專利名稱：抗人IL-1α單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗人IL-α單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
IL-I (IL-Ια和IL-I β )是一種多功能的細(xì)胞因子。1972年Gery等人發(fā)現(xiàn)在人白細(xì)胞的培養(yǎng)上清中含有一種可溶性物質(zhì)，起初命名為淋巴細(xì)胞激活因子或內(nèi)源性熱原質(zhì)、破骨細(xì)胞激活因子、黑素瘤細(xì)胞生長抑制因子等，1979年國際統(tǒng)一命名為IL-1。IL-I可由多種細(xì)胞合成和分泌，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。小鼠和人的IL-I基因定位于2號染色體，含7個外顯子。IL-I在不同種屬中有較高同源性。在氨基酸水平上，IL-Ia和IL-Ιβ在不同種屬同源性分別為60%_70%和 75%-78% ；但在同一種屬中IL-I α與IL-1 β同源性只有20%_30%。IL-Ia是促炎癥細(xì)胞因子，能刺激與炎癥及免疫相關(guān)的基因的表達(dá)。IL_1 α的前體是由IL-IA基因合成的、無信號肽的31-kDa的分子。IL-Ia前體被Ca2+依賴的鈣蛋白激酶降解為17KD的成熟體和16KD的N氨基末端肽，而活化的細(xì)胞產(chǎn)生有活性的膜型的IL-I α。IL-I α無論是胞內(nèi)的前體還是膜型的IL-I α均有活化作用，因為它的分泌量有限，所以分泌的成熟體的活化作用較陌生。膜型的IL-Ια具有免疫激活作用，而胞內(nèi)的 IL-I α前體能調(diào)控內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，如基因的表達(dá)、細(xì)胞的增殖與分化。已證實包括白血病，肝癌，黑色素瘤，胃癌等在內(nèi)的多種腫瘤均表達(dá)IL-I α。腫瘤細(xì)胞本身以及在細(xì)胞因子或細(xì)菌產(chǎn)物刺激下能表達(dá)IL-I α，而原代細(xì)胞需經(jīng)過炎癥或細(xì)胞因子的刺激才會誘導(dǎo)表達(dá)IL-I α。至今仍不清楚IL-I α異常表達(dá)出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中哪一特定時期。而且IL-I α在惡性腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)機制尚不清楚。為了更方便快捷地檢測IL-I α在腫瘤中的異常表達(dá)情況及對其功能進(jìn)行研究， 制備IL-I α抗體顯得尤為重要?；谝陨戏治?，需要制備一種高特異性、高效價的鼠抗人IL-I α單克隆抗體，使其能夠用于間接免疫酶聯(lián)吸附實驗(ELISA)，免疫細(xì)胞熒光(Immunocytoflurescence)，免疫熒光流式細(xì)胞分析(Flowcytometer Analysis)等多種研究手段，以實現(xiàn)IL-1 α表達(dá)的快速通量檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種人IL-I α的單克隆抗體，利用該單克隆抗體通過免疫學(xué)方法檢測人IL-I α基因的蛋白表達(dá)水平；本發(fā)明的另一目的是提供能產(chǎn)生具有良好識別 IL-I α蛋白并能與其進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)的單克隆抗體分泌型穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞株，通過該細(xì)胞株大量生產(chǎn)均質(zhì)的、穩(wěn)定的、多用途的的單克隆抗體。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國武漢大學(xué)；保藏日期2011年1月7日；保藏編號CCTCC NO :C201102 ；分類命名雜交瘤細(xì)胞株L-1F12。上述雜交瘤細(xì)胞株的制備方法包括以下步驟
(1)利用IL-I α基因(基因序列號是ΝΜ_000575. 3)原核表達(dá)產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠以獲取能產(chǎn)生針對該蛋白特異性抗體的致敏B細(xì)胞；
⑵獲取融合細(xì)胞生長克隆從免疫合格小鼠無菌取其脾細(xì)胞作為抗原致敏的B細(xì)胞， 按常規(guī)方法，將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，然后利用常規(guī)的融合細(xì)胞HAT篩選方法進(jìn)行篩選，進(jìn)而獲取融合細(xì)胞生長克??；
'3'分泌單克隆抗體融合細(xì)胞克隆的篩選①應(yīng)用雙抗體夾心ELISA或間接ELISA檢測策略篩選分泌單克隆抗體融合細(xì)胞克隆是獲取分泌單抗細(xì)胞克隆常規(guī)手段，發(fā)明人選用了間接ELISA檢測手段進(jìn)行檢測；②使用免疫熒光流式細(xì)胞分析加以篩選即以ELISA檢測陽性的作為候選克隆，再采用免疫熒光流式細(xì)胞分析陽性作為關(guān)鍵指標(biāo)以確立其陽性克??；
(1)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的獲得采用雙篩選方法，僅獲得三株合格細(xì)胞克隆，其中一株細(xì)胞9B12 (進(jìn)行融合細(xì)胞培養(yǎng)時共用了 12塊96孔板，這里指的是第9塊板的B行 12列孔中的細(xì)胞)克隆免疫熒光信號均強于其他二株(4D3和3A7，同樣的方法編號)，將該克隆細(xì)胞按常規(guī)單細(xì)胞克隆方法進(jìn)行了二輪亞克隆并對每輪亞克隆進(jìn)行雙篩選直至所有的亞克隆均呈強雙陽性后，從中挑出一株生長最旺的單細(xì)胞克隆(編號L-1F12)擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行傳代凍存。將上述技術(shù)方案中生長最旺的單細(xì)胞克隆(編號L-1F12)送交至武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。上述技術(shù)方案中，采用步驟(D的策略是基于以下幾方面考慮
首先，原核表達(dá)產(chǎn)物作免疫原其表達(dá)量高(這是真核表達(dá)產(chǎn)物無法達(dá)到的)，易純化(通過蛋白制備電泳的方法可以獲取其純度大于85%純化物，純化周期僅需1天的時間，大大減少了該蛋白降解的可能性)。其次，該基因原核表達(dá)產(chǎn)物與天然表達(dá)蛋白能有相同的抗原識別位點完全滿足制備抗體的要求；
再次，用PCR產(chǎn)物直接免疫動物屬DNA疫苗的范疇，該技術(shù)到目前為止僅為探索階段其技術(shù)不成熟，因此不宜采用該策略；
最后，選BALB/c小鼠免疫制備檢測用單克隆抗體是通用策略，我們制備該抗體目的并不用于抗體的治療故無需制備人源化的單抗，即便需要亦可在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行研究。上述技術(shù)方案中，采用步驟￡3_的策略是基于以下幾方面考慮
ELISA的優(yōu)點是可進(jìn)行大量樣本檢測，操作時間短2 池內(nèi)可出報告，但缺點是有一定的非特異性，考慮到ELISA檢測存在一定非特異性風(fēng)險，本發(fā)明采用了雙篩選方法，與常規(guī)單抗篩選方法相比，雙篩選比單篩選提高了篩選的可靠性；此外，發(fā)明人制備的免疫原是一種融合蛋白，因此用ELISA法有可能篩選了融合蛋白的標(biāo)簽的位點而非IL-I α蛋白的位點的風(fēng)險，所以必須用另一方法確立識別的是IL-I α蛋白抗原表位來佐證。本發(fā)明同時要求保護(hù)一種人IL-I α的單克隆抗體，所述人IL_1 α的單克隆抗體由上述雜交瘤細(xì)胞株L-1F12產(chǎn)生，所述單克隆抗體為高特異性的鼠源抗IL-I α單克隆抗體，所述單克隆抗體為IgM亞類，kapa型，制備所述人IL-I α的單克隆抗體的方法有兩種 第一種方法包括以下步驟以上述雜交瘤細(xì)胞9Β12亞克隆的一株細(xì)胞1F12(即雜交瘤細(xì)胞株L-1F12 )作種子細(xì)胞用10%FBS+DMEM或10%FBS+RPMI-1640，在細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備(如轉(zhuǎn)瓶細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，在培養(yǎng)上清中可分泌鼠抗人IL-I α單克隆抗體； 第二種方法采用雜交瘤細(xì)胞株L-1F12誘生腹水的方法來生產(chǎn)該單抗蛋白； 對上述兩種方法進(jìn)行比較用ELISA法進(jìn)行效價比較發(fā)現(xiàn)腹水中抗體效價比培養(yǎng)上清(細(xì)胞濃度為106/ml)抗體的效價高出3000倍以上，故采用該方法生產(chǎn)極大的提高了單抗蛋白產(chǎn)量大大的降低了生產(chǎn)成本。上述技術(shù)方案中，用雜交瘤細(xì)胞株L-1F12反復(fù)進(jìn)行誘生腹水試驗發(fā)現(xiàn)該株能良好誘導(dǎo)產(chǎn)生大量血性腹水且目標(biāo)抗體蛋白占在腹水總蛋白的比例能達(dá)到15 20%，其每毫升抗體蛋白產(chǎn)量均已達(dá)到毫克級以上，為下一步進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠保證。本發(fā)明還保護(hù)一種利用上述抗人IL-I α的單克隆抗體檢測IL_1 α蛋白表達(dá)水平的應(yīng)用。因此，本發(fā)明同時要求保護(hù)一種利用上所述單克隆抗體采用免疫學(xué)方法檢測 IL-Ia蛋白表達(dá)水平的方法。上述技術(shù)方案中，為檢測人IL-I α蛋白表達(dá)水平，優(yōu)選地，可以使用以下免疫學(xué)方法，如間接免疫酶聯(lián)吸附試驗(ELISA)法，免疫細(xì)胞熒光試驗(Immunocytoflurescence) 法，免疫熒光流式細(xì)胞分析(Flow cytometer Analysis)等法對含多種形式IL-1 α蛋白的樣本進(jìn)行檢測。上述技術(shù)方案中，所述人IL-I α蛋白包括人IL_1 α的原核表達(dá)產(chǎn)物、人IL_1 a 的真核表達(dá)產(chǎn)物、人IL-I α表達(dá)蛋白的變性蛋白和非變性蛋白。進(jìn)一步的技術(shù)方案中，上述檢測IL-Ia蛋白表達(dá)水平的方法，可以分析在細(xì)胞或組織中IL-Ia的異常表達(dá)。上述技術(shù)方案中，所述免疫學(xué)方法屬于免疫學(xué)常見基本技術(shù)，屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)；另外根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)有的試驗結(jié)果推測，所述抗體可以應(yīng)用在免疫酶組織化學(xué)和免疫組織熒光化學(xué)試驗。由于上述技術(shù)方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點
1、在檢測人IL-I α蛋白的時候，本發(fā)明由于得到了特異性高、親和力高的抗人IL-I a 單克隆抗體，因此，本發(fā)明所述檢測方法無需提取RNA那樣非?？量痰脑囼灄l件(主要防止 RNA降解)，也無需Real-time PCR技術(shù)那樣需設(shè)嚴(yán)格的內(nèi)參和外參和利用昂貴的實時定量 PCR儀，不僅大大降低了檢測的成本，更重要的是對檢測時機的要求也大大降低了，沒有上述專利嚴(yán)格；同時由于該單抗可大量生產(chǎn)也可制備直標(biāo)抗體，而不用二級免疫試劑來降低成本和提高檢測效率。2、本發(fā)明制備了一種抗人IL-I α的單克隆抗體，該單克隆抗體具有高特異性和高親和力，能夠識別人IL-I α的原核表達(dá)產(chǎn)物，人IL-I α的真核表達(dá)產(chǎn)物。因此，利用該單克隆抗體可以簡便快速準(zhǔn)確地檢測出人IL-I α蛋白的表達(dá)水平。3、本發(fā)明制備了一種可以分泌抗人IL-I α單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株具有良好的傳代能力并能大量擴(kuò)增培養(yǎng)，能穩(wěn)定體外分泌抗體，并且分泌抗體的能力隨著培養(yǎng)代次增加沒有下降，誘生腹水的能力也不隨傳代次數(shù)的增加而改變。


雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國武漢大學(xué)；保藏日期2011年1月7日；保藏編號CCTCC NO :C201102 ；分類命名雜交瘤細(xì)胞株 L-1F12 ；
附圖1為實施例一中制備抗人IL-Ci的單克隆抗體的制備方案圖； 附圖2為實施例一中L-1F12細(xì)胞不同代次的生長曲線圖； 附圖3為實施例中單克隆抗體免疫球蛋白抗體亞型分類分析結(jié)果圖； 附圖4為實施例中流式細(xì)胞術(shù)試驗結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述 實施例一鼠抗人IL-I α蛋白單克隆抗體的制備
采用IL-I α基因原核表達(dá)產(chǎn)物作為免疫原免疫BALB/c小鼠的策略以獲取該免疫原致敏的B細(xì)胞，具體的操作方法 1.制備單克隆抗體免疫原 1.1 IL-Ia基因完整開放閱讀框片段的擴(kuò)增
直接從組織或細(xì)胞中獲取純化IL-I α蛋白制備抗體十分困難，因而通過基因工程表達(dá)產(chǎn)物制備抗體是有效的方法，要獲得基因工程表達(dá)產(chǎn)物調(diào)取目的基因是先決條件。從人新鮮血液中分離外周單核淋巴細(xì)胞(PBMC)，然后經(jīng)總RNA的提取、RT-PCR擴(kuò)增和重組轉(zhuǎn)移載體PGEM-T-IL-Ia的構(gòu)建，重組質(zhì)粒的經(jīng)測序，獲取IL_1 α基因完整開放閱讀框片段，具體包括以下步驟
aJ取2X IO6個分離的PBMC，用Trizol (Invitrogen公司產(chǎn)品)提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得mRNA互補第一鏈(cDNA)；
(2)以步驟⑴所得cDNA為模板，用上下游引物進(jìn)行100 μ 1反應(yīng)體系，使用高保真PCR 擴(kuò)增酶(Roche公司產(chǎn)品)(比普通Taq保真性高6倍左右，故調(diào)取大目的基因特別是大于 500bp的基因時宜用，且能添加A尾巴，可用于T載體連接)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，清潔； 所述上下游引物為
SEQ ID No. 1 :F :5_GGATCCATGGCCAAAGTTCCAGACATGTTTG SEQ ID No. 2 :R:5_GTCGACCTACGCCTGGTTTTCCAGTATCTGAAAG 上述引物是根據(jù)公布的IL-I α基因序列(基因序列號是NM_000575. 3)設(shè)計的將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定在SOObp位置上有明顯的條帶，與預(yù)期分子量(816bp)—致，該結(jié)果表明我們已經(jīng)獲得該基因的DNA片段。⑶將步驟⑵清潔所得的片段通過A尾巴連接到pGEM T (promega公司產(chǎn)品)載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (由本室保存)，取3-4個重組菌落克隆的重組轉(zhuǎn)移載體pGEM T-IL-I α進(jìn)行IL-I α基因的測序(測序工作由上海生工完成)，測序結(jié)果與GENBANK公布的 IL-I α (NM_000575. 3) cDNA 序列一致。1. 2重組表達(dá)載體pET3h (+) -IL-I α的構(gòu)建將步驟1. 1構(gòu)建的經(jīng)測序正確的質(zhì)粒pGEM T-IL-α和質(zhì)粒pET3h ( + Xnovagen公司產(chǎn)品)用BamHI、Sail酶于37°C酶切3小時后，電泳，割膠回收目的片段，并用T4 DNA連接酶(Fermentas公司產(chǎn)品)4°C連接過夜，得到含有重組表達(dá)載體pET3h (+)-IL-1 α的連接產(chǎn)物；
繼而將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α (由本室保存)，挑單菌落，質(zhì)粒提取酶切鑒定，陽性克隆菌保種備用。所述酶切鑒定包括以下步驟將所得重組質(zhì)粒pET3h(+)-IL-I α用BamHI、Sail 酶切經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果在0. 8kb,5. 9kb位置上各有一條明顯的條帶；與此同時，將重組質(zhì)粒進(jìn)行基因測序(測序工作由上海生工完成)，測序結(jié)果與GENBANK公布的 IL-I α (NM_000575. 3) cDNA序列一致，且目的基因插入方向正確。該結(jié)果表明我們已將 IL-Ia基因片段正確克隆于原核表達(dá)載體pET3h(+)上。1. 3 IL-I α基因原核表達(dá)產(chǎn)物的獲得與純化鑒定
將上述已經(jīng)酶切鑒定重組表達(dá)載體pET3h(+)-IL-la轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌大腸桿菌BL21 株(Invitrogen公司產(chǎn)品)，挑單個菌落至含氨芐霉素MDG (5ml)培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)過夜；然后取該培養(yǎng)液Iml加至IOOml含氨芐霉素的ZYM-5052自動誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)(注MDG培養(yǎng)基，ZYM-5052自動誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基及培養(yǎng)要求均參考文獻(xiàn)F William Studier. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures, Protein Expression and Purification. 2005，41:207 - 234)。加等體積的2XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液，于沸水浴中孵育15min，12，000r/min 4°C離心15min取上清，上樣于8塊12% SDS-PAGE制備膠(IOcmX 8cmX 1. 5mm)(每塊膠均上Iml蛋白樣本液，同時設(shè)預(yù)染蛋白分子量marker孔)于冰水浴中電泳，電泳后按預(yù)染蛋白分子量marker指示分子量割取含目標(biāo)蛋白的膠條，上述膠條剪碎后置于蛋白透析袋 (14，000-20, 000D, Pharmacia公司產(chǎn)品)中，加適量電極緩沖液浸沒后扎緊，置于^iestern Blot轉(zhuǎn)移片中央，加滿電極緩沖液后，將電泳槽置于冰水浴中進(jìn)行IlOmA電洗脫池，再將透析袋置于冰冷的0. OlM PBS(pH7. 2)中透析Mh，無菌取上清于12，000r/min 4°C離心 15min再取上清，用少許樣本進(jìn)行BCA蛋白檢測(碧云天公司產(chǎn)品)進(jìn)行含量分析和1 SDS-PAGE電泳純度，其余樣本按每份IOOul分裝_80°C凍存?zhèn)溆谩Ｉ鲜黾兓锝?jīng)測定其含量約為0.5mg/ml，經(jīng)電泳鑒定發(fā)現(xiàn)在分子量50kd位置有一條明顯蛋白條帶，其純度約90%，該條帶與我們預(yù)計目標(biāo)表達(dá)產(chǎn)物分子量一致 IL-I α (3IKd) +Tag標(biāo)簽(約20Kd)=51Kd ；經(jīng)購買的多抗(Abeam公司產(chǎn)品)進(jìn)行^festern blot鑒定為目的條帶。該結(jié)果表明已經(jīng)獲得了目的基因表達(dá)產(chǎn)物電泳純樣本，已經(jīng)能滿足作免疫原免疫小鼠制備單克隆抗體的需要。2.抗原致敏B淋巴細(xì)胞的免疫小鼠獲得
無菌取步驟1. 3所得IL-I α基因原核表達(dá)并純化的蛋白樣本(蛋白濃度1. 0mg/ml)用 0.01M PBS(pH7. 2) 10X稀釋后加等體積的弗氏完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)充分混勻后按 30 μ g/只蛋白劑量注射于5只5周齡雌性的SPF級BALB/c小鼠(由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供)腹腔中，每隔二周后按上述等蛋白劑量加弗氏不完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)腹腔免疫各一次，三次免疫后再隔一周按30 μ g/只蛋白劑量(無佐劑)進(jìn)行四免，四免后5 7天， 眼眶靜脈采血取血清作待測抗體；以步驟1. 3所述IL-I α純化蛋白(0. 5mg/ml)作固定標(biāo)準(zhǔn)抗原，做間接ELISA，效價超過1 :1000的為合格小鼠，此時無菌取其脾細(xì)胞作為抗原致敏 B淋巴細(xì)胞。ELISA效價已達(dá)到1 :1000，該結(jié)果表明我們已經(jīng)獲得了能產(chǎn)生較高效價針對原核表達(dá)產(chǎn)物特異性抗體的免疫小鼠，同時說明該小鼠脾臟內(nèi)已有抗原致敏B淋巴細(xì)胞克隆。 至此已經(jīng)完成了制備單抗第一重要階段。在此需說明的是免疫小鼠獲取抗原致敏B淋巴細(xì)胞有多種方法，本實驗采用了經(jīng)典免疫方法，該方法的優(yōu)點是免疫效果好，主要體現(xiàn)在B淋巴細(xì)胞受抗原免疫刺激時間長，受免疫刺激B淋巴細(xì)胞基因重排克隆穩(wěn)定，為以后獲取優(yōu)良穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞克隆奠定了良好的基礎(chǔ)，其缺點是免疫期長需40-50天免疫周期；另外一種方法是將抗原直接注射小鼠脾臟免疫，該方法的優(yōu)點是需要的抗原量少(10ng-2 μ g/只)，免疫期短20- 天即可，但缺點是操作困難，小鼠應(yīng)激反應(yīng)強、B淋巴細(xì)胞基因重排克隆穩(wěn)定性差，在制備該抗體時，發(fā)明人考慮需要抗原易得故用經(jīng)典免疫法以獲取高穩(wěn)定性基因重排的抗原致敏B淋巴細(xì)胞。3.融合細(xì)胞克隆的獲取和分泌抗體克隆的篩選 3. 1融合細(xì)胞生長克隆培養(yǎng)
無菌取上述一只合格小鼠脾臟，將其置于無菌培養(yǎng)皿中，10%FBS+DMEM洗滌2_3次后剪成小塊，用無菌玻璃片研磨，擠出脾細(xì)胞，30-40ml 10%FBS+DMEM吹散重懸細(xì)胞，過尼龍膜進(jìn)行細(xì)胞篩后(單細(xì)胞易于細(xì)胞融合)再用DMEM培養(yǎng)基洗滌2-3次并計數(shù)；
按脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0細(xì)胞(來源于ATCC)5:1 10 1的比例將處于對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞加入脾細(xì)胞懸浮液離心管中，用DMEM培養(yǎng)基離心洗滌2-3次，按常規(guī)PEG 細(xì)胞融合劑(北京賽馳公司產(chǎn)品)細(xì)胞融合法進(jìn)行脾細(xì)胞與SP2/0融合；融合后離心去除融合液，重懸于120ml 20% FBS + DMEM培養(yǎng)液中，并按IOOul/孔植于12塊預(yù)先長有BALB/ c小鼠腹腔巨噬或胸腺細(xì)胞飼養(yǎng)層中的96孔板的孔中，(注融合前一天按3、X104個細(xì)胞/孔加入飼養(yǎng)細(xì)胞)種植12塊96孔板，每孔加100 μ 1含2XHAT (用100XHAT儲存液 (SIGMA公司產(chǎn)品)稀釋)10%FBS + DMEM培養(yǎng)液的飼養(yǎng)細(xì)胞懸浮液；)于37°C 5% CO2培養(yǎng)，一周后用含1 XHAT 20%FBS + DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行2/3換液并繼續(xù)培養(yǎng)，于2周后培養(yǎng)出多個HAT抗性克隆(細(xì)胞克隆生長面積約占孔面積的1/4時)待篩選。3. 2分泌抗體克隆的篩選與亞克隆
各取克隆孔上清分成二份(50μ1/份)作為待檢抗體，檢測前一天將IL-I α原核表達(dá)純化蛋白(0. 5mg/ml)用 0. IM Na2C03/NaHC03(ρΗ9· 6)作 1 10 稀釋并按 IOOul/ 孔包被于96孔酶標(biāo)板(Corning公司產(chǎn)品)中，于4 °C包被過夜，用0. OlM PBS (pH7. 2)洗滌 2 次，加 200 μ 1/ 孔 5%FBS (GIBC0 公司產(chǎn)品)/0. OlM PBS (ρΗ7· 2)于 37 °C濕浮 2h，用 0. OlM PBS (pH7. 2)洗滌2次，每孔加一份待檢抗體，設(shè)SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清對照孔，37°C 濕浮 lh，0. 02%Tween20/0. OlM PBS(pH7. 2)洗滌 4 次(4X5min)，各加 IOOul 的 1 :2000 HRP conjugated goat anti-mouse IgG( H+L) 二 ( Bioworld ^wJzfeBnn ) (0. OlM PBS (pH7. 2)稀釋)二抗，同上濕浮lh，洗滌4次后，加100 μ 1/孔OPD (上海生工產(chǎn)品)/H2O2 顯色液避光顯色，IOmin后用終止液(2 mol/L H2SO4溶液)終止反應(yīng)，ELISA酶標(biāo)儀(ΒΙ0ΤΕΚ 公司產(chǎn)品)測定OD492值，以試驗孔OD492值大于對照孔OD492值2倍判讀為陽性孔。準(zhǔn)備檢測前一天將HL-60細(xì)胞擴(kuò)增于細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司產(chǎn)品)中，于37°C5% CO2培養(yǎng)；收集HL-60細(xì)胞，每管IX IO5個細(xì)胞，將細(xì)胞用0. OlM PBS(pH7. 2)洗滌2次， IOOOrpm離心5分鐘，棄上清；每管加100 μ 1待檢抗體(克隆孔細(xì)胞上清)并設(shè)SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清對照孔，于4°C孵育0. 5h ；0.01M PBS (ρΗ7· 2)洗滌2次(2X5min)，每管加100 μ 1 3% FBS/0. OlM PBS (ρΗ7·2)，并加 Iul 的 FITC conjugated goat anti-mouse IgG ( H+L) (親和純FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(重鏈和輕鏈)二抗)(Bioworld公司產(chǎn)品)二抗4°C避光孵育0.證，洗滌2次后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)上樣分析，通過對照孔判讀陽性孔，篩選出雙陽性克隆。將上述雙陽性的克隆進(jìn)行至少2輪單細(xì)胞亞克隆(方法同融合細(xì)胞生長克隆培養(yǎng))，待細(xì)胞長至30%細(xì)胞單層時再進(jìn)行上述雙篩選(同上方法)直至獲得100%雙陽性克隆后，取其中生長最旺盛一株克隆并命名為L，將該克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存和復(fù)蘇。4.雜交瘤細(xì)胞克隆不同代次的生長曲線及抗體分泌能力的穩(wěn)定性分析 4.1不同代次的生長曲線
將1 X IOVml的第一代，第五代，第十代雜交瘤細(xì)胞株按2mL/孔分別種植于6孔標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司產(chǎn)品)中，于37°C，5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在12h，Mh，36h時間點每個代細(xì)胞各取3孔充分分散后用血球計數(shù)器計數(shù)，并以時間點作為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)作為縱坐標(biāo)繪出生長曲線，得圖2。如附圖2所示用10%胎牛血清培養(yǎng)基對雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行第一代，第五代，第十代生長曲線分析，細(xì)胞的倍增時約為3-4h，而各代次生長速率亦基本一致。上述結(jié)果說明實施例一獲得雜交瘤細(xì)胞能良好的傳代并能大量擴(kuò)增培養(yǎng)；同時并不隨培養(yǎng)代次增加而生長能力下降。4. 2抗體分泌穩(wěn)定性分析
首先對L-1F12雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代，分別取第一代，第五代，第十代雜交瘤(初始細(xì)胞密度lX106/ml)培養(yǎng)過夜后的上清樣本，通過BCA蛋白測定法測定各樣本總蛋白的含量，同時將上清進(jìn)行用SDS-PAGE電泳，操作步驟同Wfestern Blot中，電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，利用Quantity One分析軟件分析抗體50Kd，25Kd 二條帶占總蛋白條帶中的比例；分析結(jié)果顯示三個代次培養(yǎng)上清平均總蛋白的含量分別為5. 25mg/ml,5. 19mg/ml, 5. 21mg/ml，而上述二條帶占總蛋白的百分比約為6. 87%,6. 95%,6. 58% ；從統(tǒng)計學(xué)分析四個代次的分泌抗體量無統(tǒng)計學(xué)上的差異；
其次，對細(xì)胞分泌上清進(jìn)行ELISA鑒定，取第一代，第五代，第十代雜交瘤(初始細(xì)胞密度2X 106/ml)培養(yǎng)過夜后的上清樣本作為一抗，以1. 3中獲得的IL-I α原核純化蛋白包板，進(jìn)行ELISA，每組別均做6個重復(fù)孔，抗原抗體使用量及操作步驟同3. 2中所描述；分析結(jié)果顯示OD492平均值分別為3. 687，3. 759，3. 453 ；從統(tǒng)計學(xué)分析三個代次的分泌抗體能力無統(tǒng)計學(xué)上的差異；
從以上結(jié)果可以說明實施例一獲得雜交瘤能穩(wěn)定體外分泌抗體，同時說明隨著培養(yǎng)代次增加而分泌抗體的能力不下降。5.目標(biāo)雜交瘤體內(nèi)誘生腹水產(chǎn)生
5. 1小鼠的預(yù)處理選擇5周齡SPF級BALB/c小鼠(平均體重21g) 10只，接種細(xì)胞前 1-2周按0. 5ml/只預(yù)先腹腔注射液體石蠟(上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品)(我們用弗氏不完全佐劑、降植烷、液體石蠟等三種試劑進(jìn)行致敏效果的比較發(fā)現(xiàn)三者無明顯差異，故選用廉價的液體石蠟)致敏。5.2接種雜交瘤細(xì)胞接種前一天，我們將上述雜交瘤細(xì)胞按1:8-10傳代待細(xì)胞處于對數(shù)生長期輕輕吹打懸浮細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)基洗滌離心2次后，并用該培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至5X106/ml，按0. 5ml/只注射于上述的預(yù)處理的BALB/c小鼠腹腔中，注射后精心飼養(yǎng)。5.3腹水的采集注射后7-12天取腹水于5ml離心管中，1000 r/min離心5min 以去除腹水中的細(xì)胞，取上清4°C 12000 r/min離心15min，取少量上清并用BCA蛋白測定法和SDS-PAGE檢測其蛋白含量和純度，同時用間接ELISA法測定其效價，并分裝-80°C凍存6.單克隆抗體免疫球蛋白抗體亞型分類分析
取上述的L-1F12克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清及腹水，利用亞類測定試紙(Roche公司產(chǎn)品)鑒定單克隆抗體免疫球蛋白亞型分類分析。檢測結(jié)果見附圖3，根據(jù)試紙顯示該抗體為IgM，kapa亞型。7.單克隆抗體的特異性分析
我們對L-1F12細(xì)胞培養(yǎng)上清及所制備腹水進(jìn)行抗體特異性分析，這也同時涉及該單克隆抗體在檢測IL-I α蛋白表達(dá)水平時的應(yīng)用。7. 1流式細(xì)胞術(shù)
操作步驟同3. 2中陽性克隆的流式細(xì)胞術(shù)篩選，細(xì)胞為人白血病細(xì)胞系HL-60，并設(shè)立對照試驗；腹水一抗稀釋比例為 1:200 ;affinity purified FITC conjugated goat anti-mouse IgM (親和純FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgM (重鏈和輕鏈)二抗)二抗稀釋比例為 1:200 ；結(jié)果顯示，該單克隆抗體能夠特異的標(biāo)記HL-60細(xì)胞，陽性標(biāo)記率均達(dá)50%以上， 說明該抗體的特異性較高，且能很好識別IL-Ia (圖4)，這也為該單克隆抗體用于腫瘤 IL-Ia異常表達(dá)的通量檢測奠定基礎(chǔ)。7. 2細(xì)胞免疫熒光分析
取流式處理的HL-60的細(xì)胞涂片，進(jìn)行熒光顯微鏡拍照，結(jié)果顯示，該單克隆抗體能很好的識別真核細(xì)胞中IL-Ia蛋白，在免疫熒光實驗中有很好的表現(xiàn)，這也說明該抗體能夠應(yīng)用于免疫組化以及IL-I α的細(xì)胞定位研究。
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于，所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國武漢大學(xué)；保藏日期2011年1月7日；保藏編號=CCTCC NO :C201102 ；分類命名雜交瘤細(xì)胞株L-1F12。
2.—種人IL-I α的單克隆抗體，所述人IL-I α的單克隆抗體由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株L-1F12產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述抗人IL-Iα的單克隆抗體檢測IL-I α蛋白表達(dá)水平的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種抗人IL-1α單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，所述單克隆抗體由雜交瘤細(xì)胞株L 產(chǎn)生，所述雜交瘤細(xì)胞株的保藏信息為保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心；地址中國武漢大學(xué)；保藏日期2011年1月7日；保藏編號CCTCC NOC201102；分類命名雜交瘤細(xì)胞株L-1F12。所述高特異性、高效價的鼠抗人IL-1α單克隆抗體，能夠采用間接免疫酶聯(lián)吸附實驗(ELISA)，免疫細(xì)胞熒光，免疫熒光流式細(xì)胞分析等多種手段實現(xiàn)對IL-1α表達(dá)的快速通量檢測。
文檔編號G01N33/577GK102296050SQ20111014253
公開日2011年12月28日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月30日
發(fā)明者劉春亮, 劉海燕, 林丹丹 申請人:劉海燕, 蘇州大學(xué)