一種羊血液的IgG提取物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種動(dòng)物飼料添加劑，尤其涉及一種利用羊血制成的IgG提取物及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在現(xiàn)代畜牧業(yè)中，為了提高出生動(dòng)物的存活率，降低其患病，通常在飼料中添加抗 生素、益生素等生物制劑，多年來(lái)的持續(xù)研究顯示大規(guī)模、普遍使用抗生素會(huì)導(dǎo)致胃腸道細(xì) 菌產(chǎn)生耐藥性，使得抗生素用量越來(lái)越大，應(yīng)用成本越來(lái)越高，其在畜產(chǎn)品中的殘留也直接 威脅著人類(lèi)的健康與安全；而采用益生素則效果較差，益生素所用的益生菌在動(dòng)物腸道、消 化道中存活時(shí)間短，繁殖量低，導(dǎo)致其難以產(chǎn)生理想的效果。
[0003] 針對(duì)上述問(wèn)題，本領(lǐng)域近年來(lái)嘗試使用在幼畜飼料中添加免疫球蛋白G代替部分 抗生素、益生素，從而增強(qiáng)動(dòng)物自身對(duì)疾病的免疫效果。免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig) 是具有抗體活性的，能與相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的球蛋白，普遍存在于哺乳動(dòng)物 的血液、組織液、淋巴液和體外分泌液中的蛋白質(zhì)。免疫球蛋白在動(dòng)物體內(nèi)具有重要的免疫 和生理調(diào)節(jié)作用，對(duì)于改善嬰幼兒、中老年人及免疫力低下人群的健康具有重要的作用。
[0004] 已有的研究顯示，豬、牛、羊等動(dòng)物的IgG分子一般不能通過(guò)動(dòng)物胎盤(pán)，只能依靠 吮吸初乳獲得免疫球蛋白形成被動(dòng)免疫體系。由于母體胎盤(pán)的特殊結(jié)構(gòu)，羔羊剛出生時(shí)體 內(nèi)基本沒(méi)有抗體，而自身開(kāi)始產(chǎn)生抗體的時(shí)間一般都在出生后的三周以后，羔羊從出生到 自身產(chǎn)生主動(dòng)免疫之前屬于抗體空白期。因此，羔羊出生后必須通過(guò)吸吮初乳才能獲得被 動(dòng)免疫，從而克服在生長(zhǎng)發(fā)育的早期階段免疫系統(tǒng)不健全、對(duì)病原菌感染的抵抗力弱等缺 陷。對(duì)于出生后適宜時(shí)間內(nèi)未能吃到充足初乳的幼畜來(lái)說(shuō)，就面臨著因獲得被動(dòng)免疫的能 力下降而引起低血清IgG，容易患各種傳染性疾病，使得新生仔畜抗病力降低、死亡率提高。
[0005] 由于動(dòng)物血液中含有1. 5~2%具有活性的免疫球蛋白，是一種豐富、廉價(jià)的活性 免疫球蛋白的來(lái)源，因此本領(lǐng)域最近幾年來(lái)開(kāi)展了多種從動(dòng)物血液中提取免疫球蛋白的研 究，常用的有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、變性沉淀法、超濾法、柱層析法等，目前生產(chǎn)上應(yīng)用 的主要有鹽析法、低溫乙醇沉淀法、超濾法等。其中鹽析法可以在常溫下生產(chǎn)，是操作最簡(jiǎn) 單、成本最低廉的技術(shù)方案，被本領(lǐng)域廣為使用。例如CN101766252A公開(kāi)了一種羊血高活 性免疫球蛋白濃縮物及制備方法，利用檸檬酸三鈉鹽析結(jié)合超濾法從羊血中獲得免疫球蛋 白；也有其他類(lèi)似的技術(shù)方案，利用硫酸銨鹽析結(jié)合超濾法從羊血中獲得免疫球蛋白。這兩 種技術(shù)方案均面臨如下突出的問(wèn)題：首先是分辨能力差，純化倍數(shù)低，容易在產(chǎn)物中引入非 免疫球蛋白成分，例如白蛋白和纖維蛋白；其次是脫鹽過(guò)程時(shí)間長(zhǎng)、耗水量大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明公開(kāi)了一種羊血液的IgG提取物，作為飼喂羔羊的 免疫增強(qiáng)成分，通過(guò)對(duì)提取方法的改進(jìn)不僅提高了IgG的提取率，而且保證了IgG的活性。
[0007] 具體地說(shuō)，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] -種羊血液的IgG提取物，通過(guò)如下方法制備：
[0009] 1)向羊血漿中加入硫酸銨至20%飽和度，靜置后在4°C下離心所得上清液加入硫 酸銨至50%飽和度，靜置后離心所得沉淀溶解于PBS后加入硫酸銨至33%飽和度，靜置后 離心所得沉淀為IgG提取物粗品；
[0010] 2)IgG提取物粗品用100kd的超濾膜超濾至少一次實(shí)現(xiàn)脫鹽濃縮，超濾膜的截留 物干燥后即得IgG提取物。
[0011] 上述的技術(shù)方案，通過(guò)使用不同飽和度的飽和硫酸銨，并結(jié)合PBS控制pH值在 7. 0-7. 2,提高了IgG的提取率，且不影響IgG活性。
[0012] 其中，在步驟1)中33%飽和度鹽析過(guò)程離心速度為4000~6000g，離心15~ 25min〇
[0013] 為了保證提取效率，在上述步驟中優(yōu)選采用階梯離心，步驟1)中33%飽和度鹽析 過(guò)程離心速度為6000g、5000g、4000g，各離心20min。
[0014] 也就是說(shuō)，將50%飽和度的上清液靜置后用6000印111、201^11離心，離心后所得沉 淀溶解于PBS后加硫酸銨至33%飽和度靜置后用500〇rpm、20min離心，離心后所得沉淀溶 解于？83后加硫酸銨至33%飽和度靜置后用4000印111、201^11離心，所得沉淀即為免疫球蛋 白提取物粗品。
[0015] 在本發(fā)明中，為了提高超濾脫鹽效果，步驟2)中將IgG提取物粗品溶解于PBS至 濃度為8~10%，超濾2~3次，收取截留液。
[0016] 通過(guò)上述方法，通過(guò)加入到PBS中調(diào)整pH值避免了等電聚焦現(xiàn)象的產(chǎn)生，通過(guò)少 量多次脫鹽，縮短脫鹽時(shí)間，避免靜電聚焦現(xiàn)象的產(chǎn)生。
[0017] 在此基礎(chǔ)上，申請(qǐng)人深入研究了本發(fā)明所得羊血免疫球蛋白提取物在喂養(yǎng)出生羔 羊中的應(yīng)用。
[0018] 申請(qǐng)人進(jìn)行的大量研究顯示，提取物的用量、喂養(yǎng)方法、時(shí)間等都對(duì)喂養(yǎng)后羔羊的 發(fā)病率、死亡率具有重要影響。從而確定了如下的優(yōu)化方法：采用加入到人工初乳中一次性 或分兩次飼喂的方法，人工初乳中含有IgG提取物3~12g。
[0019] 采用上述方法，其喂養(yǎng)效果最大程度的接近于完全母乳喂養(yǎng)的效果或優(yōu)于母乳喂 養(yǎng)的效果，可用作母乳喂養(yǎng)的替代品。
[0020] 優(yōu)選的，在羔羊出生后半小時(shí)或兩小時(shí)內(nèi)飼喂，人工初乳中含有IgG提取物3~ 12g，最優(yōu)選為3g-次性飼喂。在該用量下，能夠給新生羔羊提供理想的被動(dòng)免疫保護(hù)，并 能得到較好的生產(chǎn)效益。
[0021] 本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，本發(fā)明的IgG提取物在使用時(shí)還需要加入到牛乳等中 配制成人工初乳，這是本領(lǐng)域所通用的，在實(shí)際應(yīng)用中可選擇任何可用的類(lèi)型。
[0022] 本發(fā)明的技術(shù)方案，具有如下技術(shù)進(jìn)步：
[0023] i.羊血液來(lái)源廣、價(jià)格便宜、容易獲得且IgG含量較高，是提取羊IgG粗品的理想 材料。
[0024]ii.鹽析法結(jié)合超濾技術(shù)粗提羊IgG，能獲得較高濃度、純度及效價(jià)的羊IgG粗品。
[0025]iii.將提取物配制成人工初乳配方具有原料（牛奶羊IgG提取物）來(lái)源廣、配制 操作簡(jiǎn)單、免疫增強(qiáng)劑效價(jià)高、成本低、穩(wěn)定性好、使用方便等特點(diǎn)，因此，具有廣泛的應(yīng)用 推廣前景。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明的IgG提取物制備方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 在下述實(shí)施例中，申請(qǐng)人提供了本發(fā)明的若干具體實(shí)現(xiàn)，如下所用到的原料、設(shè) 備、制劑等僅為示意性的，并不構(gòu)成特別限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神基礎(chǔ) 上所進(jìn)行的改進(jìn)、替換、調(diào)整依舊屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028] 在下述實(shí)驗(yàn)中，所用的羊全血用10%的草酸鉀抗凝，抗凝血于5000rpmX15min離 心，棄去紅細(xì)胞，制備血漿，在4°C的條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 在下述實(shí)驗(yàn)中，所用的各種試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備均可從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，也可根據(jù)需要自行 配制。
[0030] 在免疫球蛋白提取物提取過(guò)程中，主要使用了鹽析使目標(biāo)蛋白沉淀和超濾法脫鹽 的步驟。在鹽析過(guò)程中，使用了硫酸銨。在超濾過(guò)程中，使用了l〇〇kd的超濾膜。
[0031] 參考附圖1所示，顯示了本發(fā)明所用IgG提取物的制備方法，取保存的血漿向其中 加入硫酸銨至其為20%飽和度，靜置后在4°C下離心得到血清。離心所得上清液以1L:189g 的比例加硫酸銨，至其為50 %飽和度，靜置過(guò)夜后在6000rpm下離心20min，所得沉淀溶解 于PBS(pH7. 0，0. 01M)，充分溶解后加入硫酸銨至其為33 %飽和度，靜置過(guò)夜后在5000rpm 下離心20min，所得沉淀溶解于PBS(pH7. 0,0. 01M)，充分溶解后加入硫酸銨至其為33%飽 和度，靜置過(guò)夜后在4000rpm下離心20min，所得沉淀即為免疫球蛋白粗提物。
[0032] 將上述所得粗提物用PBS(pH7.0,0.01M)稀釋至濃度為8~10%，然后經(jīng)過(guò) l〇〇kd濾膜超濾2~3次，收截留液，截留液干燥12~24小時(shí)后得到免疫球蛋白提取物，在 凍干條件下保存。
[0033] 經(jīng)過(guò)上述提取過(guò)程，從300L抗凝羊血原料中得到約160L羊血漿，從160L羊血漿 中提取出約7800g羊IgG粗品（濕重），超濾脫鹽后得到干粉1800g，如下表1所示。
[0034] 表1用硫酸銨鹽析法從羊血中提取IgG的測(cè)定結(jié)果
[0035]
[0036] 對(duì)所得提取物進(jìn)行/效價(jià)的測(cè)定，用雙向免疫擴(kuò)散法測(cè)定。結(jié)果表明，所提取的羊 IgG粗品，效價(jià)為2S(原羊IgG粗品濃度為lmg/ml)。
[0037] 經(jīng)檢測(cè)，所得提取物中蛋白含量（％)如下表2所示。
[0038] 表2:提取物凍干樣品中蛋白含量
[0039]
[0040] 上述顯示，本發(fā)明的提取方法所得產(chǎn)物具有理想的純度，顯著高于現(xiàn)有技術(shù)中報(bào) 道過(guò)其它類(lèi)似方案。
[0041] 為了將上述提取物用于飼喂初生羔羊，首先將其配制人工初乳，此處沿用現(xiàn)有技 術(shù)中的常見(jiàn)方案即可，如將新鮮牛乳煮沸，然后在66°c下保持1小時(shí)，連續(xù)三天，冷藏保存 備用。臨用前加入免疫球蛋白提取物，加溫至50°C，分裝入刻度奶瓶，待冷卻至40°C左右時(shí) 飼喂。為了研究飼喂所需添加量，進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。
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