一種高純?nèi)四蜃觱iii的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種血液制品的制備，具體講是涉及一種高純?nèi)四?血因子VIII的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人凝血因子VIII(FVIII)是人體最重要的凝血因子之一，在肝臟中合成，有 2332個(gè)氨基酸殘基，由兩條肽鏈所組成，重鏈分子量為90-200kDa;輕鏈分子量為80kDa， 二條肽鏈間由Ca2+連接。在人體內(nèi)的半衰期8-12小時(shí)，血漿中的含量?jī)H為0. 05-0.lmg/L。
[0003] FVIII缺乏會(huì)引起凝血障礙，導(dǎo)致甲型血友病發(fā)生，它是FVIII編碼基因突變導(dǎo) 致該凝血因子功能缺陷所致的一種凝血功能障礙性遺傳病，呈X連鎖隱性遺傳，由女性傳 遞，男性發(fā)病，全球發(fā)病率15-20人/ 10萬(wàn)人，中國(guó)發(fā)病率約2-3人/ 10萬(wàn)人。該病的主 要癥狀是輕微損傷或小手術(shù)后有長(zhǎng)時(shí)間出血傾向。出血表現(xiàn)以下幾個(gè)方面，皮膚、粘膜 出血，幼兒亦常見(jiàn)于頭部碰撞后出血和血腫；2，關(guān)節(jié)積血，表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性關(guān)節(jié)出血及血友 病性關(guān)節(jié)病，是血友病最常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)之一，多見(jiàn)于膝關(guān)節(jié)，其次為踝、髖、肘、肩關(guān)節(jié)等 處；3，肌肉出血和血腫；4，創(chuàng)傷或手術(shù)后出血；5，其他部位的出血如臟器與顱內(nèi)；另外， 三分之二的患者出現(xiàn)血尿。甲型血友病屬遺傳性疾病，目前只能通過(guò)輸注FVIII制劑進(jìn)行 替代性治療，但只要定期輸注Fill制劑，甲型血友病患者完全可以像正常人一樣生活。國(guó) 外重組人凝血因子VIII于2007年已進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，但其昂貴的價(jià)格讓普通患者望而卻 步，而且，也有越來(lái)越多的臨床數(shù)據(jù)顯示，頻繁注射重組人凝血因子VIII的患者體內(nèi)會(huì)產(chǎn) 生抑制物，使得凝血效果明顯下降。
[0004] 國(guó)內(nèi)目前血制品公司供應(yīng)臨床的FVIII產(chǎn)品數(shù)量十分有限，難以滿足國(guó)內(nèi)甲型血 友病患者的使用要求。究其原因，主要是傳統(tǒng)的FVIII生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定，導(dǎo)致產(chǎn)品得率低， 另外由于雜蛋白含量偏高，F(xiàn)VIII比活低，產(chǎn)品不穩(wěn)定，外觀差，熱穩(wěn)定性不好，常導(dǎo)致產(chǎn)品 報(bào)廢。
[0005] 本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種從冷沉淀中分離純化FVIII的新方法，優(yōu)化了制備工藝的參 數(shù)，特別是采用了兩步層析純化工藝，克服了目前生產(chǎn)工藝普遍存在的比活低（一般低于 50IU/mg)、得率低（一般低10萬(wàn)IU/噸血漿）及產(chǎn)品外觀較差(凍干粉復(fù)溶液有析出物，乳 光明顯）的缺點(diǎn)，具有比活高、質(zhì)量穩(wěn)定，合格率高的優(yōu)點(diǎn)，可以大規(guī)模進(jìn)行生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種工藝穩(wěn)定、產(chǎn)品合格率高、質(zhì)量?jī)?yōu)良及使 用安全的人凝血因子VIII的制備方法。
[0007] -種高純?nèi)四蜃覸III的制備方法，包括如下步驟： (1 )冷沉淀溶解：按1:4-10的重量比，將冷沉淀投入預(yù)先配制的溶解緩沖液中， 溫度控制在15_30°C，攪拌1. 5-3小時(shí)，使其充分溶解； (2 )氫氧化鋁凝膠吸附與壓濾：步驟（1)所得到的溶解液中加入A1(0H)3凝膠，充 分?jǐn)嚢?. 5-1. 5小時(shí)，然后用頗爾公司生產(chǎn)的Supradur50P濾板串聯(lián)1.ΟμL?濾芯壓濾， 收集澄清濾液，過(guò)濾前用步驟（1)所述溶解緩沖液預(yù)洗濾板及濾芯； (3 )S/D病毒滅活：步驟（2)所收集的濾液中加入Tween80至1.0% (wt%)，ΤΝΒΡ(磷酸三丁酯）至〇. 3% (wt% )，攪勻后升溫至24-26°C，后保溫6-8小時(shí)，然后用0. 45μm 濾芯澄清過(guò)濾，收集濾液； (4 )陰離子交換柱層析：步驟（3)所收集的濾液上陰離子交換柱，柱子預(yù)先用平衡 緩沖液A充分平衡，上柱結(jié)束后，用平衡緩沖液A沖洗柱子，后用洗滌緩沖液A洗滌柱子， 再用洗脫緩沖液A洗脫柱子，收集洗脫液即為純化的FVIII溶液，及時(shí)用0.45μm濾芯進(jìn) 行過(guò)濾，收集濾液； (5 )疏水柱層析：步驟（4)所收集的濾液中加入氯化鈉至1.8M-2.0M，然后上疏 水柱，柱子預(yù)先用平衡緩沖液B充分平衡，上柱結(jié)束后用平衡緩沖液B沖洗柱子，后用洗 滌緩沖液B洗滌柱子，再用洗脫緩沖液B洗脫柱子，收集洗脫液即為高純FVIII溶液；用 0. 45μm或0. 22μm濾芯過(guò)濾以上洗脫液； (6 )超濾：用超濾膜包濃縮以上濾液，然后恒體積透析5-7倍，再濃縮至凝血FVIII效價(jià)高于35IU/ml;后移出超濾膜包并后洗膜包； (7 )加穩(wěn)定劑及調(diào)節(jié)：將FVIII含量稀釋至所需值(一般規(guī)格為20-30IU/ml)，加 入穩(wěn)定劑，后調(diào)PH值至6. 50-7. 50 ; (8 )納米膜除病毒過(guò)濾：用0. 1μπι濾芯串聯(lián)15-20納米濾芯進(jìn)行除病毒過(guò)濾； (9 )除菌過(guò)濾及分裝：用0. 22μm濾芯對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行除菌過(guò)濾并分裝； (10 )凍干； (11 )干熱病毒滅活：在100°c沸水浴中保溫0.5-1小時(shí)，進(jìn)行干熱病毒滅活。
[0008] 步驟⑴所述的溶解緩沖液由TRIS(三羥甲基氨基甲烷)、氯化鈉、甘氨酸、 肝素鈉及水組成，所述的溶解緩沖液中TRIS的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為 0. 1M-0. 15M，甘氨酸的濃度為0. 5-1. 5%(wt%)，肝素鈉的加入量為2000-8000IU/升，所 述的溶解緩沖液的PH值為6. 50-7. 50。
[0009] 步驟（2)所述的氫氧化鋁凝膠的加入量為80-160克/千克懸浮液。
[0010]步驟（4)所述的陰離子交換柱充填的樹(shù)脂為DEAESepharoseFF、CaptoDEAE、 QsepharoseFF、CaptoQ及QSepharoseHP中的任意一種；所述的平衡緩沖液A、洗滌 緩沖液A及洗脫緩沖液A均由檸檬酸鈉、氯化鈉、甘氨酸、氯化鈣及水組成；所述的平衡緩 沖液A中，檸檬酸鈉的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為0. 075M-0. 15M，甘氨酸的濃 度為0. 5-1. 5%，氯化鈣的濃度為0. 005M-0. 015M，PH值為PH6. 50-7. 50 ;所述的洗滌緩 沖液A中，檸檬酸鈉的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為0. 2M-0. 3M，甘氨酸的濃度 為0. 5-1.5%(wt%)，氯化鈣的濃度為0. 005M-0. 015M，PH值為PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脫 緩沖A液中，檸檬酸鈉的濃度為0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為0. 5M-2. 0M，甘氨酸的濃 度為 0. 5-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃度為 0. 001M-0. 005M，PH值為PH6. 50-7. 50。
[0011]步驟（5)所述的疏水柱的填料為CaptoPhenyl(LS)，PhenylSepharose 6FF(LS)，OctylS印harose4FF中的任意一種；所述平衡緩沖液B、洗滌緩沖液B均由 檸檬酸鈉、氯化鈉、甘氨酸、氯化鈣及水組成；所述的平衡緩沖液B中，檸檬酸鈉的濃度為 0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為1. 8M-2M，甘氨酸的濃度為0. 5-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃 度為0.01M-0.02M，PH值為PH6. 50-7. 50 ;所述的洗滌緩沖液B中，檸檬酸鈉的濃度為 0. 01M-0. 02M，氯化鈉的濃度為0. 6M-1. 6M，甘氨酸的濃度為0. 5-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃 度為0.01M-0.02M，PH值為PH6. 50-7. 50 ;所述的洗脫緩沖液B由檸檬酸鈉、甘氨酸、氯 化鈣及水組成；所述的洗脫緩沖液B中，檸檬酸鈉的濃度為0. 005M-0. 01M，甘氨酸的濃度 為 0· 1-1. 5%(wt%)，氯化鈣的濃度為 0· 001M-0. 003M，PH值為PH6. 50-7. 50。
[0012] 步驟（6 )所述的超濾膜包的超濾膜截留分子量為10K-30K。
[0013] 步驟（7 )所述的穩(wěn)定劑為甘氨酸、組氨酸、亮氨酸及谷氨酸中的一種或幾種組 合，所述甘氨酸的加入量為0.5-3%(wt%)，所述組氨酸的加入量為0.5-3% (wt%)，所述亮 氨酸的加入量為0.1-3% (wt%)，所述谷氨酸的加入量為0.1-3% (wt%)。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于：（1)本發(fā)明采用陰離子交換層析結(jié)合疏水層析純化FVIII， 所得FVIII比活可達(dá)300IU/mg左右，遠(yuǎn)高于目前傳統(tǒng)工藝制備的產(chǎn)品；（2)本發(fā)明采用壓 濾法取代離心法獲得