本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種基于重組病毒的抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法的建立和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus，rsv)是在世界范圍內(nèi)引起5歲以下兒童和嬰兒嚴(yán)重呼吸道疾病和毛細(xì)支氣管炎的最常見(jiàn)的病毒性病原體之一。rsv引起的季節(jié)性感染通常持續(xù)1-2周，在大多數(shù)健康的成年人身上表現(xiàn)為輕微的類似感冒的癥狀。然而，對(duì)于弱勢(shì)群體—嬰兒、老年人和免疫力低下的人，rsv感染易導(dǎo)致嚴(yán)重的下呼吸道感染。據(jù)估計(jì)，2005年全球約有3.38億5歲以下兒童發(fā)生了rsv感染。其中，約有340萬(wàn)人為嚴(yán)重的下呼吸道感染需要住院治療，至少有66,000人死亡。嚴(yán)重的rsv感染同樣困擾著老年人，在美國(guó)每年rsv感染會(huì)導(dǎo)致約177,000名老年人住院，約有11,000人死亡。據(jù)估計(jì)，每年住院費(fèi)用超過(guò)10億美元。持續(xù)缺乏任何特定的治療或安全有效疫苗減少全球rsv感染的發(fā)病率和死亡率。

目前還沒(méi)有授權(quán)的疫苗可以預(yù)防rsv，用于治療rsv的藥物也僅有利巴韋林和帕利珠單抗，然而帕利珠單抗是一種昂貴的人源化單克隆抗體，僅能用作預(yù)防性治療，利巴韋林是一種核苷抗代謝物，有嚴(yán)重毒性，存在致畸作用。因此，我們迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗rsv藥物。

高通量篩選(highthroughputscreening，hts)技術(shù)以分子水平和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微板形式結(jié)合自動(dòng)化操作系統(tǒng)，以靈敏快速的檢測(cè)儀器采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)高容量化合物樣品庫(kù)的篩選。高通量篩選在微板中進(jìn)行操作，樣品用量一般在微克級(jí)別，節(jié)省了化合物樣品，降低了成本；運(yùn)用自動(dòng)化操作系統(tǒng)，減少了工作人員的勞動(dòng)量，提高了篩選的準(zhǔn)確性；依賴于數(shù)量龐大的化合物樣品庫(kù)，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模的藥物篩選，充分利用了藥物資源，提高了新的藥物發(fā)現(xiàn)的概率。

高通量篩選系統(tǒng)由化合物樣品庫(kù)，自動(dòng)化操作系統(tǒng)，檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)四個(gè)部分組成，運(yùn)用所建立的高通量篩選模型，可以微量、快速、靈敏和準(zhǔn)確的進(jìn)行藥物篩選。目前，高通量篩選模型已經(jīng)成為開(kāi)發(fā)抗病毒藥物的主要方式，迄今為止已有很多高通量篩選模型用于抗病毒藥物篩選，并取得了一定的成效。

因此，提供一種抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法對(duì)于預(yù)防和治療rsv具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種基于反向遺傳學(xué)構(gòu)建的重組rsv反基因組質(zhì)粒rrsv-gfp及其經(jīng)拯救獲得的重組病毒。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、便于操作的抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種基于反向遺傳學(xué)構(gòu)建的重組rsv反基因組質(zhì)粒rrsv-egfp，其序列如seqidno.1所示，全長(zhǎng)為19543bp。

進(jìn)一步地，所述重組質(zhì)粒rrsv-egfp是將重組序列裝入到pbrat載體中獲得的；其中，所述重組序列是在rsv反基因組的5′端側(cè)翼插入t7啟動(dòng)子序列，3′端側(cè)翼插入丁型肝炎核酶(hdvribozyme,δ)序列和t7終止子，在g和f基因之間插入綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)基因，并刪除了sh基因的非編碼區(qū)186-297之間112個(gè)堿基；所述pbrat載體是將合成的linkerclaⅰ-pmeⅰ-xhoⅰ-asuⅱ-xmaⅰ-nheⅰ-mluⅰ-nruⅰ插入pbr322載體中，即得。

本發(fā)明所述重組質(zhì)粒的制備包括以下步驟：

1)將合成的linkerclaⅰ-pmeⅰ-xhoⅰ-asuⅱ-xmaⅰ-nheⅰ-mluⅰ-nruⅰ插入pbr322載體，將其改造為pbrat載體；

2)將nheⅰlmluⅰ合成片段連接到載體pmd18-t中得pmd18-t-l質(zhì)粒；取a1(pmeⅰns1ns2npmshxhoⅰ)合成片段、pbr322b載體，pmeⅰ和xhoⅰ酶切，連接，得到pbr322b-rsva1質(zhì)粒；取a2(sacishgasuⅱ)合成片段、pbr322b載體，saci和asuⅱ酶切，連接，得到pbr322b-rsva2質(zhì)粒。

3)本發(fā)明采用分段克隆的方法來(lái)構(gòu)建rrsv-egfp質(zhì)粒，即取pmd18-t-l質(zhì)粒、pbrat載體，nhei和mlui酶切，連接，得到pbrat-l質(zhì)粒，取asuiigegfpfm2lnheⅰ合成質(zhì)粒、pbrat-l質(zhì)粒，asuii和nhei酶切，連接，得到pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，取pbr322b-rsva1質(zhì)粒、pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，pmei和xhoi酶切，連接，得到pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，取pbr322-rsva2和pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，saci和asuii酶切，連接，得到rrsv-egfp質(zhì)粒。

采用相似或相同的制備原理，重組序列也可以裝入到其他的表達(dá)載體中或修改的表達(dá)載體中，表達(dá)載體的修改方式不限于本申請(qǐng)例舉的方法。

采用本發(fā)明原理構(gòu)建重組質(zhì)粒的方法，插入綠色熒光蛋白基因以外的其他報(bào)告基因，如熒光素酶、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、分泌型堿性磷酸酶等活熒光蛋白家族中的成員，實(shí)現(xiàn)通過(guò)檢測(cè)報(bào)告蛋白的表達(dá)量來(lái)評(píng)價(jià)抗rsv藥物的，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明構(gòu)建的攜帶egfp重組質(zhì)粒是在以rsvlong株為母本的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造構(gòu)建的，推動(dòng)了反向遺傳學(xué)在rsv上的應(yīng)用，另外，利用此重組質(zhì)?？捎糜谡萺sv重組病毒，并可進(jìn)一步將重組病毒用于抗rsv藥物的高通量篩選中，具有靈敏直觀的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明還提供了由上述重組質(zhì)粒經(jīng)拯救獲得重組rsv。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述重組rsv在篩選抗rsv藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明利用上述重組rsv病毒篩選抗rsv藥物的高通量篩選方法，包括以下步驟：接種宿主細(xì)胞，加入重組rsv和待篩選藥物；檢測(cè)gfp熒光強(qiáng)度；評(píng)價(jià)待篩選藥物的抗rsv效果。

基于rrsv-egfp的高通量篩選模型有很多優(yōu)點(diǎn)：第一，操作非常簡(jiǎn)單，高效，很適合自動(dòng)化的篩選以便廣泛的篩選化合物的；第二，與基于細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,cpe)等傳統(tǒng)的方法相比，基于rrsv-egfp的高通量篩選模型的數(shù)據(jù)更客觀、準(zhǔn)確和穩(wěn)定，避免了實(shí)驗(yàn)人員的主觀影響；第三，綠色熒光蛋白的發(fā)光過(guò)程不需要任何其他輔助因素，可直接產(chǎn)生綠色熒光，且gfp的表達(dá)量與病毒在細(xì)胞中的復(fù)制量相統(tǒng)一，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和病毒的復(fù)制幾乎沒(méi)有影響。

進(jìn)一步地，所述宿主細(xì)胞包括實(shí)驗(yàn)組宿主細(xì)胞、細(xì)胞對(duì)照組宿主細(xì)胞、病毒對(duì)照組宿主細(xì)胞和陽(yáng)性對(duì)照組宿主細(xì)胞。

所述宿主細(xì)胞為hep-2細(xì)胞或vero細(xì)胞；優(yōu)選地，為hep-2細(xì)胞。

利用熒光強(qiáng)度抑制率評(píng)價(jià)待篩選的藥物的抗rsv效果，公式如下：

抑制率＝(病毒對(duì)照組熒光強(qiáng)度-實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度)/(病毒對(duì)照組熒光強(qiáng)度-細(xì)胞對(duì)照組熒光強(qiáng)度)×100％

其中，所述細(xì)胞對(duì)照組既不加重組rsv也不加待篩選藥物；病毒對(duì)照組只加重組rsv，不加待篩選藥物；實(shí)驗(yàn)組既加重組rsv又加待篩選化合物；另外同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組，加重組rsv和對(duì)重組rsv明確有抑制作用的化合物。所述病毒對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組加入重組rsv的量相同。所述熒光強(qiáng)度是指綠色熒光蛋白(gfp)的熒光信號(hào)(rfu)。抑制率越大則表明待篩選藥物抗rsv作用越強(qiáng)，可以對(duì)比陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的抑制率，確定待篩選藥物對(duì)rsv的抑制作用。

進(jìn)一步地，所述熒光強(qiáng)度檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為470-481nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515-525nm；優(yōu)選地，激發(fā)波長(zhǎng)479nm，發(fā)射波長(zhǎng)517nm。

進(jìn)一步地，所述病毒加入后24-72h檢測(cè)熒光強(qiáng)度；優(yōu)選地，為48h。

進(jìn)一步地，所述96孔板中，宿主細(xì)胞感染重組rsv劑量為100-10000pfu/孔；優(yōu)選地，宿主細(xì)胞感染重組rsv病毒劑量為3000pfu/孔。

進(jìn)一步地，所述96孔板中，宿主細(xì)胞的接種密度為0.5×10⁴-4×10⁴細(xì)胞/孔；優(yōu)選地，為2×10⁴細(xì)胞/孔。

為了優(yōu)化高通量篩選方法中g(shù)fp的檢測(cè)條件，本發(fā)明對(duì)gfp的檢測(cè)波長(zhǎng)、檢測(cè)時(shí)間、病毒感染劑量、病毒感染劑量、細(xì)胞密度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示：對(duì)于檢測(cè)波長(zhǎng)：當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為470-481nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515-525nm，檢測(cè)病毒量與熒光強(qiáng)度間的線性關(guān)系較好；而激發(fā)波長(zhǎng)為479nm，發(fā)射波長(zhǎng)為517nm熒光強(qiáng)度值較高，因此，確定了檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為479nm，發(fā)射波長(zhǎng)為517nm。對(duì)于檢測(cè)時(shí)間：在感染后48h，gfp表達(dá)水平較高，72h時(shí)熒光強(qiáng)度有所下降，因此確定檢測(cè)時(shí)間為感染后48h。對(duì)于病毒感染劑量：隨著rsv濃度的增高細(xì)胞活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，然而在100-10000pfu細(xì)胞活性維持在80％以上，結(jié)合病毒感染劑量?jī)?yōu)化結(jié)果，確定病毒感染劑量為3000pfu/孔。對(duì)于細(xì)胞密度：當(dāng)細(xì)胞密度為2×10⁴細(xì)胞/孔時(shí)能夠檢測(cè)到最大信號(hào)強(qiáng)度，且各細(xì)胞密度對(duì)照組間無(wú)顯著性差異，因此，確定細(xì)胞用量為2×10⁴細(xì)胞/孔。

在本發(fā)明中，待篩選藥物可以是人工合成的化合物，也可以是從天然產(chǎn)物中分離純化的化合物，可以是單個(gè)化合物，也可以是由單個(gè)化合物組成的混合化合物。初篩后，將陽(yáng)性的混合化合物樣品拆分為單個(gè)化合物，進(jìn)行再次篩選。

本發(fā)明的有益效果如下：

1、本發(fā)明利用表達(dá)綠色熒光蛋白的重組rsv病毒與宿主細(xì)胞和待篩選化合物相互作用，由于綠色熒光蛋白的表達(dá)水平與病毒復(fù)制水平密切相關(guān)可以通過(guò)檢查熒光強(qiáng)度分析化合物的抗病毒作用，進(jìn)而建立針對(duì)rsv的高通量藥物篩選模型，進(jìn)行大規(guī)模的藥物篩選，為抗rsv藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)便，能夠更快速、準(zhǔn)確的反映病毒狀況，便于高通量操作；

3、本發(fā)明方法是在96孔板中進(jìn)行操作，能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)化合物進(jìn)行篩選，且數(shù)據(jù)更客觀、準(zhǔn)確和穩(wěn)定，避免了實(shí)驗(yàn)人員的主觀影響；

4、本發(fā)明gfp熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物及其他輔助因子，且對(duì)細(xì)胞毒性較小。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1示出載體pbrat的酶切鑒定電泳圖，其中m代表分子量標(biāo)記物。

圖2示出重組rrsv-egfp質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖，其中m代表分子量標(biāo)記物；1：asuⅱ，nheⅰ；2：pmeⅰ，xho??；3：asuⅱ，sacⅰ；4：ecorⅴ；5：spe??；6：aflⅱ；7：mluⅰ。

圖3示出質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染bhk-t7/9細(xì)胞后顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況；1：實(shí)驗(yàn)組；2：陽(yáng)性對(duì)照組；3：陰性對(duì)照組mock。

圖4示出盲傳至宿主細(xì)胞hep-2細(xì)胞后顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況；1：實(shí)驗(yàn)組；2：陰性對(duì)照組mock。

圖5示出熒光顯微鏡觀察rrsv-egfp連續(xù)傳代后熒光表達(dá)情況；p1-p8：第一到第八代。

圖6示出利用免疫酶法檢測(cè)連續(xù)傳代后重組病毒的空斑形成單位(pfu/ml)

圖7示出為不同激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)的結(jié)果，其中，pfu/孔為96孔板每個(gè)孔中的病毒數(shù)單位；檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為：a：487、509；b：485、511；c：483、513；d：481、515；e：479、517；f：470、525。

圖8示出不同時(shí)間點(diǎn)rsv與gfp之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。

圖9示出病毒感染量對(duì)細(xì)胞活性的影響。

圖10示為細(xì)胞密度與檢測(cè)結(jié)果的關(guān)系，其中，細(xì)胞/孔為96孔板每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)單位。

圖11示為化合物p13與gfp表達(dá)量的關(guān)系。

圖12示出利巴韋林與gfp表達(dá)量的關(guān)系。

圖13示出高通量篩選模型z’因子檢測(cè)統(tǒng)計(jì)圖

圖14示出sp100107化合物庫(kù)2000個(gè)化合物初篩陽(yáng)性結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1rrsv-egfp質(zhì)粒的構(gòu)建

1、將合成的linkerclaⅰ-pmeⅰ-xhoⅰ-asuⅱ-xmaⅰ-nheⅰ-mluⅰ-nruⅰ插入pbr322載體，將其改造為pbrat載體，將改造后的載體利用xhoⅰ和notⅰ進(jìn)行酶切鑒定，于3466bp處得到目的條帶(圖1)，即載體片段。

2、將nheⅰlmluⅰ合成片段連接到載體pmd18-t中得pmd18-t-l質(zhì)粒；取a1(pmeⅰns1ns2npmshxhoⅰ)合成片段、pbr322b載體，pmeⅰ和xhoⅰ酶切，連接，得到pbr322b-rsva1質(zhì)粒；取a2(sacishgasuⅱ)合成片段、pbr322b載體，saci和asuⅱ酶切，連接，得到pbr322b-rsva2質(zhì)粒。

3、反基因組rrsv-egfp質(zhì)粒構(gòu)建

取pmd18-t-l質(zhì)粒、pbrat載體，nhei和mlui酶切，連接，得到pbrat-l質(zhì)粒，取asuiigegfpfm2lnhei合成質(zhì)粒、pbrat-l質(zhì)粒，asuii和nhei酶切，連接，得到pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，取pbr322b-rsva1質(zhì)粒、pbrat-gegfpfm2l質(zhì)粒，pmei和xhoi酶切過(guò)夜，連接，得到pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，取pbr322-rsva2質(zhì)粒和pbrat-rsv-egfpδa2質(zhì)粒，saci和asuii酶切，連接，得到rrsv-egfp質(zhì)粒，將獲得的rrsv-egfp質(zhì)粒用asuⅱ，nheⅰ(1)；pmeⅰ，xhoⅰ(2)；asuⅱ，sacⅰ(3)；ecorⅴ(4)；speⅰ(5)；aflⅱ(6)；mluⅰ(7)多組酶進(jìn)行酶切鑒定，分別在相應(yīng)位置得到目的條帶(圖2)。

實(shí)施例2重組病毒的拯救

將bhkt7/9細(xì)胞接種在6孔板，24h后，轉(zhuǎn)染所述rrsv-egfp質(zhì)粒和四種輔助蛋白質(zhì)粒(pcdna3.1-n,p,l,m2-1)至宿主細(xì)胞(bhkt7/9)于37℃下培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組)，與此同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組mock，其中陽(yáng)性對(duì)照組轉(zhuǎn)染rsv微型復(fù)制子pbr322b-rsv-egfp和四種輔助蛋白質(zhì)粒(pcdna3.1-n,p,l,m2-1)，陰性對(duì)照組mock只轉(zhuǎn)染四種輔助蛋白質(zhì)粒(pcdna3.1-n,p,l,m2-1)，轉(zhuǎn)染96小時(shí)盲傳至宿主細(xì)胞hep-2繼續(xù)放置于37℃下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染(圖3)和盲傳(圖4)后每天在顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，根據(jù)細(xì)胞出現(xiàn)的熒光可以判斷實(shí)驗(yàn)組已成功拯救出重組病毒。

實(shí)施例3重組病毒穩(wěn)定性鑒定

利用熒光顯微鏡觀察rrsv-egfp連續(xù)傳代后熒光表達(dá)情況(圖5)和利用免疫酶法檢測(cè)連續(xù)傳代后重組病毒的空斑形成單位(pfu/ml)(圖6)，從連續(xù)傳代的熒光表達(dá)情況可以看出拯救出的重組病毒是穩(wěn)定的，免疫酶法檢測(cè)的結(jié)果顯示拯救出的重組病毒的量在連續(xù)傳3代后趨于穩(wěn)定(p<0.05)。

實(shí)施例4檢測(cè)條件的優(yōu)化

1.確定合適的檢測(cè)波長(zhǎng)：

96孔板中培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，感染3倍梯度稀釋的rsv(30000-0pfu)，于感染后24h檢測(cè)gfp表達(dá)水平，如圖7所示，檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為：a：487、509；b：485、511；c：483、513；d：481、515；e：479、517；f：470、525，用d、e、f三組波長(zhǎng)檢測(cè)病毒量與熒光強(qiáng)度間的線性關(guān)系較好，e組的熒光強(qiáng)度值較高，確定檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)為479nm，發(fā)射波長(zhǎng)為517nm。

2.確定合適的檢測(cè)時(shí)間和病毒感染劑量：

96孔板中培養(yǎng)hep-2細(xì)胞，感染3倍梯度稀釋的rsv(30000-0pfu)，分別于感染后24h、48h和72h檢測(cè)gfp表達(dá)水平，如圖8所示，在感染后48h，gfp表達(dá)水平較高，確定檢測(cè)時(shí)間為感染后48h。并利用mts法對(duì)感染后48h的細(xì)胞活性進(jìn)行了檢測(cè)，如圖9所示，隨著rsv濃度的增高細(xì)胞活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，然而在100-10000pfu細(xì)胞活性維持在80％以上，且病毒量與熒光強(qiáng)度有很強(qiáng)的相關(guān)性，確定病毒感染劑量為3000pfu/孔。

3.確定合適的細(xì)胞用量：

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別按0.5×10⁴細(xì)胞/孔、1.0×10⁴細(xì)胞/孔、2×10⁴細(xì)胞/孔和4×10⁴細(xì)胞/孔的密度將hep-2細(xì)胞接種到96孔板中，用3000pfu/孔的rsv感染hep-2細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)的細(xì)胞對(duì)照，感染后48h，檢測(cè)gfp表達(dá)水平。如圖10所示，當(dāng)細(xì)胞密度為2×10⁴細(xì)胞/孔時(shí)能夠檢測(cè)到最大信號(hào)強(qiáng)度(p<0.01)，因此確定細(xì)胞用量為2×10⁴細(xì)胞/孔。

實(shí)施例5系統(tǒng)驗(yàn)證

96孔板中，按2×10⁴細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，24h后取化合物p13或利巴韋林進(jìn)行10倍梯度稀釋至10^-4-10²μm加到細(xì)胞中，之后加入3000pfu/孔的rsv，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)劑量dmso對(duì)照組，細(xì)胞對(duì)照及病毒對(duì)照，感染后48h檢測(cè)egfp表達(dá)水平。當(dāng)化合物p13濃度為1m時(shí)，與dmso對(duì)照組相比，egfp表達(dá)水平顯著下降(如圖11，p<0.05)；當(dāng)p13濃度達(dá)到100μm時(shí)，egfp表達(dá)量幾乎完全被抑制。當(dāng)利巴韋林濃度為10^-2μm時(shí)，與空白對(duì)照組相比，egfp表達(dá)水平顯著下降(如圖12，p<0.05)；當(dāng)利巴韋林濃度達(dá)到100μm時(shí)，egfp表達(dá)量幾乎完全被抑制。

同時(shí)，在加入化合物p13或利巴韋林48h后，我們利用mts法對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明在所有實(shí)驗(yàn)劑量組中，細(xì)胞活性均保持在80％以上，表明陽(yáng)性化合物對(duì)rsv的抑制作用并不是由細(xì)胞毒性引起的，且dmso溶劑對(duì)egfp的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響?；谶@些結(jié)果，我們認(rèn)為此系統(tǒng)能夠正確反映陽(yáng)性化合物對(duì)rsv的抑制作用，能夠用于篩選抗rsv藥物。

實(shí)施例6高通量篩選模型z’因子檢測(cè)

96孔板中，按2×10⁴細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，24h后用3000pfu/孔的rsv感染hep-2細(xì)胞，作為病毒感染組(48個(gè)孔)，hep-2細(xì)胞只加入維持液，作為細(xì)胞對(duì)照組(48個(gè)孔)，感染后48h檢測(cè)egfp表達(dá)水平，結(jié)果如圖13所示，從圖中可以看出，病毒感染組和細(xì)胞對(duì)照組的相對(duì)熒光強(qiáng)度均穩(wěn)定分布在一定范圍內(nèi)。計(jì)算z’因子，變異系數(shù)(％cv)、信噪比(s/n)和信背比(s/b)。z’＝1-(3×病毒感染對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)偏差+3×細(xì)胞對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)偏差)/(病毒感染對(duì)照組平均值-細(xì)胞對(duì)照組平均值)，z’在0.5～1.0之間符合高通量篩選的要求。s/b＝病毒感染對(duì)照組平均值/細(xì)胞對(duì)照組平均值(推薦標(biāo)準(zhǔn)：>3)；s/n＝(病毒感染對(duì)照組平均值-細(xì)胞對(duì)照組平均值)/((細(xì)胞對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)偏差)2+(病毒感染對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)偏差)2)1/2(推薦標(biāo)準(zhǔn)：>10)。％cv＝病毒感染對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)偏差/病毒感染組平均值(推薦標(biāo)準(zhǔn)：<20)。如表1所示，根據(jù)公式計(jì)算，抗rsv藥物高通量篩選模型z’＝0.85(n＝48)，符合高通量篩選模型的可接受標(biāo)準(zhǔn)，其他各項(xiàng)參數(shù)也均符合高通量篩選的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，因此，利用gfp標(biāo)記的重組rsv建立的抗rsv藥物篩選模型符合高通量篩選要求，可以應(yīng)用于大規(guī)模篩選實(shí)驗(yàn)。

表1高通量篩選模型各參數(shù)統(tǒng)計(jì)表

實(shí)施例7sp100107化合物庫(kù)篩選

采用本發(fā)明構(gòu)建的篩選模型進(jìn)行小規(guī)模的藥物篩選，初篩2000個(gè)化合物，篩選濃度為10μm。96孔板中，按2×10⁴細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，用3000pfu/孔的rsv感染hep-2細(xì)胞同時(shí)取化合物1μl加到hep-2細(xì)胞中，感染48h后檢測(cè)綠色熒光蛋白的表達(dá)量。計(jì)算抑制率。抑制率＝(病毒感染對(duì)照組-實(shí)驗(yàn)組)/(病毒感染對(duì)照組-細(xì)胞陰性對(duì)照組)×100％。選擇抑制率大于50％的化合物作為初篩得到的陽(yáng)性化合物，包括硫唑嘌呤和6-巰基嘌呤等(如表2)，陽(yáng)性率為1.65％(部分結(jié)果如圖14)。

表2部分陽(yáng)性化合物的分子式和結(jié)構(gòu)式

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

sequencelisting

<110>北京交通大學(xué)

<120>一種抗呼吸道合胞病毒藥物的高通量篩選方法和應(yīng)用

<130>jlc17i0140ea

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19543

<212>dna

<213>質(zhì)粒rrsv-egfp

<400>1

gtttaaactaatacgactcactatagggacgggaaaaaatgcgtacaacaaacttgcgta60

aaccaaaaaaatggggcaaataagaatttgataagtaccacttaaatttaactcccttgg120

ttagagatgggcagcaattcgttgagtatgataaaagttagattacaaaatttgtttgac180

aatgatgaagtagcattgttaaaaataacatgctatactgacaaattaatacatttaact240

aatgctttggctaaggcagtgatacatacaatcaaattgaatggcattgtgtttgtgcat300

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aatcaaccaatggaaaatacatccataacaatagaattctcaagcaaattctggccttac4380

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