā)明的各種方面包括抗體和抗體片段，其藥物組合物，以及非人轉(zhuǎn)基因動物，和產(chǎn)生這些單克隆抗體的B細胞和雜交瘤。本發(fā)明也包括用本發(fā)明的抗體在體外或體內(nèi)檢測表達HER2/neu或相關(guān)交叉反應生長因子受體的細胞，或抑制表達HER2/neu的細胞生長、分化和/或運動性的方法。
為更容易理解本發(fā)明，首先定義一些名詞。其它定義在詳述中逐漸闡明。
“HER2/neu”，“HER2”，“HER2/neu抗原”和“HER2/neu受體”在這里可以互換使用，包括由人erbB-2基因(也稱作HER2基因)編碼，在細胞如人腫瘤細胞表面天然出現(xiàn)的人HER2/neu受體的任何變體或同種型。這里所用的名詞“neu”，“neu抗原”和“neu受體”指大鼠中由erbB-2基因(也稱作大鼠neu基因)編碼的人Her2/neu的等價物。在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與HER2/neu抗原的結(jié)合抑制表達HER2/neu的細胞(如腫瘤細胞)生長。在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體與HER2/neu抗原的結(jié)合介導效應細胞吞噬和/或殺滅表達HER2/neu的細胞。
這里用到的名詞“抗體”指包括至少兩條由二硫鍵內(nèi)部聯(lián)接的重(H)鏈和兩條輕(L)鏈的糖蛋白。每條重鏈包括一個重鏈可變區(qū)(這里縮寫為HCVR或VH)和一個重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個結(jié)構(gòu)域，CH1，CH2和CH3。每條輕鏈包含一個輕鏈可變區(qū)(這里縮寫為LCVR或VL)和一個輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包括一個結(jié)構(gòu)域，CL。VH和VL區(qū)可以被進一步分為稱作互補決定區(qū)(CDR)的超變區(qū)，中間鑲嵌較保守一些的區(qū)域，叫做構(gòu)架區(qū)(FR)。每條VH和VL包括三個CDR和四個FR，從氨基端到羧基端以下列順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含一個與抗原相互作用的結(jié)合域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(如效應細胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一成分(Clq)的結(jié)合。
這里用到的名詞抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡稱為“抗體部分”)是指保持與抗原(如HER2/neu)特異性結(jié)合能力的抗體的一個或更多片段。已經(jīng)介紹過抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長抗體的片段來完成。在名詞抗體的“抗原結(jié)合部位”范圍內(nèi)的結(jié)合片段的例子包括(i)一個Fab片段，即包含VL，VH，CL和CH1結(jié)構(gòu)域的單價片段；(ii)一個F(ab’)2片段，即包含兩個由鉸鏈區(qū)的二硫橋連接的Fab片段的二價片段；(iii)包含VH和CH1結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(iv)包含抗體一個單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段；(v)包含一個VH結(jié)構(gòu)域的dAb片段(Ward et al，(1989)Nature 341544-546)；以及(vi)一個分離的互補決定區(qū)(CDR)。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由各自的基因編碼，它們可以用重組技術(shù)通過合成的連接體連接，合成連接體使它們可以作為單蛋白鏈產(chǎn)生，其中VL和VH區(qū)配對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv)；見Bird et al(1988)Science 242423-426；及Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883)。這種單鏈抗體也意欲包括在名詞抗體的“抗原結(jié)合部分”范圍中。這些抗體片段用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的傳統(tǒng)技術(shù)獲得，為使用而進行的片段篩選與完整抗體的方法相同。
名詞“雙特異性分子”旨在包括任何有兩個不同的結(jié)合特異性的試劑，如蛋白、肽、或蛋白或肽復合物，它們可以與(a)細胞表面抗原和(b)效應細胞表面的Fc受體結(jié)合或反應。名詞“多特異性分子”或“異特異性分子”準備包括任何有兩個以上不同的結(jié)合特異性的試劑，如蛋白、肽、或蛋白或肽復合物，它們可以與(a)細胞表面抗原和(b)效應細胞表面的Fc受體和(c)至少一個其它成分結(jié)合或反應。因此，本發(fā)明包括，但不局限于定向于細胞表面抗原如HER2/neu和效應細胞表面Fc受體的雙特異性、三特異性和其它多特異性分子。名詞“雙特異性抗體”此外還包括雙抗體(diabodies)。雙抗體是二價的、雙特異性抗體，其中的VH和VL域在單肽鏈上表達，但使用的連接體太短，不允許在同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域配對，因此迫使此結(jié)構(gòu)域與另一條鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配對并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(見Holliger，P.et al.(1993)proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448；Poljak，R.J.，et al.(1994)Structure21121-1123)。
這里用到的名詞“異抗體(heteroantibodies)”指兩個或更多抗體、抗體結(jié)合片段(如Fab)，其衍生物，或連接在一起的抗原結(jié)合區(qū)，至少其中的兩個有不同的特異性。這些不同的特異性包括對效應細胞上的Fc受體的結(jié)合特異性，以及靶細胞如腫瘤細胞上的抗原或表位的結(jié)合特異性。這里用到的名詞“人抗體”，意欲包括有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如由體外隨機或位點特異性誘變誘導的突變或體內(nèi)的體細胞突變)。然而，這里用到的名詞“人抗體”，并不準備包括CDR序列由另一種哺乳動物物種如小鼠的種系衍生而來，被移植到人的構(gòu)架序列中的抗體。
這里用到的名詞“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指單分子組成的抗體分子制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出單結(jié)合特異性和對特定表位的親和性。因此，名詞“人單克隆抗體”是指具有從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)并表現(xiàn)出單結(jié)合特異性的抗體。在一種實施方案中，人單克隆抗體由包含一個從轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中獲得的B細胞與永生化細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因小鼠有一個包含一個人類重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人類輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。
這里用到的名詞“重組人抗體”意欲包括所有用重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的人抗體，如從轉(zhuǎn)基因為人免疫球蛋白基因的動物(如小鼠)中分離的抗體(在下面的第一部分詳述)；用轉(zhuǎn)染到宿主細胞的重組表達載體表達的抗體，由重組組合人抗體文庫分離的抗體，或用其它涉及將人免疫球蛋白基因序列剪切到其它DNA序列的方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這些重組人抗體具有由人種系免疫球蛋白序列衍生的可變和恒定區(qū)。然而在某些實施方案中，這種重組人抗體經(jīng)歷了體外誘變(或，當使用轉(zhuǎn)基因為人Ig序列的動物時，體內(nèi)體細胞誘變)，因此重組抗體VH和VL區(qū)的氨基酸序列是由人種系VH和VL序列衍生并與其相關(guān)，可能在體內(nèi)并不天然存在于人抗體種系的所有組成成分。
這里用到的“異源性抗體”是與產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物相聯(lián)系而定義的。此名詞是指這樣一種抗體，它具有與存在于不包括轉(zhuǎn)基因非人動物的生物中的氨基酸序列或編碼核酸序列相對應，并一般是從轉(zhuǎn)基因非人動物以外的物種獲得的氨基酸序列或編碼核酸序列。
這里用到的“異雜合(heterohybrid)抗體”指有不同生物來源的輕鏈和重鏈的抗體。例如，有一條人重鏈與一條鼠輕鏈結(jié)合的抗體是異雜交抗體。異雜交抗體的例子包括前面討論過的嵌合的和人源化抗體。
這里用到的“分離抗體”意指基本上沒有其它具有不同抗原特異性抗體的抗體(如特異性與HER2/neu結(jié)合的分離抗體基本上沒有與HER2/neu之外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。然而特異性與人HER2/neu的表位、同種型或變體結(jié)合的分離抗體對其它相關(guān)的如來自于其它物種的生長因子受體(如HER2/neu物種同源物)可能有交叉反應性。此外，分離抗體可以基本上沒有其它細胞物質(zhì)和/或化學物質(zhì)。在本發(fā)明的一種實施方案中，有不同特異性的“分離”單克隆抗體的結(jié)合在一種明確的組合物中結(jié)合。
這里用到的“特異性結(jié)合”是指抗體與預定的抗原結(jié)合。一般，抗體以至少約1×107M-1的親和性結(jié)合，與預定抗原結(jié)合的親和性至少比與預定抗原或密切相關(guān)抗原以外的非特異性抗原(如BSA，酪蛋白)的親和性大兩倍。短語“識別一種抗原的抗體”和“對一種抗原特異性的抗體”在這里可以與名詞“特異性與抗原結(jié)合的抗體”互換使用。
這里用到的名詞對IgG抗體的“高親和性”是指至少約107M-1，優(yōu)選為約109M-1，更優(yōu)選為約1010M-1，1011M-1，1012M-1或更高，如直到1013M-1或更高的結(jié)合親和性。然而，“高親和性”結(jié)合對其它抗體同種型可以改變。例如，對IgM同種型的“高親和性”結(jié)合是指結(jié)合親和性至少為約1×107M-1。
這里用到的名詞“Kassoc”意指特定抗體-抗原相互作用的締合常數(shù)。
這里用到的名詞“Kassoc”意指特定抗體-抗原相互作用的解離常數(shù)。
這里用到的名詞“同種型”是指由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(如IgM或IgG)。
這里用到的名詞“同種型轉(zhuǎn)換”是指抗體類型或同種型從一種Ig類型轉(zhuǎn)換到另一種其它Ig類型的現(xiàn)象。
這里用到的名詞“非轉(zhuǎn)換同種型”是指在沒有發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換的情況下產(chǎn)生的重鏈同種型類型；編碼非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因一般是功能性重排的VDJ基因下游的第一個CH基因。同種型轉(zhuǎn)換被分類為經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換。經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換是通過涉及轉(zhuǎn)基因中至少一個轉(zhuǎn)換序列區(qū)的重組事件而發(fā)生的。非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換可以通過例如在人σμ和人∑μ之間的同源重組(伴δ缺失)而發(fā)生。其它非經(jīng)典轉(zhuǎn)換機制，如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間重組及其它機制，可以發(fā)生并完成同種型轉(zhuǎn)換。
這里用到的名詞“轉(zhuǎn)換序列”是指那些負責轉(zhuǎn)換重組的DNA序列?！稗D(zhuǎn)換供體”序列，一般是一個μ轉(zhuǎn)換區(qū)，將處在轉(zhuǎn)換重組過程中被去除的結(jié)構(gòu)區(qū)的5’(上游)位?！稗D(zhuǎn)換受體”區(qū)將在將被去除的結(jié)構(gòu)區(qū)和替代恒定區(qū)(如γ，ε等)之間。由于不存在重組經(jīng)常發(fā)生的特定位點，從結(jié)構(gòu)一般不能預測最終的基因序列。
這里用到的“糖基化模式”被定義為與蛋白，更具體地說是免疫球蛋白共價連接的糖單位模式。本領(lǐng)域的一種常規(guī)技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)異源抗體的糖基化模式與衍生轉(zhuǎn)基因的CH基因的物種相比，與非人轉(zhuǎn)基因動物物種的某種糖基化模式更相似時，異源抗體糖基化模式可以鑒別為基本上與非人轉(zhuǎn)基因動物物種產(chǎn)生的抗體的天然存在的糖基化模式相似。
這里使用的應用于一種對象的名詞“天然存在”是指某種對象可以在自然中發(fā)現(xiàn)。例如，可以從天然來源中分離并沒有通過人在實驗室中進行有意的修飾的生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列就是天然存在的。
這里用到的名詞“重排”是指一條重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的一種構(gòu)型，其中的V段在分別編碼基本上完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域的一種構(gòu)象中緊鄰D-J或J段。重排的免疫球蛋白基因座可以通過與種系DNA對比而識別；重排基因座將有至少一個重組的七堿基序列/九堿基序列同源元件。
這里用到的關(guān)于一個V段的名詞“未重排”或“種系構(gòu)型”是指V段未重組因此不與D或J段緊鄰的構(gòu)型。
這里用到的名詞“核酸分子”意欲包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈，但優(yōu)選雙鏈DNA。
這里用到的關(guān)于編碼與HER2/neu結(jié)合抗體或抗體部分(如VH，VL，CDR3)的核酸的名詞“分離核酸分子”，意指其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列不含編碼與HER2/neu以外的抗原結(jié)合的抗體或抗體部分的核苷酸序列的核酸分子，其它序列可以天然地出現(xiàn)在人基因組DNA核酸旁側(cè)。SEQ ID NOS1-12與包含本發(fā)明的3.F2，1.D2和2.E8人抗HER2/neu單克隆抗體的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列對應。具體地說，SEQ ID NO1和2對應3.F2抗體的VH，SEQ ID NO3和4對應3.F2抗體的VL，SEQ ID NO5和6對應1.D2抗體的VH，SEQ ID NO7和8對應1.D2抗體的VL，SEQID NO9和10對應2.E8抗體的VH，SEQ ID NO11和12對應2.E8抗體的VL。
對于核酸，名詞“基本同源”指兩個核酸或其指定序列，當最優(yōu)排列和對比時，在有適當?shù)暮塑账岵迦牒腿笔闆r下，至少約80％的核苷酸，通常至少90到95％左右，更優(yōu)選為至少98％到99.5％左右的核苷酸是相同的。另外，在選擇性雜交條件下片段與其互補鏈進行雜交時也存在基本同源。
兩個序列間的百分比同一性是一個關(guān)于序列間相同位置數(shù)量的函數(shù)(即同源％＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)×100)，考慮在最優(yōu)排列兩個序列時需要引入的缺口數(shù)量和每個缺口的長度。對比序列和判斷兩個序列的百分比同一性可以用數(shù)學算法來完成，在下面的非限制舉例中描述。
兩個核苷酸序列的百分比同一性可以用GCG軟件包(在http//www.gcg.com可以找到)中的GAP程序判斷，使用NWSgapdna.CMP矩陣，以及40，50，60，70，或80的缺口權(quán)重和1，2，3，4，5或6的長度權(quán)重。兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性也可以用引入ALIGN程序(2.0版)中的E.Meyers和W.Miller算法判斷(CABIOS，411-17(1989))，使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長度罰分為12，缺口罰分為4。此外，兩個核苷酸或氨基酸序列之間的百分比同一性也可以用引入GCG軟件包(在http//www.gcg.com可以找到)中GAP程序中的Needleman和Wunsh算法判斷(J.Mol.Biol.(48)444-453 (1970))，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及16，14，12，10，8，6或4的缺口權(quán)重和1，2，3，4，5或6的長度權(quán)重。
本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進一步用作“詢問序列”來進行對公共數(shù)據(jù)庫的搜索，如識別相關(guān)序列。這種搜索可以按Altschul，等在(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所描述的，用NBLAST和XBLAST程序(2.0版)執(zhí)行，。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序執(zhí)行，分數(shù)＝100，字長＝12，從而獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白搜索可以用XBLAST程序執(zhí)行，分數(shù)＝50，字長＝3，從而獲得與本發(fā)明的蛋白分子同源的氨基酸序列。為對比目的而獲得有缺口的排列，有缺口的BLAST可以按照Altschul等在(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中的描述來使用。當使用BLAST和有缺口的BLAST程序時，可以使用各自程序(如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov.
核酸可以在完整細胞、溶胞產(chǎn)物或部分純化或基本純凈形式中出現(xiàn)。當用包括堿/SDS處理、CsCl顯帶、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和其它本領(lǐng)域中公知的標準技術(shù)將核酸從其它細胞成分或其它污染物如其它細胞的核酸或蛋白中純化出來時，核酸就是“分離的”或“表現(xiàn)為基本純凈”。見F.Ausubel，et al.Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987)。
來自cDNA，基因組成混合物的本發(fā)明的核酸組合物盡管通常是天然序列(除修飾的限制位點等)，但可以依照標準技術(shù)進行突變而提供基因序列。對于編碼序列，這些突變可以按照需要影響氨基酸序列。具體而言，本發(fā)明考慮了與天然V，D，J，恒定區(qū)，轉(zhuǎn)換區(qū)和其它類似序列同源或由其衍生的DNA序列(“衍生”表示一個序列與另一個序列相同或由其修飾而來)。
當核酸與另一個核苷酸序列產(chǎn)生功能關(guān)系時，就被“可操作連接”。例如，如果啟動子或增強子影響一個編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就被可操作連接到該序列。對于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，可操作連接表示被連接的DNA序列是鄰接的并且對連接讀框中的兩個鄰接的蛋白編碼區(qū)是必要的。對于轉(zhuǎn)換序列，可操作連接提示該序列可以影響轉(zhuǎn)換重組。
這里用到的名詞“載體”意指可以將核酸轉(zhuǎn)運到與其連接序列的核酸分子。載體的一種類型是“質(zhì)?！?，指可以將外來的DNA片段連接到其中的雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中的外來DNA分子可以與病毒基因組連接。某些載體可以在其引入的宿主細胞中自動復制(如有細菌復制起源的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(如非附加型哺乳動物載體)可以在導入宿主細胞時整合到宿主細胞的基因組中，與宿主基因組一起復制。此外，某些載體可以指導與其可操作連接的基因的表達。這種載體在這里被稱作“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)?？偟恼f來，應用在重組DNA技術(shù)中的表達載體通常以質(zhì)粒形式存在。在本詳述中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常使用的載體。然而，本發(fā)明意欲包括有相同功能的載體的其它表達形式，如病毒載體(如復制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒)。
這里用到的名詞“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)意指重組表達載體引入的細胞。必須理解這些名詞并不僅指特定受試細胞，也指這些細胞的后代。由于突變或環(huán)境影響可能在后代中出現(xiàn)某些修飾，這些后代實際上可能不會與母體細胞相同，但仍然包括在這里用到的名詞“宿主細胞“的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的各種方面在下面的部分中有進一步詳述。I.人HER2/neu抗體的產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體(mAbs)可以用多種技術(shù)產(chǎn)生，包括傳統(tǒng)單克隆抗體方法學如Kohler和Milstein標準體細胞雜交技術(shù)，Nature256495(1975)。盡管優(yōu)選體細胞雜交技術(shù)，原則上也可以使用其它產(chǎn)生單克隆抗體的技術(shù)，如B淋巴細胞病毒或癌基因轉(zhuǎn)化。
制備雜交瘤的優(yōu)選動物系統(tǒng)為鼠系統(tǒng)。小鼠中的雜交瘤產(chǎn)生是一個完善的程序。分離用于融合的免疫脾細胞的方案和技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。融合對象(如免疫骨髓瘤細胞)及融合程序也是公知的。
在一種優(yōu)選實施方案中，針對HER2/neu的人單克隆抗體可以用攜帶部分人免疫系統(tǒng)而不是小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因小鼠，這里稱作“HuMab”，包含一個編碼未重排人重鏈(μ和γ)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微基因座，以及滅活內(nèi)源性γ和κ鏈基因座的靶突變(Lonberg，N.Et al.(1994)Nature368(6474)856-859)。因此，此小鼠顯示小鼠IgM或κ的表達減少，并且由于免疫應答，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷了類型轉(zhuǎn)換和體細胞突變而產(chǎn)生高親和性人IgGκ單克隆抗體(Lonberg，N et al.(1994)，supra；綜述于Lonberg，N.(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 11349-101；Lonberg N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93，和Harding，F(xiàn).And Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Aci 764536-546)。HuMab小鼠的制備在下面的第II部分和以下文獻中有詳細描述，Taylor，L.Et al.(1992)Nucleic Acids Research 206287-6295；Chen，J，et al.(1993)International Immunology 5647-656；Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 903720-3724；Choi et al.(1993)Nature Genetics 4117-123；Chen J.et al.(1993)EMBO J.12821-830；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.1522912-2920；Lonberg et al.，(1994)Nature368(6474)856-859；Lonberg，N.9(1994)Handbook ofExperience Pharmacology 11349-101；Taylor，L.Et al.(1994)International Immunology 6；579-591；Lonberg，N.And Hszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.1365-93；Harding，F(xiàn).and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764536-546；Fishwild，D.Et al.(1996)Nature Biotechnology 14845-851，在此完整引入其全部內(nèi)容作為參考。還可進一步參考美國專利5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；and 5,770,429；都屬于Lonberg and kay，and GenPharm Internatiomal；美國專利No.5,545,807，屬于Surani et al.；國際公開WO98/24884，公開于1998年6月11日；WO94/25585，出版于1994年11月10日；WO93/1227，出版于1993年6月24日；WO92/22645，出版于1992年12月23日；WO92/03918，出版于1992年3月19日，在此完整引入其公開內(nèi)容作為參考。另外，例2中描述的HCO12轉(zhuǎn)基因小鼠可以用來產(chǎn)生人抗HER2/neu抗體。HuMab免疫為完整地產(chǎn)生人HER/neu單克隆抗體，HuMab小鼠可以用HER2/neu的純化或富集制劑和/或表達HER2/neu的細胞免疫，如下面的文件中所描述，Lonberg N.et al.(1994)Nature 368(6474)856-859；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology 14845-851及WO98/24884。小鼠優(yōu)選在首次融合時為6-16周齡，HER2/neu抗原的純化或富集制劑(5-20μg)可以用來腹膜內(nèi)免疫HuMab小鼠。當用HER2/neu的純化或富集制劑免疫不產(chǎn)生抗體時，也可以用表達HER2/neu的細胞如腫瘤細胞來免疫小鼠，從而促進免疫應答。
用不同試劑積累的經(jīng)驗表明，當先用與完全弗氏佐劑混合的抗原進行腹膜內(nèi)(IP)免疫，然后每隔一周(最多共6周)用與不完全弗氏佐劑混合的抗原進行腹膜內(nèi)免疫，HuMab轉(zhuǎn)基因小鼠有最好的免疫應答。免疫應答可以用免疫方案過程中由眼眶后取血得到的血漿樣品監(jiān)測。血漿可以用ELISA(如下面所描述)法篩選，有足夠抗HER2/neu人免疫球蛋白滴度的小鼠可以用來融合?？梢栽谔幩阑蛉コ⑴K之前對小鼠進行靜脈內(nèi)加強免疫。預計每種抗原需要進行2-3個融合。每種抗原需要免疫6只小鼠。例如，可以免疫總共12只HC07和HC012株的HuMab小鼠。產(chǎn)生人Her2/neu單克隆抗體的雜交瘤的生成小鼠脾細胞可以根據(jù)標準實驗方案(8，13)進行分離并用PEG與小鼠骨髓瘤細胞系融合。然后為產(chǎn)生抗原特異性抗體對產(chǎn)生的雜交瘤進行篩選。例如將從免疫小鼠得到的脾淋巴細胞單細胞懸液與P3X63-Ag8，653非分泌性小鼠骨髓瘤細胞(ATCC，CRL 1580)數(shù)量的1/6用50％的PEG進行融合。將大約2×105個細胞平鋪在平底微型滴定板，然后在包含20％胎克隆血清，18％“653”條件培養(yǎng)液，5％origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM L～谷氨酰胺1mM丙酮酸鈉，5mMHEPES，0.055mM 2-巰基乙醇，50單位/ml青霉素，50mg/ml鏈霉素，50mg/ml慶大霉素和1X HAT(Sigma；融合后24小時加入HAT)的選擇性培養(yǎng)基中孵育。兩周后，在HT替代HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。然后對每個加樣孔用ELISA法篩選人抗HER2/neu的IgM和IgG抗體。一旦雜交瘤廣泛生長，通常在10-14天后觀察培養(yǎng)基。重新平鋪抗體分泌性雜交瘤，再次篩選，如果仍然為人IgG抗Her2/neu單克隆抗體陽性，可以通過有限稀釋進行至少兩次亞克隆。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆從而組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量抗體從而進行鑒定。鑒定人單克隆抗體與HER2/neu的結(jié)合為鑒定本發(fā)明的人單克隆HER2/neu抗體的結(jié)合，可以用如ELISA法檢驗免疫小鼠血清。簡單地說，用PBS中0.25μg/ml的純化HER2/neu包被微型滴定板，然后用溶于PBS的5％牛血清白蛋白(BSA)封閉。將HER2/neu免疫小鼠的血漿稀釋液加入每個加樣孔并在37℃孵育1-2小時。用PBS/Tween漂洗微型滴定板，然后用堿性磷酸酶連接的山羊抗人IgG Fc特異性多克隆試劑在37℃孵育1小時。在漂洗后，將微型滴定板用pNPP底物(1mg/ml)顯色，在405-650的OD值下分析。優(yōu)選使用顯色最高滴度的小鼠進行融合。
或者，用小鼠抗Her2/neu抗體包被微型滴定板，在5％的BSA中封閉，用表達HER2/neu的過度生長細胞如SKBR-3腫瘤細胞培養(yǎng)物上清液孵育，從而獲得HER2/neu抗原。將純化人抗HER2/neu抗體稀釋液加入每個加樣孔，孵育，并按上述方法檢測結(jié)合。
上述ELISA分析也可用來篩選抗體，這樣，也可篩選產(chǎn)生與HER2/neu免疫原有陽性反應的抗體的雜交瘤。以高親和力與HER2/neu結(jié)合的雜交瘤將被亞克隆并進一步鑒定。保持母體反應性的每個雜交瘤的一個克隆(通過ELISA)可以選作在-140℃儲存的5-10小管細胞庫，用于抗體純化。
為純化人抗HER2/neu抗體，選定的雜交瘤可以在2升的滾瓶中生長，準備進行抗體純化。在用蛋白A-瓊脂糖(Pharmacia，piscataway，NJ)進行親和層析之前過濾并濃縮上清液?？梢杂媚z電泳檢查洗脫的IgG并用高壓液相層析保證純度。緩沖液可以交換為PBS，濃度可以采用1.43的消光系數(shù)由OD280判斷。單克隆抗體可以被等分并在-80℃下儲藏。
為判斷選定的人抗HER2/neu單克隆抗體是否與唯一的表位結(jié)合，可以用能夠買到的試劑(Pierce，Rockford，IL)生物素化每種抗體?？梢杂蒙鲜鯤ER2/neu包被的ELISA板進行未標記單克隆抗體和生物素化單克隆抗體競爭實驗。生物素化mAb可以用鏈親和素堿性磷酸酶探針檢測。
為判斷純化抗體的同種型，可以進行同種型ELISA。用10μg/ml抗人Ig包被微型滴定板的加樣孔在4℃下過夜。用5％BSA終止后，將微型滴定板與10μg/ml的單克隆抗體或純化同種型對照在室溫下反應2小時。然后將加樣孔與人IgG1或人IgM特異性堿性磷酸酶結(jié)合探針反應。按前面描述的方法進行顯影和分析。
為證明單克隆抗體與表達HER2/neu的活細胞結(jié)合，可以使用流式細胞儀。簡言之，將表達HER2/neu的細胞系(在標準生長條件下生長)在包含0.1％Tween80和20％小鼠血清的PBS中與不同濃度的單克隆抗體混合，在37℃下孵育1小時。經(jīng)過漂洗，在與一級抗體染色相同的條件下將細胞與熒光素標記的抗人IgG抗體反應。FACScan儀可以利用光和散射屬性來控制單個細胞從而分析樣品。另一種使用熒光顯微鏡的測定可以(補充或替代)流式細胞儀測定?？梢杂们懊婷枋龅姆椒▽毎旧⒂脽晒怙@微鏡檢測。這種方法允許看到單個細胞，但根據(jù)抗體密度可能會有敏感度減低。
可以通過蛋白印跡法進一步檢驗抗HER2/neu人IgG與HER2/neu抗原的反應性。簡言之，可以制備表達HER2/neu的細胞的細胞提取物并進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳。在電泳之后，可以將分開的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用20％的小鼠血清封閉，并與被檢驗單克隆抗體探針反應?？梢杂每谷薎gG堿性磷酸酶及BCIP/NBT底物片(Sigma chem.Co.，St.Louis，MO)顯影檢測人IgG結(jié)合。人HER2/neu單克隆抗體的吞噬和細胞殺滅活性除了與HER2/neu特異性結(jié)合，人HER2/neu單克隆抗體介導吞噬和殺滅表達HER2/neu的細胞的能力也可以被檢驗。體外單克隆抗體活性檢驗將提供檢驗體內(nèi)模型前的初步篩選。簡言之，從健康供體得到的多型核細胞(PMN)或其它效應細胞(如IFN-誘導的巨噬細胞)可以用Ficoll Hypaque密度離心純化，然后進行污染紅細胞裂解。洗滌過的PMN可以以不同的效應細胞和腫瘤細胞比例(E∶T)懸浮在補加10％熱滅活胎牛血清并與51Cr標記的HER2/neu表達細胞混合的RPMI中。然后加入不同濃度的純化人抗HER2/neu IgG。不相關(guān)的人IgG可以作為陰性對照。檢驗可以在37℃下進行4-16小時。可以通過測量釋放到培養(yǎng)物懸浮液中的51Cr來檢驗樣品的細胞裂解。也可以將抗HER2/neu單克隆抗體互相結(jié)合測量，以便判斷多種單克隆抗體是否可以加強細胞裂解。
也可以在體內(nèi)模型中(如在小鼠中)檢驗與HER2/neu結(jié)合的人單克隆抗體，判斷它們介導吞噬和殺滅表達HER2/neu的細胞如腫瘤細胞的效力。例如，這些抗體可以按以下標準選擇，這些標準并不是唯一的1.)與表達HER2/neu的活細胞結(jié)合。
2.)與HER2/neu結(jié)合的高親和性。
3.)與HER2/neu上的唯一表位結(jié)合(排除以組合形式使用的有互補活性的單克隆抗體將競爭相同表位的可能性)；4.)對表達HER2/neu細胞的調(diào)理作用。
5.)在人效應細胞存在時介導對表達HER2/neu細胞的生長抑制、吞噬和/或殺滅。
6.)在與HER2/neu結(jié)合后被表達HER2/neu的細胞內(nèi)化。
本發(fā)明的優(yōu)選人單克隆抗體符合一個或更多，優(yōu)選符合所有的標準。在一種特定的實施方案中，人單克隆抗體以組合形式應用，如作為包括兩個或更多抗Her2/neu單克隆抗體或其片段的藥物組合物。例如，有不同但互補活性人抗HER2/neu單克隆抗體可以在單個治療方法中結(jié)合，從而達到需要的治療或診斷效果。這種組合的一個例子是一種組合物，它包含介導在效應細胞存在時高效殺滅靶細胞的抗HER2/neu人單克隆抗體，并與另一種抑制表達HER2/neu的細胞生長的人抗HER2/neu單克隆抗體結(jié)合。II.產(chǎn)生人單克隆抗HER/neu抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物的產(chǎn)生而另一方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因非人動物，如可以表達與HER2/neu特異性，優(yōu)選以高親和性結(jié)合的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一種優(yōu)選實施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠(HuMab小鼠)，有一個包含一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。在一種實施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠用HER2/neu抗原的純化或富集制劑和/或表達HER2/neu的細胞免疫。轉(zhuǎn)基因非人動物如轉(zhuǎn)基因小鼠優(yōu)選可以通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生人HER2/neu單克隆抗體的多種同種型(如IgG，IgA和/或IgE)。同種型轉(zhuǎn)換可以通過經(jīng)典或非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換而發(fā)生。
設(shè)計以異源抗體所有組成成分并應答外來抗原刺激的轉(zhuǎn)基因非人動物要求包含在轉(zhuǎn)基因動物中的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細胞產(chǎn)生過程中正確行使功能。在一種優(yōu)選實施方案中，異源重鏈轉(zhuǎn)基因的正確功能包括同種型轉(zhuǎn)換。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因是為產(chǎn)生同種型轉(zhuǎn)換和下列內(nèi)容的一項或多項而建立的(1)高水平和細胞類型特異性表達，(2)功能基因重排，(3)激活并應答等位基因排斥，(4)表達足夠的初級組成成分，(5)信號轉(zhuǎn)導，(6)體細胞超變，和(7)免疫應答中轉(zhuǎn)基因抗體基因座的顯性化。
并不是前面的標準都需要滿足。例如，在那些轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源性免疫球蛋白基因座被功能性破壞的實施方案中，轉(zhuǎn)基因不需要激活等位基因排斥。此外，在轉(zhuǎn)基因包含一個功能性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的實施方案中，不需要第二條標準的功能基因重排，至少對于已經(jīng)重排的轉(zhuǎn)基因時如此。分子免疫學的背景知識可以參考fundamental Immunology，2ndedition(1989)，Paul WilliamE.，ed.Raven press，N.Y.，在此引入作為參考。
在某些實施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物包含重排、未重排或重排和未重排結(jié)合的轉(zhuǎn)基因動物種系中的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因。每個重鏈轉(zhuǎn)基因包含至少一個CH基因。另外，重鏈轉(zhuǎn)基因可包含能夠支持編碼轉(zhuǎn)基因動物B細胞中的多個CH基因的異源性轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換功能的同種型轉(zhuǎn)換序列。這些轉(zhuǎn)換序列可以在作為轉(zhuǎn)基因CH基因來源的物種的種系免疫球蛋白基因座中天然存在，或者這些轉(zhuǎn)換序列可以從得到轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的物種(轉(zhuǎn)基因動物)中的序列衍生而來。例如，如果摻入與小鼠重鏈基因座中天然存在的序列相同的轉(zhuǎn)換序列，用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的人轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生更高頻率的同種型轉(zhuǎn)換事件，正如假設(shè)的那樣，小鼠轉(zhuǎn)換序列優(yōu)先與小鼠轉(zhuǎn)換重組酶系統(tǒng)作用，而人轉(zhuǎn)換序列則不是。轉(zhuǎn)換序列可以用傳統(tǒng)克隆方法分離和克隆，或可以按照已發(fā)表的免疫球蛋白轉(zhuǎn)換區(qū)序列相關(guān)序列信息從重疊合成寡核苷從頭合成(Millset al.，Nucl.Acids Res.15；7305-7316(1991)；Sideras et al.，Intl.Immunol.1631-642(1989)，在此引入作為參考)。對于前面的每種轉(zhuǎn)基因動物，可以在轉(zhuǎn)基因動物很大比例的B細胞(至少10％)中發(fā)現(xiàn)功能性重排的異源性重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因包括一個含有編碼至少一個可變基因片段、一個多樣性基因片段、一個連接基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段的DNA的重鏈轉(zhuǎn)基因。免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因含有編碼至少一個可變基因片段、一個連接基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片段的DNA。編碼輕鏈和重鏈基因片段的基因片段與衍生它們的轉(zhuǎn)基因非人動物是異源性的，或者說它們與不包括轉(zhuǎn)基因非人動物的物種中編碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因片段的DNA相對應。在本發(fā)明一個方面，轉(zhuǎn)基因的結(jié)構(gòu)使單個基因片段未重排，或不重排，這樣來編碼一個功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈。這種未重排的轉(zhuǎn)基因支持在暴露于HER2/neu抗原時V，D和J基因片段(功能性未重排)重排并優(yōu)選支持D區(qū)基因的全部或部分摻入轉(zhuǎn)基因非人動物中得到的未重排免疫球蛋白重鏈。
在另一種實施方案中，轉(zhuǎn)基因包含一個未重排“微基因座”。這樣的轉(zhuǎn)基因一般包含C，D和J片段的基本部分和V基因片段的亞型。在這種轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)中，不同的調(diào)節(jié)序列，如啟動子、增強子、類型轉(zhuǎn)換區(qū)、RNA加工的剪切供體和剪切受體、重組信號等，包含從異源性DNA衍生的對應序列。這些調(diào)節(jié)序列可以從摻入與本發(fā)明使用的非人動物相同或相關(guān)物種得到的轉(zhuǎn)基因。例如，人免疫球蛋白基因片段可以在轉(zhuǎn)基因中與嚙齒類動物免疫球蛋白增強子序列結(jié)合用于轉(zhuǎn)基因小鼠。另外，合成的調(diào)節(jié)序列可以摻入轉(zhuǎn)基因，其中這種合成調(diào)節(jié)序列與已知的哺乳動物基因組中天然存在的功能性序列不同源。合成調(diào)節(jié)序列是根據(jù)共有序列規(guī)則而設(shè)計的，例如那些指定剪切受體位點或啟動子/增強子基序的允許序列的規(guī)則。例如，包含與天然存在的種系Ig基因座相比，具有一個非必需DNA部分(如間插序列；內(nèi)含子或其部分)至少一個內(nèi)部(即不在該部分的末端)缺失的基因組免疫球蛋白基因座的一部分的微基因座。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案中，用于產(chǎn)生人HER2/neu抗體的包含至少一個，一般2-10個，有時25-50或更多拷貝的WO98/24884例12所描述的轉(zhuǎn)基因(如pHC1或pHC2)的轉(zhuǎn)基因動物與含有WO98/24884例5，6，8或14所描述輕鏈轉(zhuǎn)基因的一個拷貝的轉(zhuǎn)基因動物雜交，其后代與WO98/24884例10所描述的JH缺失動物雜交，在此特意引入其內(nèi)容作為參考。對于這三種性狀的每一種，動物都雜交到純合型。這些動物有如下基因型單拷貝(每單套染色體)的人重鏈未重排微基因座(在WO98/24884例12中有描述)，單拷貝(每單套染色體)的重排人K輕鏈結(jié)構(gòu)(在WO98/24884例14中有描述)，以及在每個內(nèi)源性小鼠重鏈基因座去掉所有功能性JH片段的一個缺失(在WO98/24884例10中有描述)。這種動物與對于JH片段缺失為純合型的小鼠(WO98/24884例10)雜交，產(chǎn)生對JH缺失為雜合子(WO98/24884例10)且對人重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)為半合子的后代。給得到的動物注射抗原并用來產(chǎn)生抗這些抗原的人單克隆抗體。
從這種動物分離的B細胞對于人重鏈和輕鏈是單特異性的，因為它們只包含每個基因的一個拷貝。此外，它們對于人或小鼠重鏈將是單特異性的，因為內(nèi)源性小鼠重鏈基因拷貝由于WO98/24884例9和12介紹的跨JH缺失而都是非功能性的。此外，B細胞的絕大部分對于人或鼠輕鏈是單特異性的，因為單拷貝重排人κ輕鏈基因的表達將在絕大部分B細胞中等位和同種型排斥內(nèi)源性小鼠κ和λ鏈基因的重排。
優(yōu)選實施方案的轉(zhuǎn)基因小鼠的很大組成部分將產(chǎn)生免疫球蛋白，理想的是基本與天然小鼠相同。這樣，例如在內(nèi)源性Ig基因被滅活的實施方案中，總免疫球蛋白水平將從血清0.1到10mg/ml左右，優(yōu)選0.5到5mg/ml，最理想至少為1.0mg/ml左右。當一個可以實現(xiàn)將IgM轉(zhuǎn)換到IgG的轉(zhuǎn)基因被引入轉(zhuǎn)基因小鼠時，成年小鼠血清IgG與IgM的比例優(yōu)選10∶1左右。IgG與IgM的比例在未成熟小鼠中將低得多?？偟恼f來，大于10％，優(yōu)選40-80％的脾和淋巴結(jié)B細胞專門表達人IgG蛋白。
全部組成理想近似于非轉(zhuǎn)基因小鼠，通常至少10％，優(yōu)選25％到50％或更多。一般說來，至少將產(chǎn)生約1000個不同的免疫球蛋白(理想為IgG)，優(yōu)選104到106或更多，將主要由引入小鼠基因組不同V，J和D的區(qū)的數(shù)量決定。這些免疫球蛋白一般將識別一半或更多高抗原性的蛋白，如葡萄球菌蛋白A。一般，免疫球蛋白將顯示對預選抗原至少約107M-1，優(yōu)選至少約109M-1，更優(yōu)至少1010M-1，1011M-1，1012M-1或更高，如最高到1013M-1或更高的親和性。
在一些實施方案中，可能優(yōu)選產(chǎn)生有預定所有組成成分的小鼠來限制在對出現(xiàn)在預定抗原類型的抗體應答中的V基因選擇。有預定所有組成成分的重鏈轉(zhuǎn)基因可以包含例如在人預定抗原類型的抗體應答中優(yōu)選使用的人VH基因。另外，一些VH可能由于各種原因從定義的所有組成成分中被排除(如，不太可能編碼對預定抗原的高親和性V區(qū)；進行體細胞突變和親和性銳減(affinity sharpening)的傾向性?。换?qū)μ囟ㄈ巳菏敲庖咴缘?。這樣，在包含各種重鏈或輕鏈基因片段的轉(zhuǎn)基因重排之前，這些基因片段可以通過如雜交或DNA測序被輕易識別為是從轉(zhuǎn)基因動物以外的生物中得到。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因小鼠可以按前面所描述的用HER2/neu抗原的富集或純化制劑和/或表達HER2/neu的細胞免疫。此小鼠將產(chǎn)生通過轉(zhuǎn)基因內(nèi)轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換)進行類型轉(zhuǎn)換并表達與HER2/neu反應的免疫球蛋白的B細胞。這些免疫球蛋白可以是人序列抗體，其中重鏈和輕鏈多肽由可能包括體細胞突變和V區(qū)重組結(jié)合衍生的序列和種系編碼序列的人轉(zhuǎn)基因序列編碼；盡管由于體細胞突變和不同V-J和V-D-J重組結(jié)合可能出現(xiàn)其它非種系序列，這些人序列免疫球蛋白可以稱作與由人VL或VH基因片段和人JL或JH片段編碼的多肽序列基本等同。對于這樣的人序列抗體，每條鏈的可變區(qū)一般至少80％由人種系V，L，在重鏈中為D基因片段編碼；通常至少85％的可變區(qū)由轉(zhuǎn)基因中出現(xiàn)的人種系序列編碼；經(jīng)常90％或95％或更多的可變區(qū)由轉(zhuǎn)基因中出現(xiàn)的人種系序列編碼。然而，由于非種系序列由體細胞突變和VJ和VDJ結(jié)合而引入，人序列抗體將經(jīng)常有一些不像在小鼠種系中的人轉(zhuǎn)基因那樣由人V，D，或J基因片段編碼的可變區(qū)序列(恒定區(qū)序列少一些)。典型說來，這些非種系序列(或單個核苷酸位點)將在CDR或其附近，或在已知體細胞突變簇集的區(qū)域簇集。
與預定抗原結(jié)合的人序列抗體可以從同種型轉(zhuǎn)換得到，這樣就產(chǎn)生了包含一個人序列γ鏈(如γ1，γ2a，γ2B，或γ3)和一個人序列輕鏈(如K)的人抗體。作為親和突變和抗原選擇B細胞的結(jié)果特別是作為二級(或在后)抗原攻擊的結(jié)果，這種同種型轉(zhuǎn)換人序列抗體通常包含一個或多個體細胞突變，一般是在可變區(qū)出現(xiàn)并經(jīng)常在CDR的10個殘基內(nèi)。這些高親和性人序列抗體可以有至少約1×109M-1，一般最少5×109M-1，優(yōu)選高于1×1010M-1，并且有時5×1010M-1到1×1011M-1或更高的結(jié)合親和性。
本發(fā)明的另一方面涉及從這些小鼠中得到的B細胞，它們可以用來產(chǎn)生表達以高親和性(如大于2×109M-1)與HER2/neu結(jié)合的人單克隆抗體。這樣，在本發(fā)明的另一種實施方案中，這些雜交瘤被用來產(chǎn)生包含一個對HER2/neu的親和常數(shù)(Ka)至少為2×109M-1的免疫球蛋白的組合物，其中的上述免疫球蛋白包含一個包含如下成分的人序列輕鏈(1)有一個與由人VL基因片段和一個人JL基因片段編碼的多肽序列基本等同的多肽序列的輕鏈可變區(qū)，及(2)有一個與由人CL基因片段編碼的多肽序列基本等同的多肽序列的輕鏈恒定區(qū)；及一個包含如下成分的人序列重鏈(1)有一個與由人VH基因片段，優(yōu)選D區(qū)和一個人JH基因片段編碼的多肽序列基本等同的多肽序列的重鏈可變區(qū)，及(2)有一個與由人CH基因片段編碼的多肽序列基本等同的多肽序列的重鏈恒定區(qū)。
對HER2/neu高親和性的人單克隆抗體的產(chǎn)生可以用一種在具有一個包含整合人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因小鼠中擴展人可變區(qū)基因片段所有所有組成成分的方法來促進，上述方法包括將一個包含在上述整合人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因中不出現(xiàn)的V區(qū)基因片段的V基因轉(zhuǎn)基因引入基因組。通常，V區(qū)轉(zhuǎn)基因是一個包含人VH或VL(VK)基因片段排列的一部分的酵母人工染色體，可能在人基因組中天然存在或可能用重組方法分別剪切在一起，可能包括無序或省略V基因片段。通常YAC包括至少5個或更多功能性V基因片段。在這種變異中，可以產(chǎn)生用V所有組成成分擴展方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠，其中此小鼠表達包含一個由在V區(qū)轉(zhuǎn)基因出現(xiàn)的V區(qū)基因片段編碼的可變區(qū)序列和在人Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的C區(qū)的免疫球蛋白鏈。通過V所有組成成分擴展方法，可以產(chǎn)生至少有5個不同V轉(zhuǎn)基因小鼠；可以產(chǎn)生包含至少24個或更多V基因的小鼠。一些V基因片段可以是非功能性的(如偽基因等)；這些片段可以保留或如果需要，可以由熟練的技術(shù)人員用重組方法去除。
當小鼠種系被加工為含有一個具有擴展V片段所有組成成分，基本上在包含J和C基因片段的人Ig轉(zhuǎn)基因中不出現(xiàn)的功能性YAC時，這種特性可以被繁殖并雜交到其它遺傳背景，包括有一個擴展V片段所有組成成分的功能性YAC雜交到有不同人Ig轉(zhuǎn)基因的小鼠種系所在的背景。有一個擴展V片段所有組成成分的多功能性YAC可以雜交到一個種系而與一種人Ig轉(zhuǎn)基因(或多種人Ig轉(zhuǎn)基因)一起作用。盡管這里稱作YAC轉(zhuǎn)基因，這些轉(zhuǎn)基因在整合到基因組時可能基本缺乏酵母序列，如酵母中自主復制必需的序列；這些序列可以在酵母中復制后而不再必要時(即在引入小鼠ES細胞或小鼠前受精卵)由基因工程選擇性地去除(如限制性消化和脈沖電場凝膠電泳或其它適當方法)。繁殖人序列免疫球蛋白表達特性的方法，包括雜交具有人Ig轉(zhuǎn)基因，也可選擇將具有擴展V片段所有組成成分的YAC的轉(zhuǎn)基因小鼠。VH和VL基因片段都可在YAC上出現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因小鼠可以雜交到實施者希望的任何背景，包括攜帶其它人轉(zhuǎn)基因，包括人Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其它人淋巴細胞蛋白的轉(zhuǎn)基因的背景。本發(fā)明也提供了由具有擴展的V區(qū)所有組成成分的YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的高親和性人序列免疫球蛋白。盡管前面描述了本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選實施方案，但本發(fā)明也考慮了其它實施方案，可以分為4類I.包含一個未重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；II.包含一個未重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；III.包含一個重排重鏈和未重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；IV.包含一個重排重鏈和重排輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；在這些轉(zhuǎn)基因動物分類中，優(yōu)選的優(yōu)先順序為II＞I＞III＞IV，其中內(nèi)源性輕鏈基因(或至少K基因)通過同源重組(或其它方法)被剔除，以及I＞II＞III＞IV，其中內(nèi)源性輕鏈基因沒有被剔除并且必需由等位排斥顯性化。III.與HER2/neu結(jié)合的雙/多特異性分子而在本發(fā)明的另一種實施方案中，人HER2/neu單克隆抗體(或其抗源結(jié)合部分，或其單鏈抗體)被衍生或連接到另一個功能性分子如另一種抗體或抗體片段(包括單鏈抗體和Fab’抗體片段)或蛋白配體，產(chǎn)生與多個結(jié)合位點或靶表位結(jié)合的雙或多特異性分子。
在一種特定的實施方案中，本發(fā)明提供了一種雙特異性分子，它包括含有人單克隆抗HER2/neu抗體(或其抗原結(jié)合部分，或其單鏈抗體)的第一部分，它與一個與Fc受體，一般是FcδRI或FcαR(圖12)相結(jié)合的第二抗體(或其抗原結(jié)合部分，或其單鏈抗體)功能性連接(如通過化學偶聯(lián)，基因融合，非共價締合或其它方式)。本發(fā)明進一步提供了還包括一個與HER2/neu以外的腫瘤細胞抗原如EGF-R相結(jié)合的第三部分。在一種特定的實施方案種，第三部分為EGF。這樣，本發(fā)明的特定多特異性分子包含一個與連接到EGF的抗FcR抗體(或其抗原結(jié)合部分，或其單鏈抗體)相連接的人HER2/neu抗體(或其抗原結(jié)合部分或其單鏈抗體)。(圖12)。
因此，本發(fā)明包括含有至少一個對HER2/neu的第一結(jié)合特異性和一個對第二個靶表位有第二結(jié)合特異性的雙特異性和多特異性分子。在本發(fā)明的一種特定實施方案中，第二靶表位是Fc受體，如人FcδRI或Fcα受體。所以，本發(fā)明包括與表達FcγR，F(xiàn)cαR或FcεR的效應細胞(如單核細胞、巨噬細胞或多型核細胞(PMNs))和表達HER2/neu的靶細胞都可以結(jié)合的雙和多特異性分子。這種雙和多特異性分子將表達HER2/neu的細胞導向到效應細胞，并激發(fā)Fc受體介導的效應細胞活性，如吞噬表達HER2/neu的細胞，抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)，細胞因子釋放或產(chǎn)生超氧陰離子。
除了抗Fc結(jié)合特異性和抗HER2/neu結(jié)合特異性，本發(fā)明的雙和多特異性分子可以進一步包括一個對HER2/neu以外的靶結(jié)合特異性，也稱作“抗增強因子”。例如，第三結(jié)合特異性可以與涉及細胞毒活性的細胞表面蛋白相結(jié)合，并因此增加對靶細胞的免疫應答。第三結(jié)合特異性可以是抗體(包括ScFv)，功能性抗體片段或與某種分子如抗原或受體結(jié)合的配體，結(jié)果是增強了Fc受體或靶細胞抗原的結(jié)合決定簇的作用。第三結(jié)合特異性或“抗增強因子部分”也可以與一個Fc受體或靶細胞抗原結(jié)合。另外，抗增強因子部分結(jié)合的實體可以不同于第一和第二結(jié)合特異性所結(jié)合的實體。例如，抗增強因子部分可以與細胞毒T細胞(如通過CD2，CD3，CD8，CD28，CD4，CD40，ICAM-1或其它對靶細胞產(chǎn)生增強的免疫應答的免疫細胞)結(jié)合。
在一種實施方案中，本發(fā)明的雙和多特異性分子至少包含一個抗體，或一個其抗體片段，包括如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2FV或單鏈FV結(jié)合特異性。此抗體也可以是輕鏈或重鏈二聚體，或任何其微型片段如Fv或如Ladner等在1990年8月7日授權(quán)的美國專利4,946,778中描述的單鏈結(jié)構(gòu)，特意引入其內(nèi)容作為參考。
在另一種實施方案中，本發(fā)明的雙和多特異性分子包含(a)一個抗HER2/neu的人單克隆抗體(如這里描述的抗體3.F2)，或其抗體片段，包括如一個Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或一個單鏈Fv，和(b)一個抗效應細胞表面出現(xiàn)的FcγR或FcαR(如這里描述的抗體14.1)的人單克隆抗體，或其抗體片段，包括如一個Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)v或一個單鏈Fv。優(yōu)選地，人抗Fc抗體在與效應細胞結(jié)合時不被人IgG或IgA阻斷。
這里用到的名詞“IgG受體”是指染色體1上8個γ鏈基因的任何一個。這些基因編碼被分為三種Fcγ類型FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)的總共12個跨膜或可溶受體同種型。在一種優(yōu)選實施方案中，F(xiàn)cγ受體是一個人高親和性FcγRI。人FcγRI是一個72kD的分子，它表現(xiàn)對單體IgG的高親和性(108-109M-1)。
這些優(yōu)選單克隆抗體的產(chǎn)生和鑒定由Fanger等在PCT申請WO88/00052和在美國專利4,954,617中有描述，其教導在這里引用作為參考。這些抗體在受體Fcγ結(jié)合位點以外的位點與FcγRI、FcγRII和FcγRIII結(jié)合。這樣，它們的結(jié)合基本不被生理水平的IgG阻斷。本發(fā)明中有用的特異性抗FcγRI抗體為mAb22，mAb32，mAb44，mAb62和mAb197。產(chǎn)生mAb32的雜交瘤可以從美國典型培養(yǎng)物保藏中心，ATCC，編號HB9469得到。抗FcγRImAb22，mAb22的F(ab’)2片段可以從米德列斯公司(Annandale，N.J.)獲得。在其它實施方案中，抗Fcγ受體抗體是單克隆抗體22(H22)的人源化形式。H22抗體的產(chǎn)生和鑒定在Graziano，R.F.et al.(1995)J.Immunol155(10)4996-5002和PCT/US93/10384中有描述。產(chǎn)生H22抗體的細胞系于1992年11月4日，以HA022CL1的名稱存入美國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為CRL 11177。
在其它優(yōu)選實施方案中，對Fc受體的結(jié)合特異性由與人IgA受體如Fcα受體(FcαR(CD89))結(jié)合的抗體提供。優(yōu)選地，抗體與人IgA受體在不被內(nèi)源性IgA阻斷的位點結(jié)合。名詞“IgA”意欲包括染色體19上一個α基因(FcαRI)的基因產(chǎn)物。已知該基因編碼一些55到110Kda的選擇性剪切的跨膜同種型。FcαRI(CD89)在單核細胞/巨噬細胞，嗜酸性粒細胞和中性粒細胞上進行組成型表達，但不在非效應細胞群上表達。FcαRI對IgA1和IgA2都有中等的親和性(≈5×107M-1)，當暴露于細胞因子如G-CSF或GM-CSF時會增加(Morton，H.C.et al.(1996)Critical Reviews in Immunology 16423-440)。對識別為A3，A59，A62和A77，與FcαRI在IgA配體結(jié)合域以外結(jié)合的四種FcαRI已經(jīng)有了描述(Monteiro，R.C.et al.，1992，J.Immunol.1481764)。這里也描述了一個稱作14.1的對抗FcαRI的完全人單克隆抗體。
這里用到的“效應細胞特異性抗體”是指與效應細胞Fc受體結(jié)合的抗體或功能性片段。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選抗體與效應細胞Fc受體在內(nèi)源性免疫球蛋白不結(jié)合的位點結(jié)合。
這里用到的名詞“效應細胞”是指涉及與免疫應答識別和激活階段相對的免疫應答效應階段的免疫細胞?？梢宰鳛榉独拿庖呒毎ü撬韬土馨推鹪吹募毎?，如淋巴細胞(如B細胞和包括細胞溶解T細胞(CTL)的T細胞)，殺傷細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、多型核細胞、粒細胞、肥大細胞和嗜堿性粒細胞。一些效應細胞表達特異性Fc受體并執(zhí)行特異性免疫功能。在一種優(yōu)選實施方案中，效應細胞可以誘導抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)，如可以誘導ADCC的中性粒細胞。例如，表達FcR的單核細胞和巨噬細胞參與靶細胞的特異性殺滅及向免疫系統(tǒng)的其它成分呈遞抗原，或與抗原呈遞細胞結(jié)合。在另一種實施方案中，效應細胞可以吞噬靶抗原、靶細胞或微生物。效應細胞上特定FcR的表達可以由體液因子如細胞因子調(diào)節(jié)。例如，F(xiàn)cγRI的表達由γ干擾素(IFN-γ)上調(diào)。這種增強的表達增加了攜帶FcγRI的細胞對靶的細胞殺滅活性。效應細胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶細胞。
“靶細胞”應該表示可以被本發(fā)明的一種組合物(如人單克隆抗體，雙或多特異性分子)定向的受試者(如人或動物)不需要的任何細胞。在一種優(yōu)選實施方案中，靶細胞為表達，優(yōu)選過度表達Her2/neu的細胞。表達HER2/neu的細胞一般包括腫瘤細胞，包括腺癌細胞，如唾液腺、胃和腎、乳腺腺癌細胞、肺癌細胞、鱗狀細胞癌細胞和卵巢癌細胞。
盡管優(yōu)選人單克隆抗體，其它可以用于本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子的抗體為鼠科的、嵌合的和人源化單克隆抗體。
嵌合的鼠-人單克隆抗體(即嵌合抗體)可以由本領(lǐng)域中已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，用限制性內(nèi)切酶消化編碼鼠(或其它物種)單克隆抗體分子Fc恒定區(qū)的基因，去掉編碼鼠Fc的區(qū)域，用編碼人Fc恒定區(qū)基因的相當部分替代。(見Robinson et al，國際專利公開PCT/US86/02269；Akira，et al.，歐洲專利申請184,187；Taniguchi，M.，歐洲專利申請171,496；Morrison et al.，歐洲專利申請173,494；Neuberger et al.，國際專利申請WO 86/01533；Cabilly et al.美國專利.4,816,567；Cabilly et al.歐洲專利申請125,023；Better et al.(1988 Science 2401041-1043)；Liu et al.(1987) PNAS 843439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.139；3521-3526；Sun et al.(1987)PNAS 84214-218；Nishimura et al.，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood etal.(1985)Nature 314446-449；Shaw et al.，1988，J.NatlCancer Inst.801553-1559)。
可以通過用人Fv可變區(qū)的相當序列替代不直接參與抗原結(jié)合的Fc可變區(qū)序列使嵌合抗體進一步人源化。對人源化嵌合抗體的一般綜述可以見Morrison，S.L.，1985，Science 2291202-1207以及Oi et al.，1986，BioTechni ques 4214。這些方法包括從至少一條重鏈或輕鏈分離、操作和表達編碼所有或部分免疫球蛋白Fv可變區(qū)的核酸序列。這種核酸的來源在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中是眾所周知的，例如，可以從產(chǎn)生抗GPIIbIIIa抗體7E3的雜交瘤獲得。編碼嵌合抗體或其片段的重組DNA然后可以被克隆到適當?shù)谋磉_載體。適當?shù)娜嗽椿贵w也可以用CDR替代而產(chǎn)生，見美國專利5,225,539；Joneset al.1986 Nature 321552-525；Verhoeyan et al.1988 Science2391534；Beidler et al.1988 J.Immunol.1414053-4060。
特定人抗體的所有CDR都可以用至少一部分非人CDR替代或只有一些CDRs可以用非人CDR替代。只需要替代將人源化抗體結(jié)合到Fc受體所需要數(shù)目的CDRs。
可以用非人抗體衍生的CDR替代至少一部分人抗體CDR的方法對抗體進行人源化。Winter描述了一種用來制備本發(fā)明的人源化抗體的方法(英國專利申請GB 2188638A，1987年3月26日提交)，在此特意引入其內(nèi)容作為參考。可以按題目為Humanized Antibodiesto Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human MononuclearPhagocytes的國際申請WO 94/10332所描述的，通過寡核苷酸定向位點誘變用非人CDRs替代人CDR。
特異性氨基酸被替代、去除或增加的嵌合人源化抗體也屬于本發(fā)明的范圍。特別是優(yōu)選人源化抗體在構(gòu)架區(qū)有氨基酸替代，因而改善與抗原的結(jié)合。例如，在有小鼠CDRs的人源化抗體中，人構(gòu)架區(qū)的氨基酸序列可以被位于小鼠抗體對應位置的氨基酸替代。已知這種替代可以在某種場合改善人源化抗體與抗原的結(jié)合。有氨基酸序列增加、去除或替代的抗體在這里稱作修飾抗體或更替抗體。
名詞修飾抗體意欲包括這些抗體，如通過如去除、增加或替代抗體一些部分而修飾的單克隆抗體、嵌合抗體和人源化抗體。例如，抗體可以通過去除恒定區(qū)并用準備增加抗體半衰期如血清半衰期、穩(wěn)定性或親和性的恒定區(qū)替代來修飾。只要雙特異性和多特異性分子有至少一個對FcγR特異的抗原結(jié)合區(qū)并觸發(fā)至少一種效應功能，那么任何修飾都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子可以用化學技術(shù)(如見D.M.Kranz et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 785807)，“polydoma”技術(shù)(見Reading的美國專利4,474,893)或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。
特別是，可以用這里提供的例子所描述的本領(lǐng)域中公知的方法結(jié)合組分結(jié)合特異性，如抗FcR和抗HER2/neu結(jié)合特異性來制備本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子。例如，雙特異性和多特異性分子的每種結(jié)合特異性可以分別產(chǎn)生然后彼此結(jié)合。當結(jié)合特異性為蛋白或多肽時，可以用各種偶聯(lián)或交聯(lián)試劑進行共價結(jié)合。交聯(lián)試劑的例子包括蛋白A、碳二亞胺、N-琥珀酰胺-S-乙酰-硫代乙酸鹽(SATA)、N-琥珀酰胺-3-(2-二硫吡啶)丙酸鹽(SPDP)，及磺基琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰胺)環(huán)己烷-1-羧基(sulfo-SMCC)(見例如，Karpovsky et al.(1984)J.Exp.Med.1601686；Liu，MA et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA828648)。其它方法包括由Paulus(Behring Ins.Mitt.(1985)No.78，118-132)；Brennan等(science(1985)22981-83)，和Glennie等(J.Immunol.(1987)1392367-2375)所描述的方法。優(yōu)選的結(jié)合試劑為SATA和sulfo-SMCC，都可以從Pierce化學公司(Rockford，IL)獲得。
當結(jié)合特異性為抗體(如兩個人源化抗體)時，它們可以用兩條重鏈C端鉸鏈區(qū)的硫氫鍵連接。在一種特定優(yōu)選實施方案中，鉸鏈區(qū)被修飾為在結(jié)合前包含奇數(shù)個，優(yōu)選為一個硫氫基。
另外，兩種結(jié)合特異性都可以在同一載體中編碼并在相同宿主中表達和裝配。當雙特異性和多特異性分子為mAb×mAb，mAb×Fab，F(xiàn)ab×F(ab’)2或配體×Fab融合蛋白時，此方法特別有用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子，如雙特異性分子，可以是單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體，包含一個單鏈抗體和一個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子，或包含兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性分子也可以是單鏈分子或可以包含至少兩個單鏈分子。制備雙和多特異性分子的方法在以下文獻中舉例描述，美國專利5,260,203；美國專利5,455,030；美國專利4,881,175；美國專利5,132,405；美國專利5,091,513；美國專利5,476,786；美國專利5,013,653；美國專利5,258,498；美國專利5,482,858。
雙特異性和多特異性分子與它們的特異性靶相結(jié)合可以用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，放射免疫測定(RIA)或蛋白印跡測定來證實。每種測定方法一般都通過使用待測定復合物特異的標記試劑(如抗體)來檢測待測定蛋白-抗體復合物的存在。例如，F(xiàn)cR-抗體復合物可以用如識別并特異性與抗體-FcR復合物結(jié)合的酶連接的抗體或抗體片段來檢測。另外，可以用其它免疫測定的中的任何一種來檢測。例如，可以將抗體放射性標記并用于放免測定(RIA)(例如，見Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays，SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，TheEndocrine Society，March，1986，在此引入作為參考)。具有放射活性的同種型可以用如使用γ計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或放射自顯影的方法檢測。IV.抗體結(jié)合物/免疫毒素另一方面，本發(fā)明的特征在于與治療部分，如細胞毒素、藥物或放射性同位素結(jié)合的人抗HER2/neu單克隆抗體或其片段。當與細胞毒素結(jié)合時，這些結(jié)合抗體就叫做“免疫毒素”。細胞毒素或細胞毒試劑包括任何對細胞有害(如殺滅細胞)的試劑，其例子包括紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩葡糖苷、長春新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、北豆根堿、dihydroxy anthracin dione、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫表雄酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、嘌呤霉素及其類似物或同源物。治療試劑包括，但不局限于抗代謝物(如氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-巰基鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟鳥嘧啶)，烷化劑(如二氯甲基二乙胺、thioepachlorambucil、美法倫、亞硝基脲氮芥(BSNU)和羅氮芥(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(II)((DDP)順鉑)、anthracycline(如道諾紅霉素(以前稱作道諾霉素)和亞德里亞霉素)，抗生素(如放線菌素(以前稱作放射霉素)、博來霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)，以及抗有絲分裂劑(如長春新堿、長春花堿)。本發(fā)明的抗體可以與放射性同位素如放射性碘結(jié)合，產(chǎn)生治療HER2/neu相關(guān)疾病的細胞毒放射性藥物。
本發(fā)明結(jié)合的抗體可以用來修飾某種生物反應，藥物部分并不限于經(jīng)典化療劑的范圍。例如，藥物部分可以是一種具有所需要生物活性的蛋白或多肽。這種蛋白可以包含如酶活性毒素或其活性片段，如紅豆因、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌素、或白喉毒素；蛋白如腫瘤壞死因子或γ干擾素；或生物反應調(diào)節(jié)劑如，淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)，白介素-2(“IL-2”)，白介素-6(“IL-6”)，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(“GM-CSF”)，粒細胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其它生長因子。
將這種治療部分與抗體結(jié)合的技術(shù)非常熟悉，見，如Arnon et al.，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，In Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld et al.(eds.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom et al.，″Antibodies For Drug Delivery″，inControlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson et al.(eds.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，″AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer TherapyA Review″，in Monoclona1 Antibodies’84Biological And ClinicalApplications，Pinchera et al.(eds.)，pp.475-506(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective Of The TherapeuticUse Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy″，in MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin et al.(eds.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，and Thorpe et al.，″The preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates″，Immunol.Rev.，62119-58(1982)。V.藥物組合物另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，如藥物組合物，它包含一個或幾個本發(fā)明的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分的結(jié)合，與可藥用的載體配伍。在一種優(yōu)選實施方案中，此組合物包括多種(如兩個或以上)本發(fā)明的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分的結(jié)合。優(yōu)選地，組合物的每個抗體或其抗原結(jié)合部分與獨特的、預選的HER2/neu表位相結(jié)合。
在一種實施方案中，有補體活性的人抗HER2/neu單克隆抗體被結(jié)合應用，如作為包含兩個或更多人抗HER2/neu單克隆抗體的藥物組合物。例如，介導效應細胞存在時高效殺滅靶細胞的人單克隆抗體可以與另一種抑制表達HER2/neu的細胞生長的人單克隆抗體結(jié)合。
在另一種實施方案中，此組合物包含一個或多個本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子的結(jié)合(例如，包含至少一個對Fc受體的結(jié)合特異性和至少一個對HER2/neu的結(jié)合特異性)。
本發(fā)明的藥物組合物也可用于結(jié)合治療，即與其它試劑結(jié)合。例如，結(jié)合治療可以包括一個本發(fā)明的組合物和至少一種抗腫瘤試劑或其它傳統(tǒng)治療方法。
這里用到的“可藥用載體”包括任何和所有生理相容的溶劑、分散劑、包衣、抗細菌和抗真菌試劑、等滲的和吸收延緩試劑等。優(yōu)選地，這種載體適合靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腸外、脊髓或表皮使用(如通過注射或滴注)。取決于使用途徑，活性化合物，即抗體、雙特異性和多特異性分子可以用一種物質(zhì)包被，使化合物不受酸和其它可能滅活此混合物的自然條件的影響。
“藥用鹽”是指保持母體化合物需要的生物活性并且不帶來任何不需要的毒性作用的鹽(見Berge，S.M.，et al.(1977)J.Pharm.Sci.661-19)。這些鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括那些從如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、磷等無毒無機酸以及如脂肪酸單和二羧酸、苯替代烷酸、羥基烷酸、芳香酸、脂肪酸和芳香磺酸等無毒有機酸衍生的鹽。堿加成鹽包括從如鈉、鉀、鎂、鈣等堿金屬和N，N’-聯(lián)苯二亞胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等無毒有機胺衍生的鹽。
本發(fā)明的組合物可以通過許多本行業(yè)中公知的方法使用。正如熟練的技術(shù)人員所鑒定的，使用途徑和/或方式將由希望結(jié)果的不同而改變?；钚曰衔锟梢杂帽Ｗo化合物避免迅速釋放的載體制備，如包括埋入物、經(jīng)皮貼劑、和微膠囊運送系統(tǒng)的控釋配方?？梢允褂萌缫蚁┮宜嵋蚁ァ⒕埕?、聚乙二醇酸、膠原、聚原酸酯、和聚交酯酸等生物可降解的和生物相容的多聚體。制備這種配方的許多方法被授予專利并且在本領(lǐng)域的技術(shù)人員中是公知的。見如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
為通過某種給藥途徑使用本發(fā)明的混合物，必須將其包被于防止其被滅活的物質(zhì)中或與這種物質(zhì)共同給藥。例如，這種混合物可以用適當?shù)妮d體例如脂質(zhì)體或稀釋劑而給予受試者?？伤幱玫南♂寗┌}和水緩沖液包括水包油包水CGF乳狀液以及傳統(tǒng)脂質(zhì)體(Strejanet al.(1984)J.Neuroimmunol.727)。
可藥用載體包括為臨時制備無菌注射液或分散劑所用的無菌水溶液或分散劑和無菌粉末。這些針對藥用活性物質(zhì)的媒介和試劑的使用在本領(lǐng)域中是公知的。除了與活性混合物不相容的傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑外，考慮了將其使用在本發(fā)明的藥物組合物中。此組合物也可加入補充活性化合物。
治療組合物在生產(chǎn)和儲存條件下一般必需是無菌和穩(wěn)定的。此組合物可以配制為溶液、微乳狀液、脂質(zhì)體或其它適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。載體可以是包括如水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當?shù)幕旌衔锏娜軇┗蚍稚⒔橘|(zhì)。可以通過例如使用包膜如卵磷脂、在分散時保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當?shù)囊簯B(tài)。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鹽和明膠來延長注射組合物的吸收。
無菌注射液可以通過在適當溶劑中加入要求的劑量的活性化合物和上面列舉的一種或幾種成分的結(jié)合，并按要求進行滅菌微量過濾。一般說來，分散劑通過將活性化合物加入一種包含上面所列舉的基本分散介質(zhì)和要求的其它成分的無菌載體。對于制備無菌注射液的無菌粉末，優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥(低壓凍干)，產(chǎn)生活性成分粉末，再加上從前面無菌過濾的溶液得到的其它需要成分。
調(diào)整劑量法則來提供最優(yōu)的需要反應(如治療反應)。例如，可以使用一個大丸劑，而再次服用時可以將其分開，或由治療狀況的緊急程度按比例遞減或遞增劑量。為給藥方便和劑量統(tǒng)一，以劑量單位的形式配制腸外組合物非常有好處。這里用到的劑量單位形式是指作為治療受試者的單位劑量的生理區(qū)分的單位；每個單位包含預定量的活性化合物，經(jīng)計算可以與要求的藥物載體協(xié)同作用，產(chǎn)生需要的治療效果。本發(fā)明劑量單位形式的規(guī)格由以下內(nèi)容指定并直接依賴于(a)活性化合物的獨特特征和需要達到的特定療效及(b)行業(yè)中延襲的限制如治療所用化合物個體敏感性的限制。
可藥用抗氧化劑的例子包括(1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、半胱鹽酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、硫酸鈉等；(2)脂溶性抗氧化劑，如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁化羥基苯甲醚(BHA)，丁化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、丁基沒食子酸、α生育酚等及(3)金屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
對于治療組合物，本發(fā)明包括適于口服、鼻腔、局部(包括頰和舌下)或腸外用藥的配方。這些配方可以方便地以單位劑型存在，可以用制藥領(lǐng)域公知的方法制備。與載體物質(zhì)結(jié)合而產(chǎn)生單劑型的活性成分的量將根據(jù)被治療者和特定給藥方式而不同?？梢耘c載體物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生單劑型的活性成分的量將為產(chǎn)生療效的組合物的量。一般說來，以百分數(shù)計算，該量將為活性成分的0.01-99％左右，優(yōu)選0.1-70％左右，1-30％左右更優(yōu)。
本發(fā)明適于陰道給藥的配方也包括含有行業(yè)中公知的適當載體的陰道栓、填塞物、油膏、凝膠、糊劑、泡沫或噴霧配方。局部或經(jīng)皮使用本發(fā)明的組合物的劑型包括粉末、噴霧、軟膏、糊劑、油膏、洗液、凝膠、溶液、貼劑和吸入劑?；钚曰衔锟梢栽跓o菌條件下與可藥用載體，以及防腐劑、緩沖液或推進劑混和。
這里用到的短語“腸外的給藥”和“給藥于腸外”表示腸道和局部給藥以外的給藥方式，通常是注射、并包括但不限于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、被膜內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、被膜下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內(nèi)、胸骨內(nèi)注射和滴注。
在本發(fā)明的藥物組合物中使用的適合水或非水載體包括水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當?shù)幕旌衔?、植物油，如橄欖油、及可注射有機酯，如亞油酸?？梢酝ㄟ^例如使用包被物如卵磷脂、在分散時保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當?shù)囊簯B(tài)。
這些組合物也可以包含佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。預防微生物的出現(xiàn)可以通過滅菌程序，以及通過引入各種抗細菌和抗真菌劑如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚山梨酸等。也可能在組合物中需要包括等滲試劑，如糖、氯化鈉等。另外，可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鋁和明膠來延長注射藥物形式的吸收。
當本發(fā)明的化合物作為藥物使用于人和動物時，它們可以單獨或作為含有例如0.01-99.5％(0.1-90％更優(yōu))的活性成分的藥物組合物，并與可藥用載體結(jié)合。
忽略選擇的使用途徑，可以以適當水化形式使用的本發(fā)明的化合物，和/或本發(fā)明的藥物組合物，可以通過本行業(yè)中的公知傳統(tǒng)方法被配方為可藥用劑型。
本發(fā)明的藥物組合物中的實際劑量水平可以改變，從而獲得可以達到特定病人所需的治療反應的活性成分的量、組合物和給藥方式，而對病人無毒。選定的劑量水平將取決于各種藥代動力學因素包括本發(fā)明使用的特定組合物或其酯、鹽或胺的活性，給藥途徑、給藥時間、所使用的特定化合物的分泌率、療程、其它與所使用的特定組合物結(jié)合使用的藥物、化合物和/或物質(zhì)、年齡、性別、體重、狀況、治療病人的一般健康和過去史等醫(yī)學領(lǐng)域中熟知的因素。
本領(lǐng)域中有常規(guī)技術(shù)的醫(yī)生或獸醫(yī)可以輕易判斷并處方需要的藥物組合物的量。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于要求劑量的用于藥物組合物中的本發(fā)明的化合物劑量開始，以便獲得需要的療效并逐漸增加劑量，直到達到需要的療效?？傊?，本發(fā)明的組合物的適當劑量是有效產(chǎn)生療效的最低劑量的化合物的量。這種有效劑量一般將取決于前面所描述的因素。優(yōu)選給藥方式為靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下，優(yōu)選接近靶位點用藥。如果需要，治療組合物的的有效日劑量可以選擇作為2、3、4、5、6或更多亞劑量，在一天中的適當間隔，以單位劑型分別用藥。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨使用，優(yōu)選將化合物作為藥物配方(組合物)使用。
治療組合物可以通過本領(lǐng)域中的公知醫(yī)學設(shè)備使用。例如，在一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的治療組合物可以用無針皮下注射設(shè)備給藥，如在美國專利5,399,163，5,383,851，5,312,335，5,064,413，4,941,880，4,790,824或4,596,556中公開的設(shè)備。本發(fā)明中有用的公知植入物和模型的例子包括美國專利4,487,603，它公開了以控制速率分散藥物的可植入微量滴注泵；美國專利4,486,194，它公開了經(jīng)皮用藥的治療設(shè)備；美國專利4,447,233，它公開了以精確滴注速度運送藥物的藥物滴注泵；美國專利4,447,224，它公開了連續(xù)運送藥物的可變流量可植入滴注泵；美國專利4,439,196，它公開了一種有多室容器的滲透性藥物運送系統(tǒng)；以及美國專利4,475,196，它公開了一種滲透性藥物運送系統(tǒng)。在此引入這些專利文獻作為參考。許多其它的這種植入物、運送系統(tǒng)和模型在本領(lǐng)域中的技術(shù)人員中是公知的。
在某些實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體可以為保證體內(nèi)適當分布而配方。例如，血腦屏障(BBB)排除了許多高度親水的化合物。為保證本發(fā)明的治療化合物穿過BBB(如果需要)，它們可以在例如脂質(zhì)體中配方。關(guān)于生產(chǎn)脂質(zhì)體的方法，見，如美國專利4,522,811；5,374,548及5,399,331。脂質(zhì)體可以包括一個或多個選擇性運送到特定細胞或器官內(nèi)的部分，這樣增強了靶藥物的運送(見，如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29685)。作為例子的導向部分包括葉酸或生物素(見，如美國專利5,416,016 Low et al)；甘露糖苷(Umezawa et al.，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.1531038)；抗體(P.G.Bloeman et al.(1995)FEBS Lett.357140；M.Owais et al.(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39180)；表面活性蛋白A受體(Briscoe et al.(1995)Am.J.Physiol.1233134)，可以包含本發(fā)明的配方和發(fā)明分子成分的不同種類；p120(Schreier et al.(1994)J.Biol.Chem.2699090)；也見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4273。在一種實施方案中，本發(fā)明的治療化合物在脂質(zhì)體中配方；在一種更優(yōu)的實施方案中，脂質(zhì)體包含導向部分。在一種最優(yōu)實施方案中，脂質(zhì)體中的治療化合物由濃集注射運送腫瘤或感染附近的位點。組合物必須為液體，必需在可以容易注射的范圍內(nèi)。必需在生產(chǎn)和儲存條件下保持穩(wěn)定，并且必需在防止微生物如細菌和真菌污染的條件下保存。
與未治療者相比，“治療上有效的劑量”優(yōu)選抑制至少20％，更優(yōu)至少40％，甚至更優(yōu)至少60％，還可更優(yōu)到至少80％的腫瘤生長。化合物抑制癌癥生長的能力可以在可預測人腫瘤療效的動物模型系統(tǒng)中評估。另外，組合物的這種特征可以通過采用專業(yè)從業(yè)者公知的測定方法檢驗化合物的抑制，如體外抑制能力而評價。治療上有效劑量的治療化合物可以減小腫瘤大小，或減輕使用者的癥狀。本領(lǐng)域中的一種常規(guī)方法以如目標病灶大小、受試者的癥狀和特定的組合物和選擇的給藥途徑等因素為基礎(chǔ)，就可以判斷這些用量。
組合物必需是無菌的，并且是液態(tài)的，處于組合物可以用注射運送的范圍。除了水以外，載體可以是等滲緩沖鹽溶液，乙醇，多羥基化合物(例如，甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)，及其適當?shù)幕旌衔??？梢酝ㄟ^例如使用包被物如卵磷脂、在分散時保持要求的顆粒大小及使用表面活性劑來保持適當?shù)囊簯B(tài)。另外，可以通過在組合物中加入延緩吸收的試劑如一硬脂酸鋁和明膠使注射組合物由長期吸收。
當活性化合物受到適當保護時可以口服，例如，同惰性稀釋劑或可吸收的可食用載體一起口服。VI.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的組合物(如人HER2/neu單克隆抗體及其衍生物/結(jié)合物)有體外和體內(nèi)診斷和治療效用。例如，這些分子可以用于培養(yǎng)細胞，如體外或來自體內(nèi)，或用于受試者，如體內(nèi)，治療、預防或診斷多種疾病。這里用到的名詞“受試者”意欲包括人和非人動物。優(yōu)選的人類動物包括以HER2/neu表達特別是錯誤表達(如過度表達)為特征的疾病的病人。例如，本發(fā)明的方法和組合物可以用于治療有致腫瘤的疾病如以出現(xiàn)表達HER2/neu的腫瘤細胞，包括如腺癌細胞，如唾液腺、胃和腎、乳腺癌、肺癌、鱗狀細胞癌和卵巢癌細胞為特征的疾病的受試者。本發(fā)明的名詞“非人動物”包括所有脊椎動物，如哺乳和非哺乳動物，如非人靈長類動物、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。
本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)首先可以體外進行與治療或診斷相關(guān)的結(jié)合活性的檢驗。例如，可以用前面例子中描述的ELISA和流式細胞儀測定來檢測本發(fā)明的組合物。另外，可以測定這些分子觸發(fā)至少一種效應介導的效應細胞活性，包括表達HER2/neu的細胞的裂解的活性。測定效應細胞介導的細胞裂解的方案在前面例子中有描述。
本發(fā)明的組合物(如人抗體、雙特異性和單特異性分子)在治療和診斷HER2/neu相關(guān)疾病中有額外作用。例如，在體內(nèi)或體外引發(fā)一種或多種下列生物活性調(diào)理表達HER2/neu的細胞；介導效應細胞存在下對表達HER2/neu細胞的吞噬和細胞裂解；或者抑制表達HER2/neu的細胞生長。
在一種特定實施方案中，人抗體及其衍生物在體內(nèi)應用于治療、預防或診斷多種HER2/neu相關(guān)疾病。HER2/neu相關(guān)疾病包括多種癌癥，如腺癌，如唾液腺、胃和腎、乳腺癌、肺癌、鱗狀細胞癌和卵巢癌。
本發(fā)明的組合物(如人抗體、雙特異性和單特異性分子)的給藥方法在本領(lǐng)域中是公知的。這種分子使用的適當劑量取決于受試者的年齡和體重以及使用的特定藥物。這種分子可以與放射性核素如131I，90Y，105Rh偶聯(lián)，見下面文獻中的描述，Goldenberg，D.M.et al.(1981)Cancer Res.414354-4360，及歐洲專利0365997。本發(fā)明的組合物(如人抗體、雙特異性和單特異性分子)也可與抗感染劑偶聯(lián)。
靶特異性效應細胞，如與本發(fā)明的組合物(如人抗體、雙特異性和單特異性分子)連接的效應細胞也可作為治療試劑。定向的效應細胞可以是人白細胞如巨噬細胞、中性粒細胞或單核細胞。其它細胞包括 和其它有IgG或IgA受體的細胞。如果需要，效應細胞可以從被治療的受試者獲得。靶特異性效應細胞，可以作為可生理使用的溶液中的懸浮細胞而使用。使用的細胞數(shù)可以在108-109間，但將取決于治療目的不同而改變?？傊?，用量將足夠獲得在靶細胞如表達HER2/neu的腫瘤細胞的定位，并足夠通過如吞噬完成細胞殺滅。給藥途徑也可變化。
用靶特異性效應細胞的治療可以與其它去除靶細胞的方法結(jié)合進行。例如，用本發(fā)明的組合物(如人抗體、雙特異性和單特異性分子)和/或配備這些組合物的效應細胞的抗腫瘤治療可以與化療聯(lián)合使用。另外，結(jié)合免疫治療可以用來指導兩個不同細胞毒效應群定位于腫瘤細胞排斥。例如，連接到抗FcγRI或抗T3的抗HER2/neu抗體可以與IgG或IgA受體特異性結(jié)合劑結(jié)合使用。
本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子也可以用來調(diào)節(jié)效應細胞上的FcγR或FcαR水平，如通過給細胞表面受體加帽或去除細胞表面受體?？笷c受體混和物也可用于此目的。
有補體結(jié)合位點，如IgG1，-2或-3上的補體結(jié)合部分的本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可在補體存在下使用。在一種實施方案中，對包含靶細胞及本發(fā)明的結(jié)合劑和適當效應細胞的細胞群的來自體內(nèi)的治療可以通過加入補體或含有補體的血清而得到補充。對包被本發(fā)明的結(jié)合劑的靶細胞的吞噬可以通過與補體蛋白結(jié)合而改善。在另一種實施方案中，包被本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)的靶細胞也可被補體裂解。
本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可與補體一起使用。因此，包含人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些組合物的優(yōu)勢在于補體緊鄰人抗體、多特異性和雙特異性分子。另外，人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體可以分開使用。
包含本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)和使用說明書的試劑盒也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。試劑盒還可包含至少一個額外的試劑，如補體，或一個或更多額外的本發(fā)明的人抗體(如，區(qū)別于第一個人抗體，與HER2/neu抗原的一個表位結(jié)合的具有補體活性的人抗體)。
在另一種實施方案中，可以額外給予受試者調(diào)節(jié)，如增強或抑制Fcγ或Fcα受體的表達活性的試劑，例如，給予受試者細胞因子。在用多特異性分子治療中優(yōu)選使用的細胞因子包括粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，γ干擾素(INF-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。
本發(fā)明的組合物(如人抗體、多特異性和雙特異性分子)也可用于表達FcγR或HER2/neu的靶細胞，例如標記這些細胞。為了這種應用，可以將結(jié)合劑連接到可以檢測的分子。這樣，本發(fā)明提供了定位來自體內(nèi)或體外，表達Fc受體如FcγR或HER2/neu的細胞的方法?？蓹z測的標記物可以是，如放射性同位素、熒光化合物和酶或酶輔因子。
在一種實施方案中，本發(fā)明提供了在樣品中檢測HER2/neu的存在或測量HER2/neu抗原量的方法，包括在允許抗體或其部分和HER2/neu形成復合物的條件下，將樣品和對照樣品與特異性與Her2/neu結(jié)合的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸。然后檢測復合物的形成，樣品與對照樣品間不同的復合物形成提示樣品中有HER2/neu抗原。
在另一種實施方案中，本發(fā)明提供了體內(nèi)或體外檢測Fc表達細胞的存在或為其定量的方法。此方法包括(i)給予受試者本發(fā)明的一種組合物(如多或雙特異性分子)或其片段，與可檢測標記物結(jié)合；(ii)將受試者暴露于檢測該可檢測標記物的方法，識別包含F(xiàn)c表達細胞的區(qū)域。
本發(fā)明的其它實施方案在下面的例子中有描述。
通過下面的實施例對本發(fā)明做了進一步說明，但這些例子不應作為進一步的限制。在此特意引入序列表、圖和所有參考文獻、在本申請過程中引用的專利和公開的專利申請的內(nèi)容作為參考。實施例實施例1 Cmu靶小鼠的產(chǎn)生CMD導向載體的建立質(zhì)粒pICEmu包含一個跨mu基因，從Balb/C基因組λ噬菌體文庫中獲得的鼠Ig重鏈基因座的EcoRI/XhoI片段(Marcu et al.Cell22187，1980)。此基因組片段被亞克隆到質(zhì)粒pICEM19H的XhoI/EcoR位點(Marsh et al；Gene 32，481-485，1984)。包含在pICEmu的重鏈序列從mu內(nèi)含子增強子3’端的EcoRI位點向下游延伸到mu基因最后一個跨膜外顯子下游約1kb的XhoI位點；然而，通過在大腸桿菌中傳代，許多mu轉(zhuǎn)換重復區(qū)域被去除。
導向載體按如下方法建立(見圖1)。將一個1.3kb的HindIII/SmaI片段從pICEmu切除并亞克隆到HindIII/SmaI消化的pBluescript(Stratagene，La Jolla，CA)。此pICEmu片段從位于Cmu1 5’端約1kb的HindIII位點延伸到Cmu1內(nèi)部的SmaI位點。產(chǎn)生的質(zhì)粒用SmaI/SpeI消化，然后插入一個約4kb的從pICEmu得到的，從Cmu1 3’端的SmaI位點延伸到最后一個Cmu外顯子下游的XbaI位點的SmaI/XbaI片段。產(chǎn)生的質(zhì)粒pTAR1在SmaI位點被線性化，插入一個neo表達盒。該盒包含一個在小鼠磷酸甘油激酶(pkg)啟動子(XbaI/TaqI片段；Adra et al.(1987)Gene 6065-74)轉(zhuǎn)錄控制下并包含pkg聚腺苷酸化位點(PvuII/HindIII片段；Boeret al.(1990)Biochemical Genetics 28299-308)的neo基因。該盒從質(zhì)粒pKJ1(Tybulewicz et al.(1991)Cell 651153-1163有描述)得到，neo盒作為EcoRI/HindIII片段被切除并亞克隆到EcoRI/HindIII消化的pGEM-7Zf(+)而產(chǎn)生pGEM-7(KJ1)。Neo盒從pGEM-7(KJ1)通過EcoRI/SalI消化被切除，為平端，并被亞克隆到質(zhì)粒pTAR1的SmaI位點，與基因組Cmu序列方向相反。產(chǎn)生的質(zhì)粒被NotI線性化，插入一個單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)盒，這樣可以允許有同源重組的ES克隆富集，如Mansour et al.(1988)Nature 336348-352的描述。該盒包含了其兩端為小鼠pgk啟動子和聚腺苷酸化位點的tk基因編碼序列，如Tybulewicz et al.(1991)Cell 651153-1163的描述。產(chǎn)生的CMD導向載體包含與重鏈基因座總共約5.3kb的同源性，并設(shè)計產(chǎn)生在第一個Cmu外顯子的唯一SmaI位點插入neo表達盒的突變mu基因。導向載體在電穿孔到ES細胞之前，用在質(zhì)粒序列內(nèi)部剪切的PvuI線性化。靶ES細胞的產(chǎn)生和分析AB-1 ES細胞(McMahon，A.P.and Bradley，A.，(1990)Cell621073-1085)在有絲分裂不活躍的SNL76/7細胞飼養(yǎng)層(ibid.)上生長，基本如(Robertson，E.J.(1987)，Teratocareinomas andEmbryonic Stem Cellsa Practical Approach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，p.71-112)所描述。線性化的CMD導向載體通過Hasty等描述的方法(Hasty，P.R.Et al.(1991)Nature350243-246)被電穿孔到AB-1細胞中。被電穿孔的細胞以1-2×106個細胞/平皿的密度被平鋪到100mm的平皿。24小時后，將G418(200mg/ml活性成分)和FIAU(5×10-7M)加入培養(yǎng)基，抗藥克隆允許培養(yǎng)8-9天。挑選克隆，用胰蛋白酶消化，分為兩部分，并進一步展平。然后從每個克隆得到的細胞的一半被冷凍，另一半為進行載體和靶序列之間的同源重組而進行分析。
DNA分析通過DNA印跡雜交執(zhí)行。按Laird等描述的方法(Laird，P.W.et al.，(1991)Nucleic Acids Res.194293)將DNA從克隆中分離。分離的基因組DNA用SpeI消化并用一個與mu內(nèi)含子增強子和mu轉(zhuǎn)換區(qū)之間的序列雜交的915bp的SacI片段即探針A(見圖1)探測。探針A檢測野生型基因座的一個915bp的SacI片段和mu基因座的一個與CMD導向載體同源重組(neu表達盒包含一個SpeI位點)的7.6kb的鑒別帶。在DNA印跡分析篩選的1132個抗G418和FIAU克隆中，3個顯示出了提示mu基因座同源重組的7.6kb的SpeI帶。用酶BglI，BstXI和EcoRI進一步消化這3個克隆，證明載體被同源性整合到mu基因中。當與探針A雜交后，用BglI，BstXI或EcoRI消化的野生型DNA的印記分別產(chǎn)生15.7，7.3和12.5kb的片段，而靶mu等位基因的存在分別由7.7，6.6，和14.3kb的片段提示。由SpeI消化檢測的所有3個陽性克隆表現(xiàn)出預期的鑒別neo盒插入Cmul外顯子的BglI，BstXI和EcoRI限制片段。具有突變mu基因的小鼠的產(chǎn)生將這三個編號為264，272和408的靶ES克隆融化并按Bradley在Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cellsa PracticalApproach(E.J.Robertson，ed.)OxfordIRL Press，p.113-151)中描述的方法注射入C57BL/6J胚泡。將被注入的胚泡轉(zhuǎn)移到假孕雌性小鼠中產(chǎn)生表現(xiàn)從引入ES細胞和宿主胚泡細胞衍生的細胞混合的嵌合小鼠。ES細胞對嵌合體的貢獻可以由C57BL/BJ黑色背景上的從ES細胞系衍生的灰色皮毛顏色數(shù)量用肉眼估計?？寺?72和408只產(chǎn)生低百分比的嵌合體(即低百分比灰色色素)，但克隆264產(chǎn)生高百分比的雄性嵌合體。這些嵌合體與C57BL/J6雌鼠雜交并產(chǎn)生灰色后代，提示ES細胞基因組的種系轉(zhuǎn)移。對靶mu基因的篩選是通過對尾部解剖得到的DNA用BglI消化進行DNA印跡分析而執(zhí)行的(如前面所描述的ES細胞DNA分析)。約50％的灰色后代除了野生型的15.7kb帶，也表現(xiàn)出7.7kb的雜交BglI帶，證明了靶mu基因的種系轉(zhuǎn)移。mu基因功能性滅活的轉(zhuǎn)基因小鼠的分析為判斷neo盒插入到Cmu1是否滅活了Ig重鏈基因，將一只克隆264的嵌合體與一只JHD突變純合小鼠雜交，JHD突變由于去除JH基因段而導致重鏈表達失活(Chen et al，(1993)Immunol.5647-656)。產(chǎn)生四只灰色后代。從1月齡的這些動物中得到血清并用ELISA測定鼠IgM的存在。四只后代中的兩只完全缺失IgM(見表1)。從尾部解剖得到的DNA用BglI消化并與探針A雜交，以及通過用StuI消化并與一個475bp的EcoRI/StuI片段(ibid)雜交，DNA印跡分析測定的四只動物的基因型證明，不能表達血清IgM的動物重鏈基因座中的一個等位基因有JHD突變，另一個有Cmul突變。JHD突變的雜合小鼠顯示野生型水平的血清Ig。這些資料證明Cmul突變滅活mu基因的表達。
表1
表1表示由ELISA檢測的，有CMD和JHD突變(CMD/JHD)的小鼠，JHD突變雜合子小鼠(+/JHD)，野生型(129SV×C57BL/6J)F1小鼠(+/+)及B細胞缺陷JHD突變純合小鼠(JHD/JHD)的血清IgM水平。實施例2 HCO12轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生HCO12人重鏈轉(zhuǎn)基因HCO12轉(zhuǎn)基因通過共同注射80kb的pHC2插入片段(Taylor etal.，1994，Int.Immunol.，6579-591)和25kb的pV×6插入片段產(chǎn)生。質(zhì)粒pV×6按如下方法建立。
一個包含種系人VH1-18(DP-14)基因以及約2.5kb的5’側(cè)翼和5kb的3’側(cè)翼基因組序列的8.5kb的HindIII/SalI DNA片段被亞克隆到質(zhì)粒載體pSP72(Promega，Madison，WI)產(chǎn)生質(zhì)粒p343.7.16。一個包含種系人VH5-51(DP-73)基因以及約5kb的5’側(cè)翼和1kb的3’側(cè)翼基因組序列的7kb的BanHI/HindIII DNA片段被克隆到基于pBR322的質(zhì)?？寺≥d體pGP1f(Taylor et al.1992，NucleicAcids Res.206287-6295)產(chǎn)生質(zhì)粒p251f。從pGP1f衍生的一個新克隆載體pGP1k(SEQ ID NO13)被EcoRV/BamHI消化并與一個包含種系人VH3-23(DP-47)基因以及約4kb的5’側(cè)翼和5kb的3’側(cè)翼基因組序列的10kb的EcoRV/BamHI DNA片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒p112.2RR.7被BamHI/SalI消化并與p251f的7kb的純化BamHI/SalI插入片段連接。產(chǎn)生的質(zhì)粒pV×4用XhoI消化并與p343.7.16的8.5kb的XhoI/SalI插入片段連接。
獲得了一個VH1-18基因與另外兩個V基因方向相同的克隆。然后這個稱為pV×6的克隆被NotI消化，按Hogan等的描述(B.Hoganet al.，Manipulating the Mouse embryo，A Laboratory Manual，2nd edition，1994，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)，純化的26kb插入片段與純化的pHC2的80kb NotI插入片段以1∶1的摩爾比共同注射到半天的(C57BL/6J×DBA/2J)F2胚胎原核中。從注入的胚胎發(fā)育的小鼠建立了三個包含從Vx6和HC2得到的序列的獨立轉(zhuǎn)基因小鼠系。這些系被指定為(HCO12)14881，(HCO12)15083，(HCO12)15087。然后將這三個系的每一個與包含例1中描述的CMD突變、JKD突變(Chen et al.1993，EMBOJ.12811-820)和(Kco5)9272轉(zhuǎn)基因(Fishwild et al.1996，Nature Biotechnology 14845-851)的小鼠雜交。產(chǎn)生的小鼠在破壞內(nèi)源性小鼠重鏈和κ輕鏈基因座為純合的背景下表達人重鏈和κ輕鏈轉(zhuǎn)基因。實施例3 抗HER2/neu的人單克隆抗體和雙特異性分子的產(chǎn)生用下面三種來源衍生的HER2/neu抗原免疫HCO7和HCO12株HuMab小鼠產(chǎn)生人抗HER2/neu單克隆抗體1)表達高水平HER2/neu，在標準狀況下生長、收獲并用PBS沖洗的人乳腺癌細胞SKBR-3和BT-474，2)用鼠抗HER2/neu單克隆抗體和抗鼠IgG瓊脂糖凝膠免疫沉淀的SKBR-3細胞裂解產(chǎn)物；和3)從SKBR-3細胞脫落并用鼠抗HER2/neu單克隆抗體親和層析而純化的HER2/neu。HCO7HuMab小鼠按美國專利5,545,806，5,625,825，和5,545,807中的描述產(chǎn)生，在此引入其完整公開作為參考。
特別是，HCO7和HCO12小鼠首先用在完全弗氏佐劑中乳化的抗原免疫。在隨后的免疫中，抗原與不完全弗氏佐劑混合。最后，在脾切除前用純化抗原進行靜脈內(nèi)注射抗原，沒有佐劑。每2-3周對小鼠免疫一次。在第三次之后和以后的免疫中，用ELISA(見下面的描述)判斷人IgG抗HER2/neu抗體滴度。產(chǎn)生抗HER2/neu IgG應答的小鼠在脾切除前用純化抗原靜脈注射三天或三天和四天，獲取應答小鼠的脾并分散為單細胞。
為產(chǎn)生抗HER2/neu抗體的雜交瘤，從血漿中含有HER2/neu抗體的小鼠得到的脾細胞與P3X63-Ag8.653細胞(保藏于ATCC，指定為ATCC CRL 1580非分泌性小鼠骨髓瘤細胞)和PEG融合。在雜交瘤長出來后(約10-14天)，用抗人IgG ELISA篩選每個包含雜交瘤的加樣孔是否產(chǎn)生人IgG。用HER2/neu ELISA進一步檢驗陽性雜交瘤的抗原特異性。
簡言之，在PBS中用0.25μg/ml的純化HER2/neu包被微型滴定板，然后用溶于PBS的5％牛血清白蛋白(BSA)終止。將從產(chǎn)生抗HER2/neu的雜交瘤得到的上清液加入每個加樣孔并在37℃孵育1-2小時。用PBS/Tween漂洗微型滴定板，然后用堿性磷酸酶連接的山羊抗人IgG Fc特異性多克隆試劑在37℃孵育1小時。在漂洗后，將微型滴定板用pNPP底物(1mg/ml)顯影，在405nm的波長下用微型滴定板讀出器讀取樣品。圖2A描述了ELISA測量的從雜交瘤3.F2，2.E8和1.D2培養(yǎng)物得到的三種上清液與重組HER2/neu的結(jié)合。有意義的結(jié)合由與培養(yǎng)基對照比較而表示的三種抗HER2/neu雜交瘤上清液而檢測。
為純化人單克隆抗體，將一些分泌對HER2/neu有特異性的人IgG抗體的雜交瘤進行亞克隆并展平。從包含5％CO2的濕潤孵育箱中的滾瓶中生長的雜交瘤培養(yǎng)物上清液中分離單克隆抗體。根據(jù)生產(chǎn)商的詳細說明通過蛋白A-瓊脂糖凝膠柱層析對抗體進行純化(Pierce，Rockford IL)。
用小鼠抗Her2/neu抗體包被微型滴定板，用5％的BSA封閉，用過度生長的SKBR-3細胞的上清液孵育，從而獲得細胞脫落的HER2/neu。然后用不同濃度的人抗HER2/neu單克隆抗體或同種型對照(人IgG1)孵育滴定板。用前面描述的方法測定與固定化的HER2/neu結(jié)合的人抗HER2/neu抗體。圖2B特別表示了ELISA測定的抗體3.F2，2.E8，1.D2，1.B10，3.B4與重組HER2/neu的結(jié)合。
產(chǎn)生(由ELISA測定的)與HER2/neu結(jié)合的人IgG的雜交瘤可以按照下面的描述進一步通過ELISA和流式細胞儀鑒定同種型、與表達HER2/neu的腫瘤細胞的結(jié)合、缺乏與HER2/neu陰性細胞結(jié)合。有表現(xiàn)出這些特征的上清液的雜交瘤被亞克隆，它們的抗體在純化后被蛋白A親和層析進一步鑒定。
經(jīng)過ELISA和流式細胞儀的測定，被篩選的12種雜交瘤產(chǎn)生與HER2/neu特異性結(jié)合的人IgG1κ抗體(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10，3.B4，1.F11，3.D11，3.D6，1.H9，2.G7，3.E8和2.E11)。這些單克隆抗體中的5種(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4)被純化并發(fā)現(xiàn)與純化HER2/neu和表達HER2/neu的人腫瘤細胞結(jié)合。這5種抗體表現(xiàn)出體外介導細胞裂解性殺滅表達HER2/neu的腫瘤細胞并抑制人腫瘤細胞生長。
另外，一種稱作14.1×3.F2的雙特異性分子，是將人抗CD89抗體14.1得到的Fab’2片段和人抗HER2/neu抗體3.F2用標準交聯(lián)程序通過二硫鍵進行化學連接而產(chǎn)生(圖13)。實施例4 鑒定抗HER/neu的人單克隆抗體和雙特異性分子人抗HER2/neu抗體和雙特異性分子與腫瘤細胞的結(jié)合進一步檢測了從五種雜交瘤上清液純化的由ELISA檢測出與HER2/neu表現(xiàn)顯著結(jié)合的單克隆抗體(3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4)與表達高水平HER2/neu的腫瘤細胞的結(jié)合能力。簡言之，將腫瘤細胞(如SKBR-3或BT-474)與抗體或抗體F(ab’)2片段一起孵育，并洗去未結(jié)合抗體。用熒光染料標記的山羊抗人F(ab’)2檢測人抗HER2/neu抗體與細胞的結(jié)合并用流式細胞儀判斷平均熒光強度。如圖3A和3B所示，與對照人抗體相比，抗HER2/neu抗體3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4顯示了與表達HER2/neu的SKBR-3細胞的顯著結(jié)合。同樣，圖3C表示抗體3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4與表達HER2/neu的BT-474腫瘤細胞在其表面的結(jié)合。圖4證明了3.F2和2.E8抗體對HER2/neu的特異性?？笻ER2/neu抗體3.F2和2.E8顯示了與表達HER2/neu的腫瘤細胞系SKBR-3和BT-474的顯著特異性結(jié)合，而它們并不與表達高水平的與HER2/neu受體(c-erB2)同族的EGF受體(c-erbB1)的A431腫瘤細胞系結(jié)合?？梢杂猛瑯臃绞綑z測包含人HER2/neu抗體或抗體片段的雙特異性分子的結(jié)合。用人抗HER2/neu抗體和雙特異性分子抑制人腫瘤細胞生長如前面所顯示的，檢測了表現(xiàn)出與HER2/neu特異性結(jié)合的抗體抑制表達細胞表面HER2/neu的人腫瘤細胞生長的能力。簡言之，純化抗體與腫瘤細胞在正常生長條件下孵育6天，用龍膽紫染色測量細胞密度。如圖5A和5B所顯示的，與對照人抗體相比，用純化人抗HER2/neu抗體3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4的處理產(chǎn)生了SKBR-3腫瘤細胞細胞密度的劑量依賴性減低。3.F2和2.E8抗HER2/neu單克隆抗體的F(ab’)2片段也以劑量依賴性方式抑制SKBR-3腫瘤細胞生長(見圖6)。另外，如圖7A所示，與對照人抗體相比，抗HER2/neu抗體3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4顯示了BT-474腫瘤細胞密度的劑量依賴性減低。圖7B表示了給予BT-474腫瘤細胞以10μg抗HER2/neu抗體3.F2和2.E8及其F(ab’)2片段，與對照抗體相比，抑制了腫瘤細胞生長?？梢杂猛瑯臃绞綑z測包含人HER2/neu抗體或抗體片段的雙特異性分子(如圖13所示)對腫瘤細胞生長的抑制。人抗HER2/neu抗體的抗體依賴性細胞介導的細胞毒(ADCC)活性也檢測了選擇性人抗HER2/neu單克隆抗體體外介導對表達細胞表面HER/neu的靶腫瘤細胞ADCC的能力。簡言之，將單核細胞從健康供體中分離并在純化抗HER2/neu抗體3.F2，2.E8和1.D2存在下與51Cr標記的SKBR-3腫瘤細胞一起孵育。4小時后，收獲從加樣孔得到的培養(yǎng)物上清液并用γ計數(shù)器測量51Cr釋放。根據(jù)下面的公式判斷特異性裂解的百分比(實驗CPM-靶滲漏CPM)/(洗滌劑裂解CPM-靶滲漏CPM)×100％。圖8A顯示了與對照人抗體相比，抗HER2/neu抗體介導的對SKBR-3腫瘤細胞的劑量依賴性裂解。在另一項研究中，將IFN-γ誘導的巨噬細胞在5μg/ml抗HER2/neu抗體3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4存在下與51Cr標記的SKBR-3細胞一起孵育。4小時后，收獲培養(yǎng)物上清液并用上述方法測量51Cr釋放。如圖8B所示，與對照人抗體相比，抗HER2/neu抗體介導了對過度表達HER2/neu的腫瘤細胞的劑量依賴性裂解。
另外，檢測了純化雙特異性分子14.1×3.F2(圖13)通過多型核細胞進行的對51Cr標記的SKBR-3或BT-474人腫瘤細胞的ADCC殺滅。在37℃下孵育過夜后，分析釋放到培養(yǎng)物上清液中的51Cr而判斷殺死腫瘤細胞的量。報告的特異性裂解是在雙特異性分子存在下，多型核細胞單獨進行的腫瘤細胞裂解產(chǎn)生的腫瘤細胞裂解量。如圖9所示，雙特異性分子14.1×3.F2以劑量依賴性方式介導的PMN對表達HER2/neu的SKBR-3和BT-474腫瘤細胞的細胞殺滅。另外，如圖10所示，雙特異性分子14.1×3.F2以劑量依賴性方式介導單核細胞對表達HER2/neu的SKBR-3和BT-474腫瘤細胞進行殺滅。在兩種情況下，加入10μg/ml 14.1 Fab’2完全阻斷了1μg/ml雙特異性分子14.1×3.F2對腫瘤細胞的ADCC，證明靶細胞專門由CD89與效應細胞結(jié)合而介導。圖11表示雙特異性分子14.1×3.F2也以劑量依賴性方式介導全血對表達HER2/neu的BT-474腫瘤細胞的細胞殺滅。
前面的例子描述了以高親和性與HER2/neu特異性反應的人單克隆抗體和雙特異性分子的產(chǎn)生。此外，這些例子證明了人單克隆抗HER2/neu抗體有效抑制表達HER2/neu的人腫瘤細胞的生長。此外，人抗HER2/neu抗體和雙特異性分子介導效應細胞存在下對表達高水平HER2/neu的人腫瘤細胞的殺滅活性。這些結(jié)果支持包括本發(fā)明抗體的抗HER2/neu完整人單克隆抗體(及其片段)和雙特異性分子對于HER2/neu相關(guān)疾病的治療非常有用的結(jié)論。實施例5 包含定向于HER2/neu和CD89(FcαR)的人抗體結(jié)合部的雙特異性和三特異性分子促進對腫瘤細胞的細胞介導細胞毒作用下面的研究涉及誘導效應細胞介導的對表達EGF受體(EGF-R)和/或HER2/neu(也稱作HER2)的腫瘤細胞殺滅的雙特異性分子的產(chǎn)生和鑒定。此雙特異性結(jié)構(gòu)包含一個與抗HER2抗體(ScFv或Fab’)連接的抗CD89(抗FcαR)抗體(ScFv或Fab’)。三特異性結(jié)構(gòu)包括與EGF融合的雙特異性抗CD89(ScFv)×抗HER-2(ScFv)結(jié)構(gòu)。融合結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生圖12和13表示每個雙和三特異性分子及它們的母體人抗體(HuMAbs)。圖12表示單鏈(ScFv)雙特異性融合分子931和934，除934包括EGF而931沒有以外，二者相同。此結(jié)構(gòu)是用14.1(抗CD89)和3F2(抗HER2)的可變輕鏈和重鏈區(qū)產(chǎn)生的。圖13表示作為陽性對照的化學結(jié)合的Fab’抗CD89×抗HER2雙特異性分子(如前面的例4所描述)。此BsAb是用14.1和3F2的Fab片段產(chǎn)生。
此單鏈雙和三特異性分子(931和934)是用質(zhì)粒(如pJZ934)轉(zhuǎn)染NOS細胞產(chǎn)生并在包含G418的培養(yǎng)基中選擇。篩選細胞系中的融合蛋白表達并用有限稀釋法亞克隆。最后，將表達融合蛋白的細胞系過蛋白L柱純化融合蛋白，然后在非還原和還原條件下將約2μg純化蛋白加入4-15％的tris-甘氨酸凝膠。934結(jié)構(gòu)主要作為三聚體純化，在還原條件下解離為單體。鑒定與腫瘤細胞結(jié)合的雙和多特異性分子用流式細胞儀鑒定雙和多特異性分子的結(jié)合。圖14(A)表示轉(zhuǎn)染瘤上清液中的融合蛋白與腫瘤細胞的結(jié)合。轉(zhuǎn)染的(931&934)和未轉(zhuǎn)染的(NSO)上清液用SKBR-3或A431腫瘤細胞系孵育。然后用與藻紅素結(jié)合的綿羊抗人IgG fab-2染色檢測融合蛋白的結(jié)合。如圖14(B)所示，從轉(zhuǎn)染細胞(931和934)得到的上清液也介導細胞裂解(ADCC)。在這些研究中，鉻釋放測定采用16-18小時的孵育期，效應細胞(單核細胞，PMN)與靶細胞(SKBR-3，A431)比例為100∶1。用轉(zhuǎn)染(931&934)和未轉(zhuǎn)染(NSO)上清液介導特異裂解，檢測腫瘤細胞殺滅。
圖15(A)表示純化雙和三特異性分子(931和934)與U937細胞(通過CD89受體)的結(jié)合活性。不與U937細胞結(jié)合的抗體425(抗EGF-RmAb)的fab-2片段作為陰性對照?？笴D89(Fab’)×抗HER2(Fab’)化學偶聯(lián)的雙特異性分子(見圖13)作為陽性對照。除檢驗了與SKBR-3細胞的結(jié)合(通過HER2受體)，圖15(B)與圖15(A)相同。抗CD89抗體的fab-2片段14.1作為陰性對照。圖16表示934三特異性結(jié)構(gòu)與A431細胞的結(jié)合。除使用了過度表達EGF-R的A431腫瘤細胞外，此實驗是按照與圖15所示相同方法進行的。包含14.1的sFv片段與EGF的融合蛋白作為陽性對照，抗CD89抗體14.1的fab-2片段作為陰性對照。效應細胞介導的表達HER2/neu和EGF-R的腫瘤細胞裂解也檢驗了單鏈雙和三特異性分子(931和934)在效應細胞存在下介導表達HER2/neu和EGF-R的腫瘤細胞的細胞裂解(ADCC)的能力。鉻釋放測定采用16-18小時的孵育期，效應細胞(單核細胞，PMN)與靶細胞(SKBR-3，A431)比例為100∶1。用轉(zhuǎn)染(931&934)和未轉(zhuǎn)染(NSO)上清液介導特異裂解，檢測腫瘤細胞殺滅。如圖14(B)所示，從轉(zhuǎn)染細胞(931和934)得到的上清液介導單核細胞、PMN和全血的細胞裂解(ADCC)。在這些研究中，鉻釋放測定采用16-18小時的孵育期，效應細胞(單核細胞，PMN)與靶細胞(SKBR-3，A431)比例為100∶1。用轉(zhuǎn)染(931&934)和未轉(zhuǎn)染(NSO)上清液介導特異裂解，檢測腫瘤細胞殺滅。
圖17和圖18表示分別在PMN和單核細胞存在下，通過單鏈雙特異性結(jié)構(gòu)進行的對SKBR-3細胞(圖17(A)和圖18(A))和BT474細胞(圖17(B)和圖18(B))的效應細胞介導的裂解。鉻釋放測定采用16-18小時的孵育期，效應細胞與靶細胞比例為100∶1?？笴D89抗體14.1的fab-2片段在每個實驗中作為陰性對照。
總之，上述研究描述了定向于并誘導效應細胞介導的腫瘤細胞殺滅的單鏈雙和多特異性分子的產(chǎn)生。上述實驗也證實這些雙和三特異性分子可以與表達CD89，EGF-R和HER2的細胞結(jié)合。重要的是，該研究證實，在表達CD89的免疫效應細胞存在下，這些雙和多特異性分子以劑量依賴性方式介導殺滅過度表達EGF-R和HER2的細胞，這種細胞殺滅是通過與效應細胞上的CD89結(jié)合而介導的。
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等同方案本領(lǐng)域的技術(shù)人員將發(fā)現(xiàn)，或可以用常規(guī)實驗確定這里描述的本發(fā)明的特定實施方案的許多等同方案。這些等同方案將包含在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
序列表序列表<110>米德列斯公司(Medarex，Inc)<120>HER2/neu的人單克隆抗體<130>MXI-160PC<140><141><150>USSN 60/146,313<151>1999-07-29<150>USSN 60/188,539<151>1999-03-10<160>13<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>372<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(372)<400>1gag gtg cag ctg ttg gag tct ggg gga ggc ttg gta cag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttt agc agc tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr phe Ser Ser Tyr20 25 30gcc atg acc tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45tca gct atc agt ggt agt ggt tat agc aca tac tac gca gac tcc gag 192Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Glu50 55 60aag ggc cgg ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac acg ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gcc gta tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aaa ggg ttt cag tat ggt tcg ggg agt tat tat acc cac ttt gac 336Ala Lys Gly Phe Gln Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Thr Hig Phe Asp100 105 110tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca 372Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120<210>2<211>124<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>2Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Glu50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Gly Phe Gln Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Thr His Phe Asp100 105 110Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>3<211>321<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)..(321)<400>3gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct gta gga48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att agc agc tgg96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa 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權(quán)利要求
1.一種特異性與HER2/neu結(jié)合的分離人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中抗體或其抗原結(jié)合部分有一種或多種下列特征a)對HER2/neu最少為約107M-1的結(jié)合親和常數(shù)；b)調(diào)理表達HER2/neu的細胞的能力；c)在人效應細胞存在下以約10μg/ml或更低的濃度體外抑制表達HER2/neu的細胞生長或介導裂解表達HER2/neu的細胞的能力；或d)在與HER2/neu結(jié)合后被表達HER2/neu的細胞內(nèi)化的能力。
2.權(quán)利要求1的分離人抗體，或其抗原結(jié)合部分，具有選自以下的同種型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgAsec，IgD和IgE。
3.權(quán)利要求1的分離人抗體，或其抗原結(jié)合部分，其為IgG1κ。
4.權(quán)利要求1的分離人抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中表達HER2/neu的細胞為腫瘤細胞。
5.權(quán)利要求4的分離人抗體，或其抗原結(jié)合部分，其中表達HER2/neu的細胞選自腺癌細胞，如唾液腺、胃和腎、乳腺腺癌細胞、肺癌細胞、鱗狀細胞腺癌細胞和卵巢癌細胞。
6.權(quán)利要求1的分離人抗體，或其抗原結(jié)合部分，由包含一個與永生化細胞融合的B細胞的雜交瘤產(chǎn)生，此B細胞由轉(zhuǎn)基因非人動物產(chǎn)生，此轉(zhuǎn)基因動物包含一個含有一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。
7.權(quán)利要求1的分離人抗體，或其抗原結(jié)合部分，由選自3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4之一的雜交瘤產(chǎn)生，以編號＿＿＿＿＿保藏在ATCC。
8.一種分離人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，人效應細胞存在時介導對表達HER2/neu的細胞的裂解。
9.權(quán)利要求8的分離人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，可以在體外以1×10-7M或更低的IC50介導人效應細胞對表達HER2/neu的細胞的裂解。
10.一種抑制表達HER2/neu細胞的生長的分離人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分。
11.權(quán)利要求10的分離人單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，可以在體外以1×10-7M或更低的IC50抑制表達HER2/neu的細胞的生長。
12.一種雜交瘤，包含一個與永生化細胞融合的B細胞，此B細胞由轉(zhuǎn)基因非人動物產(chǎn)生，此轉(zhuǎn)基因動物包含一個含有一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，其中此雜交瘤產(chǎn)生可測定量的特異性與HER2/neu結(jié)合的人單克隆抗體。
13.權(quán)利要求12的雜交瘤，其中人單克隆抗體有下列一種或幾種特征a)對HER2/neu最少為約107M-1的結(jié)合親和常數(shù)；b)調(diào)理表達HER2/neu細胞的能力；c)在人效應細胞存在下以約10μg/ml或更低的濃度體外抑制表達HER2/neu的細胞生長并介導裂解表達HER2/neu的細胞的能力；或d)在與HER2/neu結(jié)合后被表達HER2/neu的細胞內(nèi)化的能力。
14.權(quán)利要求13的雜交瘤，選自3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4一組中之一，以編號＿＿＿＿＿保藏在ATCC。
15.一種轉(zhuǎn)基因非人動物，表達與HER2/neu特異性結(jié)合的人單克隆抗體，其中此轉(zhuǎn)基因非人動物包含一個含有一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。
16.產(chǎn)生與HER2/neu特異性結(jié)合的人單克隆抗體的方法，包括用HER2/neu或表達HER2/neu的細胞免疫包含一個含有一個人重鏈轉(zhuǎn)基因和一個人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物，這樣由此動物的B細胞產(chǎn)生抗體；分離此動物的B細胞；及將此B細胞與骨髓瘤細胞融合形成永生化的分泌對HER2/neu有特異性的人單克隆抗體的雜交瘤細胞。
17.一種雙特異性分子，包含一個為人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，與HER2/neu特異性結(jié)合的的第一結(jié)合特異性，以及對Fc受體的第二結(jié)合特異性。
18.權(quán)利要求17的雙特異性分子，其中Fc受體為人FcγRI或人Fcα受體。
19.權(quán)利要求17的雙特異性分子，與Fc受體在此受體的免疫球蛋白結(jié)合位點以外的位點結(jié)合。
20.權(quán)利要求17的雙特異性分子，其中與Fc受體結(jié)合的第二結(jié)合特異性為人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。
21.權(quán)利要求17的雙特異性分子，為單鏈或Fab’融合蛋白。
22.一種多特異性分子，包含一個為人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，與HER2/neu特異性結(jié)合的的第一結(jié)合特異性，一個對Fc受體的第二結(jié)合特異性，以及一個對HER2/neu以外的腫瘤抗原的第三結(jié)合特異性。
23.權(quán)利要求22的雙特異性分子，其中第三結(jié)合特異性為EGF。
24.一種組合物，包含權(quán)利要求1的分離人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，以及可藥用載體。
25.一種組合物，包含兩種或兩種以上權(quán)利要求1的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分，其中每種該抗體或其抗原結(jié)合部分與不同HER2/neu表位結(jié)合。
26.一種抑制表達HER2/neu的細胞生長的方法，包括將表達HER2/neu的細胞與特異性與HER2/neu結(jié)合的分離人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸，這樣表達HER2/neu的細胞的生長被抑制。
27.一種誘導對表達HER2/neu的細胞進行細胞裂解的方法，包括在效應細胞存在下，將表達HER2/neu的細胞與特異性與HER2/neu結(jié)合的分離人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸，這樣發(fā)生表達HER2/neu的細胞的裂解。
28.一種治療或預防以HER2/neu錯誤表達為特征的疾病的方法，包括給予受試者可以有效治療或預防HER2/neu介導疾病用量的特異性與HER2/neu結(jié)合的分離人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分。
29.權(quán)利要求28的方法，其中人單克隆抗體與Fc受體的結(jié)合特異性相結(jié)合。
30.權(quán)利要求28的方法，其中人單克隆抗體與細胞毒素相結(jié)合。
31.權(quán)利要求28的方法，其中疾病為癌癥。
32.權(quán)利要求31的方法，其中癌癥為腺癌，如唾液腺、胃和腎、乳腺癌、肺癌、鱗狀細胞癌和卵巢癌之一。
33.檢測樣品中HER2/neu抗原或表達HER2/neu的細胞存在的方法，包括在允許抗體或其抗原結(jié)合部分與HER2/neu之間形成復合物的條件下，將樣品和對照樣品與特異性與HER2/neu結(jié)合的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分相接觸；及檢測復合物的形成，其中樣品與對照樣品之間復合物形成的不同提示HER2/neu在樣品中的存在。
34.一種表達載體，包含一個編碼特異性與HER2/neu結(jié)合的人單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分重鏈和輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)的核苷酸序列，其中抗體或其抗原結(jié)合部分有一種或多種下列特征a)對HER2/neu最少為約107M-1的結(jié)合親和常數(shù)；b)調(diào)理表達HER2/neu的細胞的能力；c)在人效應細胞存在下以約10μg/ml或更低的濃度體外抑制表達HER2/neu的細胞生長并介導裂解表達HER2/neu的細胞的能力；或d)在與HER2/neu結(jié)合后被表達HER2/neu的細胞內(nèi)化的能力。
35.權(quán)利要求34的表達載體，其中抗體或其抗原結(jié)合部分是由3.F2，2.E8，1.D2，1.B10和3.B4之一的雜交瘤產(chǎn)生，以編號＿保藏在ATCC。
全文摘要
公開了特異性與HER2/neu結(jié)合的分離人單克隆抗體及其抗原結(jié)合部分。也公開了包含特異性與HER2/neu結(jié)合的人單克隆抗體及其抗原結(jié)合部分的雙和多特異性分子。人抗體可以在非人轉(zhuǎn)基因動物如轉(zhuǎn)基因小鼠中產(chǎn)生，可以通過進行V－D－J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多種人單克隆抗體同種型。也公開了包含人抗體的藥物組合物、產(chǎn)生人抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物和雜交瘤，以及使用人抗體的治療和診斷方法。
文檔編號G01N33/574GK1399645SQ00813673
公開日2003年2月26日 申請日期2000年7月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月29日
發(fā)明者T·凱勒, Y·德奧 申請人:米德列斯公司