發(fā)明領域

本發(fā)明涉及單克隆抗體構建體或抗體片段，其對呼吸道合胞體病毒(rsv)的融合蛋白(f蛋白)具有特異性，編碼所述抗體構建體或片段的核酸，和表達所述抗體構建體或片段的細胞系。本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生所述單克隆抗體構建體或抗體片段的方法，和所述單克隆抗體構建體或抗體片段用于治療或預防具有常規(guī)或突變的形式的f蛋白的rsv的感染的應用。

相關領域描述

呼吸道合胞體病毒(rsv)是人呼吸道感染的最常見病因之一，并且是嬰兒住院治療的首要原因，以及嬰兒死亡的首要病毒因素。每年冬季都有rsv流行病復發(fā)。每年的爆發(fā)嚴重性可能會有變化，這歸因于兩種主要rsv株a組和b組的共同傳播。在給定的年度流行過程中，群體中的大部分發(fā)展rsv上和/或下呼吸道感染。

全部嬰兒中有約2/3在其生命第一年中感染rsv。發(fā)病率高峰出現(xiàn)在2-8月齡；截至2歲時，有99％的兒童已感染過rsv至少一次，且36％已感染至少兩次。這些rsv感染中的大部分導致輕度上呼吸道疾病和感冒樣癥狀?？傮w上，4-5百萬4歲以下的兒童經(jīng)歷rsv感染，且美國有多于120,000兒童每年因該感染而住院治療。

人們努力開發(fā)有效疫苗，但長期以來未能成功。甚至在重復疫苗接種之后，人免疫系統(tǒng)也無法產(chǎn)生充分保護性的基于抗體的免疫應答。每年復發(fā)的感染甚至常見于免疫功能正常的先前感染過的個體，雖然在具有完整免疫系統(tǒng)的較年長的兒童和成人中少見住院治療。疫苗接種或重復感染之后的保護性免疫缺失的原因目前未知。目前，幾乎沒有可用于rsv下呼吸道感染的治療方案，并且，必須在感染發(fā)作時及時開始治療以抑制病毒有效復制。在1986年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(fda)批準了利巴韋林，其為一種廣譜抗病毒劑，用于治療患有嚴重rsv疾病的兒童。

f蛋白介導病毒膜與靶細胞膜的融合，因此介導病毒基因組進入靶細胞。f蛋白包埋進入感染的細胞膜，介導感染的細胞及其相鄰物之間的融合，導致rsv感染特征性的合胞體形成。f蛋白是i型融合蛋白，其由亞穩(wěn)的融合前構象重排成高度穩(wěn)定的融合后結構。蛋白質(zhì)中的該結構變化是膜融合所需的。結合至抗原性位點ii/a的抗體干擾該結構變化，由此預防靶細胞感染、感染的細胞與相鄰細胞的融合，和合胞體的后續(xù)形成。

融合機制的抑制防止體外和體內(nèi)感染，有效地中和病毒。先前的動物實驗指示，針對rsv感染的保護主要由中和抗體，尤其是針對rsv顆粒表面上的f蛋白的抗體提供。鼠源性單克隆抗體，例如med-493(也稱為帕利珠單抗或synagis)被后續(xù)開發(fā)用于處于rsv感染的風險的人(boeckh,m等，2001)。帕利珠單抗在1998年通過fda批準用于高風險患者，并且是目前批準用于人的針對rsv的唯一單克隆抗體。

采用對rsva2株的f蛋白具有特異性的鼠源性中和抗體，構建了中和和融合中涉及的表位的詳細拓撲學和操作圖。鑒定了三種非重復抗原性位點(a、b和c)和一個橋接位點(ab)。市售可得的抗rsv單克隆抗體，帕利珠單抗，結合至成熟f蛋白胞外結構域的高度保守區(qū)域，稱為抗原性位點ii或位點a(抗原性位點ii/a)，據(jù)稱其涵蓋氨基酸262-275。

帕利珠單抗的安全性和功效驗證了抗原性位點ii/a是至關重要且有效的單克隆抗體靶標，用作預防性手段以預防感染。不過，rsv株有一亞集對于帕利珠單抗具有抗性，并且采用帕利珠單抗可選擇所述抗性株。

第二代抗體，莫維珠單抗，通過處理帕利珠單抗的六個互補決定區(qū)(cdr)中的個體氨基酸而產(chǎn)生。這些區(qū)域中的氨基酸各自被任何氨基酸取代，并且選擇具有優(yōu)于帕利珠單抗的改善的功效且不改變對于確定表位的特異性的最佳組合。莫維珠單抗比其前體帕利珠單抗有力約十倍，這歸因于其對f蛋白的更高親和性。然而，莫維珠單抗不提供針對具有造成下呼吸道感染的高風險的患者中的rsv感染的保護的顯著改善，并且具有出現(xiàn)不希望的副作用的較高風險，尤其是過敏反應。fda未批準莫維珠單抗用于人。臨床結果顯示，對現(xiàn)有抗體序列中的少數(shù)氨基酸進行處理可能會增加人中嚴重副作用的風險。

已進行改善帕利珠單抗抗體的其它嘗試。在授予spits的rsv特異性結合分子和用于生產(chǎn)它們的手段(rsv-specificbindingmoleculesandmeansforproducingthem)(u.s.8,562,996)中，提供了針對rsv的不同表位區(qū)域的高親和性抗體。似乎該抗體針對某些rsv株的ic50可高于帕利珠單抗。在gurnett的針對呼吸道合胞體病毒f蛋白的人抗體及其使用方法(humanantibodiestorespiratorysyncytialvirusfproteinandmethodsofusethereof)(u.s.14/207797)中，公開了與帕利珠單抗具有重疊表位區(qū)域的抗體，其具有較高親和性，并且能夠中和a亞型和b亞型rsv。然而，尚無參考文獻公開任何抗體中和不被帕利珠單抗中和的rsv分離物的能力的任何差異。

因此，極其需要靶向廣泛rsv株，包括帕利珠單抗抗性株，的新抗體。此外，對于具有較低的人中不利反應的風險的抗體有興趣。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)預測：識別rsv的f蛋白的完全人抗體構建體能夠中和帕利珠單抗抗性rsv株和帕利珠單抗敏感性rsv株。此外，提供方法和組合物以進一步增強抗體的藥物動力學和細胞毒性。

顯示帕利珠單抗抗性的所有rsv株已顯示包含f蛋白上的抗原性區(qū)域ii/a中特定區(qū)域中的氨基酸變化(zhao,x等，2004)。例如，體外選擇的帕利珠單抗抗性rsv株在融合蛋白的位置272處具有突變，從賴氨酸到天冬酰胺、甲硫氨酸、蘇氨酸、谷氨酰胺，或谷氨酸。在突破患者中檢測到位置272和275處包含突變的變體。

f蛋白抗原性區(qū)域ii/a作為預防rsv感染(包括下呼吸道道感染)的靶標的合適性已通過帕利珠單抗的功效證實。盡管先前報告抗原性區(qū)域ii/a中的大多數(shù)表位在a亞組病毒中恒定，但位點ii/a中的若干表位在b亞組病毒中具有高變性。在測試的所有臨床分離物中，f蛋白上的抗原性位點ii/a，尤其是帕利珠單抗和莫維珠單抗覆蓋的表位(262-275的區(qū)域中的氨基酸位置)以1/20的頻率經(jīng)歷突變。帕利珠單抗無效于預防這些突變體株所致的下呼吸道道感染。因此，在其中于這些氨基酸位置處發(fā)現(xiàn)突變的情況中，相較于帕利珠單抗和莫維珠單抗，靶向相同抗原性區(qū)域的抗體可顯示改善的功效。因此，急需開發(fā)以高于帕利珠單抗的親和性結合至rsvf蛋白的抗原性區(qū)域ii/a并且能夠預防和/或治療帕利珠單抗抗性rsv株所致的感染的新單克隆抗體。

嚴重的過敏性反應是基于抗體的預防和/或治療介入的常見副作用，其高度限制了此類抗體的使用。已在莫維珠單抗的臨床測試過程中觀察到嚴重的過敏性副作用。例如，臨床測試中觀察到頻率增加的超敏反應，包括表明過敏性反應的情況。用多個劑量的莫維珠單抗治療的若干患者發(fā)展出抗藥物抗體(ada)并且具有歸因于ada的嚴重的過敏性反應。帕利珠單抗和莫維珠單抗均為鼠源性且非人來源。莫維珠單抗在cdr處的重新設計的氨基酸結構及其剩余鼠序列是后期臨床研究中負面反應的可能原因，而莫維珠單抗最后被認為不具有人類應用安全性。

針對病原體例如rsv通過人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體固有地顯示與人自身抗原反應的較低傾向。在一個優(yōu)選實施方式中，靶向rsv的本文所述的新抗體構建體或抗體片段是完全從人來源構建的。

帕利珠單抗不足以預防由每種rsv分離物所致的感染。因此，極其需要對rsv抗原性區(qū)域(例如ii/a)具有特異性的完全人、高-親和性抗體構建體或抗體片段。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段優(yōu)選識別帕利珠單抗敏感性rsv株和帕利珠單抗抗性rsv株。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段優(yōu)選地具有大于約10^-9m，且優(yōu)選大于約10^-10m，或大于約10^-11m的親和性常數(shù)。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段識別并中和a型和b型型人rsv株。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段識別并中和多于一種rsv株，且優(yōu)選地，一種或多種帕利珠單抗抗性rsv株。

在本發(fā)明的一個實施方式中，描述了對rsv抗原性區(qū)域ii/a具有特異性，以及至少10^-9m且優(yōu)選大于10^-10m的親和性常數(shù)的完全人抗體構建體或其片段。在另一個實施方式中，所述完全人抗體構建體或其片段能夠中和a型和b型rsv病毒株。在一個實施方式中，所述抗體能夠抑制帕利珠單抗的結合。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段中和一種或多種帕利珠單抗抗性株。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包含編碼重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)的一種或多種cdna序列的細胞，其中，各cdna序列構建自rsv-感染的人，該細胞產(chǎn)生包含所述重鏈可變區(qū)和/或所述輕鏈可變區(qū)的抗體構建體或抗體片段，從而，所述抗體構建體或其片段結合至rsv抗原性區(qū)域ii/a。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于1x10^-9的親和性結合至rsv抗原性區(qū)域ii/a。在一個實施方式中，所述細胞是真核細胞。在一個實施方式中，所述細胞是哺乳動物細胞。在一個實施方式中，所述細胞是植物細胞。在一個實施方式中，所述細胞是hek293t細胞。在一個實施方式中，所述細胞是煙草細胞。

在一個實施方式中，所述重鏈可變區(qū)cdna序列偶聯(lián)至編碼人免疫球蛋白的恒定區(qū)的cdna序列。在一個優(yōu)選實施方式中，所述恒定區(qū)cdna序列來自重鏈可變區(qū)和/或輕鏈可變區(qū)不同的患者。在一個實施方式中，所述人免疫球蛋白來自igg1。

在一個實施方式中，重鏈可變區(qū)cdna序列包含與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。在一個實施方式中，編碼所述抗體構建體或抗體片段的重鏈的互補決定區(qū)(cdr)1的核苷酸序列包含與seqidno.:5的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。在一個實施方式中，編碼所述抗體構建體或抗體片段的重鏈的cdr2的核苷酸序列包含與seqidno.:6的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。在一個實施方式中，編碼所述抗體構建體或抗體片段的重鏈的cdr3的核苷酸序列包含與seqidno.:7的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

在一個實施方式中，輕鏈可變區(qū)cdna序列偶聯(lián)至編碼人免疫球蛋白的輕鏈恒定區(qū)的cdna序列。在一個優(yōu)選實施方式中，所述恒定區(qū)cdna序列來自輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)不同的患者。在一個實施方式中，所述人免疫球蛋白來自igg1。

在一個實施方式中，輕鏈可變區(qū)cdna序列包含與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。在一個實施方式中，編碼所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈的cdr1的核苷酸序列包含與seqidno.:11的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。在一個實施方式中，編碼所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈的cdr2的核苷酸序列包含與seqidno.:12的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。在一個實施方式中，編碼所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈的cdr3的核苷酸序列包含與seqidno.:13的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及本文所述的cdna序列。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及通過本文所述的cdna序列編碼的rna分子。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及結合至rsv抗原性區(qū)域ii/a的抗體構建體或抗體片段。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于1x10^-9m的親和性結合至rsv抗原性區(qū)域ii/a。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和至少一種rsv株。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和對帕利珠單抗具有抗性的一種或多種rsv株。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少2倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少3倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少4倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少5倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少10倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少15倍大于帕利珠單抗的中和能力。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的重鏈可變區(qū)包含與seqidno.:1的具有至少90％序列同源性的氨基酸序列的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的重鏈的cdr1的氨基酸序列包含與gasinlyd(seqidno.:8)具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的重鏈的cdr2的氨基酸序列包含與gyisgst(seqidno.:9)具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的重鏈的cdr3的氨基酸序列包含與ardvgwgpqyyygldv(seqidno.:10)具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈的cdr1的氨基酸序列包含與hsvqsts(seqidno.:14)具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈的cdr2的氨基酸序列包含與ggs(seqidno.:15)具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈的cdr3的氨基酸序列包含與qqsdrsppit(seqidno.:16)具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段識別rsv的f蛋白上的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段識別rsvf蛋白的抗原性區(qū)域ii/a中的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段識別與seqidno.:23和/或seqidno.:24的表位具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。

在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或片段是完全人的。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是嵌合的。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是人源化的。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含(a)重鏈互補決定區(qū)(cdr)1，其包含氨基酸序列gasinlyd(seqidno.:8)；(b)重鏈cdr2，其包含氨基酸序列gyisgst(seqidno.:9)；(c)重鏈cdr3，其包含氨基酸序列ardvgwgpqyyygldv(seqidno.:10)；(d)輕鏈cdr1，其包含氨基酸序列hsvqsts(seqidno.:14)；(e)輕鏈cdr2，其包含氨基酸序列ggs(seqidno.:15)，和(f)輕鏈cdr3，其包含氨基酸序列qqsdrsppit(seqidno.:16)。

在本發(fā)明的一個方面中，構建所述抗體或抗體片段以包含缺乏巖藻糖和木糖的聚糖，和/或納入fc區(qū)域，其適于以低于ar201至少10倍(或100倍)的親和性結合至新生兒上皮細胞受體fcrn。在一些實施方式中，所述抗體是ar201的修飾形式，例如，保留本文鑒定的6個cdr。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包含本文所述的抗體構建體或抗體片段以及藥學上可接受的運載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是凍干的。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段在水性溶液中。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于靜脈內(nèi)治療的袋，其包含本文所述的抗體構建體或抗體片段和藥學上可接受的運載體、稀釋劑或賦形劑。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生抗體構建體或其功能部分的方法，所述方法包括：在其中cdna序列被表達的條件下培養(yǎng)上述細胞，由此產(chǎn)生特異性結合至rsv抗原性區(qū)域ii/a的抗體構建體或片段。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體或其片段以大于1x10^-9m的親和性結合至rsv抗原性區(qū)域ii/a。在另一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體或其片段能夠中和至少一種rsv株。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述抗體或其片段能夠中和對帕利珠單抗具有抗性的一種或多種rsv株。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包含本文所述的抗體構建體或抗體片段的色譜柱或膜，其中，所述抗體構建體或抗體片段結合至所述色譜柱或膜。在一個實施方式中，所述色譜柱或膜包含蛋白a，例如蛋白a樹脂。在一個實施方式中，所述色譜柱或膜包含離子交換樹脂。在一個實施方式中，所述色譜柱或膜包含疏水電荷誘導色譜柱。

一方面，本發(fā)明涉及用于治療由rsv感染的患者的方法，該方法通過向所述患者給予本文所述的抗體構建體或抗體片段來進行。一方面，本發(fā)明涉及用于預防具有rsv感染風險的患者中rsv感染的方法，所述方法通過給予該患者本文所述的抗體構建體或抗體片段來進行。給予可通過專業(yè)臨床醫(yī)師確定的任何合適的方法進行。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段經(jīng)肌內(nèi)或靜脈內(nèi)給予。

附圖的簡要說明

圖1是從選擇和培養(yǎng)的人淋巴細胞分離對rsvf蛋白具有特異性的抗體的方法的示意圖。

圖2描述了ar201的重鏈的可變區(qū)的氨基酸序列(seqidno.:2)和完整核苷酸序列(seqidno.:1)。

圖3描述了ar201的κ輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列(seqidno.:4)和完整核苷酸序列(seqidno.:3)。

圖4描述了ar201的重鏈的可變區(qū)的cdr區(qū)域的氨基酸序列(seqidno.:8；seqidno.:9；seqidno.:10)和完整核苷酸序列(seqidno.:5；seqidno.:6；seqidno.:7)。

圖5描述了ar201的輕鏈的可變區(qū)的cdr區(qū)域的氨基酸序列(seqidno.:14；seqidno.:15；seqidno.:16)和完整核苷酸序列(seqidno.:11；seqidno.:12；seqidno.:13)。

圖6描述了純化的ar201(●)和人非特異性單克隆igg1(▲)在寬濃度范圍上與rsv-eia抗原的結合。

圖7描述了ar201對rsv-a和rsv-b的參照株的識別和結合。

圖8a和8b比較了ar201(黑色短線)和帕利珠單抗(白色短線)對rsv的臨床分離物的識別。

圖8c指示ar201和帕利珠單抗與rsv的臨床分離物的結合比率。黑色短線指示ar201超過帕利珠單抗對相應的臨床rsv分離物的結合的結合比率大于5，指示臨床分離物對帕利珠單抗的抗性。

圖9a提供臨床分離物的f蛋白的核苷酸序列(seqidno.:17)，其對帕利珠單抗具有抗性。

圖9b描述對帕利珠單抗具有抗性的一種臨床分離物的f蛋白的氨基酸序列(seqidno.:18)。

圖10提供帕利珠單抗表位區(qū)域(seqidno.:23)的氨基酸序列，以及由ar201識別的帕利珠單抗抗性株的f蛋白的對應氨基酸序列(seqidno.:24)。

圖11提供由包含帕利珠單抗表位區(qū)域的片段的rsvf蛋白的asp-n消化所得的預測的肽(seqidno.:25和seqidno.:26)。

圖12描述由ar201(黑色短線)或帕利珠單抗(白色短線)結合的rsvf蛋白的asp-n切割。

圖13的圖表顯示，相較于帕利珠單抗，im給予ar201在保護大鼠不受rsv攻擊方面的相對預防有效性。

發(fā)明詳述

應理解，本發(fā)明不限于所述的具體實施方式，因為它們可具有變化形式。還應理解，本文所用術語的目的僅是描述具體實施方式，不用來構成限制，因為本發(fā)明的范圍僅受所附權利要求書的限制。

僅出于讀者便利的考慮，本發(fā)明的詳細描述被分成多個部分，任何部分中的公開均可與另一部分中的內(nèi)容合并。除非另有說明，本文所用的所有科技術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員所理解的通常含義相同。

應注意到，本文和所附權利要求書所用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“這種”包括復數(shù)含義，除非另有明確說明。因此，比如引用“一種化合物”包括引用多種化合物。

定義

除非另有說明，本文所用的所有科技術語與本發(fā)明所屬領域普通技術人員所理解的通常含義相同。如本文中所用，以下術語具有以下含義。

術語“約”用于數(shù)字標號例如溫度、時間、量和濃度等包括范圍之前，表示可在(+)或(-)10％、5％或1％內(nèi)變化的近似值。

“包括”或“包含”意在表示所述組合物和方法包括所提及的要素，但并不排除其它要素。當用以定義組合物和方法時，“基本由……組成”應表示排除出于所述目的對于該組合物具有任何基本意義的其它要素。因此，本文所述的基本由要素們組成的組合物應不排除本質(zhì)上不影響本發(fā)明的基本特點和新特點的其它材料或步驟?！坝伞M成”表示排除多于其它成分的微量元素和基本方法步驟。通過各個這些轉(zhuǎn)換術語定義的實施方式在本發(fā)明范圍內(nèi)。

“藥學上可接受的組合物”指適于給予人的組合物。所述組合物包括多種賦形劑、稀釋劑、運載體，和本領域技術人員熟知的此類其它無活性試劑。

“治療有效量”或“治療量”指這樣的一定量的藥物或試劑，在將它們給予具有某一病癥的患者時，它們將具有意圖的治療效果，例如，緩和、改善、減輕或消除該患者中病癥的一種或多種表現(xiàn)。治療有效量將根據(jù)如下因素而變化：患者和待治療的病癥、對象體重和年齡、病癥嚴重性、鹽、溶質(zhì)，或所選活性藥物部分的衍生物、所選具體組合物或賦形劑、遵循的給藥方案、給予時間、給予方式等，它們均可由本領域普通技術人員容易地確定。完全治療效果不一定通過給予一個劑量而獲得，而是可能只有在給予一系列劑量之后才能獲得。因此，可以一次或多次給藥形式給予治療有效量。

“治療”、“處理”和“調(diào)治”定義為采用試劑對疾病、紊亂或病癥產(chǎn)生作用，以減少或改善該疾病、紊亂或病癥的有害的或任何其它不希望的作用和/或其癥狀。本文所用的“治療”涵蓋對患者的治療，并且包括：(a)降低經(jīng)確定為預先有傾向發(fā)展病癥但尚未被診斷為具有該病癥的患者中出現(xiàn)該病癥的風險，(b)阻礙該病癥的發(fā)展，和/或(c)減輕該病癥，即，造成該病癥的轉(zhuǎn)歸和/或減輕該病癥的一種或多種癥狀?！爸委煛被颉疤幚怼辈“Y或患者指采取步驟以獲得有益或所需結果，包括臨床結果，例如癥狀的減少。出于本發(fā)明目的，有益或所需的臨床結果包括但不限于：預防有rsv感染風險的患者的感染；或，降低通過rsv的感染的嚴重性，例如，通過減少一種或多種癥狀，減少感染時長等。

本文所用的，術語“患者”指哺乳動物。在一個優(yōu)選實施方式中，所述患者是人。

本文所用的，術語“株”或“rsv株”指任何rsv。株包括但不限于，臨床分離物、變體、突變體等。株可以是帕利珠單抗抗性或帕利珠單抗敏感性的。株可以是a或brsv型。一般而言，株通過一種或多種遺傳突變來區(qū)分，即便此類突變不具有針對病毒的不同特點也是如此。

關于抗體與rsv肽序列的結合，本文所用的“表位區(qū)域”是鑒定為包括參與與所述抗體的結合相互作用的那些氨基酸的序列。例如，盡管某些試驗具有充分分辨率以鑒定其中發(fā)生抗體結合相互作用的抗原氨基酸區(qū)域，實際上，這些氨基酸并不是全部參與該結合相互作用。本文所用的“表位”是與所述抗體相互作用的表位區(qū)域中的氨基酸的組合，提供抗原與抗體之間的特異性結合。

本文所用的術語“抗體構建體”指這樣的抗體，其中，所述抗體的至少部分源自已經(jīng)暴露至感興趣的抗原的人患者抗體?？贵w構建體可以是整個抗體或其片段或部分，所提供的抗體、片段或部分具有針對f蛋白的所述親和性?？贵w構建體可以是完全人、人源化或嵌合的?？贵w構建體可包含源自單一患者、多名患者和/或已知抗體序列(例如，共有恒定區(qū)序列)的氨基酸序列。

本文所用的術語“抗體片段”指任何識別表位的抗體的部分。抗體片段可以是糖基化的。通過非限制性示例，抗體片段可以是fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、fv片段、rigg片段、功能抗體片段、前述組分的單一鏈重組形式等。f(ab')2、fab、fab'和fv是抗原-結合片段，其可由igg和igm的可變區(qū)產(chǎn)生。它們可具有不同尺寸、價和fc含量。所述片段可通過任何方法產(chǎn)生，包括通過細胞或細胞系，或多種細胞或細胞系表達成分(例如，重和輕鏈部分)。

“f(ab')2”片段包含通過二硫鍵連接與鉸鏈接合的兩種抗原-結合區(qū)域，并且缺失大部分fc區(qū)域。“fab'”片段源自f(ab')2，但僅包括一種抗原結合區(qū)域。它們可包含小部分的fc。

“fab”片段是產(chǎn)生自igg和igm的單價片段，由可變重鏈、恒定重鏈，和可變輕鏈、恒定輕鏈區(qū)域組成，通過分子內(nèi)二硫鍵連接。

“fv”是產(chǎn)生自igg和igm的最小片段，其包含完整抗原-結合位點。fv包含可變重和輕鏈的部分，它們通過非共價相互作用聯(lián)合在一起。這些鏈趨于在稀釋后解離，但可交聯(lián)，例如采用戊二醛、分子間二硫鍵或肽接頭。fv片段與fab具有相同結合性質(zhì)和相似的三維結合特點。

“rigg"指減少的igg或半igg，其包含一個重鏈和一個輕鏈。rigg可通過選擇性地減少鉸鏈-區(qū)域二硫鍵來產(chǎn)生。

本文所用的，術語“完全人抗體”指抗體、抗體構建體，或完全由人氨基酸序列組成的抗體片段。即，人單克隆抗體構建體的氨基酸序列源自人細胞。這可以不同方式獲得。例如，由人氨基酸序列組成的人單克隆抗體構建體可獲自工程改造以表達來自源自人患者(例如，已暴露至rsv和/或rsvf蛋白的患者)的抗體的可變區(qū)重和輕鏈和/或cdr的細胞?；蛘?，人單克隆抗體構建體可獲自雜交瘤，其中，所述b細胞是人b細胞?；蛘?，人單克隆抗體構建體可通過將cdr區(qū)域，例如示于圖4和5中的那些，cdr接枝至可用的人單克隆抗體上來獲得，由此產(chǎn)生本發(fā)明的人單克隆抗體構建體。人單克隆抗體構建體的完整人氨基酸序列能防止不希望的負面作用例如排異反應或過敏性休克的出現(xiàn)。

本文所用的術語“中和”或“中和能力”指抗體構建體降低病毒感染性的能力。例如，抗體構建體可使病毒融合蛋白無效，從而該病毒和細胞的融合，和/或感染的細胞之間的融合，被阻滯或減弱。本文提供具有至少兩倍帕利珠單抗的中和能力的抗體，如實施例6所示(通過感染性試驗確定)。

單克隆抗體構建體及其片段

本發(fā)明涉及單克隆抗體構建體或抗體片段，其特異性結合rsvf蛋白。優(yōu)選地，所述抗體構建體或抗體片段特異性結合至f蛋白抗原性區(qū)域ii/a。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于1x10^-9m的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于1x10^-10m的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于5x10^-10m的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于1x10^-11m的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于1x10^-12m的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以大于5x10^-12m的親和性結合至f蛋白。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以高于帕利珠單抗的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為約2:1-約500:1的親和性結合至f蛋白。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為約20:1-約200:1的親和性結合至f蛋白。應理解，該比例范圍可以是這些值中任何兩個之間的范圍，或其間的任何值(包括終點)。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約2:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約5:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約10:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約50:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約100:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約200:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約300:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約400:1的親和性結合至f蛋白。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段以對比帕利珠單抗為至少約500:1的親和性結合至f蛋白。

一方面，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和rsv病毒株。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和至少一種rsv株。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和至少一種rsva型株。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和至少一種rsvb型株。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和至少一種rsva型株和至少一種b型株。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠中和對帕利珠單抗具有抗性的一種或多種株。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段能夠以大于帕利珠單抗的中和能力中和至少一種rsv株。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少2倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少5倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少10倍大于帕利珠單抗的中和能力。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段針對至少一種rsv株的中和能力至少15倍大于帕利珠單抗的中和能力。

一方面，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:1的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:1的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:1的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:1的氨基酸序列具有至少96％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:1的氨基酸序列具有至少97％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:1的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:1的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含seqidno.:1的氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的重鏈可變區(qū)包含seqidno.:1的氨基酸序列。

一方面，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:8、seqidno.:9和/或seqidno.:10的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:8、seqidno.:9和/或seqidno.:10的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:8、seqidno.:9和/或seqidno.:10的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:8、seqidno.:9和/或seqidno.:10的氨基酸序列具有至少96％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:8、seqidno.:9和/或seqidno.:10的氨基酸序列具有至少97％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:8、seqidno.:9和/或seqidno.:10的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:8、seqidno.:9和/或seqidno.:10的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含含有seqidno.:8，seqidno.:9，和/或seqidno.:10的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含具有seqidno.:8的氨基酸序列的重鏈cdr1、具有seqidno.:9的氨基酸序列的重鏈cdr2，和具有seqidno.:10的氨基酸序列的重鏈cdr3。

一方面，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少96％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少97％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含與seqidno.:3的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含seqidno.:3的氨基酸序列。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)包含seqidno.:3的氨基酸序列。

一方面，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:14、seqidno.:15和/或seqidno.:16的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:14、seqidno.:15和/或seqidno.:16的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:14、seqidno.:15和/或seqidno.:16的氨基酸序列具有至少95％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:14、seqidno.:15和/或seqidno.:16的氨基酸序列具有至少96％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:14、seqidno.:15和/或seqidno.:16的氨基酸序列具有至少97％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:14、seqidno.:15和/或seqidno.:16的氨基酸序列具有至少98％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，抗體構建體或抗體片段包含含有與seqidno.:14、seqidno.:15和/或seqidno.:16的氨基酸序列具有至少99％序列同源性的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含含有seqidno.:14，seqidno.:15，和/或seqidno.:16的氨基酸序列的至少一個cdr。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段包含具有seqidno.:14的氨基酸序列的輕鏈cdr1、具有seqidno.:15的氨基酸序列的輕鏈cdr2，和具有seqidno.:16的氨基酸序列的輕鏈cdr3。

本發(fā)明還涉及本文所述的抗體構建體或抗體片段的衍生物。術語“衍生物”涵蓋具有通過至少一個氨基酸的添加、缺失和/或取代而不同的所述抗體構建體的任何突變體。優(yōu)選地，所述衍生物是在圖4和5中所示的重鏈和/或輕鏈中的任何cdr中攜帶至少一個保守取代的所述抗體構建體的突變體。更優(yōu)選地，所述突變體具有不多于5、不多于4、優(yōu)選不多于3、特別優(yōu)選不多于2個保守取代。所述抗體的片段或衍生物結合至所述表位的能力可通過直接elisa來測定，例如，如下文部分的實施例中所述。

根據(jù)本發(fā)明，術語“保守取代”表示屬于具體理化組的一種氨基酸用屬于相同理化組的氨基酸替代。所述理化組定義如下：非極性氨基酸組包括：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，和色氨酸。具有不帶電極性側(cè)鏈的氨基酸的組包括：天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、半胱氨酸和半胱氨酸。具有帶正電的極性側(cè)鏈的氨基酸理化組包括：賴氨酸、精氨酸和組氨酸。具有帶負電的極性側(cè)鏈的氨基酸的理化組包括：天冬氨酸(asparticacid)和谷氨酸(glutamicacid)，也稱為天冬氨酸(aspartate)和谷氨酸(glutamate)。

在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體構建體或抗體片段的輕鏈具有κ或λ型。在一個優(yōu)選實施方式中，所述輕鏈具有κ型。所述輕鏈可以是天然產(chǎn)生的鏈，包括天然重排、遺傳修飾的或合成的輕鏈類型。根據(jù)另一個實施方式，本發(fā)明的抗體的重鏈選自所有人同種型，即igm、iga或igg。所述輕鏈和重鏈可共價連接成單鏈抗體(例如二價scfv、雙功能scfv和雙特異性scfv)或彼此非共價連接。

一方面，所述抗體構建體或抗體片段識別rsv的f蛋白上的表位。在一個實施方式中，所述表位在抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:23或seqidno.:24的氨基酸序列的部分具有至少85％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:23或seqidno.:24的氨基酸序列的部分具有至少90％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:23或seqidno.:24的氨基酸序列的部分具有至少95％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:23或seqidno.:24的氨基酸序列的部分具有至少96％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:23或seqidno.:24的氨基酸序列的部分具有至少97％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:23或seqidno.:24的氨基酸序列的部分具有至少98％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:23或seqidno.:24的氨基酸序列的部分具有至少99％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。

在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:25或seqidno.:26的氨基酸序列的部分具有至少85％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:25或seqidno.:26的氨基酸序列的部分具有至少90％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:25或seqidno.:26的氨基酸序列的部分具有至少95％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:25或seqidno.:26的氨基酸序列的部分具有至少96％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:25或seqidno.:26的氨基酸序列的部分具有至少97％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:25或seqidno.:26的氨基酸序列的部分具有至少98％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。在一個實施方式中，所述抗體構建體識別與seqidno.:26或seqidno.:26的氨基酸序列的部分具有至少99％序列同源性的抗原性區(qū)域ii/a內(nèi)的表位。

本發(fā)明還涉及編碼所述抗體構建體或抗體片段，或其部分，的核苷酸序列。在一個實施方式中，所述核苷酸序列包含cdna序列。在一個實施方式中，所述核苷酸序列包含編碼所述重鏈可變區(qū)的cdna序列。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少85％序列同源性的重鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的重鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少95％序列同源性的重鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少96％序列同源性的重鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少97％序列同源性的重鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少98％序列同源性的重鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:2的核苷酸序列具有至少99％序列同源性的重鏈可變區(qū)。

在一個實施方式中，所述核苷酸序列包含編碼所述輕鏈可變區(qū)的cdna序列。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少85％序列同源性的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少95％序列同源性的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少96％序列同源性的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少97％序列同源性的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少98％序列同源性的輕鏈可變區(qū)。在一個實施方式中，所述cdna序列編碼與seqidno.:4的核苷酸序列具有至少99％序列同源性的輕鏈可變區(qū)。

在一個實施方式中，所述核苷酸序列編碼一個或多個cdr。在一個實施方式中，編碼一個或多個cdr的核苷酸序列包含與seqidno.:5、seqidno.:6、seqidno.:7、seqidno.:11、seqidno.:12和/或seqidno.:13的核苷酸序列具有至少85％序列同源性的核苷酸。在一個實施方式中，編碼一個或多個cdr的核苷酸序列包含與seqidno.:5、seqidno.:6、seqidno.:7、seqidno.:11、seqidno.:12和/或seqidno.:13的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸。在一個實施方式中，編碼一個或多個cdr的核苷酸序列包含與seqidno.:5、seqidno.:6、seqidno.:7、seqidno.:11、seqidno.:12和/或seqidno.:13的核苷酸序列具有至少96％、97％、98％或99％序列同源性的核苷酸。在一個優(yōu)選實施方式中，編碼一個或多個cdr的核苷酸序列包含seqidno.:5、seqidno.:6、seqidno.:7、seqidno.:11、seqidno.:12和/或seqidno.:13的核苷酸序列。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，包含seqidno.:5、seqidno.:6和/或seqidno.:7的核苷酸序列的核苷酸序列編碼所述抗體構建體或抗體片段的重鏈可變區(qū)的cdr。在一個實施方式中，包含seqidno.:5、seqidno.:6和/或seqidno.:7的核苷酸序列的核苷酸序列編碼所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)的cdr。在一個實施方式中，包含seqidno.:11、seqidno.:12和/或seqidno.:13的核苷酸序列的核苷酸序列編碼所述抗體構建體或抗體片段的重鏈可變區(qū)的cdr。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，包含seqidno.:11、seqidno.:12和/或seqidno.:13的核苷酸序列的核苷酸序列編碼所述抗體構建體或抗體片段的輕鏈可變區(qū)的cdr。

在一個實施方式中，所述核苷酸序列是cdna序列。在一個實施方式中，所述核苷酸序列是由包含seqidno.:5、seqidno.:6、seqidno.:7、seqidno.:11、seqidno.:12和/或seqidno.:13的核苷酸編碼的rna分子。在一個實施方式中，所述核苷酸序列是由包含seqidno.:2的核苷酸編碼的rna分子。在一個實施方式中，所述核苷酸序列是由包含seqidno.:4的核苷酸編碼的rna分子。

本發(fā)明還提供載體，其包含編碼本發(fā)明的抗體構建體或抗體片段的輕鏈的至少一種核酸和/或編碼本發(fā)明抗體構建體或抗體片段的重鏈的至少一種核酸。所述核酸可在同一載體中或可以二元載體的形式存在。所述載體優(yōu)選地包含操作性地連接至所述核酸的啟動子，以促進編碼所述輕和/或重鏈的核酸的表達。優(yōu)選地，所述載體還包括起始序列，用于在宿主細胞中復制并保留。所述載體還可包含編碼位于編碼所述輕鏈和/或重鏈的核酸的5'的信號序列的核苷酸序列。所述信號序列可促進編碼的鏈分泌進入培養(yǎng)基。所述載體還可包含編碼his標簽的核苷酸序列，其導致構建體表達以產(chǎn)生在所述抗體構建體或抗體片段的輕和/或重鏈的n末端具有his標簽的融合產(chǎn)物，這有利于蛋白質(zhì)的純化。

在一個實施方式中，本發(fā)明的抗體構建體或抗體片段是經(jīng)修飾的。所述修飾包括單體形式的二聚、寡聚或聚合，例如，通過采用二環(huán)己基碳二亞胺的交聯(lián)?？赏ㄟ^凝膠過濾使二聚物、寡聚物或聚合物彼此分離。其它修飾包括側(cè)鏈修飾，例如分別有ε-氨基-賴氨酸殘基的修飾或氨基和羧基末端修飾。其它修飾包括翻譯后修飾，例如對蛋白質(zhì)進行糖基化和/或部分或完全去糖基化修飾，以及二硫鍵形成。所述抗體構建體或片段還可偶聯(lián)至標記物，例如酶、熒光或放射性標記物。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是嵌合抗體。在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是人源化的抗體。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是人抗體。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是完全人抗體。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或抗體片段是凍干的。

一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述的抗體構建體或抗體片段的藥物組合物。所述組合物包括多種賦形劑、稀釋劑、運載體，和本領域技術人員熟知的此類其它無活性試劑。在一個實施方式中，所述藥物組合物包含所述抗體構建體或抗體片段和藥學上可接受的運載體、稀釋劑或賦形劑。

制備抗體構建體及其片段的方法

本發(fā)明還涉及用于制備本文所述的抗體構建體或抗體片段的方法和組合物。

在一個實施方式中，人b細胞獲自已經(jīng)暴露至rsv和/或rsvf蛋白的患者(例如，漸愈患者或經(jīng)f蛋白或其片段免疫的患者)。血液樣品可采自所述患者，并且人b細胞可以已知方式分離(例如，《新編免疫學方案》(currentprotocolsinimmunology)第7.1章.外周血和臍帶血分離完全單核細胞(isolationofwholemononuclearcellsfromperipheralbloodandcordblood).由威利父子出版社(wiley&sons)出版，jccoligan等編)。在一個實施方式中，所述人b細胞可融合至骨髓瘤或異源骨髓瘤，以根據(jù)已知技術按照經(jīng)典科勒與米爾斯坦法(kohlerandmilsteinapproach)產(chǎn)生雜交瘤，如下所述，lang等“囊胞性纖維癥和免疫力低下患者中的綠膿假單胞菌感染的預防和治療(prophylaxisandtherapyofpaseudomonasaeruginosainfectionincysticfibrosisandimmunocompromisedpatients)”vaccine22:s44-s48(2004)，通過引用其全文納入本文。在一個優(yōu)選實施方式中，培養(yǎng)所述b細胞，并且從中分離所述重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)和/或一個或多個cdr的cdna序列。cdna序列可用于產(chǎn)生一種或多種載體。產(chǎn)生完全人抗體的方法描述于，例如，beerli等“通過哺乳動物細胞展示分離人單克隆抗體(isolationofhumanmonoclonalantibodiesbymammaliancelldisplay)”pnas105(38):14336-14341(2008)其各自通過引用其全文納入本文。

可將一種或多種載體引入細胞，從而該細胞產(chǎn)生所述抗體構建體、抗體片段，或其部分。所述細胞可以是原核細胞或真核細胞。在一個優(yōu)選實施方式中，所述細胞是植物細胞或哺乳動物細胞。在一個實施方式中，所述細胞是人細胞。在一個實施方式中，所述細胞是hek293細胞。在一個實施方式中，所述細胞是perc6細胞、cho細胞、cos細胞，或hela細胞。

在一個實施方式中，本文所述的抗體構建體或抗體片段在植物細胞中產(chǎn)生。在植物細胞中產(chǎn)生抗體的方法描述于，例如，美國專利號8,119,406和8,513,397，其各自通過引用其全文納入本文。在一個優(yōu)選實施方式中，所述細胞來自煙草植物(例如，煙草屬(nicotiana))。在植物宿主系統(tǒng)中表達具有一些益處。例如，植物系統(tǒng)的替代性的糖基化可改善產(chǎn)物抗體的藥物動力學和/或希望的細胞毒性作用。

優(yōu)選地，所述宿主細胞包含編碼所述輕鏈的至少一種核酸和編碼所述重鏈的至少一種核酸，并且能夠組裝抗體構建體，從而產(chǎn)生與由人b細胞產(chǎn)生的人抗體的三維結構相等同的三維結構。如果輕鏈與重鏈分開產(chǎn)生，則這兩個鏈可經(jīng)純化并后續(xù)組裝以產(chǎn)生基本具有如人b細胞產(chǎn)生的人抗體的三維結構的抗體。或者，宿主細胞包含編碼輕鏈的至少抗原-結合部分的至少一種核酸，和編碼重鏈的至少抗原-結合部分的至少一種核酸，并且能夠組裝抗體構建體或片段，從而所述抗體構建體或片段能夠結合所述抗原。

所述抗體構建體或抗體片段還可通過重組表達編碼的輕和/或重鏈(或其部分)來獲得，其中，所述核酸通過分離編碼人抗體的核酸并將編碼圖中所示的cdr的核酸序列接連至該分離核酸來產(chǎn)生。

抗體或抗體片段可通過任何方法，純化自，例如來自細胞培養(yǎng)上清液。抗體純化的示例性方法描述于liu等，“用于單克隆抗體生成的回收和純化工藝開發(fā)(recoveryandpurificationprocessdevelopmentformonoclonalantibodyproduction)”mabs2(5):480-499(2010)，通過引用其全文納入本文。

一方面，本發(fā)明涉及包含本文所述的抗體構建體或抗體片段的色譜柱或膜，其中，所述抗體構建體或抗體片段結合至所述色譜柱或膜。在一個實施方式中，所述色譜柱或膜包含蛋白a，例如蛋白a樹脂。在一個實施方式中，所述色譜柱或膜包含離子交換樹脂。在一個實施方式中，所述色譜柱或膜包含疏水電荷誘導色譜柱。

盡管本文說明書和實施例涉及單一細胞或細胞系中抗體構建體或片段的生成，考慮所述抗體構建體或片段的一個或多個部分可通過分開的細胞或細胞系產(chǎn)生，然后合并以形成功能抗體構建體或片段。例如，重鏈(或其部分)可通過一種細胞產(chǎn)生，而輕鏈(或其部分)可通過第二種細胞產(chǎn)生。所述組分可經(jīng)分離或純化自，例如來自細胞培養(yǎng)上清液，并通過常規(guī)方法共價或非共價連接。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于確定推定抗體針對對于市售可得的抗體(例如，帕利珠單抗)具有抗性的rsv株的功效的方法。推定抗體針對至少一種rsv株的結合親和性、中和能力、抗原性或?qū)τ谟杏眯缘娜魏纹渌攘靠膳c本發(fā)明的抗體構建體相比較。在一個實施方式中，相較于本文所述的抗體構建體，經(jīng)確定以等同或更大親和性結合，具有等同或更大的中和能力，和/或顯示等同或更少抗原性的推定抗體，經(jīng)歷進一步測試以檢測針對rsv的有效性。

治療方法

本發(fā)明還涉及采用本文所述的抗體構建體或抗體片段進行治療的方法。

一方面，本發(fā)明涉及預防具有rsv感染風險的患者中的rsv感染的方法。在一個實施方式中，預防上呼吸道感染。一方面，預防下呼吸道感染。一方面，預防上和下呼吸道感染。

一方面，本發(fā)明涉及治療患者中rsv感染的方法。在一個實施方式中，治療上呼吸道感染。一方面，治療下呼吸道感染。一方面，治療上和下呼吸道感染。

在一個實施方式中，該患者是人。在一個優(yōu)選實施方式中，所述患者是嬰兒(例如，12個月齡以下)。在一個實施方式中，所述患者是具有使rsv感染風險升高的情況的人。增加rsv感染風險的情況包括但不限于，6月齡以下；12月齡以下且早產(chǎn)(例如，40周胎齡之前)；肺疾病；慢性阻塞性肺?。幌忍煨孕呐K?。怀溲孕牧λソ?；虛弱的免疫系統(tǒng)；哮喘；免疫缺陷(例如，器官移植、白血病、hiv/aids)。盡管認為rsv感染對(早產(chǎn))嬰兒具有主要影響，年老人和免疫力低下患者(例如hiv陽性患者、接受化療的患者或具有另一嚴重的潛在病癥的患者)也具有風險。帕利珠單抗并不常規(guī)性地用以治療這些患者組，因為它功效低。ar-201顯示針對該病毒的較高親和性，其識別更多病毒株并且目前正經(jīng)工程改造以增強adcc并延長半衰期。所述改善的功效和作用持久性預計能增強抗rsvmab對于感染rsv的免疫力低下和年老患者的藥物價值。

在一個實施方式中，將所述抗體構建體或抗體片段給予具有rsv感染風險的患者。在一個實施方式中，將所述抗體構建體或抗體片段給予具有或認為具有rsv感染的患者。在一個實施方式中，給予治療有效量的所述抗體構建體或抗體片段。在一個實施方式中，所述治療有效量是約1mg/kg體重-約1000mg/kg體重。在一個優(yōu)選實施方式中，所述治療有效量是約1mg/kg體重-約100mg/kg體重。在一個更優(yōu)選的實施方式中，所述治療有效量是約5mg/kg體重-約50mg/kg體重。應理解，所述量可以是這些值中任何兩個之間的范圍，或其間的任何值(包括終點)。

所述抗體構建體或抗體片段可通過任何合適途徑給予。適于根據(jù)本文提供的方法給予的，本文中提供或已知的組合物，可適于多種遞送模式，包括但不限于，肌內(nèi)和靜脈內(nèi)遞送。也可采用適于內(nèi)部、肺、直腸、鼻、陰道、舌、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)和皮下途徑的組合物。還可采用緩釋劑型。所有劑型可以使用本領域的標準方法制備(參見例如《雷明頓藥物科學》(remington’spharmaceuticalsciences)，第16版，a.oslo主編，賓夕法尼亞州伊斯頓1980)。

在一個實施方式中，所述抗體構建體或片段給予一次。在一個優(yōu)選實施方式中，所述抗體構建體或片段給予多次。在一個更優(yōu)選的實施方式中，所述抗體構建體或片段在rsv季每月給予一次。最優(yōu)選地，所述抗體構建體或片段僅給予一次/季。rsv季一般是11月至4月(北半球)，但可能更長，這取決于區(qū)域和其它因素(例如，給定年流行的主要株)。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及用于靜脈內(nèi)遞送的袋，包括包含所述抗體構建體或抗體片段和藥學上可接受的賦形劑的iv袋。

實施例

除非另有說明，貫穿說明書使用的縮寫具有如下含義：

cdna＝互補脫氧核糖核酸

cdr＝互補決定區(qū)

elisa＝酶聯(lián)免疫吸附試驗

fcs＝胎牛血清

g＝克

hc＝重鏈

hrp＝辣根過氧化物酶

ig＝免疫球蛋白

kd＝解離常數(shù)

kg＝千克

lc＝輕鏈

m＝摩爾

mab＝單克隆抗體

mg＝毫克

min＝分鐘

ml＝毫升

mm＝毫摩爾

ng納克

nm＝納摩爾

pbs＝磷酸鹽緩沖鹽水

pcr＝聚合酶鏈式反應

pm＝皮摩爾

rna＝核糖核酸

rsv＝呼吸道合胞體病毒

rt-pcr＝逆轉(zhuǎn)錄pcr

μg＝微克

μl＝微升

μμ＝微摩爾

℃＝攝氏度

這些單字母符號在代表氨基酸時具有以下含義：

a＝丙氨酸

r＝精氨酸

n＝天冬酰胺

d＝天冬氨酸

c＝半胱氨酸

e＝谷氨酸

q＝谷氨酰胺

g＝甘氨酸

h＝組氨酸

i＝異亮氨酸

l＝亮氨酸

k＝賴氨酸

m＝甲硫氨酸

f＝苯丙氨酸

p＝脯氨酸

s＝絲氨酸

t＝蘇氨酸

w＝色氨酸

y＝酪氨酸

v＝纈氨酸

代表核酸時，a＝腺嘌呤；t＝胸腺嘧啶；c＝胞嘧啶；g＝鳥嘌呤；u＝尿嘧啶，n＝任何核酸。

以下實施例還意在說明本公開內(nèi)容的某些實施方式，且并不意圖限制其范圍。

實施例1：對rsv具有特異性的人b細胞的選擇

對于對rsvf蛋白具有特異性的抗體構建體的產(chǎn)生，來自rsv感染的人嬰兒近期切除的扁桃體的人淋巴細胞通過機械破碎并通過細胞過濾器來分離。分離的淋巴細胞通過細胞培養(yǎng)瓶中的塑性粘附平行地從單核細胞耗盡，隨后通過使淋巴細胞與固定的總rsv抗原孵育來富集rsv特異性b細胞。為此，6孔板用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中的10μg/ml總rsv抗原(eia-抗原)被覆過夜。被覆后，孔通過與pbs中的10％胎牛血清(fcs)孵育來封閉。被覆的六孔板的每個孔孵育1百萬-1千萬個單核細胞耗盡的細胞。孵育一小時后，孔經(jīng)清洗，并通過胰蛋白酶化收獲結合的細胞。將細胞添加至包含含有10％fcs和10％條件性上清液以及20,000個el-4b5飼養(yǎng)層細胞(獲贈自瑞士日內(nèi)瓦的日內(nèi)瓦大學醫(yī)院(genevauniversityhospital))的細胞培養(yǎng)基的板，所述細胞已通過gammacell40研究型輻照儀經(jīng)5000cgy輻照。條件性上清液通過用植物血球凝集素(pha，5μg/ml)和豆蔻酰佛波醇乙酯(pma，10ng/ml)刺激分離的外周血淋巴細胞36小時來產(chǎn)生，隨后移出細胞和碎片，然后低溫貯藏。該條件性上清液經(jīng)融化，然后添加至rsv-eia選擇的淋巴細胞。在至多十天之后，通過rsveiaelisa分析小等分的細胞培養(yǎng)上清液的特異性抗體。

elisa板用rsv-eia抗原或純化的rsvf蛋白(人rsv(a2)融合糖蛋白rsvf蛋白，中國北京的義翹神州生物技術有限公司(sinobiologicalinc.))以0.5pg/ml在4℃孵育過夜，然后用pbs中的0.5％bsa封閉。細胞培養(yǎng)上清液用包含0.05％吐溫(pbs-吐溫)的pbs稀釋并等分進入孔。孵育且隨后用pbs-吐溫清洗之后，采用辣根過氧化物酶-(hrp)標記的山羊抗人igg來檢測結合至抗原的人igg。陽性孔通過色度檢測法鑒定，然后使來自陽性孔的細胞以低密度在經(jīng)輻照的飼養(yǎng)層細胞和包含10％fcs和10％條件性上清液(如上所述)的細胞培養(yǎng)基的存在下擴增數(shù)天時間。在重新測試上清液對rsvf蛋白的特異性之后，來自陽性孔的細胞經(jīng)收集并處理用于rna分離。

實施例2：針對rsv的人單克隆抗體的生成

用于分離特異性抗體的方法匯總于圖1。具體地，使用來自選擇的b細胞的rna來產(chǎn)生5'racecdna，隨后進行同種型特異性rt-pcr，以鑒定重鏈(hc)和輕鏈(lc)的可變區(qū)，如下所述，welschofm等,1995。hc的可變區(qū)通過pcr與igg1的恒定區(qū)合并，其基本根據(jù)imgt參照序列y14737(lefranc,m.-p.等，2001，《免疫球蛋白資料手冊》(theimmunoglobulinfactsbook)，英國倫敦學術出版社(academicpress))，并克隆進入真核表達載體pcdna3.3-topo(美國的英杰公司(invitrogen))。lc的整個編碼區(qū)域通過rt-pcr擴增并克隆進入表達載體。然后，將載體瞬時轉(zhuǎn)染進入hek293t細胞[atcc#crl-11268(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，弗吉尼亞州瑪納薩斯，20110usa)]。轉(zhuǎn)染后四至五天，通過elisa測試上清液中抗原-結合抗體的存在，如上所述。最有希望的候選物，ar201(也稱作kbrv201)，經(jīng)選擇用于對重和輕鏈的可變區(qū)測序。最終載體經(jīng)擴增并通過桑格測序分析。

核苷酸和對應氨基酸序列示于圖2(重鏈，seqidno.:1和2)和3(輕鏈，seqidno.:3和4)。個體cdr區(qū)域的核苷酸和對應氨基酸序列示于圖4(重鏈:cdr1，seqidno.:5和8；cdr2，seqidno.:6和9；cdr3，seqidno.:7和10)和5(輕鏈:cdr1，seqidno.:11和14；cdr2，seqidno.:12和15；cdr3，seqidno.:13和16)。

實施例3:人單克隆抗體與rsvf蛋白抗原的結合

測試經(jīng)分離和序列的人抗體ar201與rsvf蛋白的結合特點，如圖6所示。hek293t細胞以300,000細胞/孔接種于六孔板并培育過夜。一天后，更換培養(yǎng)基，并且將新鮮制備的表達質(zhì)粒的溶液小心地添加至細胞。細胞另孵育24小時，并且再次更換培養(yǎng)基為pro293a-cdm培養(yǎng)基。三至五天后，收集包含重組抗體的所得上清液并通過的配有hitrap蛋白a瓊脂糖親和性柱(ge醫(yī)療生命科學公司，美國賓夕法尼亞州匹茲堡)的親和性色譜來純化抗體。所得抗體貯存于-20℃直至使用。對于結合實驗，elisa板如上所述經(jīng)被覆，并且添加純化的ar201或不相關的完全人單克隆igg1抗體(對照)的系列稀釋物。仔細清洗之后，用抗人igg-hrp標記的二抗檢測結合的抗體。ec50值基于結合的抗體的色度檢測來計算，使用可變斜率-四參數(shù)等式(graphpadprism軟件v5.02，graphpad軟件公司，美國加利福尼亞州圣迭戈)。ar201的ec50值經(jīng)計算為0.1031nm。對于對照單克隆人igg1抗體沒有可計算的ec50值。

實施例4：ar201的親和性檢測

ar201對比市售可得的對于rsvf蛋白具有特異性的抗體(帕利珠單抗)的相互作用的動力學表征通過表面等離子體共振(biaffin有限公司，德國卡塞爾)進行。ar201如上所述產(chǎn)生并純化。重組人rsvf蛋白通過偶聯(lián)至cm5傳感芯片的胺來共價固定，用于對與抗體的相互作用進行動力學表征，采用biacore2000儀(ge醫(yī)療集團，瑞典烏普薩拉的比亞科國際公司(biacoreab))上的表面等離子體共振。對于抗體ar201的動力學分析，制備ar201抗體的稀釋物，在十二份跑動緩沖劑中的1:1稀釋物之后，從100nm到49pm。樣品注射兩分鐘的締合時間，然后，在轉(zhuǎn)換至跑動緩沖劑后以30pl/分鐘的流速監(jiān)測解離30分鐘。各注射后，結合的抗體通過表面再生法，采用100mmhcl(3x10秒)來移出。通過結合曲線的全局擬合，假設朗繆爾1:1結合模型，采用比亞科評價軟件(biacoreevaluationsoftware)4.1版進行數(shù)據(jù)評價。ar201確定的解離常數(shù)(kd)為58±6pm。通過比較，帕利珠單抗具有顯著更低的kd值，960pm(www.ema.europa.eu/docs/en_gb/document_library/epar_-_scientific_discussion/human/000257/wc500056731.pdf)。結果列于表1。

表1.ar201的締合和解離常數(shù)。

實施例5：ar201與rsv參照株的結合

ar201與rsv參照株的結合通過elisa試驗測試。rsv參照株rsv-a長型(atccvr-26)、rsv-b(atccvr1580)和rsv-a2(atccvr-1540)均購自lcg(lgc標準品公司s.a.r.l.(lgcstandardss.a.r.l.)，法國莫爾塞姆)并在vero細胞中擴增。然后，陽性孔的上清液在-80℃凍存直至進一步使用。對于elisa，試驗板用500ng/ml的多克隆抗rsv抗體被覆。同時，10μg/mlar201或人單克隆igg1同種型對照抗體用rsv以冷凍擴增的rsv株的1:10稀釋孵育。1小時后，將免疫復合物轉(zhuǎn)移至被覆的elisa板，并且添加二抗人igg-hrp標記的抗體。結合的人igg通過色度檢測法檢測。如圖7所示，全部三個參照株均被ar201識別。

實施例6：ar201對參照株的中和

在感染性試驗中測試ar201和帕利珠單抗對rsv參照株的中和。參照株rsv-a長型(atccvr-26)和rsv-b(atccvr1580)的病毒儲液(25-250pfu/孔)與兩倍連續(xù)稀釋的抗體溶液孵育，然后添加至已在一天前接種于24孔板的vero細胞。四小時后，接種體用半固體瓊脂糖覆蓋物代替并另孵育三天。然后，細胞經(jīng)固定并通過免疫組化染色來檢測rsv特異性空斑的存在。各濃度的rsv特異性抗體的中和的百分比基于每孔空斑數(shù)量計算?；诳贵w儲液的濃度，計算出最小中和抗體濃度達到>50％病毒中和。如表2所示，相較于帕利珠單抗，ar201對于各株的病毒顆粒的中和的有效性為至少兩倍，并且預防指示活性、再生性感染的合胞體的形成。igg同種型人單克隆對照抗體對于預防vero細胞的各rsv參照株的感染沒有效果。

表2：估計的最大半有效抗體濃度(ng/ml)。

實施例7：ar201與rsv的臨床分離物的結合

ar201對新鮮分離的臨床rsv分離物的識別通過elisa試驗測試。臨床rsv分離物(21個分離開的分離物)收集自測試為rsv陽性患者的鼻咽粘液。收集的粘液通過在vero細胞上孵育，然后將陽性孔(通過多核體的形成鑒定)的上清液連續(xù)傳代兩次至新鮮vero細胞上來培養(yǎng)。陽性孔的上清液在-80℃凍存直至進一步使用。對于結合分析，elisa板用個體rsv分離物(稀釋1:10)被覆，然后用ar201、帕利珠單抗或人單克隆igg同種型對照抗體以1μg/ml孵育。將二抗人igg-hrp標記的抗體加至各孔。結合的人igg通過色度檢測法檢測。從采用ar201或帕利珠單抗檢測的信號兩次扣除由對照igg單克隆抗體的信號確定的背景吸光度，并且將大于0.1的任何吸光度值視為陽性信號。實驗重復三次；代表性實驗示于圖8a和8b。ar201以不同程度識別所有21個臨床分離物，而帕利珠單抗總是顯示較弱信號強度。為了鑒定帕利珠單抗抗性株，分析ar201超過帕利珠單抗的結合信號比。ar201超過帕利珠單抗的結合信號比為5或更大的任何臨床分離物被視為帕利珠單抗抗性分離物。

分析結果示于圖8c和表3。ar201以不同程度識別所有21個臨床分離物，而帕利珠單抗總是顯示較弱信號強度。帕利珠單抗無法識別21個分離物中的4個，具體是臨床分離物#6、#9、#12和#20。臨床分離物#20具有剛剛超過5的比。

表3a.臨床rsv分離物的識別

在進一步分析中，68個其它分離物通過替代性方法:空斑減少試驗來分析。相較于第一試驗(elisa)，該第二試驗給出了不同的輸出形式：對于分離物#1和分離物#20(“第一，elisa試驗”抗體連續(xù)稀釋物經(jīng)測試以獲得ic50，其經(jīng)考慮用于進一步測試。在空斑減少試驗中，分析涉及測試一種抗體濃度，并計數(shù)形成了多少空斑。較少的空斑指示抗體提供了較少的病毒感染性。

通過空斑減少試驗中的ar201和帕利珠單抗測試42個rsv/a分離物和26個rsv/b-分離物的中和。帶有5e4pfu/ml病毒的20μg/mlar201或帕利珠單抗的溶液36℃孵育1小時，連續(xù)稀釋并添加至24孔板中近乎融合的hep-2靶細胞單層。1.5小時后，吸出上清液，細胞用培養(yǎng)基覆蓋并進一步孵育。每天監(jiān)測細胞病變效應，并且在形成明確定義的空斑之后對板進行固定和染色。對空斑形成單位(pfu)計數(shù)，并且計算由ar201或帕利珠單抗造成的pfu減少。

在空斑減少試驗中，ar201在所有情況中將空斑數(shù)減少至少于1％，而帕利珠單抗僅在45％的分離物中顯示這樣強的減少。對于rsv/a病毒，ar201的減少空斑的能力平均比帕利珠單抗強100倍。對于rsv-b分離物，相比帕利珠單抗，ar201顯示20倍更強的減少。ar201完全抑制了測試的42個a-株中的38個中的空斑形成(消除性免疫)(帕利珠單抗：42個a株中的2個)，和測試的26個b-株中的23個中的空斑形成(帕利珠單抗：26個b-株中的7個)。68個測試的a-和b-分離物中，相比帕利珠單抗，有59個被ar201更有效地中和。另外9個被兩種抗體完全中和(形成0個空斑)–在測試的抗體濃度上檢測不到中和效率差異。

表3b.ar201相較于帕利珠單抗單克隆抗體對于多重rsv/a和rsv/b株的作用的匯總，通過空斑減少試驗測定。

檢測限0.5pfu(-0.3log10)；無空斑的陰性樣品給予檢測限值的一半(0.25pfu(-0.6log10))。

^akruskal-wallis非參數(shù)檢驗，雙尾。pmab，帕利珠單抗。

表3c.ar201和帕利珠單抗對于pfu的≥100倍減少和用rsv/a和rsv/b病毒株的消除性免疫的作用

^a消除性免疫定義為未稀釋的樣品中無空斑可見。出于統(tǒng)計學目的，無空斑指定0.25pfu值。^b費舍爾精確t檢驗，雙側(cè)。^c評價的分離物的數(shù)量。

實施例8：ar201對臨床分離物的中和

在感染性試驗中測試ar201和帕利珠單抗對兩種臨床rsv分離物(分離#1和#20)的中和。兩種rsv分離物在vero細胞上擴增，并且上清液凍存直至進一步使用。組織培養(yǎng)中達到50％感染率的儲液溶液的稀釋度(tcid)基于斯皮爾曼和寇氏(spearmanand)算法計算(hierholzer等，1996，刊于《病毒學方法手冊》(virologymethodsmanual)，由bmjmahy和hokangro編，倫敦:學術出版社，第47頁)。病毒儲液經(jīng)融化并稀釋至10xtcid50，然后用抗體ar201、帕利珠單抗或igg1同種型人對照單克隆抗體的系列稀釋物孵育。將該混合物添加至96孔板中融合的hep2細胞(atccccl-23)并孵育四天。細胞經(jīng)固定，并且用抗rsv小鼠單克隆抗體克隆631(米蘭分析公司(milananalyticaag)，瑞士)檢測感染的細胞。感染率和ic50值基于結合的抗體的色度檢測通過使用可變斜率-四參數(shù)等式(graphpadprism軟件v5.02，graphpad軟件公司，美國加利福尼亞州圣迭戈)來計算。ic50作為中和活性的度量。ic50是中和50％的rsv感染劑量的感染能力的抗體濃度(g/ml)。

結果見表4。對于分離物#1，ar201的ic50比帕利珠單抗低18倍。對于分離物#20，對于帕利珠單抗沒有觀察到中和能力，證實帕利珠單抗不結合至臨床分離物#20，而ar201對于分離物#20顯示與分離物#1所見相似的ic50。

表4.ar201和帕利珠單抗對于臨床分離物#1和#20的ic50

實施例9：帕利珠單抗-抗性臨床分離物#20的f蛋白序列的測序

確定臨床分離物#20的f蛋白的核苷酸和氨基酸序列。rna從擴增的臨床分離物#20分離，并且采用f蛋白特異性引物(引物rsv-af蛋白:gaaattaaacctggggcaaataacc[seqidno.:19]；引物rsv-bf蛋白:acaaaatmaactctggggcaaataac[seqidno.:20])產(chǎn)生cdna。所得片段(預計大?。?935bp)采用特定引物(rsv-7607:cttcgygacatatttgccccag[seqidno.:21]；zhaof:ggggcamtmcmtggagttgc[seqidno.:22])擴增。擴增的dna在microsynth公司(巴爾加赫，瑞士)通過桑格測序法測序。

編碼臨床分離物#20的f蛋白的區(qū)域的核苷酸序列(seqidno.:17)示于圖9a。對應的氨基酸序列(seqidno.:18)示于圖9b。

相比帕利珠單抗鑒定為rsvf蛋白a2株的氨基酸254-277的序列的公設表位區(qū)域的公開的序列(mclellanjs.等，2010)，揭示臨床分離物#20的位置272的賴氨酸到天冬酰胺(k272n)的突變，如圖10所示。位置272處從賴氨酸到另一氨基酸的突變在先前描述為帕利珠單抗喪失與f蛋白的結合的標準(zhu等，2011；adams等，2010)，證實帕利珠單抗無法結合至臨床分離物#20的表位區(qū)域內(nèi)，證實分離物#20區(qū)域的序列不包括像帕利珠單抗表位那樣的氨基酸序列功能。此外，產(chǎn)生兩種帕利珠單抗抗性突變體病毒，它們均在位置262處具有單一氨基酸(aa)突變。

實施例10：帕利珠單抗抗性突變體的生成。

在以漸增濃度(40、80、160和320μg/ml)的帕利珠單抗對病毒進行系列傳代之后，分別產(chǎn)生rsv/a/tracy和rsv/b/18537的帕利珠單抗抗性突變體。分離兩種帕利珠單抗抗性突變體病毒，它們均在位置262處具有單一氨基酸(aa)突變，如圖10所示。兩種親本株在aa262處均具有天冬酰胺(酰胺，中性極性aa)，并且兩種帕利珠單抗抗性突變體均具有酪氨酸(芳香中性極性aa)。推定抗原性ii結構域和在帕利珠單抗確定的表位區(qū)域(aa262-276)中出現(xiàn)n262y變化。大多數(shù)公開的帕利珠單抗抗性突變體具有在aa272、268、275和276發(fā)生的變化。如下表5所示，rsv/a/tracy或rsv/b/18537感染的棉鼠的帕利珠單抗抗性突變體與親本病毒相比等同地好，然而，突變體病毒對帕利珠單抗免疫接種效果具有抗性。

表5.ar201和帕利珠單抗(各40μg/ml)對帕利珠單抗抗性rsv/a/tracy和rsv/b/18537的抑制作用的比較

實施例11：ar201和帕利珠單抗對rsv臨床分離物的交叉抑制

帕利珠單抗是迄今已經(jīng)fda批準用于預防嬰兒和新生兒的rsv感染的唯一的抗rsv單克隆抗體。帕利珠單抗結合至rsv的f蛋白上的抗原性區(qū)域a，并抑制rsv與人肺上皮細胞的融合事件。

兩種獨立的單克隆抗體的結合的有效交叉抑制僅能在兩種抗體識別緊密相近的一個或多個表位(例如，相同表位區(qū)域)出現(xiàn)，從而一種抗體結合至其表位時產(chǎn)生對于另一種抗體的結合的位阻阻礙。

完整rsv顆粒用競爭抗體(帕利珠單抗，ar201，或?qū)φ眨?0μg/ml)預孵育1小時，然后添加至聚苯乙烯elisa板，該板已經(jīng)用帕利珠單抗或ar201被覆。4℃孵育1小時后，板經(jīng)清洗，并且向各孔添加多克隆兔-抗rsv-hrp標記的抗血清。結合的病毒顆粒通過色度檢測法檢測。相對于單克隆人igg對照抗體存在時的結合，測定rsv與固定的抗體在競爭抗體存在時的最大結合。

結果列于表6。rsv病毒顆粒與ar201的預孵育將與ar201被覆的板的結合減少至22.5％，而用帕利珠單抗的預孵育對于與ar201被覆的板的結合的影響較少，且僅將信號減少至對照值的29.2％。反之亦然，rsv病毒顆粒與ar201的預孵育將rsv與帕利珠單抗被覆的板的結合減少至40.8％，而與帕利珠單抗的預孵育將與帕利珠單抗被覆的板的結合減少至稍低水平，35.3％。

這些結果指示，ar201與帕利珠單抗靶標rsvf蛋白上的相同抗原性區(qū)域。即，ar201和帕利珠單抗可能在rsvf-蛋白上的氨基酸的相似區(qū)域中具有靶標表位，但這些抗體可能不一定與該區(qū)域中的相同氨基酸表位成員相互作用。交叉抑制的差異指示，ar201識別與帕利珠單抗所識別的相似或相近的表位，但非相同表位。

表6.ar201或帕利珠單抗對于rsv與抗體被覆的板的結合的交叉抑制

實施例12：f蛋白的蛋白酶消化

asp-n是內(nèi)切蛋白酶，其選擇性地切割天冬氨酸殘基n末端的肽鍵。rsvf蛋白的asp-n消化將切割氨基酸位置263和269的n末端的公設帕利珠單抗表位，產(chǎn)生長度為62個氨基酸和40個氨基酸的兩種蛋白質(zhì)片段。各肽僅包含對于帕利珠單抗的完整表位的部分，如圖11所示。

根據(jù)生產(chǎn)商說明，在二硫蘇糖醇(dtt)和碘乙酰胺的存在下，純化的重組f蛋白與asp-n(普洛麥格(promega)，美國威斯康星州麥迪遜)37℃孵育5小時，然后被覆至elisa板上。將抗體(ar201或帕利珠單抗)以兩種不同濃度添加至板，隨后添加多克隆抗人igg-hrp標記的抗體。結合的抗體基于色度檢測法檢測。

帕利珠單抗未識別rsvf蛋白的完全消化物的任何片段，而ar201仍結合，如圖10所示。這顯示兩種抗體不共有相同表位，并且ar201識別的rsvf蛋白的254-277表位區(qū)域中的表位氨基酸的組合與帕利珠單抗靶標表位氨基酸組成的氨基酸不同。此外，表位結合區(qū)域以三維構型存在，從而ar201以不同于帕利珠單抗的方式結合。

實施例13：構象表位作圖。

為了進一步表征ar201的表位，包含表位區(qū)域序列的肽的預突變經(jīng)三維結構化以模擬非線性表位，并通過elisa測試ar201和帕利珠單抗的結合(clips技術：timmerman等，2007，采用clipstm技術的構象表位的功能重建與合成模擬(functionalreconstructionandsyntheticmimicryofaconformationalepitopeusingclips^tmtechnology).j.mol.recognit.20:283^-99；slootstra等1996；通過小隨機肽文庫揭示的抗體-抗原相互作用的結構方面(structuralaspectsofantibody-antigeninteractionrevealedthroughsmallrandompeptidelibraries)，moleculardiversity1:87^-96；在荷蘭的pepscanprestobv公司進行；見下文)。該研究的主要目的是確定ar201和帕利珠單抗是否結合相同/不同表位。

感興趣的區(qū)段縮減至nsellslindmpitndqkklmssnvqivrqqsysi，這是來自rs-病毒的f-蛋白的區(qū)段(氨基酸254-288)。設計一組均覆蓋該區(qū)段的clips結構化的肽，以肽掃描陣列形式合成并在肽掃描elisa中篩選。

為了總結第一階段的研究，發(fā)現(xiàn)兩種抗體似乎結合在研究的區(qū)段中的重疊表位區(qū)域內(nèi)。然而，結合特異性極其不同，這表示clips似乎將肽設計成一種抗體優(yōu)先的構象，而另一種設計為第二抗體優(yōu)先的構象。

基于所述結果，對兩種鑒定的結合物進行詳細的跟進丙氨酸掃描。對于兩種抗體，發(fā)現(xiàn)必需的相似位置(帶粗體和下劃線)：

nsellslindmpitndqkklmssnvqivrqqsysi[seqidno:29]

引人注意地，采用ar201多個單一或雙重丙氨酸突變增加了結合活性，尤其在肽的nvqivrqqsysi部分中(其不是帕利珠單抗識別的表位的“必需部分”)。采用在研究的第一部分中具有msi的增長的肽觀察到相似效果。

總體結論是，這兩種抗體結合至nsellslindmpitndqkklmssn(seqidno:29)，但特異性不同。表位，但也在該表位的外部，的小結構差異，影響兩種抗體以完全不同的方式的結合。同樣，這表明ar201和帕利珠單抗之間的結合相互作用和表位氨基酸不同。

實施例14：植物中ar201的生成。

ar201在植物本氏煙(nicotianabenthamiana)中采用宏染(magnifection)技術生成(giritch等，2006，全長igg抗體在用非競爭病毒載體共同感染的植物中的快速高產(chǎn)表達(rapidhigh-yieldexpressionoffull-sizeiggantibodiesinplantscoinfectedwithnoncompetingviralvectors).proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica103(40):14701-14706)，其允許在極短時程內(nèi)產(chǎn)生抗體。具有減少的巖藻糖-和木糖-轉(zhuǎn)移酶的植物的使用(strasser等，2008，用于生成具有同源人樣n-聚糖結構的單克隆抗體糖工程改造的本氏煙(nicotianabenthamiana)的生成(generationofglyco-engineerednicotianabenthamianafortheproductionofmonoclonalantibodieswithahomogeneoushuman-liken-glycanstructure).plantbiotechnologyjournal6(4):392-402.)允許生成攜帶缺乏巖藻糖和木糖的聚糖的抗體。不含巖藻糖的igg抗體的供應具有增加的引發(fā)adcc(抗體-依賴性細胞-介導的細胞毒性)的能力，這歸因于它們對于fcriiia(cd16a)的較高親和性。

對于植物生長條件，載體、滲透、提取和純化，遵循他處描述的方法(castilho等，2011；快速高產(chǎn)生成埃博拉病毒單克隆抗體的不同糖鏈異質(zhì)體(rapidhighyieldproductionofdifferentglycoformsofebolavirusmonoclonalantibody).plosone,6(10),e26040.,giritch等,2006)。簡言之，將密碼子優(yōu)化的重和輕鏈克隆進入植物表達載體(giritch等，2006)并轉(zhuǎn)化進入根癌土壤桿菌(agrobacteriumtumefaciens)。過夜生長的等體積的土壤桿菌(agrobacterium)培養(yǎng)物在滲透緩沖劑(1mmmes/10mmmgso4ph5.5)中混合，獲得各個體培養(yǎng)物的1:1000稀釋物。將在22℃采用16/8小時光/暗周期生長4-5周的本氏煙(n.benthamiana)植物倒置，并將地上部分浸入細菌/緩沖劑溶液中。施加0.5巴的真空2分鐘，并在釋放后將葉子用細菌溶液浸潤。使植物重新回到生長間，并且在7天后在攪拌機中提取葉組織，其中為250ml冷緩沖劑(100mmtris，1mmedta，40mm抗壞血酸)/kg葉材料。提取物通過如下方式澄清化：用1m磷酸將ph降至4.8然后用2mtris堿重調(diào)節(jié)至ph7.5，以通過離心(16,000g，30分鐘)并通過過濾(0.2μm)使植物聚合物不溶化。進行蛋白a樹脂上的純化，隨后通過陰離子色譜精細化。tff濃縮后，提取物經(jīng)過濾(0.2μm)并立即施加至蛋白a柱。清洗柱(50mmhepes/100mmnacl，ph7.5)，洗脫(0.1m乙酸，ph3.0)中和洗脫物(2mtris，ph8.0)和添加吐溫80至0.01％之后，mab溶液通過q過濾(mustangacrodiscq膜；pall)精細化，等分并貯存在-80℃直至使用。

通過cho細胞和替代性地在植物中產(chǎn)生的抗體ar201與帕利珠單抗在棉鼠模型中比較，如下文討論。此外，在植物中產(chǎn)生2種ar201突變體，以增加抗體在血清中的半衰期。ar201-yte是三重突變m252y/s254t/t256e(yte)，將其引入fc部分。類似地，fc部分可經(jīng)修飾以具有igg(fcrn)的新生fc受體以增強半衰期。

棉鼠(a-f)分別用5mg/kg肌內(nèi)ar201、ar201-yte、ar201-xtnd和帕利珠單抗處理，并在第0天用rsv/a/tracy攻擊。

下文顯示，來自cho細胞的材料和來自植物的材料在肺灌洗空斑減少試驗和中和試驗中是相當?shù)?。此外，對于ar201產(chǎn)生的突變體與ar201在上述兩項試驗中顯示相當?shù)慕Y果。注意，“nic”指示煙草(nicotiana)表達，而“cho”指示cho細胞表達。以下字母，–xtnd或–yte，指示ar201抗體突變體。

比較cho/植物材料:肺灌洗空斑減少試驗中的rsv/a/tracy效價

表7.第+4天的肺灌洗流體中的rsv/a/tracy效價

*最小檢測約1.4log10/g肺。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組6對比2、3、4、5，p≤0.035。

rsv/a/tracy血清中和抗體效價：

表8.第0天的rsv/a/tracy血清中和效價

*斯氏t檢驗，雙尾。最小檢測＝2.5；對于統(tǒng)計學分析<2.5的值計為2。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組3對比2、4，p≤0.049；組6對比2、3、4、5，p<0.00001。

表9.第+4天的rsv/a/tracy血清中和效價

*斯氏t檢驗，雙尾。最小檢測＝2.5；對于統(tǒng)計學分析<2.5的值計為2。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組3對比4、5，p≤0.016；組6對比2、3、4、5，p<0.00001。

對于ar201產(chǎn)生的突變體與ar201在rsv/a/tracy肺灌洗空斑減少效價試驗中顯示相當?shù)慕Y果：

表10.第+4天的肺灌洗流體中的rsv/a/tracy效價

*最小檢測＝1.3log10/g肺。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組5對比2、4，p≤0.0082。

rsv/a/tracy血清中和抗體效價

表11.第0天的rsv/a/tracy血清中和效價

*斯氏t檢驗，雙尾。最小檢測＝2.5；對于統(tǒng)計學分析<2.5的值計為2。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組5對比2、3、4，p<0.00001。

表12.第+4天的rsv/a/tracy血清中和效價

*斯氏t檢驗，雙尾。最小檢測＝2.5；對于統(tǒng)計學分析<2.5的值計為2。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組5對比2、3、4，p≤0.000031。

本發(fā)明的任選方面是包含修飾的糖基化(例如，植物表達)和fc突變之一或兩者的抗體(例如，ar201)。我們預期植物表達(例如，存在缺乏巖藻糖和/或木糖的聚糖的抗體)和fc突變(m252y/s254t/t256e-yte)的組合將加和地或協(xié)同地增強抗體在預防和治療rsv感染方面的有效性。

實施例15：im給予ar201和帕利珠單抗在rsv/a/tracy棉鼠模型中的有效性

進行微中和試驗以在棉鼠的血清中測試針對的rsv/a/tracy的中和抗體。血清樣品在56℃加熱失活30分鐘，以雙份連續(xù)兩倍稀釋并與空斑純化的rsv/a/tracy(rsv/a)混合。具有近乎融合的hep-2細胞的96孔微效價板經(jīng)感染，進一步孵育，并如上所述(實施例8，“空斑減少試驗”)評價空斑形成。中和抗體效價定義為觀察到>50％空斑形成減少的血清稀釋度。

在棉鼠模型中測試ar201和帕利珠單抗的im給予的降低rsv效價的有效性。棉鼠(a-f)在-1天接受5mg抗體/kg體重(或?qū)φ罩苿?，并在第0天用具有1.35x10⁵空斑形成單位/棉鼠的rsv/a/tracy攻擊。攻擊后即刻，收集血液用于確定rsv-中和抗體水平。在第+4天，處死動物，收集血液樣品，并切除左肺葉。血液從肺葉移出，并肺采用3ml的具有與2％fbs-mem混合的15％甘油(1:1，v:v)的伊可夫氏培養(yǎng)基跨胸膜灌洗。通過輕柔按壓膨脹的肺葉回收灌洗液體，并用以按相同技術灌洗右葉。rsv效價如上所述(實施例8，“空斑減少試驗)測定。

相比接受了帕利珠單抗的棉鼠，接受了預防性劑量的ar201的棉鼠具有血清中顯著較高的rsv/a/tracy中和抗體效價。盡管ar201和帕利珠單抗以5mg/kg劑量給藥，在rsv/a/tracy攻擊時(第0天)，對于ar201的血清中和抗體效價顯著高于對于帕利珠單抗的效價。該中和抗體的效價差異通過第4天ar201處理的棉鼠的肺灌洗流體中的病毒效價的減少反映(參見下文)。

ar201和帕利珠單抗均減少了肺灌洗流體中的病毒效價，然而，盡管帕利珠單抗僅減少約70倍因數(shù)的效價，ar201以超過500倍減少肺病毒效價，因此比帕利珠單抗有效數(shù)倍。因此，在rsv/a棉鼠模型中降低肺病毒效價方面，ar201是比帕利珠單抗更有力的單克隆抗體。參見圖13。

表13.第0天的rsv/a/tracy血清中和效價

*斯氏t檢驗，雙尾。最小檢測＝2.5；對于統(tǒng)計學分析<2.5的值計為2。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組2對比3，p<0.00001。

表14.第+4天的rsv/a/tracy血清中和效價

*斯氏t檢驗，雙尾。最小檢測＝2.5；對于統(tǒng)計學分析<2.5的值計為2。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組2對比3p≤0.000031。

表15.第+4天的肺灌洗流體中的rsv/a/tracy效價

*最小檢測＝1.3log10/g肺。額外顯著p值(斯氏t檢驗，雙尾)：組2對比3。

實施例16：增強的ar201。

已經(jīng)描述不同igg突變以通過改變其與新生fc受體(fcrn)的結合來延長igg在血清中的半衰期。fcrn在核內(nèi)體中于酸性ph下結合igg，并且在細胞中性ph將其釋放。fcrn結合位點上，但也在更遠位置處的，igg的突變，可能會影響該結合表現(xiàn)，增加抗體對fcrn的親和性，并延長igg的半衰期，大致為3-4倍。

產(chǎn)生兩種突變體ar201-yte和ar201-xtnd(參見實施例14，上文)，以產(chǎn)生具有延長的半衰期的高親和性rsv-抗體。這將允許使這些抗體的給藥頻率大致從一次/月減少至僅一次/rsv感染季(4-6個月)。尤其對于高風險嬰兒、他們的家長及他們的醫(yī)師，這將提供對于當前治療/預防方案的顯著改善。

抗體效應物功能樣抗體依賴性細胞-介導的細胞毒性(adcc)在對抗病毒感染中是重要的。adcc由通過在相同時間結合至表位和fcriiia(cd16a)(某些免疫細胞上表達的“adcc-受體“)交聯(lián)抗原和免疫細胞(例如，自然殺傷細胞)的抗體介導。這引發(fā)adcc，或?qū)Π屑毎臍??？贵w對于fcγriiia的更高親和性意味著免疫細胞對靶標增加的殺傷，即意味著更佳的adcc?？贵w對于受體的親和性可通過改變抗體的氨基酸序列來影響，但也通過改變抗體的糖基化概況影響(shinkawa，j.biol.chem.2003；278(5):3466–3473)。特異性聚糖部分(α-1,6-巖藻糖)的缺失顯著增加了對于fcriiia受體的親和性并由此增加了adcc)。不幸的是，大多數(shù)常用igg生產(chǎn)系統(tǒng)產(chǎn)生具有高度巖藻糖化的抗體(約95％)。允許生成非巖藻糖化或低巖藻糖化的抗體的其它替代物包括植物生成系統(tǒng)，如上所述。

ar201在基于植物的抗體生成系統(tǒng)(例如，具有宏染系統(tǒng)的本氏煙(nicotianabenthamiana))中的生成導致產(chǎn)生具有幾乎檢測不到的巖藻糖的ar201。帶有fc修飾的抗體(例如，ar201-yte)的生成已顯示良好親和性并且會增強抗體半衰期。改善的產(chǎn)物可以是同時具有這兩個特征的抗體。例如，抗rsv抗體(例如ar201)可設計具有fc突變，以具有更佳的半衰期，并且在植物中表達以具有更佳的細胞毒性。該組合提供的功效可高于單一個體所提供的功效。在研的ar201作為抗體結合了通過氨基酸突變實現(xiàn)的更長半衰期和通過優(yōu)化的糖基化概況和/或氨基酸突變實現(xiàn)的增加的adcc的兩種效果，并且預計優(yōu)于迄今描述的任何抗rsv。所述改善的抗rsv抗體可為嬰兒、老年人和免疫力低下患者提供挽救生命的益處。

本文所述的所有參考文獻均通過引用其全文納入本文。