專利名稱：一種抗人蛋白rn181的單克隆抗體及雜交瘤細(xì)胞株3953與試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體及其試劑盒。
背景技術(shù)：
肝癌是世界上最常見的致命癌癥之一，在各種癌癥中發(fā)病率居第四，大部分患有肝癌的病人都在作出診斷后的一年之內(nèi)死亡，并且在以往的20多年里死亡率都沒有下降。 一部分原因是現(xiàn)有的診斷方法并不是很有效，肝癌的發(fā)現(xiàn)和診斷較為困難，尤其是原發(fā)性肝癌發(fā)現(xiàn)時多為晚期。因此對于原發(fā)性肝癌的早期檢測可有效的提高對這種疾病的預(yù)后。 但是現(xiàn)有的肝癌血清標(biāo)志物諸如甲胎蛋白AFP和DCP缺乏足夠的檢測特異性和靈敏性，因此需要選擇更加特異性的檢測靶點(diǎn)。人蛋白RN181是一種新發(fā)現(xiàn)的具有類似E3酶活性的蛋白，它能參與蛋白酶體途徑。它具有RING指結(jié)構(gòu)域，屬于C3HC4型鋅指蛋白家族的蛋白。其基因全長716個堿基， 編碼蛋白長153個氨基酸。RING指區(qū)域是一種蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域，既往研究提示擁有 RING指的蛋白普遍具有兩方面功能①可參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)和重組、細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腫瘤抑制等多種生物過程；②RING指區(qū)域是&泛素蛋白連接酶的重要活性區(qū)域，許多含有RING指結(jié)構(gòu)域的蛋白都在泛素化途徑中起關(guān)鍵作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)人RN181蛋白在原發(fā)性肝癌細(xì)胞內(nèi)會表達(dá)下降。RN181免疫組化檢測結(jié)果顯示，所有外科手術(shù)時切除的原發(fā)性肝癌腫瘤樣本中均呈弱陽性或不表達(dá)，而相對應(yīng)的癌旁正常細(xì)胞或正常肝臟中則表達(dá)強(qiáng)烈。根據(jù)檢測到的陽性肝細(xì)胞著色程度，可將RN181的著色歸入四個不同的等級(ScoreO、 ScoreU Score2, Score3)中。koreO顯示原發(fā)性肝癌惡化的一種高度特異性狀況，呈零級著色；對應(yīng)于癌旁或正常肝樣本中三級著色。因此，抗RN181單克隆抗體將有利于原發(fā)性肝癌的診斷，并使原發(fā)性肝癌的診斷獨(dú)立于病因?qū)W之外，因而更為簡便。而其他一些腫瘤標(biāo)志物諸如KI-67、P53、PCNA的特異性和靈敏性均不理想，僅用于識別肝臟組織中的增殖細(xì)胞，相比之下，抗RN181單克隆抗體的應(yīng)用將提高原發(fā)性肝癌檢測的靈敏度和特異性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體，它具有區(qū)分原發(fā)性肝癌組織和正常組織，以及對原發(fā)性肝癌組織的作用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種雜交瘤細(xì)胞株，2010年6月25日，其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC3953。分類命名為鋅指蛋白RN181單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。—種抗人蛋白RN181的單克隆抗體，由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌所得。優(yōu)選的實(shí)施方案，抗人蛋白RN181的單克隆抗體是由上述雜交瘤細(xì)胞株通過接種小鼠腹腔，抽腹水的方法進(jìn)行制備。作為優(yōu)選，純化抗人蛋白RN181的單克隆抗體是使用protein-G和分子篩的方法， 純化后的單克隆抗體純度不低于85%。作為優(yōu)選，抗人蛋白RN181的單克隆抗體的鑒定方法是SDS-PAGE結(jié)合灰度掃描的方法。作為優(yōu)選，抗人蛋白RN181的單克隆抗體區(qū)分原發(fā)性肝癌組織和癌旁組織是通過免疫組化方法來實(shí)現(xiàn)的。作為優(yōu)選，抗人蛋白RN181的單克隆抗體對原發(fā)性肝癌組織進(jìn)行分級是通過免疫組化方法來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的另一個目的是利用抗人蛋白RN181的單克隆抗體制備一種原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒。一種原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒，包括3%H202、抗人蛋白RN181的單克隆抗體、生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、鏈霉素標(biāo)記的辣根過氧化物酶及DAB顯色緩沖液，所述抗人蛋白RN181的單克隆抗體為上述保藏編號為CGMCC3953的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體， 工作濃度為2Pg/ml。根據(jù)本發(fā)明目的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，使用原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒檢測時，需自配0.01M PBS (pH7. 4)，及使用蘇木素，蘇木素采用市售產(chǎn)品，推薦北京中杉金橋公司的產(chǎn)品。作為優(yōu)選，原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒所使用的標(biāo)本為肝臟組織石蠟切片。根據(jù)本發(fā)明目的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，其中擴(kuò)增RN181基因的引物序列為上游引物5，-CTC GAG ATG GCG TCC TAT TTC 3，，下游引物5，-GGA TCC CGT GTA CAT GGC 3，。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明的抗人蛋白RN181的單克隆抗體及利用該單克隆抗體制備的原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒可用于區(qū)分原發(fā)性肝癌組織和癌旁正常組織，以及對原發(fā)性肝癌組織進(jìn)行分級，從而實(shí)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的診斷。


圖1 S^festern-blot鑒定結(jié)果，其中2為CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181 單克隆抗體。圖2為CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體對癌旁正常組織的石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測的結(jié)果，結(jié)果顯示為score 3。圖3為CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體對病理分級為1級的癌組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測的結(jié)果，結(jié)果顯示為score 2。圖4為CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體對病理分級為2級的癌組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測的結(jié)果，結(jié)果顯示為score 1。圖5為CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體對病理分級為3級的癌組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化檢測的結(jié)果，結(jié)果顯示為score 0。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 抗RN181單克隆抗體的制備 1、接種動物
將處于液氮中的保藏編號為CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，在已用石蠟油致敏的BALB/c小鼠腹腔接種處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞約IO6個。10天后采集腹水并使用12000r/min離心IOmin得到上清，將上清用0. 22 μ m濾膜過濾。采用Protein-G親和層析純化已過濾的腹水上清先用0. 01mol/L PBS平衡柱子3個柱體積，用0. Olmol/L PBS 1 10稀釋上清，上樣，O.Olmol/L PBS洗雜質(zhì)后，用0. lmol/L鹽酸甘氨酸緩沖液(pH2. .8)洗脫，再用lmol/L This-HCl (pH9. 0)按1:100比例中和。將經(jīng)ProteinG純化的上清通過kpharose S-200分子篩脫鹽，O.Olmol/L PBS洗脫，收集的蛋白峰用12%SDS_PAGE電泳，用灰度掃描，抗RN181 單克隆抗體純度達(dá)到91.2%。2、Western-blot 鑒定
收集肝癌細(xì)胞(H印G2 )，用1 X SDS裂解緩沖液裂解后上樣，經(jīng)12%SDS-PAGE后用 Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，TTBS洗膜3次，每次 lOmin，加入使用CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體，室溫孵育Ih后，TTBS 洗膜3次，每次lOmin，二抗為Marker抗體和1 5000稀釋的羊抗鼠IgG多克隆抗體為二抗， 室溫孵育lh，TTBS洗膜3次，用濾紙吸去多余的溶液，平鋪于干凈的保鮮紙上，加入1. 4ml SuperSignal 系列Western化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液(A:B=1 1)，使膜完全浸潤于反應(yīng)液中， 迅速取出，用濾紙吸去多余液體，鋪于另一張保鮮紙上，用保鮮紙把膜包好，放入X射線攝影暗盒，在暗房中顯影。CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體出現(xiàn)單一的特異性條帶，結(jié)果如圖1所示。3、單克隆抗體濃度測定
純化后的CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體使用BIO-RAD公司生產(chǎn)的 Smart Spec plus核酸蛋白測定儀測定，其濃度為0. 818mg/ml。
實(shí)施例2 抗RN181單克隆抗體使用濃度的確定
把CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備的抗RN181單克隆抗體按4、3、2、1、0. 5ug/ml濃度進(jìn)行稀釋，對不同病理分級肝癌組織和癌旁正常組織的石蠟切片免疫組化檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單克隆抗體在濃度為2Pg/ml時，結(jié)果特異且清晰，且對不同病理分級的標(biāo)本可以進(jìn)行很好的分級，參見圖2 5。
實(shí)施例3 原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒的組成(規(guī)格為120片)及使用方法 1、試劑盒的組成
1)3% H2O2 6ml
2)2μδ/πι1抗人蛋白RN181的單克隆抗體(CGMCC3953雜交瘤細(xì)胞制備)6ml
生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、鏈霉素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)、DAB顯色緩沖液購買的是Dako REAL Envision detection system，其中各組分的體積均為6ml。
2、試劑盒的使用方法
試劑盒的使用方法相同，如下所示
1)3% H2O2每片滴一滴，室溫孵育IOmin ；
2)0.OlM PBS (PH7.4)沖洗 5minX3 次；
3)2ug/ml抗人蛋白RN181的單克隆抗體室溫孵育1小時；
4)0.OlM PBS (PH7.4)沖洗 5minX3 次；
5)生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體每片滴一滴，室溫孵育30分鐘；
6)0.OlM PBS (PH7.4)沖洗 5minX3 次；
7)鏈霉素標(biāo)記的辣根過氧化物酶每片滴一滴，室溫孵育10分鐘；
8)0.OlM PBS (PH7.4)沖洗 5minX3 次；
9)DAB顯色緩沖液每片滴一滴，室溫反應(yīng)5-lOmin ；
10)蘇木素復(fù)染lmin，鹽酸酒精(鹽酸75%酒精按1:99比例配制)分化5秒，自來水返藍(lán)1分鐘；
11)脫水、透明、封片，觀察結(jié)果。 實(shí)施例4 使用試劑盒進(jìn)行99對臨床標(biāo)本的檢測
收集中山大學(xué)腫瘤研究中心原發(fā)性肝癌手術(shù)標(biāo)本99對，每對含癌組織和癌旁正常組織，其中病理分級為1級的19對，2級的51對，3級的四對。使用試劑盒按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)，按照染色程度1、2、3、4級和染色細(xì)胞程度1 (<10%)，2 (11-50%), 3 (51-75%), and 4 (>75%)進(jìn)行評分，最后用SPSS11. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。RN181在癌旁正常組織中表達(dá)強(qiáng)烈，所有的99例癌旁正常組織都獲得評分為score 3。 對應(yīng)的癌組織RN181的表達(dá)明顯下降(Ζ = -8.864，Ρ<0. 001)。在99例樣品中，病理分級為1級的19例癌組織染色程度均為中等(score 2)，病理分級為2級的51例癌組織均呈現(xiàn)弱染色(score 1)，而剩余病理分級為3級的四例癌組織染色程度很弱甚至無染色 (score 0)。結(jié)論利用試劑盒的檢測結(jié)果與病理檢測結(jié)果完全一致。
權(quán)利要求
1.一種雜交瘤細(xì)胞株，2010年6月25日，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心， 保藏編號為CGMCC3953。
2.一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體，其特征在于是由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株分泌所得。
3.—種原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒，包括3%H202、抗人蛋白RN181的單克隆抗體、 生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、鏈霉素標(biāo)記的辣根過氧化物酶及DAB顯色緩沖液，其特征在于所述抗人蛋白RN181的單克隆抗體為權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，工作濃度為2Pg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體及雜交瘤細(xì)胞株3953與試劑盒。一種雜交瘤細(xì)胞株，其保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.3953。一種抗人蛋白RN181的單克隆抗體，由上述雜交瘤細(xì)胞株分泌所得。優(yōu)選的實(shí)施方案，抗人蛋白RN181的單克隆抗體是由上述雜交瘤細(xì)胞株通過接種小鼠腹腔，抽腹水的方法進(jìn)行制備。本發(fā)明的抗人蛋白RN181的單克隆抗體及利用該單克隆抗體制備的原發(fā)性肝癌免疫組化診斷試劑盒可用于區(qū)分原發(fā)性肝癌組織和癌旁正常組織，以及對原發(fā)性肝癌組織進(jìn)行分級，從而實(shí)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的診斷。
文檔編號G01N33/577GK102277334SQ20111017705
公開日2011年12月14日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者李明, 李月, 王穗海, 董慧敏, 黃湘 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)