專利名稱：：多價抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合部位的基因工程抗體，和此類基因工程抗體的用途，如治療應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：天然存在抗體的結(jié)構(gòu)天然存在抗體(免疫球蛋白)包含靠二硫鍵連接在一起的兩條重鏈和兩條輕鏈，每一條輕鏈與每一條重鏈靠二硫鍵相連。每條重鏈在一末端有一個可變區(qū)(VH),其后是多個恒定區(qū)(三個或四個恒定區(qū)，CH1、CH2、CH3和CH4,取決于抗體種類)。每條輕鏈i一末端有一個可變區(qū)(VL),在另一末端有一個恒定區(qū)(CL);輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)對齊，而輕鏈可變區(qū)與重鏈可變區(qū)對齊。見本文圖1。據(jù)信，在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間由具體的氨基酸殘基形成一個界面，參見例如，Chothia等，J.Mol.Biol.186:651-663(1985);及Novotny和Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:4592-4596(1985)。恒定區(qū)并不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但卻參與各種效應(yīng)器功能，如參與抗體在抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)中的作用。每對輕鏈和重鏈的可變區(qū)直接參與抗體與抗原的結(jié)合。天然存在輕鏈和重鏈的可變區(qū)具有相同的一般結(jié)構(gòu)；每一可變區(qū)包括由3個互補決定區(qū)(CDRs)連接的4個框架區(qū)(FRs),其序列多少有些保守。(見Kabat等,SequencesofproteinsofImmunologicalInterest,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD,(1991))。此4個FRs大多采取P-片層構(gòu)象，而CDRs形成環(huán)連接，某些情況下形成(3-片層結(jié)構(gòu)的一部分。每條鏈的CDRs通過FRs而與另一條鏈的CDRs緊密相接，從而形成抗原結(jié)合部位。圖2A-E描述5種主要天然存在免疫球蛋白同種型的結(jié)構(gòu)。IgG、IgD和IgE免疫球蛋白僅有2個抗原結(jié)合部位。另一方面，IgA和IgM能夠形成具有更高價的多聚結(jié)構(gòu)。IgM是由漿細胞分泌的五聚體，其五個單體由連接它們羧基末端(C(i4/C^i4)結(jié)構(gòu)域和Cp/Cp結(jié)構(gòu)域的二硫鍵結(jié)合在一起。這五個單體亞單位是這樣排列的它們的Fc區(qū)位于五聚體的中央，10個抗原結(jié)合部位位于分子的外周。每個五聚體包含另外的稱為J(連接)鏈的Fc-連接多肽，它通過二硫鍵連接到10個)a鏈中2個的羧基末端半胱氨酸殘基上。該J鏈似乎對于單體聚合以形成由五聚體IgM而言是必需的；它恰好是在五聚體分泌之前才加上去的。一個IgM分子可以結(jié)合IO個小的半抗原分子；然而，由于空間位阻，僅能同時結(jié)合5個較大的抗原分子。增加了價數(shù)的五聚體IgM,增加了其結(jié)合多維抗原如病毒顆粒和紅細胞(RBCs)的能力。IgA主要以單體存在，盡管有時可以見到其聚合體形式，如二聚體、三聚體、甚至四聚物。外分泌的IgA由二聚體或四聚物，一個J鏈多肽和一個稱為分泌成分的多肽鏈構(gòu)成?？贵w的臨床應(yīng)用單克隆抗體具有廣泛的用途，特別是衍生自嚙齒類動物(包括鼠)的單克隆抗體，可是，在人臨床應(yīng)用中它們常常具有抗原性。例如，嚙齒類動物單克隆抗體在臨床應(yīng)用中的主要局限性是治療期間的抗球蛋白反應(yīng)(Miller等，Blood62:988-995(1983);andSchroff,R.W.等，CancerRes.45:879-885(1985))。本領(lǐng)域技術(shù)人員試圖通過構(gòu)建"嵌合"抗體來攻克這一難題，在所述嵌合抗體中，動物抗原結(jié)合可變區(qū)與人恒定區(qū)偶聯(lián)(Cabilly等，美國專利4，816,567;Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984);Boulianne等，Nature312:643-646(1984);及Neuberger等，Nature314:268-270(1985))?？梢赃x擇人恒定區(qū)同種型以適應(yīng)嵌合抗體參與ADCC和CDC(參見例如Briigg醒nn等，J.Exp.Med.166:1351-1361(1987);Riechmann等，Nature332:323-327(1988);Love等，MethodsinEnzymology178:515-527(1989);以及Bindon等，J,Exp.Med.168:127-142(1988))。在代表性的實施方案中，此類嵌合抗體含有約三分之一的嚙齒類動物(或其它非人種)序列，因而能夠在人類引發(fā)顯著的抗球蛋白反應(yīng)。例如，在使用鼠抗-CD3抗體OKT3的情況下，所引起的抗球蛋白反應(yīng)主要是對抗可變區(qū)而不是恒定區(qū)(Jaffers等，Transplantation41:572-578(1986))。另一努力是為解決抗體的抗原結(jié)合功能和減少使用人抗體中的異源序列，Winterse及其同事(Jones等,Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-327(1988);和Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))已經(jīng)用嚙齒類動物的CDRs或CDR4列替換了人抗體的相應(yīng)片段。該研究的治療前景得到臨床效果的支持人源化抗體對2個非何杰金淋巴瘤患者的CAMPATH-1抗原特異，其中一個患者此前已出現(xiàn)了對親本大鼠抗體的抗球蛋白反應(yīng)(Riechmann等，Nature332:323-327(1988);和Hale等，Lanceti:1394-1399(1988》。有些情況下，用來自嚙齒類動物抗體的CDRs代替人框架的人CDRs,足以帶來高抗原結(jié)合親和力(Jones等，Nature321:522-525(1986);Verhoeyen等，Science239:1534-1536(1988))，而在其它情況下，有必要另外替換一個(Riechmann等，Nature332:323-327(1988))或數(shù)個(Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989))框架殘基。也參見Co等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2869-2873(1991);美國專利5,821,337(Carter等)；和美國專利5,530,101(Queen等)。有關(guān)人源化抗體的其它參考文獻包括Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4181-4185(1991);Daugherty等，核酸Research19(9):2471-2476(1991);Brown等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:2663-2667(1991);以及Junghans等，CancerResearch50:1495-1502(1990)。為了避免產(chǎn)生對抗鼠抗體的人抗體(稱為"HAMA反應(yīng)")，人們可以用人抗體取代嵌合/人源化抗體，來治療患者。數(shù)種技術(shù)可用于產(chǎn)生人抗體。使用噬菌體展示技術(shù)可以篩選人抗體。噬菌體展示已被用于從未免疫供體中篩選人抗體(Marks等J.Mol.Biol.222:581-597(1991))。根據(jù)這一方法，PCR用于從人外周血淋巴細胞(PBLs)制備的mRNA中擴增可變區(qū)基因。使用使IgG和IgM重鏈的DNA以及k和入鏈的DNA得到擴增的引物。然后，這些基因隨機地結(jié)合并以與M13噬菌體的基因III外被蛋白融合的單鏈Fv(scFv)形式進行表達。接著，通過幾輪生長(roundsofgrowth)并且經(jīng)過與抗原結(jié)合(如結(jié)合固相化抗原)的篩選而鑒定抗目的抗原的人抗體。見Griffiths等EM80J.12:725-734(1993)。"合成的"噬菌體-抗體所有組成成分，也已從克隆的人VH-基因片段制得。使用5或8個隨機殘基的短H3環(huán)，首先構(gòu)建所有組成成分(每一具有49個片段)(2X107克隆)，并與固定輕鏈結(jié)合(Hoogenboom等J.Mol.Biol.227:381-388(1992))。經(jīng)加入一段不同長度的H3環(huán)(達到12殘基)，建立單個文庫，從此文庫可以篩選出大于20個結(jié)合特性的范圍(Winter等Ann.Rev.I讓uno.12:433-55(1994))。通過隨機化處理人抗體CDRs,已從單個抗體的框架建立了其它的合成文庫(GarrardandHennergene128:103-109(1993))。由此類合成的噬菌體-抗體所有組成成分得來的抗體，也被認為是本文的"人"抗體。使用噬菌體展示技術(shù)，可以改善低親和力"初級"噬菌體-抗體的親和力。一個方法是使用鏈改組策略，其中VH區(qū)域保持不變，然后與VL基因的原始文庫和通過與固相化抗原結(jié)合選擇出的更緊密結(jié)合物進行重組。通過固定新的VL區(qū)并與原始VH文庫重組，重復(fù)進行此循環(huán)(Marks等Bio/technology10:779-783(1992))?；蛘撸缅e配PCR和由使用噬菌體展示選擇出的更高親和力的結(jié)合物，而在初級抗體中引入點突變。Gram等PNAS(USA)89:3576-3580(1992)。的小鼠來產(chǎn)生人抗體。重度復(fù)合性免疫缺陷病(SCID)小鼠，由于其重組酶基因中的缺陷而缺乏產(chǎn)生自身免疫球蛋白的能力。通過轉(zhuǎn)移人外周血淋巴細胞(PBLs)，數(shù)個研究組已在這些小鼠中重建了功能性體液免疫系統(tǒng)。這些hu-PBL-SCID小鼠可用于抗原免疫時產(chǎn)生人抗體。Duchosal等Nature355:258-262(1992)。使用另一方法，關(guān)閉小鼠體內(nèi)的重鏈和輕鏈基因，然后把已用含有人重鏈和輕鏈基因的大DNA序列進行過工程改造的酵母人工染色體(YACs)引入小鼠中。此"異種小鼠(XenoMice)"能夠在目的抗原免疫下產(chǎn)生人抗體。見美國專利5，434,340;美國專利5，591，699;美國專利5，569，825;美國專利5，545，806;和美國專利5,545,807。也可以通過無限增殖產(chǎn)生目的抗體的人B淋巴細胞，來生產(chǎn)人單克隆抗體。在體外免疫人淋巴細胞，可以避免為產(chǎn)生活化的人B淋巴細胞而免疫人所帶來的道德問題。已經(jīng)成功地對人PBLs(Borrebaeck等Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:3995-4000(1988))和人脾細胞(Boemer等J.Immunol.147,86-95(1991))進行了體外免疫。使用鼠-人異源雜交作為融合配對，已經(jīng)在人雜交瘤
技術(shù)領(lǐng)域：
取得了進展(Boemer等)?？贵w變體為了增加抗體的抗原-結(jié)合價數(shù)，已對抗體進行了修飾。舉例來說,Ghetie等使用兩個異源雙功能性交聯(lián)劑，在一對IgG間用化學(xué)方法引入硫醚鍵，使胂瘤-反應(yīng)性單克隆抗體(抗-CD19、抗-CD20、抗-CD21、抗-CD22和抗-HER2抗體)同型二聚體化。Ghetie等PNAS(USA)94:7509-7514(1997);和WO99/02567.Wolff等CancerResearch53:2560-2565(1993)使用異源雙功能交聯(lián)劑，也用化學(xué)方法聯(lián)接了IgG單克隆抗體(CHiBR96),在棵鼠產(chǎn)生了具有提高了抗-腫瘤活性的單克隆抗體同型二聚體。Shopes等，在人IgGl重鏈羧基末端附近(Ser""用半胱氨酸替換絲氨酸殘基。在Cys444殘基間引入的分子間二硫鍵"尾-對-尾"聯(lián)接一對免疫球蛋白，從而形成共價二聚體(H2L2)2。據(jù)稱，抗-丹磺酰二聚體較單體人IgGl在對攜帶半抗原的紅細胞的抗體依賴性補體介導(dǎo)的細胞溶解方面更為有效。Shopes,B.J.Immunol,148(9):2918-2922(1992);和WO91/19515。該涉及引入半胱氨酸殘基的方法，已被用于產(chǎn)生CAMPATH-1H抗體的同型二聚體。使用低密度靶細胞表達性抗原，同型二聚體CAMPATH-1H抗體顯示出改善的細胞溶解作用，但是使用高密度細胞表達性抗原，未觀察到細胞溶解作用改善。Greenwood等Ther.Immunol.1:247255(1994)。也參見，Caron等J,Exp.Med.176:1191-1195(1992)，涉及在重鏈444位用絲氨酸取代半胱氨酸的基因工程抗CD33抗體使得ilgG的COOH末端形成鏈間二硫鍵。據(jù)說，同型二聚體性IgG與其親本IgG具有相同的親和力，但明顯顯示出改善內(nèi)化和使放射性同位素保留在靶白血病細胞內(nèi)的能力，而且在使用人效應(yīng)細胞時，對補體介導(dǎo)的白血病細胞殺死和抗體依賴的細胞性細胞毒作用方面更為有效。Coloma和MorrisonNatureBiotech.15:159-163(1997)描述了四價雙特異性抗體，所述抗體是經(jīng)過將編碼IgG3抗-丹磺?？贵wC末端(CH3-scFv)之后或鉸鏈(鉸鏈-scFv)之后的單鏈抗-丹磺?？贵wFv(scFv)的DNA融合而進行基因工程改造的。也參見WO95/09917。Smith和Morrison通過把(l)IgM重鏈的Cys414或(2)IgM重鏈的Cys575，或者(1)和(2)插入IgG3重鏈基因，而改造了3個版本的mu-樣IgG3。所有3個突變構(gòu)i物，均由Sp2/0細胞表達并且裝配成含有多達6個H2L2亞單位的聚合物。認為如此產(chǎn)生的IgG的'IgM-樣'聚合物既具有IgG的Fc"y受體結(jié)合特性又具有IgM的更強補體活性。參見，Smith和MorrisonBio/technique12:683-688(1994)。Shuford及其同事從轉(zhuǎn)染的骨髓瘤細胞系分離出了人IgGl抗-B族鏈球菌抗體低聚體。Shuford等Science252:.724-727(1991)。免疫化學(xué)分析和DNA測序表明，細胞系既產(chǎn)生正常k輕鏈又產(chǎn)生37kDV-V-C變異輕鏈(L37)。共轉(zhuǎn)染編碼重鏈與L37的栽體，導(dǎo)致低聚IgG的產(chǎn)生。美國專利5,641，870(Rinderknecht等)描述了與輕鏈共分泌的含有串連重復(fù)重鏈片段(VH-Cm-VH-CHl)的二價線狀F(ab')2片段。CHI的C-末端與VH的N-末端直接聯(lián)接，而沒有任何無關(guān)的聯(lián)接蛋白序列。有關(guān)抗體變體的其它出版物包括WO00/06605;美國專利5，591，828;美國專利5，959,083;美國專利6，027,725;W098/58965;WO94/13804;Tutt等J.Immunol.147:60-69(1991);W099/37791;美國專利5,989,830;W094/15642;EP628,078B1;W097/14719;Stevenson等Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。ErbB受體酪氨酸激酶ErbB受體酪氨酸激酶是細胞生長、分化和存活的重要介質(zhì)。該受體家族包括至少四個不同的成員，包括表皮生長因子受體(EGFR或ErbBl)、HER2(ErbB2或pl85咖)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。EGFR，由erbBl基因編碼，被推斷為與導(dǎo)致人類惡性腫瘤有關(guān)。具體而言，已經(jīng)觀察到EGFR在乳腺癌、膀胱癌、肺癌、頭頸部癌和胃癌以及神經(jīng)膠質(zhì)瘤的表達增加。EGFR受體表達增加常常與同一腫瘤細胞EGFR配體—轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-oc)產(chǎn)生增加有關(guān)，導(dǎo)致受體由自分泌刺激通路活化。Baselga和MendelsohnPharmac.Ther.64:127-154(1994)。在治療此類惡性腫瘤中，已經(jīng)評價了抗EGFR或其配體TGF-a和EGF的單克隆抗體，作為治療劑的價值。參見例如，Baselga和Mendelsohn"出處同上；Masui等CancerResearch44:1002-1007(1984);及Wu等J.Clin.Invest.95:1897-1905(1995)。ErbB家族的第二個成員，pl85neu,最初被認定為化學(xué)處理過的大鼠的神經(jīng)母細胞瘤的轉(zhuǎn)化基因產(chǎn)物。neu原癌基因的活化形式，源自所編碼蛋白跨膜區(qū)的點突變(纈氨酸變?yōu)楣劝彼?。觀察到乳腺癌和卵巢癌中人neu同系物擴增，并且與預(yù)后差相關(guān)(Slamon等，Science,235:177-182(1987);Slamon等，Science,244:707-712(1989);和美國專利4，968，603)。迄今，尚未有關(guān)于人腫瘤的類似于neu原癌基因的點突變的報道。已觀察到HER2過度表達(經(jīng)常但不是一律歸咎于基因擴增)與其他癌癥有關(guān)，其中包括胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、曱狀腺癌、胰腺癌和膀胱癌。抗大鼠p185neu和人HER2蛋白產(chǎn)物的抗體已有描述。Drebin及其同事已經(jīng)生產(chǎn)了抗大鼠neu基因產(chǎn)物-P185腳的抗體。參見例如，Drebin等，Cell41:695-706(1985);Myers等，Meth.Enzym.198:277-290(1991);和W094/22478。Drebin等Oncogene2:273-277(1988)報道，與pl85neu兩個不同區(qū)反應(yīng)的抗體混合物對植入棵鼠的neu-轉(zhuǎn)化的NIH-3T3細胞產(chǎn)生協(xié)同抗-腫瘤效應(yīng)。也參見1998年10月20日發(fā)布的美國專利5,824,311。Hudziak等，Mol.Cell.BioL9(3):1165-1172(1989)描述一系列抗HER2抗體的產(chǎn)生，其特征是使用人乳腺肺瘤細胞系SKBR3。SKBR3細胞暴露于抗體后72小時，對單層細胞進行結(jié)晶紫染色測定相對細胞增生。利用該分析測定，得到的結(jié)果是稱作4D5的抗體抑制細胞增生的最大抑制為56%。在此分析測定中，一系列抗體中的其他抗體較小程度減少細胞增生。進一步發(fā)現(xiàn)，抗體4D5使HER2-過度表達性乳腺腫瘤細胞系對TNF-ot的細胞毒性作用敏感。也參見，1997年10月14日發(fā)布的美國專利5,677,171。在Hudziak等中討論的抗-HER2抗體，在下述文獻中做了進一步描述Fendly等CancerResearch50:1550-1558(1990);Kotts等InVitro26(3):59A(1990);Sarup等GrowthRegulation1:72-82(1991);Shepard等J.Clin.Immunol.11(3):117-127(1991);Kumar等Mol.Cell.Biol.11(2):979-986(1991);Lewis等CancerImmunol.Immunother.37:255-263(1993);Pietras等Oncogene9:1829-1838(1994);Vitetta等CancerResearch54:5301-5309(1994);Sliwkowski等J.Biol.Chem.269(20):14661-14665(1994);Scott等J.Biol.Chem.266:14300-5(1991);D'souza等Proc.Natl.Acad.Sci.91:7202-7206(1994);Lewis等CancerResearch56:1457-1465(1996);及Schaefer等Oncogene15:1385-1394(1997)。重組人源化IgGl版本的小鼠抗-HER2抗體4D5(rhuMAbHER2或HERCEPTIN;購自Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco),對在前已經(jīng)4妄受過抗癌治療的患HER2-過度表達性轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者具有臨床療效(Baselga等，J.Clin.Oncol.14:737-744(1996))。HERCEPT歸于1998年9月25日得到食品藥品管理局的上市許可，用于治療患有過度表達HER2蛋白的腫瘤的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者。其他具有不同特性的抗-HER2抗體，描述在下列文獻中Tagliabue等Int.J.Cancer47:933-937(1991);McKenzie等Oncogene4:543-548(1989);Maier等CancerRes.51:5361-5369(1991);Bacus等MolecularCarcinogenesis3:350-362(1990);Stancovski等PNAS(USA)88:8691-8695(1991);Bacus等CancerResearch52:2580-2589(1992);Xu等Int.J.Cancer53:401-408(1993);WO94/00136;Kasprzyk等CancerResearch52:2771-2776(1992);Hancock等CancerRes.51:4575-4580(1991);Shawver等CancerRes.54:1367-1373(1994);Arteaga等CancerRes.54:3758-3765(1994);Harwerth等J.Biol.Chem.267:15160-15167(1992);美國專利5，783,186;KIapper等Oncogene14:2099-2109(1997);WO98/77797;以及美國專利5,783,186。同源篩選導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了另外2個ErbB受體家族成員；HER3(美國專利5,183,884和5，480,968，以及Kraus等PNAS(USA)86:9193-9197(1989))和HER4(歐洲專利申請599，274;Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993);和Plowman等，Nature,366:473-475(1993))。這兩種受體均顯示至少在某些乳腺癌細胞系中表達增加。通常發(fā)現(xiàn)ErbB受體在細胞中呈各種結(jié)合形式，而異源二聚化被認為增加對各種ErbB配體的細胞應(yīng)答的多樣性(Earp等BreastCancerResearchandTreatment35:115-132(1995))。EGFR被6種不同的配體結(jié)合表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)、雙調(diào)節(jié)素(amphiregulin)、肝素結(jié)合性表皮生長因子(HB-EGF)、P細胞調(diào)節(jié)素(betacellulin)和表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin)(Groenen等Growthfactors11:235-257(1994))。由單基因選擇性(alternative)剪接產(chǎn)生的遺傳調(diào)節(jié)蛋白(heregulin)蛋白家族是HER3和HER4的配體。遺傳調(diào)節(jié)蛋白家族包括oc、(3和y遺傳調(diào)節(jié)蛋白(Holmes等，Science,256:1205-1210(1992);美國專利5，641,869;和Schaefer等Oncogene15:1385-1394(1997));neu分化因子(NDFs)，神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGFs);乙酰膽堿受體誘導(dǎo)活性(ARIA);及感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(SMDF)。評述見Groenen等Growthfactors11:235-257(1994);Lemke,G.Molec.&Cell.Neurosci.7:247-262(1996)和Lee等Pharm.Rev.47:51-85(1995)。近日，鑒定了另外兩種ErbB配體神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3，據(jù)報道，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2結(jié)合HER3或HER4(Chang等Nature387509-512(1997);和Carraway等Nature387:512-516(1997)),而神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-3結(jié)合HER4(Zhang等PNAS(USA)94(18):9562-7(1997))。HB-EGF、P細胞調(diào)節(jié)素和表皮調(diào)節(jié)素也與HER4結(jié)合。盡管EGF和TGF-ot不結(jié)合HER2，但是，EGF刺激EGFR和HER2形成異二聚體，后者激活EGFR并導(dǎo)致異二聚體中HER2的磷酸根轉(zhuǎn)移。二聚作用和/或磷酸根轉(zhuǎn)移似乎激活HER2酪氨酸激酶。見Earp等，出處同上。同樣地，當HER3與HER2共表達時，形成一活性信號復(fù)合物，抗HER2的抗體能夠干擾此復(fù)合物(Sliwkowski等，J.Biol.Chem"269(20):14661-14665(1994))。此外，在與HER2共表達時，HER3與遺傳調(diào)節(jié)蛋白(HRG)的親和力升高到更高親和力水平。有關(guān)HER2-HER3蛋白復(fù)合物，也參見，Levi等，JournalofNeuroscience15:1329-1340(1995);Morrissey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:1431-1435(1995);和Lewis等，CancerRes"56:1457-1465(1996)。HER4，象HER3—樣，與HER2形成一活性信號復(fù)合物(CarrawayandCantle，Cell78:5-8(1994))。TNF受體超家族有多種分子已被鑒定為細胞因子腫瘤壞死因子("TNF')家族的成員，如腫瘤壞死因子-a("TNF-a")、腫瘤壞死因子-(3("TNF-P")、淋巴毒素-a("LT-a")、CD30配體、CD27配體、CD40配體、OX40配體、4-1BB酉己體、Apo-1配基(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作TRAIL)、Apo-3配體(也稱作TWEAK)、osteoprotegerin(OPG)、APRIL、RANK配體(也稱作TRANCE)和TALL-1(也稱作BlyS、BAFF或THANK)(參見例如，Gmss和Dower,Blood,85:3378-3404(1995);Pitti等，J.Biol.Chem.,271:12687-12690(1996);Wiley等，Immunity,3:673-682(1995);Browning等，Cell,72:847-856(1993);Armitage等Nature,357:80-82(1992);1997年1月16日公布的WO97/01633;1997年7月17日公布的WO97/25428;Marsters等，Curr.Biol"8:525-528(1998);Simonet等，Cell,89:309-319(1997);Chicheportiche等，Biol.Chem.，272:32401-32410(1997);Hahne等，J.Exp.Med,,188:1185-1190(1998);1998年7月2日公布的WO98/28426;1998年10月22日公布的WO98/46751;1998年5月7日公布的WO/98/18921;Moore等，Science,285:260-263(1999);Shu等，J.LeukocyteBiol"65:680(1999);Schneider等，J.Exp.Med"189:1747-1756(1999);以及Mukhopadhyay等,J.Biol,Chem.，274:15978-15981(1999》。在這些分子中，已報道TNF-oc、TNF-P、CD30配體、4-1BB配體、Apo-1配體、Apo-2配體(Ap(^L/TRAIL)和Apo-3配體(TWEAK)參與細胞凋亡。據(jù)報道，TNF-a和TNF-p均誘導(dǎo)易感腫瘤細胞中的細胞凋亡(Schmid等，Proc.Natl.Acad.Sci"83:1881(1986);Dealtry等，Eur.J.Immunol"17:689(1987))。也聲稱，TNF家族中的多種分子在免疫系統(tǒng)的功能或發(fā)育中發(fā)揮作用(Gruss等，Blood,85:3378(1995))。Zheng等已報道，TNF-a參與CD8-陽性T細胞刺激后的細胞凋亡(Zheng等，Nature,377:348-351(1995))。其他研究者報道，CD30配體可能參與胸腺自身反應(yīng)T細胞的耗竭(Amakawa等，ColdSpringHarborLaboratorySymposiumonProgrammedCellDeath,Abstr.No.10:(1995))。CD40配體激活B細胞的許多功能，包括增生、免疫球蛋白分泌和存活(Renshaw等，J.Exp.Med.,180:1889(1994))。已有報道稱，另一新近鑒定的TNF家族細胞因子，TALL-l(BlyS),在一定條件下誘導(dǎo)B細胞增生和免疫球蛋白分泌(Moore等，出處同上；Schneider等，出處同上；Mackay等，J.Exp.Med.，190:1697(1999))。小鼠Fas/Apo-l受體或配體基因(分別稱作7^和gW,)的突變與某些自身免疫病有關(guān)，表明Apo-l配體可能在調(diào)節(jié)外周自身反應(yīng)淋巴細胞的克隆耗竭中發(fā)揮作用(Krammer等，Curr.Op.Immunol.,6:279-289(1994);Nagata等，Science,267:1449-1456(1995))。也報道稱，Apo-1配體誘jCD4-陽性T淋巴細胞和B淋巴細胞的剌激后細胞凋亡，并且可能參與活化淋巴細胞在其功能不再需要時的消除(Krammer等，出處同上；Nagata等，出處同上)。已有報道，激動劑與Apo-1受體特異結(jié)合的小鼠單克隆抗體，顯示出與TNF-a堪比的或類似的殺細胞活性(Yonehara等，J.Exp.Med"169:1747-1756(1989))。據(jù)信，由此類TNF家族細胞因子介導(dǎo)的各種細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)是由其與特異細胞受體的結(jié)合而引發(fā)的。以前，鑒定了大約55-kDa(TNFRl)和75-kDa(TNFR2)的兩種不同TNF受體(Hohman等，J.Biol.Chem.，264:14927-14934(1989);Brockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.,87:3127-3131(1990);1991年3月20日公開的EP417,563;Loetscher等，Cell,61:351(1990);Schall等,Cell,61:361(19%);Smith等，Science,248:1019-1023(1990);Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci"88:2830-2834(1991);Goodwin等,MoLCell.Biol"11:3020-3026(1991))。發(fā)現(xiàn)那些TNFR具有細胞表面受體的典型結(jié)構(gòu)，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。發(fā)現(xiàn)兩種受體的胞外部分也均作為天然可溶性TNF-結(jié)合蛋白(Nophar等，EMBOJ.，9:3269(19卯)；和Kohno等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:8331(1990);Hale等,J.Cell.Biochem.Supplement15F,1991，p.113(P424))。1型和2型TNFRs(TNFR1andTNFR2)的細胞外部分，包含重復(fù)的從NH2-末端開始指定為1至4的四個半胱氨酸-豐富區(qū)(CRDs)的氨基酸序列基序(Schall等，出處同上；Loetscher等，出處同上；Smith等，出處同上；Nophar等，出處同上；Kohno等，出處同上；Banner等，Cell,73:431-435(1993))。其他細胞表面蛋白存在CRDs的相似重復(fù)基序，所述細胞表面蛋白包括p75神經(jīng)生長因子受體(NGFR)(Johnson等，Cell,47:545(1986);Radeke等，Nature,325:593(1987))、B細胞抗原CD40(Stamenkovic等，EMBOJ"8:1403(1989》、T細胞抗原OX40(Mallet等，EMBOJ"9:1063(1990))以及Fas抗原(Yonehara等,出處同上，和Itoh等，Cell，66:233-243(1991))。在Shope痘病毒和粘液瘤痘病毒的可溶性TNFR(sTNFR)-樣T2蛋白中，也發(fā)現(xiàn)了CRDs(Upton等，Virology,160:20-29(1987);Smith等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，176:335(1991);Upton等，Virology,184:370(1991))。這些序列的最適排列表明，半胱氨酸殘基的位置是相當保守的。有時，將這些受體共同稱為TNF/NGF受體超家族的成員。迄今鑒定了的TNF家族配體，除淋巴毒素-a外，是type11跨膜蛋白,其C-末端是胞外的。相反，迄今鑒定了的TNF受體(TNFR)家族的大多數(shù)受體，是I型跨膜蛋白。然而，在TNF配體和受體家族中，家族成員間的同源性鑒定均發(fā)現(xiàn)主要是在胞外區(qū)("ECD")。數(shù)個TNF家族細胞因子，包括TNF-a、Apo-l配體和CD40配體，在細胞表面蛋白水解性裂解；每種情況下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)通常形成作為可溶性細胞因子發(fā)揮作用的同源三聚體分子。TNF受體家族蛋白也通常蛋白水解性裂解以釋放出可以作為同族細胞因子抑制劑而發(fā)揮作用的可溶性受體ECDs。最近，已鑒定了TNFR家族的其他成員。在vonBulow等，Science,278:138-141(1997)中，研究者描述了稱作跨膜激活劑和CAML-交互劑(Interactor)或"TACr的質(zhì)膜受體。據(jù)報道，TACI受體包含TNFR家族特征的半胱氨酸-豐富基序。在體外分析測定中，轉(zhuǎn)染Jurkat細胞表面的TACI與TACI-特異性抗體交聯(lián)，導(dǎo)致NF-KB活化(也參見，1998年9月18日公布的WO98/39361)。Laabi等，EMBOJ.,11:3897-3904(1992)報道，鑒定了稱作"BCM"的新基因，發(fā)現(xiàn)其表達與B細胞最終成熟相一致。BCM正常cDNA的開放讀框，預(yù)示具有單個跨膜結(jié)構(gòu)域的184個氨基酸長的多肽。后來，這些研究者將此基因命名為"BCMA."(Laabi等，NucleicAcidsRes.，22:1147-1154(1994))。據(jù)報道，代表原-B淋巴細胞階段的人惡性B細胞系沒有BCMAmRNA表達，因此，認為BCMAmRNA表達與淋巴細胞分化階段有關(guān)(Gras等，Int.Immunology,7:1093-1106(1995))。在Madry等Int.Immunology,10:1693-1702(1998)中，描述了小鼠BCMAcDNA的克隆。據(jù)報道，小鼠BCMAcDNA編碼185個氨基酸長的多肽，后者與人BCMA多肽具有62%—致性。小鼠與人BCMA蛋白序列對比揭示在N-末端區(qū)6個半胱氨酸的保守基序，提示BCMA蛋白屬于TNFR超家族(Madry等，出處同上)。在Marsters等，Curr.Biol.，6:750(1996)中，研究者描述了稱為Apo-3的全長天然序列人多肽，其顯示出與TNFR家族相似的在其胞外半胱氨酸豐富區(qū)的重復(fù)性，并且因為其含有胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域序列而與TNFR1和CD95相似(也參見Marsters等，Curr,Biol"6:1669(1996))。Apo-3也被其他研究者稱作DR3、wsl-l、TRAMP和LARD(Chinnaiyan等，Science,274:990(1996);Kitson等，Nature,384:372(1996);Bodmer等，Immunity,6:79(1997);Screaton等，Proc,Natl,Acad.Sci,，94:4615-4619(1997》。Pan等已公開了稱作"DR4"的另一TNF受體家族成員(Pan等，Science,276:111-113(1997);也參見1998年7月30日公布的W098/32856)。據(jù)報道，DR4包含能夠參與細胞自殺的胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域。Pan等披露，據(jù)信DR4是已知Apo2L/TRAIL配體的受體。在Sheridan等，Science,277:818-821(1997)和Pan等，Science,277:815-818(1997)中，描述了據(jù)信是Apo2L/TRAIL受體的另一分子(也參見，1998年11月19日公開的WO98/51793;和1998年9月24日公開的WO98/41629)。稱該分子為DR5(它也被稱作Apo-2;TRAIL-R,TR6,Tango-63,hAP08,TRICK2或KILLER(Screaton等，Curr,Biol"7:693-696(1997);Walczak等，EMBOJ,,16:5386-5387(1997);Wu等，NatureGenetics,17:141-143(1997);1998年8月20日公開的WO98/35986;1998年10月14日公開的EP870,827;1998年10月22日公開的WO98/46643;1999年1月21日公開的WO99/02653;1999年2月25日公開的WO99/09165;和1999年3月11日公開的WO99/11791)。據(jù)報道，DR5與DR4—樣，含有能夠傳輸細胞凋亡信號的胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域。在Hymowitz等，MolecularCell,4:563-571(1999)中，描述了Apo2L/TRAIL和DR5之間形成的復(fù)合物的晶型結(jié)構(gòu)。最近鑒定了含j死亡結(jié)構(gòu)域的另一受體，DR6(Pan等，F(xiàn)EBSLetters,431:351-356(1998))。除了含有4個推定的胞外半胱氨酸豐富結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域外，據(jù)信DR6含有推定的與胞質(zhì)區(qū)脯氨酸-豐富基序重疊的亮氨酸拉鏈序列。脯氨酸-豐富基序類似于與src-同源性-3結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的序列，其見于許多細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中。最近鑒定的另一組受體被稱作"引誘受體(decoyreceptor)",據(jù)信，它們起抑制物而不是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)物的功能。該組受體包括DcRl(也稱作TRID、LIT或TRAIL隱R3)(Pan等，Science,276:111-113(1997);Sheridan等，Science,277:818-821(1997);McFarlane等，J.Biol.Chem.，272:25417-25420(1997);Schneider等，F(xiàn)EBSLetters,416:329-334(1997);Degli-Esposti等，J.Exp.Med"186:1165-1170(1997);和Mongkolsapaya等，J.Immunol"160:3-6(1998))和DcR2(也稱作TRUNDD或TRAIL-R4)(Marsters等，Curr.Biol"7:1003-1006(1997);Pan等，F(xiàn)EBSLetters,424:41-45(1998);DegliEsposti等，Immunity,7:813-820(1997)),這兩種細胞表面分子，以及OPG(Simonet等，出處同上；Emery等，infra)和DcR3(Pitti等，Nature,396:699-703(1998)),均是分泌的可溶性蛋白。近來鑒定的TNFR家族的其他成員包括CAR1、HVEM、GITR、ZTNFR-5、NTR-1和TNFL1(Brojatsch等，Cell,87:845-855(1996);Montgomery等，Cell,87:427-436(1996);Marsters等，J.Biol.Chem.,272:14029-14032(1997);Nocentini等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:6216-6221(1997);Emery等，J.Biol.Chem.,273:14363-14367(1998);1999年1月28曰公開的WO99/04001;1999年2月18日公開的WO99/07738;1999年7月8曰公開的WO99/33980)。如Tewari等最近評述的那樣，TNFR1、TNFR2和CD40通過激活轉(zhuǎn)錄細胞因子、細胞因子。受體:和細胞粘附分子的表達(Tewari等，Curr.Op.Genet.Develop.，6:39-44(1996))。NF-kb是二聚體型轉(zhuǎn)錄因子家族的原型，所述二聚體型轉(zhuǎn)錄因子的亞單位含有保守的Rel區(qū)(Verma等，GeneDevelop"9:2723-2735(1996);Baldwin,Ann.Rev.Immunol"14:649-681(1996))。i其非活性形式中，NF-kb是與i-kb抑制物家族成員相復(fù)合的；對某些刺激應(yīng)答時，I-k6失活，幹放出的NF-kB易位到細胞核，結(jié)合到特異DNA序列上，從而激活基因轉(zhuǎn)錄如前所述，迄今鑒定的TNFR成員包括或缺乏細胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域。一些缺乏死亡結(jié)構(gòu)域的TNFR分子，如TNFR2、CD40、HVEM和GITR，能夠調(diào)節(jié)NF-kb活性(參見，如，Lotz等，J.LeukocyteBiol"60:1-7(1996))。有關(guān)細胞因子TNF家族及其受體的綜述，參見AshkenaziandDixit,Science,281:1305-1308(1998);Golstein，Curr.Biol"7:750-753(1997);GrussandDower,出處同上，和Nagata，Cell,88:355-365(1997)。B細胞表面抗原淋巴細胞是造血過程中由骨髓產(chǎn)生的多種白細胞中的一種。有兩種主要的淋巴細胞群B淋巴細胞(B細胞)和T淋巴細胞(T細胞)。本文特別關(guān)注的淋巴細胞是B細胞。B細胞在骨髓內(nèi)成熟，其細胞表面表達抗原-結(jié)合型抗體時離開骨髓。當初始B細胞首次遇到對所具有的膜結(jié)合抗體來說是特異的抗原時，細胞開始迅速分裂，其子代細胞分化為記憶B細胞和稱為"漿細胞"的效應(yīng)細胞。記憶B細胞具有較長的壽命并繼續(xù)表達與原始母細胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細胞不產(chǎn)生膜結(jié)合抗體，但是，代之膜結(jié)合抗體的是，它產(chǎn)生可分泌形式的抗體。分泌的抗體是體液免疫的主要效應(yīng)分子。CD20抗原(也稱作人B-淋巴細胞-限制性分化抗原，Bp35)是一個位于前-B和成熟B淋巴細胞上的分子量約35kD的疏水性跨膜蛋白(Valentine等J.Biol.Chem.264(19):11282-11287(1989);和Einfeld等EMBOJ.7(3):711-717(1988))。該抗原也在大于90%的B細胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)中表達(Anderson等Blood63(6):1424-1433(1984))，但是，在造血干細胞、前-B細胞、正常漿細胞或其他正常組織未見表達(Tedder等J.Immunol.135(2):973-979(1985))。CD20調(diào)節(jié)細胞周期啟動和分化的活化過程中的早期步驟(Tedder等，出處同上)，而且可能起鈣離子通道的功能(Tedder等J.Cell.Biochem.14D:195(1990》。如果CD20在B細胞淋巴瘤中表達，該抗原可作為"靶向"此類淋巴瘤的候選物。實質(zhì)上，此靶向可如下產(chǎn)生向患者施用對B細胞CD20表面抗原特異的抗體。這些抗-CD20抗體與正常和惡性B細胞上的CD20抗原(表面)特異結(jié)合；與CDM表面抗原結(jié)合的抗體可導(dǎo)致瘤性B細胞破壞和耗竭。另外，具有破壞腫瘤效力的化學(xué)藥品或者放射性標記物可與抗-CD20抗體偶聯(lián)，從而使得這些藥品或制劑特異地向瘤性B細胞"釋放"。不管采用什么方法，其主要目標是破壞腫瘤；具體方法可通過使用的特定抗-CD20抗體確定，因此，靶向CD20抗原的可利用方法可以是極為不同的。CD19是在B淋巴細胞系細胞表面表達的另一抗原。象CD20—樣，從干細胞階段至即將分化為終末漿細胞之前的整個過程中，在細胞上均發(fā)現(xiàn)有CD19(Nadler,L.LymphocyteTypingII2:3-37和Appendix,Renling等編著(1986)bySpringerVerlag)。然而，不象CD20,CD19抗體結(jié)合CD19引起CD19抗原內(nèi)化。除了別的之外，CD19抗原通過HD237-CD19抗體(也稱作"B4"抗體)進行鑒定(Kiesel等LeukaemiaResearchII,12:1119(1987))。CD19抗原存在于外周血4-8%的單核細胞上，而在從外周血、脾臟、淋巴結(jié)或扁桃體分離的B細胞上存在量則大于90%。在外周血T細胞、單核細胞或粒細胞上，未檢測到CD19。事實上，非-T細胞型急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、B細胞慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和B細胞淋巴瘤，表達可由抗體B4測得的CD19(Nadler等J.Immunol.131:244(1983);andNadler等inProgressinHematologyVol.XIIpp.187-206.Brown,E.ed.(1981)byGrune&Stratton，Inc)。已鑒定了識別由B細胞系細胞表達的分化階段-特異性抗原的其它抗體。在這些抗體中，抗CD21抗原的是B2抗體；抗CD22抗原的是B3抗體；和抗CD10抗原(也稱作CALLA)的是J5抗體。參見1997年1月21曰公布的美國專利5，595，721(Kaminski等)。rituximab(RITUXAN⑧抗體是遺傳基因工程改造的抗CD20抗原的嵌合小鼠/人單克隆抗體。在1998年4月7日公布的美國專利5，736,137中，Rituximab被稱作"C2B8"抗體(Anderson等)。指出，RITUXAN⑧用于治療復(fù)發(fā)性或頑固性低級或濾泡性CD20陽性B細胞非何杰金氏淋巴瘤患者。體外作用機制研究已經(jīng)證明，RITUXAN⑧結(jié)合人補體并通過CDC溶解淋巴樣B細胞系(Reff等Blood83(2):435-445(1994))。此外，在分析ADCC中，RITUXAN⑧具有顯著的活性。最近，業(yè)已證明RITUXAN⑧在氚標記去氧胸腺嘧啶核苷摻入試驗中具有抗-增殖作用并且直接誘導(dǎo)細胞凋亡，而其它抗-CD19和CD20抗體無此作用(Maloney等Blood88(10):637a(1996))。也已經(jīng)試驗性地觀察到RITUXAN⑧和化學(xué)療法之間的協(xié)同和毒性。更具體而言，RITUXAN⑧使抗藥人B細胞淋巴瘤細胞系對阿霉素、CDDP、VP-16、白喉毒素和篦麻毒蛋白的細胞毒作用敏感(Demidem等CancerChemotherapy&Radiopharmaceuticals12(3):177-186(1997))。在體內(nèi)進行的臨床前研究證明，RITUXAN從外周血、淋巴結(jié)和骨髓耗竭獼猴的B細胞，推斷是通過補體和細胞介導(dǎo)的過程進行的(Reff等Blood83(2):435-445(1994》。發(fā)明概述本發(fā)明提供具有三個或更多個抗原結(jié)合部位的多價抗體(如四價抗體),其可通過編碼抗體多肽鏈的核酸重組表達而方便地產(chǎn)生。在一實施方案中，多價抗體含有二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多個抗原結(jié)合部位。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域含有一個Fc區(qū)或一個鉸鏈區(qū)(或由其組成)。在一實施方案中，本發(fā)明提供分離的在其氨基末端含有二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多個抗原結(jié)合部位的抗體。本發(fā)明進一步提供分離的含有一個Fc區(qū)和在Fc區(qū)氨基末端三個或更多個抗原結(jié)合部位的抗體。本文優(yōu)選的多價抗體含有(或由其組成)3至約8個，優(yōu)選4個抗原結(jié)合部位(如本文定義的那樣，它們一般均是"功能性的")。在一實施方案中，多價抗體含有5個或更多個(如多達約8個)抗原結(jié)合部位。本文的多價抗體優(yōu)選不是天然序列IgA或IgM,并且缺乏Fc區(qū)或者僅有一個Fc區(qū)。在優(yōu)選的實施方案中，多價抗體含有至少一條多肽鏈(并優(yōu)選2條多肽鏈)，其中多肽鏈含有2個或更多個可變區(qū)。舉例來說，多肽鏈可含有VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一個可變區(qū)，VD2是第二個可變區(qū)，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，XI和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。譬如，多肽鏈可含有VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈;VL-CL-柔性接頭-VL-CL-Fc區(qū)鏈；或者VL-CL-VL-CL-Fc區(qū)鏈。多肽鏈含有Fd-柔性接頭-Fd時，柔性接頭可含有肽如gly-ser,gly-ser-gly-ser(SEQIDNO:10)，ala-ser,或者gly-gly-gly畫ser(SEQIDNO:11)。本文多價抗體優(yōu)選還含有至少2個(和優(yōu)選4個)輕鏈可變區(qū)多肽。譬如，本文多價抗體可包括約2至約8個輕鏈可變區(qū)多肽。本文考慮到的輕鏈可變區(qū)多肽包括輕鏈可變區(qū)，和任選地，進一步包括CL區(qū)。從治療觀點講，本文多價抗體具有所需的特性。舉例來說，多價抗體可以(l)通過與抗體相結(jié)合的細胞表達性抗原而較二價抗體更快內(nèi)化(和/或發(fā)生分解代謝)；(2)是一激動型抗體；和/或(3)誘導(dǎo)表達多價抗體能夠與之結(jié)合的抗原的細胞死亡和/或細胞凋亡?？商峁┒鄡r抗體的至少一個抗原結(jié)合特異性的"親本抗體"，可以通過抗體與之結(jié)合的細胞表達性抗原而內(nèi)化(和/或發(fā)生分解代謝)；和/或可以是激動劑、細胞死亡-誘導(dǎo)性和/或細胞凋亡-誘導(dǎo)性抗體，本文描述的多價形式抗體可顯示出在這些特性中一種或多種特性的改善。而且，親本抗體可能缺少這些特性中的一種或多種，但是當構(gòu)建前述多價抗體時則賦予它們這些特性。本文多價抗體的三個或更多個抗原結(jié)合部位均可以結(jié)合相同的抗原；或者可與2種或更多種(如2至約3種)不同的抗原結(jié)合。多價抗體可結(jié)合(l)腫瘤細胞表達的(或過度表達的)細胞表面蛋白，如表皮生長因子受體(EGFR)、HER2受體、HER3受體、HER4受體，或DcR3;(2)腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族中的受體(如Apo2L受體，諸如DR4、DR5、DcRl或DcR2);和/或(3)B細胞表面抗原(如CD19、CD20、CD22或CD40)。在本發(fā)明一優(yōu)選實施方案中，多價抗體的所有功能性抗原結(jié)合部位均與前面列出的相同抗原相結(jié)合(例如，四價抗體的所有4個抗原結(jié)合部18位均與(1)、(2)或(3)結(jié)合)。本發(fā)明也提供包括與細胞毒制劑相偶聯(lián)的多價抗體的免疫偶聯(lián)劑。本文的細胞毒制劑可以是一旦內(nèi)化即具有殺細胞活性的物質(zhì)。本發(fā)明另外涉及包含VDl-(Xl)n-VD2(X2)n-Fc的肽鏈，其中VD1是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。舉例來說，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈；VL-CL-柔性接頭-VL-CL-Fc區(qū)鏈；或VL-CL-VL-CL-Fc區(qū)鏈。在另一實施方案中，多肽鏈包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CH1-二聚化結(jié)構(gòu)域；VH-CH1-VH-CH1-二聚化結(jié)構(gòu)域；VL-CL-柔性接頭-VL-CL-二聚化結(jié)構(gòu)域；或VL-CL-VL-CL-二聚化結(jié)構(gòu)域。譬如，多肽鏈可包含VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-鉸鏈區(qū)；VH-CH1-VH-CH1-鉸鏈區(qū)。本發(fā)明另外提供包含一個或多個(優(yōu)選2個)此類多肽鏈的抗體。該抗體優(yōu)選進一步包含至少2個(并優(yōu)選4個)輕鏈或重鏈可變區(qū)多肽，例如,其輕鏈可變區(qū)多肽含有VL-CL而重鏈可變區(qū)多肽含有VH-CH1。本發(fā)明進一步提供包含三個或更多個重鏈或輕鏈可變區(qū)的多肽鏈，其中每一可變區(qū)能夠與三個或更多個輕鏈或重鏈可變區(qū)多肽結(jié)合以形成三個或更多個抗原結(jié)合部位，每一抗原結(jié)合部位對抗相同的抗原。本發(fā)明也提供分離的包含多肽鏈的抗體。在一優(yōu)選的實施方案中，多肽鏈包含三個或更多個重鏈可變區(qū)，抗體優(yōu)選進一步包含三個或更多個能夠與重鏈可變區(qū)結(jié)合的輕鏈可變區(qū)多肽以形成三個或更多個抗原結(jié)合部位。此類抗體的實例示于圖23D(具有3個抗原結(jié)合部位)和圖23E(具有4個抗原結(jié)合部位)。此外，本發(fā)明提供包含下列各式的多肽鏈(a)VL-CL-柔性接頭-VL-CL-柔性接頭-VL-CL;(b)VH-Cm-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl;(c)(VL-CL)n，其中n是3或更大數(shù)；或(d)(VH-CHl)n,其中n是3或更大數(shù)。本發(fā)明進一步提供分離的編碼多價抗體或多肽鏈的核酸；包含編碼多聚抗體或多肽鏈的核酸的載體，任選地，與被用載體轉(zhuǎn)化過的宿主細胞所識別的控制序列可操作地相連接；含有編碼多聚抗體或多肽鏈的核酸(如用所述核酸轉(zhuǎn)化)的宿主細胞；制備多價抗體或多肽鏈的方法，包括培養(yǎng)宿主細胞以便使得核酸被表達，和任選地，從宿主細胞培養(yǎng)物(如，從宿主細胞培養(yǎng)基)中回收多價抗體或多肽鏈。優(yōu)選地，編碼多價抗體(l)重鏈可變區(qū)和(2)輕鏈可變區(qū)的核酸由被(1)和(2)二者轉(zhuǎn)化過的宿主細胞共表達。核酸(l)和(2)可存在于相同或不同的載體中?？紤]了本文公開的多價抗體的診斷和治療用途。在一診斷應(yīng)用中，本發(fā)明提供測定目的抗原的方法，包括將可疑含有抗原的樣本暴露于多價抗體，并檢測多價抗體與樣本的結(jié)合。提供了體外和體內(nèi)診斷方法。在一治療應(yīng)用中，本發(fā)明提供治療患有疾病或病癥或具有患病傾向的哺乳動物的方法，包括向哺乳動物施用治療有效量的本文公開的多價抗體或者含有所述多價抗體與可藥用載體的組合物。本文所述^^皮治療的病癥可以是癌癥，在此情況下，該方法可進一步包括向哺乳動物施用治療有效量的細胞毒制劑。本發(fā)明還涉及誘導(dǎo)癌細胞凋亡的方法，包括使細胞暴露于本文描述的多價抗體，其中多價抗體與腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族中的受體結(jié)合。該方法可涉及通過使細胞暴露于結(jié)合B細胞表面抗原的多價抗體而殺死B細胞。而且，該方法可涉及殺死表達(或過度表達)ErbB受體的細胞，包括使細胞暴露于與ErbB受體結(jié)合的抗體的步驟。更具體地，本發(fā)明涉及1.一種分離的抗體，其包含F(xiàn)c區(qū)和三個或更多個抗原結(jié)合部位，所述抗原結(jié)合部位結(jié)合在所述Fc區(qū)的氨基末端。2.項1的抗體，含有4個抗原結(jié)合部位。3.項1的抗體，含有5個或更多個抗原結(jié)合部位。4.項1的抗體，包含含有2個或更多個可變區(qū)的多肽鏈5.項4的抗體，其中所述多肽鏈含有VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變區(qū)，VD2是第二可變區(qū)，F(xiàn)c是一種Fc區(qū)的其中一條多肽鏈，XI和X2代表氨基酸或多肽,n是0或1。6.項5的抗體，包含2個或更多個多肽鏈，每一條多肽鏈含有VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc。7.項1的抗體，包含至少一條具有式(a)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc區(qū)鏈；或式(b)VH-CHl-VH-CHl-Fc區(qū)鏈的多肽鏈。8.項1的抗體，包含至少2個輕鏈可變區(qū)多肽。9.項8的抗體，其中輕鏈可變區(qū)多肽進一步含有CL區(qū)。10.項1的抗體，包含多肽鏈，其中該多肽鏈含有Fd-柔性接頭-Fd。11.項10的抗體，其中柔性接頭含有選自下組的肽gly-ser、gly-ser-gly陽ser(SEQIDNO:10)、ala-ser和gly-gly-gly-ser(SEQIDNO:11)。12.項1的抗體，其與二價抗體相比，被表達相應(yīng)抗原的細胞內(nèi)化的速度更快，其中所述相應(yīng)抗原是能與所述抗體結(jié)合的抗原。13.項1的抗體，其是激動型抗體。14.項1的抗體，其誘導(dǎo)細胞凋亡。15.項1的抗體，所述三個或更多個抗原結(jié)合部位均結(jié)合相同抗原。16.項1的抗體，其中所述三個或更多個抗原結(jié)合部位結(jié)合2種或更多種不同的抗原。17.項1的抗體，其結(jié)合由腫瘤細胞表達的細胞表面蛋白。18.項17的抗體，其中細胞表面蛋白選自表皮生長因子受體(EGFR)、HER2受體、HER3受體、HER4受體和DcR3受體。19.項17的抗體，其中細胞表面蛋白是HER2受體。20.項1的抗體，其結(jié)合由腫瘤細胞過度表達的細胞表面蛋白。21.項1的抗體，其結(jié)合肺瘤壞死因子(TNF)受體超家族中的一種受體。22.項21的抗體，其中所述TNF受體是Apo2L受體。23.項22的抗體，其中所述Apo2L受體選自DR4、DR5、DcRl和DcR2。24.項22的抗體，其中所述Apo2L受體是DR4或DR5。25.項21的抗體，其是激動型抗體。26.項21的抗體，其誘導(dǎo)細胞凋亡。27.項1的抗體，其結(jié)合B細胞表面抗原。28.項27的抗體，其中B細胞表面抗原選自CD19、CD20、CD22和CD復(fù)29.項27的抗體，其中B細胞表面抗原是CD20。30.—種免疫偶聯(lián)物，包含與細胞毒制劑偶聯(lián)的項1的抗體。31.項30的免疫偶聯(lián)物，其中細胞毒制劑一旦內(nèi)化則具有殺細胞活性。32.項30的免疫偶聯(lián)物，其中細胞毒制劑選自放射性同位素、美登木素生物;威和加利車霉素。33.—種分離的抗體，包含三個或更多個抗原結(jié)合部位，其中該抗體能夠結(jié)合肺瘤壞死因子(TNF)受體超家族中的一種受體。34.項33的抗體，其不是天然序列IgM或IgA抗體。35.項33的抗體，其僅有一個Fc區(qū)或者缺乏Fc區(qū)。36.項33的抗體，其包含含有2個或更多個可變區(qū)的多肽鏈。37.項33的抗體，其包含4個抗原結(jié)合部位，每一抗原結(jié)合部位均能結(jié)合所述TNF受體。38.項33的抗體，其中TNF受體是Apo2L受體。39.項38的抗體，其中Apo2L受體選自DR4、DR5、DcRl和DcR2。40.項38的抗體，其中Apo2L受體是DR4或DR5。41.項33的抗體，其是激動型抗體。42.項33的抗體，其誘導(dǎo)細胞凋亡。43.分離的含有至少3個抗原結(jié)合部位的抗體，其能結(jié)合ErbB受體。44.項43的抗體，其不是天然序列IgM或IgA抗體。45.項43的抗體，其僅有一個Fc區(qū)或者缺乏Fc區(qū)。46.項43的抗體，其包含含有2個或更多個可變區(qū)的多肽鏈。47.項43的抗體，其含有4個抗原結(jié)合部位，每一抗原結(jié)合部位均能結(jié)合所述ErbB受體。48.項43的抗體，其中ErbB受體選自表皮生長因子受體(EGFR)、HER2受體、HER3受體和HER4受體。49.項43的抗體，其中ErbB受體是HER2受體。50.—種分離的抗體，含有至少3個抗原結(jié)合部位，其中該抗體能夠結(jié)合B細力包表面抗原。51.項50的抗體，其不是天然序列IgM或IgA抗體。52.項50的抗體，其僅有一個Fc區(qū)或者缺乏Fc區(qū)。53.項50的抗體，其包含含有2個或更多個可變區(qū)的多肽鏈。54.項50的抗體，其含有4個抗原結(jié)合部位，每一抗原結(jié)合部位均能結(jié)合所述B細胞表面抗原。55.項50的抗體，其中B細胞表面抗原選自CD19、CD20、CD22和CD40。56.—種分離的抗體，含有至少3個抗原結(jié)合部位，其中該抗體能夠結(jié)合由癌細胞過度表達的抗原。57.—種多肽鏈，包含(a)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-二聚化結(jié)構(gòu)域;或(b)VH-CHl-VH-CHl-二聚化結(jié)構(gòu)域。58.—種分離的抗體，含有項57所述的多肽鏈。59.項58的抗體，進一步含有2個或更多個輕鏈可變區(qū)多肽。60.項59的抗體，其中輕鏈可變區(qū)多肽含有VL-CL。61.—種分離的抗體，含有二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多個抗原結(jié)合部位，所述抗原結(jié)合部位結(jié)合在所述二聚化結(jié)構(gòu)域的氨基末端。62.項61的抗體，其中二聚化結(jié)構(gòu)域選自鉸鏈區(qū)、Fc區(qū)、CH3區(qū)和CH4區(qū)。63.項62的抗體，其中二聚化結(jié)構(gòu)域是鉸鏈區(qū)。64.項63的抗體，其中二聚化結(jié)構(gòu)域進一步含有亮氨酸拉鏈。65.項63的抗體，包含含有下式的多肽鏈(a)VH-CHl-柔性接頭-VH-CH1陽4交鏈區(qū)；或(b)VH-CH1-VH-CH1國4史鏈區(qū)。66.—種多肽鏈，含有三個或更多個重鏈或輕鏈可變區(qū)，其中每一可變區(qū)能夠與三條或更多條輕鏈或重鏈可變區(qū)多肽結(jié)合以形成三個或更多個抗原結(jié)合部位，每一抗原結(jié)合部位針對相同抗原。67.項66的多肽鏈，其含有3個重鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)能夠與3條輕鏈可變區(qū)多肽結(jié)合從而形成3個針對相同抗原的抗原結(jié)合部位。68.項66的多肽鏈，其含有4個重鏈可變區(qū)，所述可變區(qū)能夠與4條輕鏈可變區(qū)多肽結(jié)合以形成4個針對相同抗原的抗原結(jié)合部位。69.項66的多肽鏈，其中所述抗原是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族中的一種受體。70.項66的多肽鏈，其中所述抗原是B細胞表面抗原。71.項66的多肽鏈，其中所述抗原是ErbB受體。72.項66的多肽鏈，其中所述抗原是由腫瘤細胞表達的細胞表面蛋白。73.—種多肽鏈，含有下式(a)VL-CL-柔性接頭-VL-CL-柔性接頭扁VL-CL;(b)VH-CHl-柔性接頭-VH-Cm-柔性接頭-VH-CHl;(c)(VL-CL)n，其中n是3或更大；或者(d)(VH-CHl)n，其中n是3或更大。74.項67的多肽鏈，含有式(a)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭-VH-CH1;(b)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭畫VH-CH1;或(c)(VH-CHl)n,其中n是3或4。75.—種分離的抗體，含有項66的多肽鏈。76.項75的分離的抗體，還含有三條或更多條輕鏈或重鏈可變區(qū)多肽。77.項76的分離的抗體，包含三條或更多條輕鏈可變區(qū)多肽，每一條多肽含有VL-CL。78.項77的分離的抗體，包含4條輕鏈可變區(qū)多肽，每一條多肽含有VL-CL。79.—種多肽鏈，含有(a)VL-CL-柔性接頭-VL-CL-二聚化結(jié)構(gòu)域；(b)VL-CL-VL-CL-二聚化結(jié)構(gòu)域。80.—種免疫偶聯(lián)物，包含與細胞毒制劑偶聯(lián)的項75的抗體。81.—種分離的核酸，編碼項1所述抗體、項57所述多肽鏈或項66所述多肽鏈。82.含有項81的核酸的載體。83.含有項81的核酸的宿主細胞。84.—種產(chǎn)生抗體或多肽鏈的方法，包括培養(yǎng)項83所述的宿主細胞以使所述核酸得以表達。85.項84的方法，進一步包括從宿主細胞培養(yǎng)物中回收抗體或多肽鏈。86.項85的方法，其中所述抗體或多肽鏈是從宿主細胞培養(yǎng)基質(zhì)中回收的。87.—種治療哺乳動物病癥的方法，包括向哺乳動物施用治療有效量的項1所述的4元體。88.項87的方法，其中所述病癥是癌癥。89.項87的方法，還包括向哺乳動物施用治療有效量的細胞毒制劑。90.誘導(dǎo)癌細胞凋亡的方法，包括將癌細胞暴露于項33所述的抗體。91.一種殺死B細胞的方法，包括將B細胞暴露于項50所述的抗體。92.—種殺死表達ErbB受體的細胞的方法，包括將所述細胞暴露于項43所述的抗體。93.項92的方法，其中所述細胞是過度表達ErbB受體的癌細胞。圖1是天然IgG和其用(l)木瓜蛋白酶消化以產(chǎn)生2個Fab片段和一個Fc區(qū)或用(2)胃蛋白酶消化以產(chǎn)生一個F(ab')2片段和多個小片段的圖示。用CH1和CL區(qū)之間以及2個CH2區(qū)之間的線表示二硫鍵。V是可變區(qū)；C是恒定區(qū)；L代表輕鏈而H代表重鏈。圖2A-E描述5種主要天然存在免疫球蛋白同種型的結(jié)構(gòu)；IgG(圖2A)、IgD(圖2B)、IgE(圖2C)、IgA二聚體(圖2D),和IgM五聚體(圖2E)。圖3描述天然序列IgGFc區(qū)的排列。顯示天然序列人IgGFc區(qū)序歹寸，humlgGl(非-A和A同種異型)(分別是SEQIDNO:1和2)、humlgG2(SEQIDNO:3)、humlgG3(SEQIDNO:4)和humlgG4(SEQIDNO:5)。人IgGl序列是非-A同種異型，該序列與A同種異型的差異示于人IgGl序列之下(在356位和358位；EU編號系統(tǒng))。也顯示了天然序列小鼠IgGFc區(qū)序歹寸，murIgGl(SEQIDNO:6)、murlgG2A(SEQIDNO:7)、murlgG2B(SEQIDNO:8)和murlgG3(SEQIDNO:9)。圖4A-B圖示描述本發(fā)明的四價抗體。圖4A中，對4個抗原結(jié)合的Fab進行了編號(l和2代表四價抗體的各臂)，X代表二聚化結(jié)構(gòu)域。圖4B中，四價抗體的二聚化結(jié)構(gòu)域是Fc區(qū)。圖5示用于表達實施例1中的四價抗-HER2抗體(OctHER2)的構(gòu)建體。圖6A-C描述使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行測定，OctHER2(圖6A)、由293細胞表達的二價IgGlrhuMAb4D5-8(圖6B)和瓶裝HERCEPTIN(由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞表達)(圖6C)與HER2胞外區(qū)(ECD)的結(jié)合。圖7描述超速離心測定OctHER2與HER2ECD的結(jié)合。顯示平均分子量(理論值或試驗測定值)對OctHER2與HER2ECD摩爾比。假定四價抗體具有四個全功能性結(jié)合部位，理論計算的平均分子量用圓圈表示；假定四價抗體具有三個全功能性結(jié)合部位，理論計算的平均分子量用正方形表示；三角代表試驗測得的分子量。圖8A-D描述使用SKBR3(3+HER2過度表達)(圖8A)、MDA361(2+HER2過度表達)(圖8B)、BT474(3+HER2過度表達)(圖8C)和MCF7(0+HER2表達)(圖8D)細胞系，HERCEPTIN⑧與OctHER2相比的生長抑制活性。圖9描述針對MDA231細胞(1+HER2過度表達)或SKBR3細胞(3+HER2過度表達)，柔性接頭對四價抗-HER2抗體的生長抑制活性的影響。圖10A-B比較OctHER2與HERCEPTIN(圖10B)涉及MDA453(2+HER2過度表達)和SKBR3(3+HER2過度表達)細胞系的內(nèi)化/分解代謝(圖10A)之速率。圖11A-I是顯示OctHER2內(nèi)化的電子顯微鏡照片。圖11A-F顯示125I-OctHER2在SKBR3細胞中的亞細胞定位。觀察到與頂端細胞膜的絨毛有關(guān)的放射自顯影銀粒(圖IIA)，緊緊靠近形成的有被小窩(圖11B,箭頭)、光滑的胞質(zhì)嚢泡(圖11C和D)和核內(nèi)體(圖11E和F)。棒-0.25nM。圖11G-I顯示在0小時(圖11G)和5小時(圖IIH和lll)時的內(nèi)化。圖12A-E描述與非-癌對照細胞系-HUMEC(圖12E)相比，由抗-DR5四價抗體(16E2章魚)、抗-DR5二價IgG抗體(16E2IgG)和Apo2L/TRAIL(Apo2L)誘導(dǎo)的下述癌細胞系的細胞凋亡COLO205(圖12A)、SK-MES-1(圖12B)、HCT116(圖12C)和HOP92(圖12D)。圖UA-D是染色的組織學(xué)玻片以檢測凋亡的細胞。取自用16E2章魚或Apo2L/TRAIL治療過的小鼠的腫瘤組織固定在10%福爾馬林中，接著石蠟包埋并切片到玻片上，然后用蘇木精和伊紅染色，在400倍放大比例下觀測。16E2章魚于6和24小時的作用分別示于圖13A和B;對照-處理的細胞示于圖13C;Apo2L/TRAIL-處理的細胞示于圖13D。圖14表示Apo2L/TRAIL(60mg/kg,5x/周)、3H3二價IgG(5mg/kg給藥0、3、5和9天)、16E2二價IgG(16E2)(5mg/kg給藥0、3、5和9天)和16E2章魚(5mg/kg給藥0、3、5和9天)對無胸腺棵鼠COLO205肺瘤的體內(nèi)活性。圖15表示證實小鼠實驗中所用材料(Apo2L/TRAIL和16E2章魚)的凋亡活性與Apo2L標準陽性對照相比的alamarBlue體外測定。小鼠實-瞼中用作陰性對照的抗-IgE抗體(E25)被證實沒有凋亡活性。圖16表示抗-DR53H3章魚與各批量抗-DR516E2章魚相比，結(jié)晶紫的細胞凋亡測定的結(jié)果。圖17A-B顯示Apo2L/TRAIL(W097/25428)、抗-DR53H3章魚抗體、抗-DR516E2章魚抗體和具有通過抗-FLAG抗體(W097/25428)交叉連接的FLAG表位-標記的Apo2L/TRAIL,對SK-MES-1(圖17A)和Jurkat(圖17B)細胞，在存在5%小牛血清(FBS)時alamarBlue凋亡測定的結(jié)果。圖18A-C顯示2天時，抗-DR516E2章魚(較高的曲線)與Apo2L/TRAIL(較低的曲線)相比，對白血病、非-小細胞肺癌、結(jié)腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CND)癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌人腫瘤細胞系生長的作用的劑量反應(yīng)曲線。結(jié)果得自國立癌癥研究所發(fā)展治療項目(theNationalCancerInstituteDevelopmentalTherapeuticsProgram)。戶斤有才羊本均在5個濃度下4企測，從1%貯存液開始(16E2章魚貯存液濃度為0.2mg/ml)和4x0.5對數(shù)稀釋。圖19A-C顯示6天時，抗-DR5l犯2章魚(較高的曲線)與Apo2L/TRAIL(較低的曲線)相比，對白血病、非-小細胞肺癌、結(jié)腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CND)癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌人腫瘤細胞系生長的作用的劑量反應(yīng)曲線。結(jié)果得自國立癌癥研究所發(fā)展治療項目。所有樣本均在5個濃度下檢測，從1%貯存液濃度開始(16E2章魚貯存液濃度為0.2mg/ml)和4x0.5對數(shù)稀釋。圖20A-B表示2天時，抗-DR5l犯2章魚(圖^A)與ApoA/TRAIL(圖20B)的生長抑制(GI50)、停滯(TGI)和毒性(LC50)的體外定量測定結(jié)果，該結(jié)果得自國立癌癥研究所發(fā)展治療項目。圖21A-B表示6天時，抗-DR516E2章魚(圖20A)與Apo2L/TRAIL(圖20B)的生長抑制(GI50)、停滯(TGI)和毒性(LC50)的體外定量測定結(jié)果，該結(jié)果得自國立癌癥研究所發(fā)展治療項目。圖22描述由抗-CD20抗體RITUXAN、與抗-人IgG(RITUXAN-IgG)交叉-連接的RITUXAN⑧和四價抗-CD20抗體(OctCD20)誘導(dǎo)的Wil-2細胞凋亡。圖"A-E是描述全長章魚/四價抗體(圖BB)、章魚F(ab)'2(圖23C)、POPoct-3Fab(圖23D)和POPoct-4Fab(圖23E)與天然IgG(圖23A)比較的卡通畫?？?CD20(C2B8)章魚蛋白的代i性考馬斯染色的Tris-甘氨酸凝膠，比較了在非-還原條件下完整抗體的大小(圖23F)與在還原條件下重鏈的大小，在還原條件下二硫鍵被打開而造成重鏈與輕鏈分開(圖23G)。圖24描述章魚F(ab')2主鏈的構(gòu)建。任何VH/CH1區(qū)可通過BamHI、NheI和BspEI限制性內(nèi)切酶位點而替換入F(ab')2主鏈中。圖25描述POPoct-3重鏈的構(gòu)建。圖26描述POPoct-4重鏈的構(gòu)建。圖27描述多價抗-HER2抗體在使用BT474細胞進行的細胞增殖抑制測定中的活性。圖28A-B描述多價抗-HER2抗體在使用SKBR3細胞進行的細胞增殖抑制測定中的活性。這些圖是n-4的細胞增殖抑制測定的代表性繪圖。圖29A-B顯示多價抗-HER2抗體在SKBR3細胞(圖29A)和BT474細胞(圖29B)中的內(nèi)化能力。圖30A-B顯示由多價抗-DR5抗體導(dǎo)致的COLO205細胞的凋亡。圖31A-B證明多價抗-DR5抗體通過caspase通路的信號傳輸。圖32比較由交叉-連接RITUXAN的IgG(RITUXAN-lgG)和由交叉-連接OctCD20的IgG(OctCD20-IgG)誘導(dǎo)的細胞凋亡。圖33顯示由多價抗-CD20抗體、IF5抗-CD20抗體(Clark等PNAS(USA)82:1766-1770(1985))和交叉-連接IF5抗體的IgG(IF5+IgGX)導(dǎo)致的WIL2細胞凋亡。圖34描述由IF5抗-CD20抗體、交叉-連接IF5抗體的IgG和POPoct-3CD20的誘導(dǎo)的在WIL2S細胞中的同型細胞粘附。圖35A-35F反映DB、WIL2和RamosB細胞淋巴瘤系上的RITUXAN或OctCD20的內(nèi)化/分解代謝。優(yōu)選實施方案詳述I.定義在本發(fā)明整個說明書和權(quán)利要求書中，免疫球蛋白重鏈中殘基的編號是Kabat等在SequenceofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的EU指數(shù)的編號，所述文獻特別在此引入作為參考。如在Kabat文獻中那樣，"EU指數(shù)"是指人IgGlEU抗體的殘基編號。"ErbB受體"，是屬于ErbB受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR、HER2、ErbB3和ErbB4受體以及TEGFR(美國專利5,708,156)和今后被識別的該家族的其他成員。ErbB受體通常包含胞夕卜區(qū)，它可與ErbB配體結(jié)合；親脂性跨膜結(jié)構(gòu)域；保守的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域；和包含數(shù)個酪氨酸殘基(它們可祐:磷酸化)的羧基末端信號結(jié)構(gòu)域。ErbB受體可以是天然序列ErbB受體或其氨基酸序列變體。優(yōu)選地，ErbB受體是天然序列人ErbB受體。"ErbB配體"，是指與ErbB受體結(jié)合和/或激活ErbB受體的多肽。本文特別感興趣的ErbB配體是天然序列人ErbB配體，例如表皮生長因子(EGF)(Savage等，J.Bio/.Chem.247:7612-7621(1972));轉(zhuǎn)化生長因子a(TGF-a)(Marquardt等，Science223:1079-1082(1984));雙調(diào)節(jié)素也稱作schwanoma或角質(zhì)形成細胞自分泌生長因子(Shoyab等Science243:1074-1076(1989);Kimura等Nature348:257-260(1990);和Cook等Mol.Cell.Biol.11:2547-2557(1991));p細胞調(diào)節(jié)素(Shing等，Science259:1604-1607(1993);Sasada等Biochem.Biophys,Res.Commun.190:1173(1993));肝素結(jié)合表皮生長因子(HB-EGF)(Higashiyama等，Science251:936-939(1991));表皮調(diào)節(jié)素(Toyoda等，J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995);和Komurasaki等Oncogene15:2841-2848(1997)),遺傳調(diào)節(jié)蛋白(下述)；神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-2(NRG-2)(Carraway等，Nature387:512-516(1997));神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白誦3(NRG-3)(Zhang等，Proc.Natl.Acad.Sci.94:9562-9567(1997》;或cripto(CR-1)(Kan腿等J.Biol.Chem.272(6):3330-3335(1997))。結(jié)合EGFR的ErbB配體包括EGF、TGF-a、雙調(diào)節(jié)素、(3細胞調(diào)節(jié)素、HB-EGF和表皮調(diào)節(jié)素。結(jié)合HER3的ErbB配體包括遺傳調(diào)節(jié)蛋白。能夠結(jié)合HER4的ErbB配體包括卩細胞調(diào)節(jié)素、表皮調(diào)節(jié)素、HB-EGF、NRG-2、NRG-3和遺傳調(diào)節(jié)蛋白。本文所用"遺傳調(diào)節(jié)蛋白"(HRG),是指如美國專利5，641，869或Marchionni等，Nature,362:312-318(1993)公開的那樣，含有由遺傳調(diào)節(jié)蛋白基因產(chǎn)物編碼的氨基酸序列的多肽及該多肽的生物活性變體。遺傳調(diào)節(jié)蛋白的實例包括遺傳調(diào)節(jié)蛋白-a、遺傳調(diào)節(jié)蛋白-pi、遺傳調(diào)節(jié)蛋白-P2和遺傳調(diào)節(jié)蛋白-{33(Holmes等，Science,256:1205-1210(1992);和美國專利5，641，869);neu分化因子(NDF)(Peles等Cell69:205-216(1992));乙酰膽堿受體-誘導(dǎo)活性(ARIA)(Falls等Cell72:801-815(1993));神經(jīng)膠質(zhì)生長因子(GGFs)(Marchio皿i等，Nature,362:312-318(1993));感覺和運動神經(jīng)元衍生因子(SMDF)(Ho等J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995));丫-遺傳調(diào)節(jié)蛋白(Schaefer等Oncogene15:1385-1394(1997))。天然序列HRG多肽的生物活性片段/氨基酸序列變體的實例，是EGF-樣結(jié)構(gòu)域片段(如HRG卩1177-244)。本文的"ErbB異源-低聚體"，是非共價結(jié)合的低聚體，包括至少2個不同的ErbB受體。當表達2個或更多個ErbB受體的細胞暴露于ErbB配體時，可形成該復(fù)合物，并且該復(fù)合物可通過免疫沉淀而凈皮分離，并可通過SDS-PAGE予以測定，例如Sliwkowski等在J.Biol.Chem.,269(20):14661-14665(1994)中描述的方法。此類ErbB異源"氐聚體的實例包括EGFR-HER2、HER2-HER3和HER3-HER4復(fù)合物。而且，ErbB異源-低聚體可包含2個和更多個與不同ErbB受體(如HER3、HER4或EGFR)結(jié)合的HER2受體。其它蛋白，如細胞因子受體亞單位(如gpl30),可包括在異源-低聚體中。在本文中可交換使用的術(shù)語"ErbBl"、"表皮生長因子受體"和"EGFR",是指例如Carpenter等在Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)公開的天然序列EGFR,包括其變體(如在Humphrey等PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中所述的缺失突變EGFR)。erbBl是指編碼EGFR蛋白產(chǎn)物的基因。與EGFR結(jié)合的抗體的實例包括MAb579(ATCCCRLHB8506)、MAb455(ATCCCRLHB8507)、MAb225(ATCCCRL8508)、MAb528(ATCCCRL8509)(參見美國專利4,943,533,Mendelsohn等)及其變體，如嵌合的(chimerized)225(C225)和重構(gòu)的(reshaped)人225(H225)(參見WO96/40210,ImcloneSystemsInc.)。本文中可交換使用的術(shù)語"ErbB2"和"HER2",是指例如Semba等在PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等在Nature319:230-234(1986)(Genebank編號X03363)描述的天然序列人HER2蛋白及其變體。術(shù)語erbB2是指編碼人HER2的基因，而neu則是指編碼大鼠P185neu的基因。優(yōu)選的HER2是天然序列人HER2。與HER2結(jié)合的抗體的實例包括MAbs4D5(ATCCCRL10463)、2C4(ATCCHB-12697)、7F3(ATCCHB-12216)和7C2(ATCCHB12215)(參見美國專利5，772,997;W098〃7797;和美國專利5，840，525，這些文獻特別在此引入作為參考)。人源化抗-HER2抗體，包括美國專利5,821,337中表3所述的huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8(HERCEPTIN),該文獻特別在此引入作為參考；人源化520C9(W093/21319)。人抗-HER2抗體，描述在1998年6月30日公布的美國專利5,772,997和1997年1月3日公開的WO97/00271中。"ErbB3"和"HER3"，是指例如美國專利5,183,884和5,480,968以及Kraus等PNAS(USA)86:9193-9197(1989)中所描述的受體多肽，包括其變體。結(jié)合HER3的抗體的實例，描述在美國專利5，968,511(Akita和Sliwkowski)中，如8B8抗體(ATCCHB12070)或其人源化變體。本文中的術(shù)語"ErbB4"和"HER4"，是指例如在EP專利申請599,274;Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:1746-1750(1993);和Plowman等,Nature,366:473-475(1993)中所述的受體多肽，包括其變體，如WO99/19488中公開的HER4同種型。本文的"B細胞表面標志"，是在B細胞表面表達的可作為與之結(jié)合的抗體的輩巴向目標的抗原。例證性B細胞表面標志包括CD10，CD19,CD20,CD21,CD22,CD23，CD24，CD37,CD40，CD53，CD72,CD73,CD74,CDw75,CDw76,CD77,CDw78,CD79a,CD79b，CD80,CD81,CD82，CD83,CDw84'CD85和CD86白細胞表面標志。特別感興趣的B細胞表面標志，是與哺乳動物的其它非-B細胞組織相比優(yōu)選在B細胞上表達的，并且既可在前體B細胞又可在成熟B細胞上表達。在一個實施方案中，標志是一個，象CD20或CD19，它發(fā)現(xiàn)于B細胞系從干細胞階段直至最終分化成漿細胞之前一刻的整個分化過程中的B細胞上。本文優(yōu)選的B細胞表面標志是CD19、CD20、CD22和CD40。"CD20"抗原是在來自外周血或淋巴器官的大于90%的B細胞上發(fā)現(xiàn)的約35kDa的非-糖基化磷蛋白。CD20在前-B細胞發(fā)育早期表達并一直保持直到漿細胞分化。CD20既存在于正常B細胞也存在于惡性B細胞上。文獻中對于CD20的其它命名包括"B淋巴細胞-限制性抗原"和"Bp35"。例如，CD20抗原描述在Clark等PNAS(USA)82:1766(1985)中。與CD20抗原結(jié)合的抗體的實例包括目前稱作"rituximab"("RITUXANS")的"C2B8"(美國專利5,736,137,特別在此引入作為參考)；稱作"Y2B8"的釔-[90]-標記的2B8小鼠抗體(美國專利5，736,137，特別在此引入作為參考)；任選用1311標記以產(chǎn)生'""I-Bl"抗體(BEXXARTM)的小鼠IgG2a"B1"(美國專利5,595，721,特別在此引入作為參考)；小鼠單克隆抗體"1F5"(Press等Blood69(2):584-591(1987));"嵌合2H7"抗體(美國專利5,677,180,特別在此引入作為參考)；和可購自InternationalLeukocyteTypingWorkshop的單克隆抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1或NU-B2(Valentine等，In:LeukocyteTypingIII(McMichael,Ed"p.440,OxfordUniversityPress(1987))。"CD19"抗原，是指例如通過HD237CD19或B4抗體識別的約90kDa的抗原(Kiesel等LeukaemiaResearchII,12:1119(1987))。象CD20—樣，CD19發(fā)現(xiàn)于B細胞系從干細胞階段直至最終分化成漿細胞之前一刻的整個分化過程的細胞上?？贵w與CD19的結(jié)合可引起CD19抗原的內(nèi)化。與CD19抗原結(jié)合的抗體的實例包括Hekman等在CancerImmunol.Immunother.32:364-372(1991)和Vlasveld等在CancerImmunol.Immunother.40:37-47(1995)中描述的抗-CD19抗體；以及Kiesel等在LeukaemiaResearchII,12:1119(1987)中描述的B4抗體。"CD22"抗原的分子量約為140,000kD。CD22在早期前-B細胞和祖細胞的胞漿內(nèi)表達，僅出現(xiàn)在成熟B細胞和大多數(shù)非何杰金淋巴瘤(NHL)細胞的表面，然后在漿細胞階段之前的最終分化期間從細胞表面和胞漿中消失?？?CD22抗體的一個實例是Juweid等在CancerResearch55:5899-5907(1995)中描述的LL2抗體，包括其嵌合/人源化變體。"CD40"抗原是細胞表面磷酸化糖蛋白，它在各種類型細胞上表達，所述細胞包括B細胞、B細胞惡性腫瘤、濾泡樹突細胞、基底上皮細胞和癌。CD40結(jié)合CD40配體(CD40L)。除了是B細胞表面抗原外，CD40也是TNF受體超家族的成員之一。結(jié)合CD40的抗體的實例，包括那些(l)阻斷CD40/CD40L相互作用和具有抗-腫瘤特性的抗體(Armitage等，美國專利5,674，492);(2)通過CD40拮抗信號傳輸?shù)目贵w(deBoer等，美國專利5，677,165);(3)通過CD40釋放剌激性信號但是并不增加CD40和CD40L之間相互作用的抗體，如G28-5(Ledbetter等，美國專利5,182，368);(4)增加CD40和CD40L之間相互作用的抗體，如CD40.4(5C3)(PharMingen,SanDiego,Califomia)和S2C6(于1999年5月25日以登記號PTA-110保藏于地處Manassass,Virginia的美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC))。本文的"腫瘤壞死因子受體超家族"或"TNF受體超家族"，是指可與TNF家族的細胞因子結(jié)合的受體多肽。一般而言，這些受體是在其胞外區(qū)具有一個或多個半胱氨酸豐富的重復(fù)序列的I型跨膜受體。TNF受體超家族可進一步細分為(l)死亡受體；(2)引誘受體；和(3)缺少死亡結(jié)構(gòu)域的信號傳輸受體。"死亡受體"在其胞漿或胞內(nèi)區(qū)含有一"死亡結(jié)構(gòu)域"，即，在細胞中起到傳輸導(dǎo)致細胞凋亡信號或誘導(dǎo)某些基因的作用的區(qū)或序列。"引誘受體"缺乏功能性死亡結(jié)構(gòu)域，不能夠傳輸導(dǎo)致細胞凋亡的信號。TNF基因家族中細胞因子的實例包括胂瘤壞死因子-a(TNF-a)、胂瘤壞死因子-P(TNF-j3或淋巴毒素)、CD30配體、CD27配體、CD40配體、OX-40配體、4-1BB配體、Apo-l配體(也稱作Fas配體或CD95配體)、Apo-2配體(也稱作TRAIL)、Apo-3配體(也稱作TWEAK)、osteoprotegerin(OPG)，APRIL、RANK配體(也稱作TRANCE),和TALL-1(也稱作BlyS、BAFF或THANK)。TNF受體超家族中受體的實例包括1型腫瘤壞死因子受體(TNFR1)、2型腫瘤壞死因子受體(TNFR2)、p75神經(jīng)生長因子受體(NGFR)、B細胞表面抗原CD40、T細胞抗原OX-40、Apo-l受體(也稱作Fas或CD95)、Apo-3受體(也稱作DR3、swl-l、TRAMP和LARD)、稱作"跨膜激活劑和CAML-相互作用子(interactor)"或"TACI"的受體、BCMA蛋白、DR4、DR5(或者，也稱作Apo-2;TRAIL-R2,TR6，Tango-63,hAP08,TRJCK2或KILLER)、DR6、DcRl(也稱作TRID、UT或TRAIL-R3)、DcR2(也稱作TRAIL-R4或TRUNDD)、OPG、DcR3(也稱作TR6或M68)、CAR1、HVEM(也稱作ATAR或TR2)、GITR、ZTNFR-5、NTR-1、TNFL1、CD30、淋巴毒素(3受體(LTBr)、4-1BB受體和TR9(EP988,371Al)。術(shù)語"Apo-2配體"或"Apo2L",是指1997年7月17日公開的W097/25428中所述的Apo2L多肽，該專利文獻特別在此引入作為參考。為了本申請的目的，這些術(shù)語也指1997年1月16日/>開的WO97/01633和1998年6月9日公布的美國專利5，763，223中公開的稱作TRAIL的多肽，所述文獻特別在此引入作為參考。"Apo2L受體"是Apo2L能與之特異結(jié)合的多肽。本文所用術(shù)語"Apo2L受體"，涵蓋天然序列Apo2L受體及其變體。這些術(shù)語嚢括來自哺乳動物包括人的各種Apo'2L受體。Apo2L受體可以是從各種來源(如從人組織類型或從其它來源)中分離得到的，或者是通過重組或合成的方法制備的。"天然序列"Apo2L受體的實例包括Apo-2多肽或DR5(W098/51793,特別在此引入作為參考)、Pan等在Science276:111-113(1997)描述的天然序列DR4;Sheridan等在Science277:818-821(1997)中所述的天然序列引誘受體1或DcRl，和Marsters等Curr.Biol.7:1003-1006(1997)中所述的天然序列引誘受體2或DcR2;天然序列osteoprotegerin(參見，Simonet等，Cell89:309-319(1997);和Emery等J.InterferonandCytokineResearch18(5):A47Abstract2.17(1998))?？?DR5抗體的實例包括3F11.39.7(ATCCHB-12456)、3H3.14.5(ATCCHB-12534)、3D5丄10(HB12536)和3H1.18.10(HB-12535)、16E2和20E6(參見WO98/51793，特別在此引入作為參考)?？?DR4抗體的實例包括4E7.24.3(ATCCHB-12454)和4H6.17.8(ATCCHB12455)(參見WO99/37684,特別在此引入作為參考)。天然序列"DcR3"描述于WO99/14330,該文獻特別在此引入作為參考。在該專利出版物中，描述了下列抗DcR3的mAbs:4C4.1.4(ATCCHB-12573);5C4.14.7(ATCCHB-12574);11C5.2.8(ATCCHB-12572);8D3丄5(ATCCHB-12571);和4B7丄1(ATCCHB-12575)。"天然序列"多肽包括與得自天然的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可具有天然存在的人多肽、鼠多肽或其它哺乳動物物種來源多肽的氨基酸序列。此天然序列多肽可從自然中分離，或者可通過重組或合成方法制備。術(shù)語"天然序列"多肽特別包括天然截短型或分泌型(例如，細胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然變體型(例如，可替換式剪切型)和天然等位變體。"多肽變體"是指與天然序列多肽具有至少約800/。氨基酸序列同一性的生物活性多肽。此類變體多肽包括，例如，在多肽的N-和/或C-末端增加或刪減一個或多個氨基酸殘基的多肽。通常，變體多肽與天然序列多肽具有至少約80%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約90%的氨基酸序列同一性，甚至更優(yōu)選至少約95%的氨基酸序列同一性。"細胞凋亡"是指程序性細胞死亡。表明細胞凋亡發(fā)生的生理事件常包括DNA片段化，細胞皺縮，內(nèi)織網(wǎng)膨脹，細胞碎裂，和/或膜泡(稱為凋亡小體)形成?？捎酶鞣N方法檢測與凋亡相關(guān)的細胞事件。例如，磷脂酰絲氨酸(PS)易位可通過膜聯(lián)蛋白v結(jié)合來測定；DNA片段化可通過DNA序列梯(laddering)來評估；與DNA片段化相伴的核/染色體濃縮可通過亞二倍體細胞中的任何增加來評估。術(shù)語"抗體"是指最廣義上的抗體，包括單克隆抗體(包括全長或完整單克隆抗體)、多克隆抗體、多價抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)和抗體片段(只要其顯示所需生物學(xué)活性即可，并且見下述)。除非另外指出，"多價抗體"的表述用于整個說明書中，其是指包含三個或更多個抗原結(jié)合部位的抗體。多價抗體優(yōu)選基因工程改造為具有三個或更多個抗原結(jié)合部位并且通常不是天然序列IgM或IgA抗體。"抗體片段"，僅包括完整抗體的一部分，一般包括完整抗體的抗原結(jié)合部位，因而保持結(jié)合抗原的能力。本說明書定義的抗體片段的實例包括(i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1區(qū)；(ii)Fab'片段，它是在CH1區(qū)的C-末端具有一個或多個半胱氨酸殘基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1區(qū)的Fd片段；(iv)具有VH和CH1區(qū)并且在CH1區(qū)的C-末端有一個或更多個半胱氨酸殘基的Fd'片段；(v)具有單臂抗體的VL和VH區(qū)的Fv片段；(vi)由一個VH區(qū)構(gòu)成的dAb片段(Ward等,Nature341，544-546(1989));(vii)分離的CDR區(qū)；(viii)F(ab')2片段，包括在4交鏈區(qū)由一個二石克橋連接的2個Fab'片段的二價片段；(ix)單鏈抗體分子(如單鏈Fv;scFv)(Bird等，Science242:423-426(1988);和Huston等，.PNAS(USA)85:5879-5883(1988》；(x)具有2個抗原結(jié)合部位的"雙抗體(diabodies)",包含與同一多肽鏈中的輕鏈可變區(qū)(VL)相連接的重鏈可變區(qū)(VH)(參見如,EP404,097;WO93/11161;和Hollinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993));(xi)包含一對串聯(lián)Fd片段(VH-CHl-VH-CHl)的"線性抗體"，串連Fd片段與互補的輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(Zapata等ProteinEng.8(10):1057-1062(1995);和美國專利5,641,870)。本文中術(shù)語"單克隆抗體"，是指來自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能少量存在的天然突變以外，該抗體群中的各個抗體均相同。單克隆抗體具有高度的特異性，是抗單個抗原的。而且，與通常包括的抗不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單個表位。修飾詞"單克隆"，不解釋為需通過任何特殊方法產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過由Kohler等(Nature,256:495(1975))首先描述的雜交瘤法進行制備，或者可通過重組DNA法進行制備(例如見美國專利4816567)。"單克隆抗體"還可利用例如Clackson等(Nature,352:624-628(1991))和Marks等(分子生物學(xué)雜志，222:581-597(1991))所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。本文中的單克隆抗體特別包括"嵌合，，抗體，其重鏈和/或輕鏈的一部分與源自特殊物種或?qū)儆谔厥饪贵w種類或亞類的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，但所述鏈的其余部分的序列與源自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體種類或亞類的抗體(以及此抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性)的相應(yīng)序列相同或同源(美國專利4，816，567;和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A"81:685卜6855(藤))。"人源化"型非人(例如小鼠)抗體是包含非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)中受者超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和力和性能的小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類等非人源物種抗體(供體抗體)的超變區(qū)殘基所取代。在一些實例中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基由相應(yīng)的非人類殘基所取代。而且，人源化抗體可包括在受者抗體或供者抗體中不存在的殘基。這些修飾旨在進一步改善抗體的性能。通常，人源化抗體基本上包括至少一個(通常包括兩個)可變區(qū)的全部，其中超變環(huán)的全部或基本上全部對應(yīng)于非人免疫球蛋白的相應(yīng)部分，而FR序列的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還任選包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的一部分，通常為人免疫^t蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。詳見Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。術(shù)已經(jīng)制得的抗體相一致氨基酸序列的抗體。人抗體的定義特別排除含有非-人抗原-結(jié)合殘基的人源化抗體。可以使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來制備人抗體。在一實施方案中，由表達人抗體的噬菌體展示文庫篩選人抗體[Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol"227:381(1991);Marks等，J.MoLBiol,222:581(1991)]。也可通過把人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物(例如鼠)，來制備人抗體，所述轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源性免疫球蛋白基因已被部分或完全失活。攻擊鼠后，觀察到人抗體產(chǎn)生，所產(chǎn)生的抗體在各個方面均與在人觀察到的極為相似，包括基因重排、裝配和抗體所有組成部分。這方面的進展參見例如，美國專利5545807、5545806、5569825、5625126、5633425、5661016,和下述科學(xué)出版物Marks等，Bio/Technology10:779-783(1992);Lonberg等，Nature368:856-859(1994);Morrison,Nature368:812-13(1994);Fishwild等，NatureBiotechnology14:845-51(1996);Neuberger,NatureBiotechnology14:826(1996);Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。或者，可通過產(chǎn)生抗靶抗原的抗體的無限增殖人B淋巴細胞來制備人抗體(如B淋巴細胞可從個體中回收或者已在體外4^免疫)。參見,如，Cole等，MonoclonalAntibodyandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985);Boerner等，J.Immunol"147(1):86-95(1991);美國專利5，750,373。術(shù)語"可變，，是指可變區(qū)某些部分的序列在抗體之間有很大差異，它們可在各個抗體對其特殊抗原的結(jié)合和特異性方面發(fā)揮作用。然而，該變異性不是均勻的分布于整個抗體的可變區(qū)。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中三個稱作超變區(qū)的節(jié)段中?？勺儏^(qū)中保守性較高的區(qū)域稱為框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)各包括4個FR，主要采取P折疊構(gòu)象，由三個超變區(qū)相連接，所述三個超變區(qū)形成環(huán)狀連接，而在某些情況下可形成部分P折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈的超變區(qū)通過FR緊密地靠近在一起，并且與其它鏈的超變區(qū)一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(見Kabat等，NIHPubl.No.91-3242,第I巻，第647-669頁(1991))。恒定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是表現(xiàn)出各種效應(yīng)器功能，例如參與抗體的抗體依賴性細胞毒性作用(ADCC)。本文所用術(shù)語"超變區(qū)"，是指負責與抗原-結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。超變區(qū)通常包含來自"互補決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(LI),50-56(L2)和89-97(L3)及重鏈可變區(qū)中的31-35(HI),50-65(H2)and95-102(H3);Kabat等,SequenceofproteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD.(1991))和/或來自"超變區(qū)環(huán)"的那些殘基(如輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(LI),50-52(L2)和91-96(L3)及重鏈可變區(qū)中的26-32(HI),53-55(H2)和96-101(H3);Chothia和LeskJ,Mol.Biol.196:901-917(1987》。"框架區(qū)"或"FR"殘基是那些可變區(qū)的殘基而不是本文定義的超變區(qū)殘基。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，可將完整抗體分為不同"類"。主要有5類完整抗體IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成"亞類"(同種型)，例如IgGl(包括非-A和A同種異型)、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同類抗體的重鏈恒定區(qū)，分別稱為oc、5、s、y和M。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)象是眾所周知的。脊推動物任何物種的抗體的"輕鏈"，可依據(jù)其恒定區(qū)氨基酸序列而歸為完全不同的兩型(稱為k和A)中的一型。術(shù)語"Fc區(qū)"用于定義免疫球蛋白重鏈的C-末端區(qū)，它可通過木瓜蛋白酶消化完整抗體而制得。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的邊界可能不同，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為從氨基酸殘基約Cys226位或從約Pro230位伸展到羧基-末端的Fc區(qū)。免疫球蛋白的Fc區(qū)一般包括2個恒定區(qū)即CH2區(qū)和CH3區(qū)，以及任選地包含CH4區(qū)。本文的"Fc區(qū)鏈"，是指Fc區(qū)的一個或2個多肽鏈。人IgGFc區(qū)的"CH2區(qū)"(也稱作"Cy2"區(qū))，一般從約231位氨基酸殘基延伸到約340位氨基酸殘基。CH2區(qū)是獨特的，因為它不與另一區(qū)緊密配對。而且，在完整天然IgG分子的2個CH2區(qū)之間插入2個N-連接的分支碳水化物鏈。已推測，碳水化合物可能替代區(qū)-區(qū)配對并幫助穩(wěn)定CH2區(qū)。Burton,Molec.Immunol.22:161-206(1985)。本文的CH2區(qū)，可以是天然序列CH2區(qū)或變體CH2區(qū)。"CH3區(qū)"，包含C-末端向Fc區(qū)中CH2區(qū)延伸的殘基(即，從IgG的約341位氨基酸殘基向約447位氨基酸殘基延伸)。本文的CH3區(qū)，可以是天然序列CH3區(qū)或變體CH3區(qū)(如，CH3區(qū)具有在一條鏈引入的"突起(protroberance)",而另一條鏈相應(yīng)引入的"空穴"；參見美國專利5，821，333,特別在此引入作為參考)。此類變體CH3區(qū)可用于制備本文所述的多特異(如雙特異)性抗體。."鉸鏈區(qū)"，一般定義為從人IgGl的約Glu216或約Cys226向約Pro230延伸(Burton，Molec.Immunol.22:161-206(1985))。通過把形成鏈間-重鏈S-S鍵的第一個和最后一個半胱氨酸殘基放入到相同的位置，可將其它IgG同種型的鉸鏈區(qū)與IgGl序列對齊。本文的鉸鏈區(qū)可以是天然序列鉸鏈區(qū)或變體鉸鏈區(qū)。變體鉸鏈區(qū)的兩條多肽鏈的每一條多肽鏈一般保留至少1個半胱氨酸殘基，以便變體鉸鏈區(qū)的多肽鏈可在兩條鏈間形成二硫鍵。本文優(yōu)選的鉸鏈區(qū)是天然序列人鉸鏈區(qū)，如天然序列人IgGl鉸鏈區(qū)。"功能性Fc區(qū)"具有天然序列Fc區(qū)的至少一個"效應(yīng)器功能"。"效應(yīng)器功能"的實例包括Clq結(jié)合；補體依賴性細胞毒性(CDC);Fc受體結(jié)合;抗體依賴性細胞-介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC);吞噬作用；細胞表面受體(如B細胞受體；BCR)的下調(diào)，等等。此類效應(yīng)器功能一般需要Fc區(qū)被結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如抗體可變區(qū))結(jié)合并且能使用各種本領(lǐng)域已知的評價此類抗體效應(yīng)器功能的方法而祐:評定。"天然序列Fc區(qū)"，包含與天然Fc區(qū)氨基酸序列相同的氨基酸序列。圖3提供天然序列人和小鼠IgGFc區(qū)的氨基酸序列。"變體Fc區(qū)"，包含由于至少1個氨基酸修飾而與天然序列Fc區(qū)不同的氨基酸序列。優(yōu)選地，與天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)相比，變體Fc區(qū)具有至少1個氨基酸取代，如約1個至約10個氨基酸取代，優(yōu)選地，天然序列Fc區(qū)或親本多肽的Fc區(qū)中有約1至約5個氨基酸取代。本文的變體Fc區(qū)，將優(yōu)選與天然序列Fc區(qū)和/或與親本多肽的Fc區(qū)具有至少約80%序列同一性，最優(yōu)選至少約卯％序列同一性，更優(yōu)選至少約95%序列同一性。"抗體依賴性細胞-介導(dǎo)的細胞毒性"和"ADCC"，是在指細胞-介導(dǎo)的反應(yīng)，在此反應(yīng)中，表達Fc受體(FcRs)的非特異性細胞毒細胞(如，天然殺傷(NK)細胞、中性白細胞和巨噬細胞)識別結(jié)合在耙細胞上的抗體并且繼而引起靶細胞的溶胞作用。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細胞，僅表達Fc7Rin，而單核細胞則表達FcyRI、FcyRII和FcyRin。FcR在造血細胞上的表達情況總結(jié)于RavetchgndKinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464頁的表3中。為評定相關(guān)分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定，如描述于美國專利5，500，362或5,821,337中的測定方法。用于此類測定的有用效應(yīng)器細胞，包括外周血單核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘呋蛄硗?，在體內(nèi)如，用Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)公開的動物模型，測定有關(guān)分子的ADCC活性，。"人效應(yīng)器細胞"是表達一種或多種FcR并發(fā)揮效應(yīng)器功能的白細胞。優(yōu)選地，細胞至少表達FcyRJII且發(fā)揮ADCC效應(yīng)器功能。人介導(dǎo)ADCC的白細胞的實例包括外周血單核細胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細胞、單核細胞、細胞毒性T細胞和中性白細胞；以PBMC和NK細胞為優(yōu)選。效應(yīng)器細胞可從其天然來源中分離得到，如從血液或者本文所述的PBMC分離。術(shù)語"Fc受體"和"FcR"，用于描述與抗體Fc區(qū)結(jié)合的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。而且，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(—種Y受體)，并包括FcyRI,FcyRII,和FcyRIII亞類受體，包括等位基因變體和這些受體的不同剪切形式。FcyRII受體包括FcyRIIA(—種"激活性受體")和FcyRIIB(一種"抑制性受體")，其具有類似的氨基酸序列，主要區(qū)別在于它們胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的不同。激活性受體FcyRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于酪氨酸激活基序(ITAM)的免疫受體。抑制性受體FcyRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有基于酪氨酸抑制基序的免疫受體(ITIM)。(綜述于Daeron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。對FcR的綜述，參見Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991);Capel等，Immunomethods4:25-34(1994);以及deHaas等,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。其它FcR，包括今后將被鑒定的那些FcR,均涵蓋在本文術(shù)語"FcR"之內(nèi)。該術(shù)語也包括新生(neonatal)受體，F(xiàn)cRn，該受體負責將母親的IgG傳遞給胎兒(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976);和Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。"補體依賴性細胞毒性"和"CDC",是指補體存在下的靶細胞溶解。補體激活途徑是由補體系統(tǒng)的第一個組分(Clq)與已與相關(guān)抗原復(fù)合的分子(如抗體)相結(jié)合而啟動的。為了評定補體激活，可使用CDC測定，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods202:163(1996)中所描述的方法。"親和力成熟"抗體，是指該抗體的一個或多個CDR區(qū)中存在一個或多個改變，從而導(dǎo)致該抗體相對于其沒有這些改變的親本抗體而言，對所要結(jié)合的抗原的親和力得到改善。優(yōu)選的親和力成熟抗體對其靶抗原具有納摩爾甚至皮克摩爾的親和力。使用本領(lǐng)域已知的任何方法，制備親和力成熟抗體。Marks等Bio/technology10:779-783(1992)描述通過VH和VL區(qū)改組(shuffling)的親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機誘變描述在下列文獻中Barbas等ProcNat.Acad.Sci,USA91:3809-3813(1994);Schier等Gene169:147-155(1995);Yelton等J.Immunol.155:1994-2004(1995);Jackson等，J.Immunol.154(7):3310-9(1995);和Hawkinsetai,IMol.Biol.226:889-896(1992)。本文的"百分比(％)氨基酸序列同一性"，定義為候選序列的氨基酸殘基與選擇序列的氨基酸殘基進行序列對比，并在必要時導(dǎo)入空隙以獲取最大百分比的序列同一性，而不將任何保守取代視為序列同一性的部分時，候選序列與選擇序列的氨基酸殘基相同的百分數(shù)?？墒褂帽绢I(lǐng)域各種方法進行序列對比以便測定氨基酸序列同一性百分比，例如，使用公眾可得到的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定測量對比的適宜參數(shù)，包括對所比較的序列全長獲得最大對比所需的任何算法。然而，為此目的，氨基酸序列同一性°/。值是使用下述序列對比計算機程序ALIGN-2而獲得的。ALIGN-2序列對比計算機程序的作者是Genentech，Inc.，該程序和用戶資料一起已經(jīng)提交地處WashingtonD.C.,20559的美國版4又局，其美國版權(quán)注冊登記號為TXU510087。7>眾通過Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California可以得到ALIGN-2程序。ALIGN2程序應(yīng)當為在UNIX操作系統(tǒng)，優(yōu)選在數(shù)碼UNIXV4.0D使用而進行編制。ALIGN-2程序設(shè)定了所有序列對比參數(shù)并且不變。為了本發(fā)明目的，給定氨基酸序列A相對于給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者這樣說給定氨基酸序列A具有或含有給定氨基酸序列B相同氨基酸序列的％)如下計算X/Y比值乘以100其中X是用序列對比程序ALIGN-2比較A和B的氨基酸殘基后計算出的相同氨基酸數(shù)，其中Y是B的氨基酸殘基總數(shù)?？梢岳斫?，當氨基酸序列A與氨基酸序列B的長度不相等時，A相對于B的氨基酸序列同一性%將不等于B相對于A的氨基酸序列同一性％。"多肽鏈"，是其中每一個結(jié)構(gòu)域與其它結(jié)構(gòu)域均通過肽鍵而不是通過非-共價相互作用或二硫鍵相連接的多肽。本文的"柔性接頭"，是指含有由肽鍵連接的2個或更多個氨基酸殘基、并且為其連接的2個多肽(如2個Fd區(qū))提供更大轉(zhuǎn)動自由度的肽。此轉(zhuǎn)動自由度使得由柔性接頭連接的2個或更多個抗原結(jié)合部位接近其各自靶抗原(一個或多個)更加高效。適宜柔性接頭的實例包括包含下列序列的肽序列g(shù)ly-ser,gly-ser-gly-ser(SEQIDNO:10)、ala-ser和gly-gly-gly-ser(SEQIDNO:11)。優(yōu)選地，柔性接頭含有2至約10氨基酸殘基，最優(yōu)選4個或更少殘基。"二聚化結(jié)構(gòu)域"，是通過至少2個氨基酸殘基(一般為半胱氨酸殘基)或至少2個肽或多肽(其可具有相同或不同的氨基酸序列)相締合而形成的。肽或多肽相互之間可通過共價和/或非-共價締合而相互作用。本文二聚化結(jié)構(gòu)域的實例包括Fc區(qū)；鉸鏈區(qū)；CH3區(qū)；CH4區(qū)；CH1-CL對；具有基因工程改造的"隆凸"和/或"突起"的"界面"(描述于美國專利5,821,333中，特別在此引入作為參考)；亮氨酸拉鏈(如jun/fos亮氨酸拉鏈，參見Kostelney等，J.Immunol"148:1547-1553(1992);或酵母GCN4亮氨酸拉鏈)；異亮氨酸拉鏈；受體二聚體對(如，白介素-8受體(IL-8R);和整聯(lián)蛋白異二聚體如LFA-1和GPIIIb/IIIa),或者它們的二聚化區(qū)；二聚配體多肽(如神經(jīng)生長因子(NGF),神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3),白介素-8(IL-8),血管內(nèi)皮生長因子(VEGF),和腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF);參見Arakawa等J.Biol.Chem.269(45):27833-27839(簡)和Radziejewski等Biochem.32(48):1350(1993)),或者它們的二聚化區(qū)；一對能夠形成二硫鍵的半胱氨酸殘基；一對肽或多肽，每一包含至少一個半胱氨酸殘基(如從約1、2或3至約10個半胱氨酸殘基)，這樣使得在肽或多肽之間可以形成二硫鍵(此后指"合成的鉸鏈")；和抗體可變區(qū)。本文最優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域是Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。"天然存在氨基酸殘基"(即，由遺傳密碼編碼的氨基酸殘基)可選自丙氨酸(Ala);精氨酸(Arg);天冬酰胺(Asn);門冬氨酸(Asp);半胱氨酸(Cys);谷氨酰(Gln);谷氨酸(Glu);甘氨酸(Gly);組氨酸(His);異亮氨酸(Ile):亮氨酸(Leu);賴氨酸(l:ys);蛋氨酸(Met);苯丙氨酸(Phe);脯氨酸(Pro);絲氨酸(Ser);蘇氨酸(Thr);色氨酸(Trp);酪氨酸(Tyr);和纈氨酸(Val)。"非-天然存在氨基酸殘基"，是指在多肽鏈中能夠與相鄰氨基酸殘基共價連接但不是上述列舉的天然存在氨基酸殘基的殘基。非-天然存在氨基酸殘基的實例包括正亮氨酸、鳥氨酸、正纈氨酸、高絲氨酸和其它例如描述于Ellman等Meth.Enzym.202:301-336(1991)中的氨基酸殘基類似物。為了產(chǎn)生這些非-天然存在氨基酸殘基，可以使用Noren等Science244:182(1989)和Ellman等(出處同上)的方法。簡言之，這些方法涉及用非-天然存在氨基酸殘基化學(xué)性激活抑制型tRNA，繼之在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯RNA。"分離的"多肽，是指已從其天然環(huán)境組分中鑒定和分離和/或收獲的多肽。肽的天然環(huán)境中的污染成分是那些將干擾使用多肽進行診斷和治療的物質(zhì)，可包括酶、激素和其它蛋白性或非-蛋白性溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，多肽被純化為(l)使用Lowry方法測定為大于95重量。/。、最優(yōu)選大于99重量％的多肽，(2)用轉(zhuǎn)杯式蛋白測序儀，達到足以獲得N-末端或內(nèi)部氨基酸序列至少15個殘基的程度，或者(3)使用考馬斯藍或優(yōu)選銀染色，達到在非-還原或還原條件下SDS-PAGE電泳同質(zhì)性的程度。分離的多肽包括在重組細胞內(nèi)的原位多肽，因為多肽天然環(huán)境中的至少一個組分是不存在的。然而，通常用至少一個純化步驟來制備分離的多肽?？贵w的"功能性抗原結(jié)合部位"，是能夠結(jié)合靶抗原的部位。抗原結(jié)合部位的抗原結(jié)合親和力，并不必需具有與抗原結(jié)合部位所衍自的親本抗體同樣的強度，但是結(jié)合抗原的能力必須是使用任何一種已知評價抗原結(jié)合抗體的各種方法可以測定的。而且，本文多價抗體每一抗原結(jié)合部位的抗原結(jié)合親和力，不必具有相同的定量。對于本文的多聚抗體，功能性抗原結(jié)合部位的數(shù)量可用下述實施例2中所描述的超速離心法進行評定。根據(jù)此方法,假定有不同數(shù)量功能性結(jié)合部位的情況下，計算靶抗原與多聚抗體締合的不同比率和復(fù)合物的平均分子量。為了計算功能性結(jié)合部位的數(shù)量，將這些理論值與得到的實際試驗值進行比較。"受體的配體激活"，是指由與受體(或含有目標受體的受體復(fù)合物)結(jié)合的配體所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如，對于酪氨酸激酶受體來說，是由酪氨酸激酶受體的胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域磷酸化受體或底物多肽中的酪氨酸殘基而引起)。在ErbB受體時，通常將會涉及ErbB配體與ErbB異源-低聚體的結(jié)合，這將激活異源-低聚體中一個或多個ErbB受體的激酶結(jié)構(gòu)域，并因而導(dǎo)致一個或更多個ErbB受體中酪氨酸殘基的磷酸化和/或其它底物多肽(一條或多條多肽)中酪氨酸殘基的磷酸化。"阻斷"受體的配體激活的抗體，是降低或阻止上面定義的配體激活的抗體。此阻斷可以任何方法發(fā)生，如通過干擾配體與受體的結(jié)合、受體復(fù)合物形成、受體復(fù)合物中酪氨酸激酶受體的酪氨酸激酶活性，和/或受體內(nèi)或受體附近酪氨酸激酶殘基(一個或多個)的磷酸化。阻斷ErbB受體的配體激活的抗體的實例，包括單克隆抗體2C4和7F3(它阻斷HER2/HER3和HER2/HER4異源-低聚體的HRG激活；和EGFR/HER2異源-低聚體的EGF、TGF-P或雙調(diào)節(jié)素激活)；和L26、L96及L288抗體(Klapper等Oncogene14:2099-2109(1997)),它阻斷EGF和NDF與表達EGFR、HER2、HER3和HER4的T47D細胞之結(jié)合。具有指定抗體的"生物特性"的抗體，是具有能夠?qū)⒖贵w同那些與相同抗原結(jié)合的其它抗體區(qū)別開來的一種或多種生物特性的抗體。本文所用的"生長抑制劑",是指抑制體內(nèi)或體外細胞生長的化合物或組合物。因此，細胞因子抑制劑是顯著降低S期細胞百分比的化合物或組合物。生長抑制劑的實例包括阻斷細胞周期進程的制劑(在s期之外的環(huán)節(jié)),譬如，誘導(dǎo)Gl期和M-期停滯的制劑。傳統(tǒng)的M-期阻斷劑包括長春花堿(長春新堿和長春堿)、紫杉酚和拓樸酶II抑制劑如阿霉素、表阿霉素、柔紅霉素、依托泊苷和博萊霉素。那些使Gl期停滯的制劑也使S-期停滯，例如，DNA烷化劑如他莫昔芬、潑尼松、達卡巴噪、氮芥、順鉑、氨曱蝶呤、5-氟尿嘧啶和阿糖胞嘧啶-C。進一步的信息可在下列文獻中找到TheMolecularBasisofCancer,Mendelsohn和Israel,eds.，Chapter1,entitled"Cellcycleregulation,oncogens,andantineoplasticdrugs"byMurakami等(WBSaunders:Philadelphia,1995)，特別是第13頁。"生長抑制性"抗-HER2抗體的實例，是那些與HER2結(jié)合并抑制過度表達HER2的癌細胞生長的抗體。優(yōu)選的生長抑制性抗-HER2抗體在抗體濃度約0.5~30pg/ml時抑制培養(yǎng)物中SKBR3乳腺腫瘤細胞生長大于20%、優(yōu)選大于50%(如從約50%至約100%),該生長抑制是在SKBR3細胞暴露于抗體6天后測定的。(見1997年10月14日公布的美國專利5,677,171)。"誘導(dǎo)細胞死亡"的抗體，是引起活細胞變得無法生存的抗體。細胞通常是表達抗體要與之結(jié)合的抗原的細胞，尤其是過度表達抗原的細胞。優(yōu)選地:細胞是癌細胞，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎癌、結(jié)腸癌、曱狀腺癌、胰腺癌或者膀胱癌細胞。在體外，細胞可以是SKBR3、BT474、Calu3、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SKOV3細胞。體外的細胞死亡可在不存在補體和免疫效應(yīng)器細胞的情況下測定，以區(qū)別于抗體依賴性細胞-介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)引起的細胞死亡。因此，細胞死亡試驗可使用熱滅活血清(即不含有補體)并在不含免疫效應(yīng)器細胞時進行。為了測定抗體是否能夠誘導(dǎo)細胞死亡，可評定相對于未處理細胞的胞膜完整性是否喪失，細胞完整性可通過^輿化丙啶(propidiumiodide)(PI)、臺盼藍(見Mooreetal.Cytotechnology17:1-11(1995))或7AAD的攝取進行測定。"誘導(dǎo)細胞凋亡"的抗體，是誘導(dǎo)程序性細胞死亡的抗體，程序性細胞死亡是通過測定膜聯(lián)蛋白V結(jié)合、DNA片段化、細胞皺縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹、細胞碎裂和/或膜泡(稱為凋亡小體)形成而確定的。細胞是表達抗體要與之結(jié)合的抗原的細胞，并且可以是過度表達抗原的細胞。細胞可以是肺瘤細胞，如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎、結(jié)腸癌、曱狀&泉癌、胰腺癌或膀胱癌細胞。體夕卜，細胞可以是SKBR3、BT474、Calu3細胞、MDA-MB-453、MDA-MB-361或SK0V3細胞?？捎酶鞣N方法檢測與凋亡相關(guān)的細胞事件。例如，磷脂酰絲氨酸(PS)易位可通過膜聯(lián)蛋白結(jié)合來測定；DNA片段化可通過本文實施例中所公開的DNA序列梯來評估；與DNA片段化相伴的核/染色體濃縮可通過亞二倍體細胞中的任何增加來評估。優(yōu)選地，誘導(dǎo)細胞凋亡的抗體是，在使用表達抗體要與之結(jié)合的抗原的細胞的膜聯(lián)蛋白結(jié)合試驗中，該抗體對膜聯(lián)蛋白結(jié)合的誘導(dǎo)是未處理細胞的約2~50倍，優(yōu)選約5~50倍，最優(yōu)選約10~50倍。誘導(dǎo)細胞凋亡的抗體的實例包括抗-HER2單克隆抗體7F3(ATCCHB-12216)和7C2(ATCCHB12215)，包括其人源化和/或親和力成熟變體;抗-DR5抗體3F11.39.7(ATCCHB隱12456);3H3.14.5(ATCCHB-12534);3D5.1.10(ATCCHB-12536);和3H3.14.5(ATCCHB-12534)，包括其人源化和/或親和力成熟變體；人抗-DR5受體抗體16E2和20E6,包4舌其親和力成熟變體(W098/51793,特別在此引入作為參考)；抗-DR4抗體4E7.24.3(ATCCHB-12454);4H6.17.8(ATCCHB-12455);1H5.25.9(ATCCHB-12695);4G7.18.8(ATCCPTA-99);和5G11.17.1(ATCCHB-12694)，包括其人源化和/或親和力成熟變體。為了篩選與被感興趣抗體結(jié)合的抗原上的表位相結(jié)合的抗體，可進行如在Antibody,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中描述的常規(guī)交叉-阻斷試驗。"激動型抗體"是與受體結(jié)合并激活受體的抗體。通常，激動型抗體的受體激活能力至少與受體的天然激動型配體性質(zhì)上相似(并且可以是基本上性質(zhì)相似)。激動型抗體的實例，是與TNF受體超家族中受體結(jié)合并誘導(dǎo)表達TNF受體的細胞凋亡。測定細胞凋亡誘導(dǎo)作用的試驗描述在W098/51793和W099/37684中，該兩篇文獻特別在此引入作為參考。"病癥"是指將受益于抗體治療的任何狀況。其包括慢性和急性病癥或疾病，包括哺乳動物易于患上正被討論病癥的那些病理學(xué)狀況。在本文中，受治病癥的非-限定性實例包括良性和惡性肺瘤；白血病和淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤；神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、下丘腦和其他腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)和嚢胚腔的病癥；以及炎性、血管生成和免疫學(xué)的病癥。術(shù)語"治療有效量"，是指藥物有效治療哺乳動物疾病或病癥的量。在癌癥的情況下，藥物的治療有效量是減少癌細胞數(shù)量；縮小腫瘤；抑制(即，減緩到一定程度并優(yōu)選停止)癌細胞侵潤入周邊器官；抑制(即，減緩到一定程度并優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；抑制腫瘤生長至一定程度；和/或緩解與病癥有關(guān)的一種或更多種癥狀至一定程度。到此程度，藥物可以阻止現(xiàn)存的癌細胞生長和/或殺死癌細胞，藥物可以是細胞抑制劑和/或細胞毒素。對于癌癥治療，體內(nèi)效力可以是例如，通過評定疾病進展時間(TTP)和/或測定反應(yīng)速度(RR)來測量。"治療"是指治療性治療和預(yù)防性措施。需要治療的那些對象，包括已經(jīng)患有病癥的那些個體，也包括要預(yù)防發(fā)生病癥的那些個體。術(shù)語"癌"，是指或描述哺乳動物的以無控性細胞生長為特征的生理狀況。癌的實例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌的更具體的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非-小細胞肺癌、肺的腺癌、肺的鱗癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺腎癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭頸癌。.本文的"自身免疫性疾病"，是由對抗個體自身組織應(yīng)答而引起的非-惡性疾病或病癥。自身免疫性疾病或病癥的實例包括但不限于炎癥性反應(yīng).，如包括牛皮癬和皮炎(如特應(yīng)性皮炎)的炎癥性皮膚疾??；系統(tǒng)性硬皮病和」埂化癥；與炎性腸道疾病有關(guān)的反應(yīng)(如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成年呼吸窘迫綜合征；ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；眼色素層炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；變應(yīng)性狀況如濕疹和哮喘以及涉及T細胞浸潤和慢性炎癥性反應(yīng)的其它狀況；動脈粥樣硬化；白細胞粘附缺陷；類風濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);糖尿病(如I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；多發(fā)性硬化癥；雷諾氏綜合征；自身免疫性曱狀腺炎；變應(yīng)性腦脊膜炎；Sjorgen's綜合征；青少年糖尿?。缓陀杉毎蜃雍蚑淋巴細胞介導(dǎo)的與急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)有關(guān)的免疫反應(yīng)，通常見于結(jié)核、類肉瘤病、多肌炎、肉芽腫病和結(jié)節(jié)性脈管炎；惡性貧血(阿狄森氏病)；涉及白細胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷沉淀球蛋白血癥或Coombs試驗陽性貧血)；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。豢?腎小球基膜疾??；抗磷脂綜合征；變應(yīng)性神經(jīng)炎；格雷夫斯??；Lambert-Eaton肌無力綜合征；大皰性天皰疳；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌腺病；萊特爾氏??；強直-人綜合征(stiff-mansyndrome);貝切特氏??；巨細胞性動脈炎；免疫復(fù)合物性腎炎；IgA腎??；IgM多神經(jīng)?。惶匕l(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等。"外來抗原"，是指對于接觸之的哺乳動物而言不是內(nèi)原性或天然的分子。外來抗原可引發(fā)免疫應(yīng)答，如在哺乳動物介導(dǎo)的體液和/或T細胞應(yīng)答。通常，外來抗原將誘導(dǎo)對抗所述抗原的抗體產(chǎn)生。本文考慮到的外來抗原的實例包括免疫原性治療劑，例如蛋白如抗體，特別是含有非-人氨基酸殘基的抗體(如嚙齒類動物、嵌合/人源化抗體和靈長化(primatized)抗體)；毒素(任選地與靶向分子如抗體偶合，其中靶向分子也可以是免疫原性的)；基因治療病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒；移植物；傳染性物質(zhì)(如細菌和病毒)；同種抗原(即在某些成員中存在而在同一物種的其他成員中卻不存在的抗原)，例如在血型、人淋巴細胞抗原(HLA)、血小板抗原、在移植器官上表達的抗原、血液成分、妊娠(Rh)以及血友病因子(如因子VIII和因子IX)方面的差異。"阻斷對外來抗原的免疫應(yīng)答"，是指減少或阻止因暴露于外來抗原而產(chǎn)生的至少一種免疫-介導(dǎo)的應(yīng)答。例如，人們可以減輕對抗外來抗原的體液應(yīng)答，即，通過阻止或減少哺乳動物中抗該抗原的抗體產(chǎn)生。或者，或另外，抑制獨特型抗體；"減緩"包被有同種抗體的細胞的清除；和/或通過耗竭抗原-呈遞細胞而影響同種抗原呈遞。本文所用術(shù)語"移植物"，是指得自供體的用于移植入接受者的生物學(xué)材料。移植物包括各種材料，例如，分離的細胞，如胰島細胞；組織，如新生兒的羊膜、骨髓、造血前體細胞，和眼組織如角膜組織；以及器官，如皮膚、心臟、肝臟、脾臟、胰腺、甲狀腺葉、肺、腎、管狀器官(如，腸、血管或者食管)等。管狀器官可用于替換食管、血管或膽管的損傷部分。皮膚移植物不僅可用于燒傷，而且可用作損傷腸道或者封閉一些缺損如膈疝的敷料。移植物得自于任何哺乳動物，包括人，無論是來自尸體還是活的供體。優(yōu)選地，移植物是骨髓或者器官如心臟，并且移植物的供體與宿主的HLAII類抗原相適配。本文所用術(shù)語"哺乳動物宿主"，是指任何相容的移植物接受者。"相容的"是指將接受捐贈移植物的哺乳動物宿主。優(yōu)選，宿主是人。如果移植物的供體和宿主均是人，那么優(yōu)選他們HLAII類抗原相適配，以便改善組織相容性。本文所用術(shù)語"供體"，是指移植物所取自的死的或活的哺乳動物。供體優(yōu)選是人。人供體優(yōu)選是體檢正常并且具有相同主要ABO血型的血統(tǒng)-相關(guān)的志愿者供體，因為交叉主要血型可能影響同種移植物的存活。然而，將例如O型血供體的腎臟移植給A、B或者AB接受者是可能的。術(shù)語"移植"及其變異(variations)，是指移植物插入宿主，無論移植術(shù)是同系移植(其中供體和接受者在遺傳上是完全相同的)、同種異體移植(其中供體和接受者是不同的基因來源但是屬于相同的物種)，還是異種移植(其中供體和接受者來源于不同的物種)。因此，在一代表性方案中，宿主是人而移植物是來自于相同或不同遺傳起源的人的同種移植物。在另一方案中，移植物來自于不同于要移植入的種群的物種,譬如狒狒心臟移植入人接受者宿主體內(nèi)，并包括種系發(fā)生上具有極大差異的物種的動物，例如，將豬心臟瓣膜或動物P胰島細胞或者神經(jīng)元細胞移植入人宿主體內(nèi)。"脫敏待移植哺乳動物",是指在將移植物施用到哺乳動物之前減少或者消除對移植物的過敏性敏感度或者反應(yīng)性。這可通過任何機制而達到例如減少脫敏哺乳動物的抗-供體抗體，例如其中抗-供體抗體是抗人淋巴細胞抗原(HLA)的。本文所用術(shù)語"細胞毒制劑"，是指抑制或阻止細胞功能和/或引起細胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y卯、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)，化療劑，毒素如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體。"化療劑"是在腫瘤治療中使用的化學(xué)化合物?；焺嵗ㄍ榛瘎?，如噻替哌(thiotepa);環(huán)磷酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安(busulfan)，英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan);氮丙咬(aziridine)如苯并多巴(benaodopa)，卡波醌(carboquone),美妥替旅(meturedopa)和尿烷亞胺(uredopa);氮丙咬和methylamelamine包括六曱蜜胺(altretamme)，三亞胺p秦(triethyenemelamine),三亞乙基石岸酰胺，三亞乙基碌u代磷酰胺和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine);acetogenins(特別是bullatacin和bullatacinone);喜樹堿(包括合成的類似物拓樸替康(topotecan));苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；cryptophycins(特別是cryptophycin1牙口cryptophycin8);海兔毒素(dolastatin);duocarmycin(包4舌合成類似物，KW-2189和CBI-TMI);eleutherobin;pancratistatin;sarcodictyin;spongistatin;氮芥(nitrogenmustards)長口苯丁酸氮芥,萘氮芥,膽石舞酰胺(cholophosphamide)，對參氮芥(estramustine),異環(huán)磷酰胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine)，鹽酸氧氮芥；左萬走苯丙氨酸氮芥(melphalan)，新氮芥(novembichin),膽甾醇苯乙酸氮芥，松龍苯芥(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧咬氮芥；亞硝基脲(nitrosureas)如亞硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，■福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine),雷莫司汀(ranimustine);4元生素如enediyne抗生素(如加利車霉素，尤其是加利車霉素？和加利車霉素e1,參見例如AgnewChemIntl.Ed.Engl.33:183-186(1994);dynemicin,包括dynemicinA;esperamicin;以及新制癌菌素生色團(chromophore)和相關(guān)的色蛋白enediyne抗生素生色團)，阿克拉霉素，力t線菌素，authramycin,重氮絲氨酸，博來霉素，放線菌素C(cactinomycin),carabicin,洋紅霉素(carminomycin)，嗜癌素(carzinophilin)，色霉素，放線菌素D,柔紅菌素(daunorubicin),地托比星(detorubicin),6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin)(包括嗎啉代-阿霉素，氰基嗎啉代-阿霉素，2-吡咯啉基-阿霉素和脫氧阿霉素)，表阿霉素(epirubicin),依索比星(esorubicin)，伊達比星(idarubicin),發(fā)波霉素(marcellomycin),絲裂霉素，霉酚酸，諾加霉素(nogalamycin)，橄欖霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin,噪呤霉素，三鐵阿霉素(quelamycin)，羅多比星(rodorubicin),鏈黑菌素；鏈脲霉素(streptozocin),殺結(jié)核菌素，烏苯美司(ubenimex),凈司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin);抗代謝藥如氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，如二曱葉酸(denopterin),氨曱蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物氟達拉濱(fludarabine),6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，如安西他濱(ancitabine)，阿扎胞普(azacitidine)，6-氮尿苦，卡莫氟(carmofUr),P可糖胞苦，雙脫氧尿苷，去氟氧尿苷(doxifluridine),依諾他濱(enocitabine),氟尿苷，5-FU;雄激素類，如二曱睪酮(calusterone)，丙酸曱雄烷酮(dromostanolongpropionate),環(huán)石克雄醇(epitiostanol),美名,氨(mepitiostane)，睪內(nèi)酯(testolactone);抗腎上腺類，如氨魯米特(aminoglutethimide)，米托坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑如frolinicacid;醋葡內(nèi)酉旨；趁石岸酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖咬(amsacrine);bestrabucil;比生群(biasntrene);依達曲沙(edatraxate);defofamine;^火水仙胺；i也吖醌(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptiniumacetate);epothilone;依托格魯(etoglucid);硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖(lentinan);氯尼達明(lonidamine);美登木素生物堿(maytansinoids)(包括美登素和柄型菌素)米托胍腙(mitoguazone);米托蒽醌(mitoxantrone);莫哌達醇(mopidamol);硝'p夫旦(nitracrine);噴司寸也丁(pentostatin);phenamet;p比柔比星(pirarubicin);鬼臼樹酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);rhizoxin;西索菲蘭(sizofiran);鍺螺胺(spirogermanium);細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,2'，2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);單端孢霉烯族毒素類(尤其是T-2毒素，verracurinA，桿孢菌素A，蛇形菌素(anguidine));烏拉坦(urethan);長春堿酰胺；達卡巴嗪(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");環(huán)磷酰胺；三胺碌u磷(thiotepa);taxoids，如紫杉醇(TAX01^,Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和紫杉碎(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他濱(gemcitabine);6-石克代鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨曱蝶呤；柏類似物如順鉑和卡鉑；長春花堿；鉑；依托泊甙(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺；絲裂霉素C;米托蒽醌；長春新堿；長春瑞賓(vinorelbine);新霉酰胺(navelbine);novantrone;替尼泊甙(teniposide);柔紅霉素；氨基蝶呤；xeloda;伊拜膦酸鹽(ibandronate);CPT-11;拓樸異構(gòu)酶抑制劑RPS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);維曱酸；esperamicins;卡培他濱(capecitabine);以及上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或衍生物。此定義還包括能調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素制劑，如抗雌激素制劑，包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(raloxifene),芳香酶抑制劑4(5)-咪唑，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene)，keoxifene，LY117018，奧那司酮(onapristone),和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素制劑，如氟他氨(flutamide),尼魯米特(nilutamide),比卡魯胺(bicalutamide),亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和上述任何物質(zhì)的可藥用鹽、酸或書t生物。術(shù)語"細胞因子"，是由一個細胞群釋放出的作為細胞內(nèi)遞質(zhì)作用于另一細胞的蛋白質(zhì)的通用詞。此類細胞因子的實例是淋巴因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。包括在細胞因子中的有生長激素，如人生長激素、N-曱硫氨酰人生長激素和牛生長激素；曱狀旁腺素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如卵泡刺激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH和黃體生成素(LH);肝生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳激素；胎盤催乳激素(placentalactogen);腫瘤壞死因子-a和腫瘤壞死因子-P;苗勒氏-抑制物質(zhì)；鼠促性腺素-有關(guān)的肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長因子；整合素；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子，如NGF-a;血小板-生長因子;轉(zhuǎn)化生長因子(TGFs),如TGF-a和TGF-p;胰島素-樣生長因子-I和胰島素-樣生長因子-II;促紅細胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactors);干擾素，如干擾素-ou干擾素-p和-丫集落刺激因子(CSFs)如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞巨噬細胞-CSF(GM-CSF);和粒細胞-CSF(G-CSF);白介素(ILs)如IL曙1，IL-la,IL-2，IL-3，IL-4,IL-5，IL-6，IL-7，IL-8,IL-9，IL-10,IL陽11:IL-12;腫瘤壞死因子，如TNF-oc或TNF-(3;以及其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。本文所用術(shù)語細胞因子，包括來自天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白和天然序列細胞因子的生物活性等效物。本申請所用術(shù)語"前體藥物"，是指藥物活性物質(zhì)的前體或衍生物形式，其相對于親本藥物對腫瘤細胞的細胞毒作用較小且可酶促活化或被轉(zhuǎn)換成更具活性的親本形式。例見Wilman，"癌癥化療中的前體藥物"BiochemicalSocietyTransaction,14，pp.375-382,615thMeetingBelfast(1986)和Stella等，"前體藥物一種藥物定向運送的化學(xué)方法"定向藥物運送，Borchardt等(編)，pp.247-267,Humanapress(1985)。本發(fā)明的前體藥物包括但不限于含有磷酸鹽的前體藥物、含有硫代磷酸鹽的前體藥物、含有硫酸鹽的前體藥物、含有肽的前體藥物、D-氨基酸修飾的前體藥物、糖基化的前體藥物、含有P-內(nèi)酰胺的前體藥物、任選取代的含有笨氧乙酰胺的前體藥物或任選取代的含有苯基乙酰胺的前體藥物、5-氟胞嘧啶和可轉(zhuǎn)化為更具細胞毒活性的游離藥物的其它5-氟尿嘧啶前體藥物?？裳苌鸀楸景l(fā)明所用前體藥物形式的細胞毒藥物包括，但不限于上述化療劑。"血管生成因子"是剌激血管發(fā)育的生長因子。在本文中，優(yōu)選的血管生成因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。本文中所用"標記"一詞，是指直接或間接地與多肽偶聯(lián)的可檢測的化合物或組合物。標記可以是其本身可被測得(例如放射性同位素標記或熒光標記)，或者如果是酶標記時，可以是可測得的催化底物化合物或組合物發(fā)生的化學(xué)變化。"分離的"核酸分子，是從至少一個污染核酸分子中鑒定和分離出來的核酸分子，而天然來源的多肽核酸通常與所述污染核酸分子締合在一起。一分離的核酸分子不是在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式或按其天然存在的形式。因而，分離的核酸分子區(qū)別于天然細胞中存在的核酸分子。但是，分離的核酸分子，含有包含在通常表達多肽的細胞中的核酸分子，例如，所述核酸分子所在的染色體位置與在天然細胞中所處位置不同。術(shù)語"控制序列",是指在特定宿主生物中表達可^Ht連接的編碼序列所必要的DNA序列。適宜于原核生物的控制序列是例如包括啟動子，任選地啟動子序列，-和核糖體結(jié)合位點。已知真核細胞是使用例如啟動子、多腺苷酸化信號和增強子。當置入核酸使與另一核酸序列功能性關(guān)聯(lián)時，核酸是"可操作地連接"。例如，如果一個肽是作為參與多肽分泌的前蛋白而被表達的話，則把DNA前序列(presequence)或分泌性前導(dǎo)序列可操作性地連接于這個多肽的DNA;如果啟動子或增強子影響序列的轉(zhuǎn)錄，則把該啟動子或增強子可操作地連于該編碼序列；或者如果核糖體結(jié)合位點所處位置是為了促進序列的翻譯，則把該核糖體結(jié)合位點可操作地連于該編碼序列。通常，"可操作地連接"是指連接的DNA序列是鄰接的，和在分泌性前導(dǎo)序列的情況下-,是鄰接的并且是在閱讀相的。然而，增強子并非必須是鄰接的。通過在適宜限制性酶切位點的連接反應(yīng)完成連接。如果不存在這樣的酶切位點，則根據(jù)常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。在本文中，"細胞"、"細胞系"和"細胞培養(yǎng)物"的表述互換使用，并且所有命名均包括后代細胞。因此，單詞"轉(zhuǎn)化物(transformants)"和"轉(zhuǎn)化的細胞"包括原始主體細胞和由其傳代的培養(yǎng)物，.而不考慮傳遞的數(shù)量。也應(yīng)理解，由于有意或無意的突變，所有后代細胞在DNA內(nèi)容上可能并不精確地完全相同。與所篩選的最初轉(zhuǎn)化的細胞具有相同功能或生物學(xué)活性的突變的后代細胞包括在本發(fā)明中。不同的命名旨在使
發(fā)明內(nèi)容更清楚。II.實現(xiàn)本發(fā)明的方法A.多價抗體本發(fā)明涉及制造多價抗體的方法。本申請下一部分將描述生產(chǎn)多價抗體的可變區(qū)所起源的"親本"或"起始"抗體的各種技術(shù)。本文感興趣的具體多價抗體，是包含至少3個(并優(yōu)選4個或更多，如4或5至約8個)抗原結(jié)合部位的抗體。通常，所有抗原結(jié)合部位均是如前所定義的"功能性的"。優(yōu)選地，多價抗體在自然界不存在，而且不是天然序列IgM或IgA抗體。本文多價抗體優(yōu)選不在體外通過把一對抗體進行化學(xué)交聯(lián)而產(chǎn)生(如Ghetie等(1997)，出處同上或Wolff等(l993)，出處同上所描述的方法)。本申請也提供不需要在親本抗體中？I入半胱氨酸殘基(一個或多個)以便通過在一對Fc區(qū)之間的二硫鍵來形成多價抗體的多價抗體(如Shopes等(1992),出處同上或Caron等(1992)，出處同上所描述的方法)。在一實施方案中，多價抗體包含含有至少2個重鏈(或輕鏈)可變區(qū)的第一條多肽鏈和含有至少2個重鏈(或輕鏈)可變區(qū)的第二條多肽鏈。優(yōu)選地，第一條多肽鏈含有2個重鏈可變區(qū)而第二條多肽鏈也含有2個重鏈可變區(qū)，它們可以與相應(yīng)的輕鏈可變區(qū)(每條多肽鏈至少2個)結(jié)合從而產(chǎn)生4個(或更多個)抗原結(jié)合部位。在本發(fā)明一優(yōu)選的實施方案中，多價抗體包含一個二聚化結(jié)構(gòu)域，它將(l)2個(或更多個)抗原結(jié)合部位與(2)1個、2個(或更多個)抗原結(jié)合部位相結(jié)合。本文考慮到了各種二聚化結(jié)構(gòu)域，但是優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域是Fc區(qū)或4交鏈區(qū)。當多價抗體包含F(xiàn)c區(qū)(如天然序列或變體Fc區(qū))時，F(xiàn)c區(qū)優(yōu)選是前述定義的"功能性的"，因而它能夠起到一個或更多個抗體效應(yīng)器功能，如ADCC或CDC。優(yōu)選地，多價抗體僅含有一個Fc區(qū)或缺乏Fc區(qū)。當多價抗體包含一個Fc區(qū)時，優(yōu)選地，為Fc區(qū)氨基末端(而不是Coloma和Morrison,(1997)出處同上所述的Fc區(qū)羧基末端)提供三個或更多個抗原結(jié)合部位。這可以通過提供用式VD1-Xl-VD2-X2-Fc表示的第一條多肽鏈來實現(xiàn):，其中(l)VD1是第一個重鏈或輕鏈可變區(qū)(優(yōu)選是重鏈可變區(qū))，(2)VD2是第二個重鏈或輕鏈可變區(qū)(優(yōu)選是重鏈可變區(qū))，(3)Fc含有Fc區(qū)的一條鏈，和(4)X1與X2代表任選插入的氨基酸或多肽。XI與X2優(yōu)選包含或者由CH1區(qū)(其VD1或VD2是重鏈可變區(qū))或CL區(qū)(其VD1或VD2是輕鏈可變區(qū))組成。任選地,X1進一步包含一個柔性接頭，它一般由c-末端至VD1(或C-末端至CH1或CL，如果存在的話)。柔性接頭可含有肽如gly-ser、gly-ser-gly-ser(SEQIDNO:10)、ala-ser或gly-gly-gly-ser(SEQIDNO:11)。本文感興趣的多價抗體包含三個或更多個(如4或5至約8個)Fab多肽，每一多肽均能夠結(jié)合抗原。Fab片段優(yōu)選提供對應(yīng)Fc區(qū)的氨基末端(此時多價抗體具有Fc區(qū))。舉例來說，2個或更多個Fd片>^可以與Fc區(qū)一條鏈的氨基末端相融合。如此基因工程產(chǎn)生的多肽鏈可以與(l)通過2個或更多個Fd片段與Fc區(qū)另一條鏈的氨基末端相融合形成的另一條多肽鏈結(jié)合，以及與(2)S補性VL區(qū)(如4個或更多個VL區(qū)，其中每一區(qū)任選地與CL區(qū)融合)相結(jié)合。任選地，抗體包含2個或更多個Fd片段之間的柔性接頭。多價抗體可以，例如，包含一對具有式(l)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-Fc鏈，或式(2)VH-CH1-VH-CH1-Fc鏈(即，式中2個Fd片段之間沒有柔性接頭)的多肽鏈。本文多價抗體的三個或更多個功能性抗原結(jié)合部位，優(yōu)選每一個均是通過重鏈和輕鏈可變區(qū)形成的。因此，其中2個或更多個重鏈可變區(qū)融合在一起(正如前面所指出的那樣，任選與插入氨基酸殘基(一個或多個)融合),含有2個或更多個互補輕鏈可變區(qū)的多肽與重鏈可變區(qū)結(jié)合(例如，在相同宿主細胞中通過共-表達融合蛋白和輕鏈可變區(qū)多肽(一個或多個))。優(yōu)選地,抗體包含4個或5個或者更多個(如多達約8個)輕鏈可變區(qū)多肽，其中每一個任選地含有CL區(qū)。在本文的一個實施方案中，具有三個或更多個(如3至約IO個，但優(yōu)選3個或4個)抗原結(jié)合部位的抗體可以包含含有三個或更多個(如3至約10個，但優(yōu)選3個或4個)重鏈或輕鏈可變區(qū)的多肽鏈，其中每一可變區(qū)以形成抗原結(jié)合部位的方式與三個或更多個(如3至約10個，4旦優(yōu)選3個或4個)輕鏈或重鏈可變區(qū)多肽相結(jié)合或者聯(lián)合。由此，當多肽鏈含有三個或更多個重鏈可變區(qū)時，它與三個或更多個相應(yīng)的輕鏈可變區(qū)多肽(如與VL-CL多肽)相結(jié)合或者聯(lián)合?；蛘撸敹嚯逆満腥齻€或更多個輕鏈可變區(qū)時，它與三個或更多個相應(yīng)的重鏈可變區(qū)多肽(如與VH-CH1多肽)相結(jié)合或聯(lián)合。優(yōu)選地，三個或更多個抗原結(jié)合部位中的每一個均抗相同的抗原。與此類抗體結(jié)合的抗原的實例包括(1)腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族中的受體(該受體可以是'三聚體受體'，這樣抗體僅需要包括所需的3個抗原結(jié)合部位)如DR4和DR5;(2)B細胞表面抗原如CD20;(3)以HER2受體為例的ErbB受體；或者(4)由腫瘤細胞表達的細胞表面蛋白。舉例來說，多肽鏈可包括3個(或4個)能夠與3個(或4個)輕鏈可變區(qū)多肽(優(yōu)選VL-CL多肽)結(jié)合以產(chǎn)生抗相同抗原的3個(或4個)抗原結(jié)合部位的重鏈可變區(qū)。此類抗體例示于圖23D(具有3個抗原結(jié)合部位)和圖23E(具有4個抗原結(jié)合部位)中。多價抗體也可包含含有下列各式的多肽鏈(a)VL-CL-柔性接頭-VL-CL-柔性接頭-VL-CL;在該實施方案中，多肽可含有由柔性接頭連接的3至約8個VL-CL多肽；(b)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl;在該實施方案中，多肽可含有由柔性接頭連接的3至約8個VH-CH1多肽；(c)(VL-CL)n,其中n是三個或更多個(如3至約8個，但優(yōu)選3個或4個)；或(d)(VH-CHl)n,其中n是三個或更多個(如3至約8個，但優(yōu)選3個或4個)。優(yōu)選地，多肽鏈含有下式(a)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl;(b)VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl-柔性接頭-VH-CHl;或者(c)(VH-CHl)n,其中n是3或4。本文多價抗體具有特別用于體內(nèi)治療和診斷所需的特性。舉例來說，更快的分解代謝。因此，本發(fā)明提供含有與細胞毒制劑(如一旦內(nèi)化則具有殺細胞活性的細胞毒制劑)偶聯(lián)的多價抗體的免疫偶聯(lián)物。本文描述了生產(chǎn)免疫偶聯(lián)物的各種細胞毒制劑，但是優(yōu)選的細胞毒制劑是放射性同位素、美登素或加利車霉素。多價抗體，和/或多價抗體的至少一個抗原結(jié)合特異性所源自的親本抗體，可具有某些特性。舉例來說，多價抗體和/或親本抗體可以(1)是激動型抗體(如，其中抗體所結(jié)合的抗原是TNF受體家族的受體或B細胞表面抗原);(2)誘導(dǎo)細胞凋亡(譬如，其中抗體所結(jié)合的抗原是ErbB受體或TNF受體超家族的受體)；(3)結(jié)合腫瘤細胞上所表達的細胞表面蛋白(如B細胞表面抗原或者ErbB受體)；(4)結(jié)合由腫瘤細胞過度表達的細胞表面蛋白(如表皮生長因子受體(EGFR)、HER2受體、ErbB3受體、ErbB4受體或DcR3受體)；和/或(5)是生長抑制性抗體。本文的多價抗體可以4又對一個抗原，或一個以上抗原(如2至約3個抗原)具有特異性。在一實施方案中，多價抗體的三個或更多個功能性抗原結(jié)合部位可以結(jié)合相同的抗原(優(yōu)選結(jié)合抗原上相同的表位，在這種情況下，多價抗體被認為是"單特異性的")。本申請也提供"多特異"抗體。這樣，三個或更多個功能性抗原結(jié)合部位可結(jié)合2個或更多個(如2至約3個)不同的抗原或者表位。本申請顯示，可以基因工程改造抗受體抗原的多價抗體，該抗體令人驚奇地具有在定量上與天然配體相似的激動性和/或細胞凋亡4秀導(dǎo)能力。這里的"定量上相似"，是指在測定激動性和/或細胞凋亡-誘導(dǎo)活性的試驗中，多{介抗體具有天然配體活性的約10倍、優(yōu)選約5倍以內(nèi)的激動性和/或細胞凋亡誘導(dǎo)活性。在該實施方案中，具有激動性和/或細胞凋亡"^秀導(dǎo)活性的抗體可以是一個對TNF受體超家族受體(諸如Apo2L受體，如DR4、DR5、DcRl和DcR2(優(yōu)選DR4或DR5))具有特異性的抗體，在此情況下，如在下面實施例3中所述的那樣，抗體在細胞凋亡試驗中的活性是在該試驗中Apo2L活性的約10倍以內(nèi)，如約5倍以內(nèi)。在本發(fā)明一實施方案中，本文的多價抗體可以結(jié)合B細胞表面抗原。優(yōu)選的B細胞表面抗原包括CD19、CD20、CD22和CD40，最優(yōu)選CD20。考慮了本文多價抗體的各種應(yīng)用并在下面做進一步詳述。多價抗體擁有一個或更多個功能性Fc區(qū)時，預(yù)期它具有介導(dǎo)效應(yīng)器功能(如ADCC和CDC)并且較缺乏Fc區(qū)的多價抗體具有更長的半衰期。此類多價抗體可用于期望殺死細胞，如腫瘤或者癌細胞的情形。需要本文缺少Fc區(qū)的多價抗體的其他形式的情況有在期望短的半衰期時(如治療心血管或者炎癥性疾病或病癥，或者抗體是與細胞毒制劑相偶聯(lián)的情況)；當期望抗體被內(nèi)化時(如用含有抗體和細胞毒制劑的免疫偶聯(lián)物治療)；用于改善對實體腫瘤的穿透時；當期望多價抗體在非-哺乳類宿主細胞(如原核宿主細>1包如大腸桿菌宿主細胞)表達時；用于非胂瘤疾病或病癥治療時；和/或為了避免向患者施用一些具有效應(yīng)器功能(一種或多種)抗體所觀察到的'首次劑量影響'時。此類形式的抗體可包含包括二聚化結(jié)構(gòu)域的多價抗體，其中二聚化結(jié)構(gòu)域含有與亮氨酸拉鏈區(qū)相融合的抗體鉸鏈區(qū)(亮氨酸拉鏈區(qū)促進形成二聚化結(jié)構(gòu)域的多肽的聯(lián)合，但可隨后在施用于患者之前通過蛋白水解而去除)(見圖23C);具有3個抗原結(jié)合部位的多價抗體，如圖23D所示；或者具有4個抗原結(jié)合部位的多價抗體，如圖23E所示的那些。B.抗原結(jié)合特異性本文多價抗體直接針對或者特異地結(jié)合于一個或更多個耙抗原。優(yōu)選地，被多價抗體結(jié)合的至少一個抗原是生物學(xué)上重要的多肽，而且向患有疾對抗非多肽抗原的抗體(如胂瘤-相關(guān)糖脂抗原；參見美國專利5，091,178)也在考慮之中。當抗原是多肽時，它可以是跨膜分子(如受體)或配體(如生長因子)。例證性抗原包括分子如腎素；生長激素，包括人生長激素和牛生長激素；生長激素釋放因子；甲狀旁腺素；促甲狀腺激素；脂蛋白；a-l-抗胰蛋白酶；胰島素A-鏈；胰島素B-鏈；胰島素原；印泡刺激激素；降鉀素；黃體化激素；胰高血糖素；凝血因子，如因子VIIIC、因子IX、組織因子(TF)，和馮.威利布蘭德因子(vonWillebrandsfactor);抗-凝血因子，如蛋白C;心房利鈉因子；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活物質(zhì)，如尿激酶或人尿或組織-型纖溶酶原激活物質(zhì)(t-PA);鈴蟾肽；凝血酶；造血生長因子；腫瘤壞死因子-a和腫瘤壞死因子隱P;月齒p非肽酶；RANTES(regulatedonactivationnormallyT-cellexpressedandsecreted);人巨喧細月包炎性蛋白(MIP-l-a);血清白蛋白，長口人血清白蛋白；Muellerian-抑制性物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；微生物蛋白，如P-內(nèi)酰胺酶；DNA酶；IgE;細胞毒性T-淋巴細胞相關(guān)抗原(CTLA),如CTLA-4;抑制素(inhibin);活化素(activin);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF);激素或生長因子的受體；蛋白A或D;類風濕因子；神經(jīng)營養(yǎng)因子，如骨-衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、親神經(jīng)素-3、-4、-5或-6(NT-3，NT-4，NT-5，或NT-6),或者神經(jīng)生長因子如NGF-p;血小板-衍生的生長因子(PDGF);成纖維細胞生長因子如aFGF和bFGF;表皮生長因子(EGF);轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-a和TGF-p,包括TGF-卩l(xiāng)、TGF-P2、TGF-卩3、TGF-卩4或TGF-R5;胰島素-樣生長因子-I和-II(IGF-I和IGF-II);去(des)(l-3)-IGF-I(腦IGF-I),胰島素-樣生長因子結(jié)合蛋白；CD蛋白，如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD25(IL-2受體的Tac亞單位)；促紅細胞生成素；骨誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)形成蛋白(BMP);干擾素，如干擾素-a、-卩，和y;集落刺激因子(CSFs)，如M-CSF、GM-CSF和G-CSF;白介素(ILs)，如IL-1至IL-10;超氧化物歧化酶；T-細胞受體；表面膜蛋白；衰變加速因子；病毒性抗原，諸如AIDS包膜的一部分；轉(zhuǎn)運蛋白；歸巢受體；地址素；調(diào)節(jié)蛋白；整聯(lián)蛋白，如CDlla、CDllb、CDllc、CD18和ICAM、VLA-4或VCAM;胂瘤相關(guān)抗原，如HER2、HER3或HER4受體；以及任何上述所列多肽的片段。本發(fā)明包含的抗體的優(yōu)選分子靶，包括白細胞表面標志或CD蛋白，如CD1a-c、CD2、CD2R、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CDIO、CDlla、CDllb、CDllc、CDwl2、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16、CD16b、CDwl7、CD18、CD19、C腦、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、C41、CD42a-d、CD43、CD44、CD44R、CD45、CD45A、CD45B、CD450、CD46-CD48、CD49a畫f、CD50、CD51、CD52、CD53-CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CDw65、CD66a畫e、CD68-CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a-b、CD80-CD83、CDw84、CD85-CD89、CDw90、CD91、CDw92、CD93-CD98、CD99、CD99R、CDIOO、CDwlOl、CD102-CD106、CD107a-b、CDwl08、CDwl09、CD115、CDwl16、CD117、CD119、CD120a-b、CD121a陽b、CD122、CDwl24、CD126-CD129和CD130;ErbB受體家族的成員，如EGF受體、HER2受體、HER3受體或HER4受體；前列腺特異抗原；細胞粘附分子，如lIb/IIIa、LFA-1、Macl、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、a4/(37整聯(lián)蛋白，以及av/p3整聯(lián)蛋白，后者包括其a或(3亞單位(如抗-CDlla、抗-CD18或抗-CDllb抗體)；生長因子，如VEGF;組織因子(TF);a干擾素(aIFN);白介素，如IL-8;IgE;血型抗原；flk2/flt3受體；月巴胖(OB)受體；c-mpl受體；CTLA-4;蛋白C等。可溶性抗原或其片段，任選與其他分子偶聯(lián)，可用作產(chǎn)生抗體的免疫原。對于跨膜分子，如受體、這些跨膜分子的片段(如受體的胞外區(qū))可用作免疫原?；蛘?，表達跨膜分子的細胞可用作免疫原。此類細胞可得自天然來源(如癌細胞系)或者是經(jīng)重組技術(shù)轉(zhuǎn)化的用于表達跨膜分子的細胞。其它抗原及其制備抗體有用的形式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。本文多價抗體的優(yōu)選靶抗原包括(l)ErbB受體，包括EGFR、HER2、HER3和HER4;(2)TNF受體超家族的受體，例如Apo2L受體，如DR4、DR5、DcRl和DcR2;(3)B細胞表面抗原，尤其是CD19、CD20、CD22和CD40;(4)腫瘤細胞表達的抗原；(5)腫瘤細胞過度表達的抗原(如ErbB受體;DcR3受體)；(6)多價(如二聚體或三聚體)配體(如TNF受體超家族的受體;VEGF受體等)激活的受體。在一個實施方案中，多價抗體的三個或更多個(如4至約8個)抗原結(jié)合部位可以均直接針對上述抗原之一上的相同抗原決定簇或者表位。本申請也提供多特異性抗體，即，對至少兩個不同表位或抗原決定簇具有結(jié)合特異性的抗體。多特異性抗體(如雙特異性抗體；BsAbs)作為靶向劑顯著的潛在可能性。雙特異性抗體在探查細胞表面分子的功能性特性和確定不同F(xiàn)c受體介導(dǎo)細胞毒作用的能力方面非常有用(Fanger等，Crit.Rev.Immunol.12:101-124(1992))。Nolan等，Biochem.Biophys.Acta.1040:1-11(1990)描述了BsAbs的其它診斷應(yīng)用。更具體而言，可以構(gòu)建BsAbs以〗更固相化酶免疫測定所用的酶。為了達到此目的，可將BsAb的一個臂設(shè)計成與酶上的特異表位相結(jié)合從而使得該結(jié)合不引起酶抑制，BsAb的另一個臂與固定基質(zhì)結(jié)合從而確保在所需位點具有高密度的酶。此類診斷性BsAbs的實例g括Hammering等在J.Exp.Med.128:1461-1473(1968)中描述的兔抗-lgG/抗-鐵蛋白BsAb，其用于定位表面抗原。也已開發(fā)出對辣根過氧化酶(HRP)以及激素具有結(jié)合特異性的BsAbs。BsAbs的另一潛在免疫化學(xué)應(yīng)用涉及其在兩-點免疫測定中的應(yīng)用。例如，生產(chǎn)了與分析物(analyte)蛋白上的兩個分離表位相結(jié)合的兩個BsAbs-其一BsAb結(jié)合不溶性基質(zhì)復(fù)合物，另一結(jié)會指示酶(參見Nolan等，出處同上)。多特異性抗體也可用于各種疾病如癌癥的體外或體內(nèi)免疫診斷(Songsivilai等，Clin,Exp.Immunol.79:315(1990))。為了便于BsAb的診斷應(yīng)用，BsAb的一個臂可以結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原，而另一個臂可結(jié)合可檢測標志，如與放射性核素緊密結(jié)合的螯合劑。使用該方法，LeDoussal等使得BsAb適用于結(jié)腸直腸癌和曱狀腺癌的放免檢測，其具有與癌胚抗原(CEA)結(jié)合的一條臂和與二乙三胺五乙酸(DPTA)結(jié)合的另一條臂。參見LeDoussal等，Int.J.CancerSuppl.7:58-62(1992)和LeDoussal等，J.Nucl.Med.34:1662-1671(1993)。Stickney等類似地描述了使用放免檢測法檢測表達CEA的結(jié)腸直腸癌策略。這些研究描述了結(jié)合CEA和羥乙基^:脲-千基-EDTA(EOTUBE)的BsAb。參見Stickney等，CancerRes.51:6650-6655(1991)。通過提供與靶(如病原體或腫瘤細胞)結(jié)合的一個臂和與細胞毒性觸發(fā)分子(如T-細胞受體或Fcy受體)結(jié)合的另一個臂，多特異性抗體也可用于重新傳入的細胞毒性的人體治療。相應(yīng)地，多特異性抗體可用于引導(dǎo)患者的對腫瘤細胞或感染物質(zhì)特異的細胞免疫反應(yīng)機制。利用該策略，已經(jīng)證明結(jié)合FcyRIII(即CD16)的雙特異性抗體可以在體外介導(dǎo)通過自然殺傷(NK)細胞/大顆粒淋巴細胞(LGL)的腫瘤細胞殺傷，并且對于阻止體內(nèi)的腫瘤生長是有效的。Segal等，Chem.Immunol.47:179(1989)和Segal等，BiologicTherapyofCancer2(4)DeVita等編著J.B.Lippincott，Philadelphia(1992)p.1。類似地,已經(jīng)開發(fā)出用于治療過度表達HER2抗原的卵巢癌和乳腺癌的具有一個臂與FcyRIII結(jié)合而另一個臂與HER2受體結(jié)合的雙特異性抗體(Hseih-Ma等CancerResearch52:6832-6839(1992)和Weiner等CancerResearch53:94-100(1993))。雙特異性抗體也介導(dǎo)經(jīng)T細胞的殺傷。正常地，雙特異性抗體將T細胞上的CD3復(fù)合物連接到腫瘤-相關(guān)抗原上。由連接到抗-pl85HE^的抗CD3構(gòu)成的完全人源化F(ab')2BsAb,已經(jīng)用于引導(dǎo)T細胞以殺死過度表達HER2受體的腫瘤細胞。Shalaby等，J.Exp.Med.175(1):217(1992)。已在數(shù)個早期臨床試驗中檢測了雙特異性抗體，獲得了令人鼓舞的結(jié)果。在一個試驗中，給患有肺癌、卵巢癌或乳腺癌的12個患者輸注抗-CD3/抗-腫瘤(MOC31)雙特異性抗體引導(dǎo)活化T-淋巴細胞進^f亍治療。DeLeij等BispecificAntibodiesandTargetedCellularCytotoxicity,Romet-Lemonne,Fanger和SegalEds.,Lienhart(1991)p.249。被引導(dǎo)過來的細胞誘導(dǎo)對腫瘤細胞可觀的局部溶胞作用、中度炎癥反應(yīng)，但是沒有毒副作用或者抗-鼠抗體反應(yīng)。在對一個B細胞惡性腫瘤患者使用抗-CD3/抗-CD19雙特異性抗體所進行的極為初步的試驗中，也取得了顯著減少外周腫瘤細胞數(shù)量的效果。Clark等BispecificAntibodiesandTargetedCellularCytotoxicity,Romet-Lemonne,Fanger和SegalEds.,Lienhart(1991)p.243。有關(guān)多特異性4元體的治療應(yīng)用，也參見Kroesen等，CancerImmunol.Immunother37:400407(1993),Kroesen等，Br.J.Cancer70:652-661(1994)以及Weiner等，J.I讓imol.152:2385(1994)。多特異性抗體也用作纖維蛋白溶解劑或者疫苗佐劑。另外，這些抗體也用于治療感染性疾病(如使效應(yīng)器細胞靶向病毒(如HIV或流感病毒)或者原蟲如鼠弓形蟲感染的細胞)，用于將免疫毒素遞送到腫瘤細胞，或者使免疫復(fù)合物靶向細胞表面受體(參見Fanger等，出處同上)。本文考慮到了各種多特異性抗體。舉例來說，多特異性抗體可以結(jié)合目的抗原上的2個或更多個不同表位?；蛘撸鄡r抗體對下列抗原具有特異性(1)靶細胞表達的抗原(如，靶細胞是腫瘤細胞時)，和(2)白細胞上的觸發(fā)分子，如T-細胞受體分子(如CD2或CD3)，或者IgG的Fc受體(FcyR)，如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16),以便將細胞防御機制集中到表達抗原的細胞上。多特異性抗體也可用于將細胞毒制劑局限于表達靶抗原的細胞處。這些抗體擁有靶抗原-結(jié)合臂和結(jié)合細胞毒制劑(如皂草素、干擾素-a、長春花生物堿、蓖麻毒蛋白A鏈、氨甲蝶呤或者放射性同位素半抗原)的臂。WO96/16673描述了雙特異抗-HER2/抗-FcyRIII抗體而美國專利5，837，234公開了雙特異抗-HER2/抗-Fc丫RI抗體。雙特異抗-HER2/Fcot抗體見于WO98/02463.美國專利5,821，337教導(dǎo)了雙特異抗-HER2/抗-CD3抗體。C.制備親本抗體為了產(chǎn)生多價抗體，可使用制備抗體的各種方法學(xué)，如下面所描述的那些，來制備對抗抗原的具有可變區(qū)的"親本"或"起始"抗體。起始或親本抗體的可變區(qū)序列可用于設(shè)計本文的多價抗體。(i)多克隆抗體優(yōu)選通過多次皮下(sc)或腹膜內(nèi)(ip)注射相關(guān)抗原和佐劑而在哺乳動物中產(chǎn)生多克隆抗體。使用雙功能試劑或衍生制劑，例如，」琉代琥珀酰亞胺馬來酰亞胺苯甲酰酯(maleimidobenzoylsulfosuccinimide)(通過半胱氨酸殘基偶聯(lián))、N-羥基琥珀酰亞胺(通過賴氨酸殘基偶聯(lián))、戊二醛、琥珀酸酐、SOCL2或者RNONR,其中R和R1是不同的烷基，將相關(guān)抗原與對要進行免疫的種屬來說具有免疫原性的蛋白進行偶聯(lián)是有用的，所述免疫原性蛋白的實例包括但不限于匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛曱狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。用所述抗原、免疫原性偶聯(lián)物或衍生物免疫動物，方法是,:將100jig或5ng蛋白或偶聯(lián)物(分別對抗兔或鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑混合，在多位點皮內(nèi)注射該溶液。1個月后，多位點皮下注射起始量的1/5-1/10的弗氏完全佐劑中的肽或偶聯(lián)物來加強免疫。7-14天后，對動物采血，測定血清中的抗體效價。對動物加強免疫直到效價達到平臺期為止。優(yōu)選給動物加強注射相同抗原的偶聯(lián)物，但也可以是偶聯(lián)至不同蛋白和/或通過不同的交聯(lián)劑偶聯(lián)的偶聯(lián)物。偶聯(lián)物還可以是重組細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的融合蛋白。此外，可用明礬等聚集劑增強免疫應(yīng)答。(ii)單克隆抗體單克隆抗體來自基本均一的抗體群，即該群體中的每個抗體除了可能的很小量天然突變外都相同。因此，修飾詞"單克隆"指所述抗體不是不同抗體混合物的特性。例如，單克隆抗體可用由Kohler等，Nature256:495(1975)首次描述的雜交瘤技術(shù)制備，或用重組DNA方法制備(美國專利4,816,567)。在雜交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它適合的宿主動物如倉鼠，以激發(fā)那些產(chǎn)生或能產(chǎn)生與用于免疫之蛋白特異性結(jié)合的抗體的淋巴細胞。另外，可體外免疫淋巴細胞。然后用適當融合劑，如聚乙二醇，使淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp,59-103(AcademicP謂，1986))。將如此制備的雜交瘤細胞接種至適當培養(yǎng)基中并進行培養(yǎng)，優(yōu)選該培養(yǎng)基含有一或多種能抑制未融合的親本骨髓瘤細胞生長或存活的物質(zhì)。例如，如果親本骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌呤鳥噪呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),雜交瘤培養(yǎng)基通常將包含次黃噪呤、氨基蝶呤和胸腺嘧咬核苦(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT-缺陷型細胞的生長。優(yōu)選骨髓瘤細胞是那些能有效融合、支持所選抗體生成細胞以穩(wěn)定的高水平產(chǎn)生抗體，并對諸如HAT培養(yǎng)基等類似培養(yǎng)基敏感的細胞。其中，優(yōu)選的骨髓瘤細胞系是小鼠骨髓瘤系，如由SalkInstituteCellDistreibutionCenter,SanDiego，CaliforniaUSA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠腫瘤細胞和由美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MarylandUSA提供的SP-2或X63-Ag8-653細胞。也有報道稱人骨髓瘤以及小鼠-人異源骨髓瘤(heteromyeloma)細胞系可用于產(chǎn)生人單克隆抗體(Kozbor，免疫學(xué)雜志133:3001(1984);Brodeur等，單克隆抗體制備技術(shù)及應(yīng)用，pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987》可在含有生長的雜交瘤細胞培養(yǎng)基中測定抗所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗，如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來測定。單克隆抗體的結(jié)合親和力可通過如Muson等，Anal.Biochem.,107:220(1980)所述Scatchard測定來測定。一旦鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding，單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-l03(AcademicPress,1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細胞可作為腹水中腫瘤的形式在動物體內(nèi)生長。由亞克隆分泌的單克隆抗體可用常規(guī)抗體純化方法如蛋白-A-瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析從培養(yǎng)基、腹水或血清中分離。編碼單克隆抗體的DNA可用常規(guī)方法很容易的分離和測序(如利用能與編碼小鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異結(jié)合的寡核苷酸探針)。雜交瘤細胞是這類DNA的優(yōu)選來源。DNA分離后，可將其插入表達載體中，然后用此表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，如大腸桿菌細胞、獼猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或不產(chǎn)生抗體蛋白的骨髓瘤細胞，以便在重組宿主細胞中合成單克隆抗體。編碼抗體的DNA在細菌中的重組表達的綜述見Skerra等，Curr.OpinioninImmunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Revs.,130:151-188(1992)。在另一實施方案中，可從用McCafferty等，Nature,348:552-554(1990)所述技術(shù)產(chǎn)生的抗體噬菌體文庫中分離抗體或抗體片段。Clackson等，Nature,352:624-628(1991)和Marks等，分子生物學(xué)雜志222:581-597(1991)分別描述了用噬菌體文庫分離鼠和人的抗體。后來的文獻描述了通過鏈改組制備高親和力(nM范圍)的人型抗體(Marks等，生物/技術(shù)10:779-783(1992)),以及用于構(gòu)建極大規(guī)4莫噬菌體文庫的組合感染和體內(nèi)重組方法(Waterhouse等，核酸研究21..2265-2266(1993))。因此，這些技術(shù)都可取代傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)來分離克隆抗體。DNA也可通過用人類重鏈和輕鏈的恒定區(qū)編碼序列取&小鼠同源序列來修飾(美國專利4，816,567;Mo訂ison等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1984))，或通過將非免疫球蛋白多肽的全部或部分編碼序列與免疫球蛋白編碼序列共價結(jié)合來修飾。通常用所述非免疫球蛋白多肽取代抗體恒定區(qū)，或取代抗體上一個抗原結(jié)合點的可變區(qū)，形成二價嵌合抗體，其中一個抗原結(jié)合位點特異于一種抗原而另一個抗原結(jié)合位點特異于另一種抗原。(iii)人抗體改造Kohler和Milstein首次描述的雜交瘤方法，使用人B淋巴細胞作為融合配對，制得人單克隆抗體。產(chǎn)生目的抗體的人B淋巴細胞，可以例如在征得同意后從人個體中分離出來。舉例來說，個體可以是在患有某種疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Shoenfdd等J.Clin.Invest.70:205(1982))、免疫-介導(dǎo)的血小板減少性紫癜(ITP)(Nugent等Blood70(1):16-22(1987))或癌癥時出現(xiàn)產(chǎn)生對抗自身抗原的抗體?；蛘呋蛄硗?，在體外使淋巴細胞免疫。舉例來說，人們可以將分離的人外周血淋巴細胞在體外暴露于lysomotrophicagent(如L-亮氨酸-O-甲酯、L-谷氨酸二曱酯或L-亮氨酰-L-亮氨酸-O-甲酉旨)(美國專利5,567,610,Borrebaeck等)；和/或在體外用佐劑如8-巰基鳥苷和細胞因子處理T-細胞耗竭的人外周血淋巴細胞(美國專利5,229,275,Goroff等)。然后，一般使從個體收獲的或者在體外致免疫的B淋巴細胞無限增殖以便產(chǎn)生人單克隆抗體。使B淋巴細胞無限增殖的技術(shù)包括但不限于(a)將人B淋巴細胞與人、小鼠骨髓瘤或者小鼠-人異源骨髓瘤細胞融合；(b)病毒轉(zhuǎn)化(如用Epstein-Barr病毒轉(zhuǎn)化；參見例如Nugent等，出處同上)；(c)與成淋巴細胞細胞系融合；或者(d)與'淋巴瘤細胞融合。使用適宜的融合試劑如聚乙二醇，將淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，從而形成雜交瘤細胞[Goding，單克隆抗體PrinciplesandPractice,AcademicPress,(1986)59-103頁]?？稍谶m宜培養(yǎng)基中接種雜交瘤細胞并使之生長，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有一種或多種抑制未融合的親本雜交瘤細胞生長或生存的物質(zhì)。例如，親本細胞缺乏次黃噪呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT)，雜交瘤的培養(yǎng)基通常包括次黃嘌呤、氨曱蝶呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)抑制HGPRT-缺陷型細胞生長。適宜的人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系已有描述(Kozbor，J.Immunol,,133:3001(1984);Brodeur等,MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,pp.51-63(MarcelDekker,Inc.,NewYork,198")?？稍诤猩L的雜交瘤細胞培養(yǎng)基中測定抗所述抗原的單克隆抗體的產(chǎn)生。雜交瘤細胞所產(chǎn)生的單克隆抗體的結(jié)合特異性通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合試驗，如放射免疫測定(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來測定。鑒定出能產(chǎn)生具有所需特異性、親和力、和/或活性的抗體的雜交瘤細胞后，將這些克隆通過有限稀釋法進一步克隆并用標準方法進行培養(yǎng)(Goding,單克隆抗體原理及應(yīng)用，pp.59-103(AcademicPress,1986))。適于此目的的培養(yǎng)基包括如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。使用常規(guī)免疫球蛋白純化方法，例如蛋白質(zhì)A-層析法、凝膠電泳、滲析或親和層析，可以從培養(yǎng)基或腹水中分離或純化由亞克隆分泌的單克隆抗體。也可利用能夠產(chǎn)生人抗體的非-人宿主例如小鼠來產(chǎn)生人抗體。如上所述，通過免疫，轉(zhuǎn)基因鼠現(xiàn)在已能產(chǎn)生人類抗體的所有成分，而不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白。例如，已有報道稱，嵌合及種系(germ-line)突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生被完全抑制。將人類種系免疫球蛋白基因陣列(array)轉(zhuǎn)移到這類種系突變小鼠中將導(dǎo)致因抗原攻擊而誘導(dǎo)人類的抗體產(chǎn)生。見Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，90:2551(1993);Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等，Yearinlmmuno.7:33(1993);和美國專利5591669,5589369和5545807。也可利用SCID-hu小鼠制備人抗體(Duchosal等Nature355:258-262(1992))。在另一實施方案中，可從人抗體噬菌體展示文庫中選擇人抗體?？贵w或其片段的文庫的制備是本領(lǐng)域眾所周知的，任何已知方法均可用于構(gòu)建可被引入宿主細胞的轉(zhuǎn)化載體家族。按照已知方法，可以制備噬菌體中抗體輕鏈和重鏈的文庫(Huse等，Science,246:l"5(1989))或者噬菌體或噬菌粒中的融合蛋白的文庫，參見例如，Vaughan等，NatureBiotechnology14:309-314(1996);Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:7978-7982(1991);Marks等，J.Mol.Bio"222:581-597(1991);Hoogenboom和Winter,J,Mol.Biol"227:381-388(1992);Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,89:4457-4461(1992);Griffiths等，EMBOJournal,13:3245-3260(1994);deKruif等,J.Mol.Biol"248:97-105(1995);WO98/05344;WO98/15833;WO97/47314;WO97/44491;WO97/35196;WO95/34648;美國專利5712089;美國專利5，702,892;美國專利5,427,908;美國專利5,403,484;美國專利5,432,018;美國專利5,270,170;WO92/06176;WO99/06587;美國專利5，514,548;WO97/08320;和美國專利5,702,892。使用選擇與靶抗原結(jié)合的噬菌體-抗體的本領(lǐng)域已知方法，淘選對抗噬菌體文庫的目的抗原。(iv)人源化抗體本領(lǐng)域已有關(guān)于人源化非人類抗體的制備方法的描述。優(yōu)選地，人源化抗體中已導(dǎo)入一或多個源自非人類的氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基常稱為"引進的"殘基，它們通常來自"引進的"可變區(qū)。人源化過程基本如Winter及其同事(Jones等，Nature,321:522-525(1986);Riechmann等,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等，Science,239:1534-1536(1988))所述，用高變區(qū)序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來進行。因此，這樣的"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利4,816,567),其中完整人類可變區(qū)的很少一部分被非人類物種的相應(yīng)序列取代。實踐中，人源化抗體通常是人的抗體，其中一些高變區(qū)殘基且可能有部分FR殘基被嚙齒類抗體中類似位點的殘基取代。對用于制備人源化抗體的人類可變區(qū)(包括重鏈和輕鏈)的選擇，對降低抗原性非常重要。根據(jù)所謂"最適應(yīng)"方法，對抗已知人類可變區(qū)序列的整個文庫篩選嚙齒類抗體可變區(qū)序列。將與嚙齒類的序列最相似的人類序列作為人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，免疫學(xué)雜志，151:2296(1993);Chothia等，分子生物學(xué)雜志，196:901(1987))。另一種方法是用人類輕鏈或重鏈特定亞型的所有抗體的共有序列作為特定框架區(qū)。相同的框架可用于幾種不同的人源化抗體(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.U,S.A.，89:4285(1992);Presta等，免疫學(xué)雜志，151:2623(1993))。更重要的是，將抗體人源化后保留了對抗原的高親和力和其它有利的生物特性。為達到此目的，在一種優(yōu)選方法中，通過用親本序列和人源化體。免疫球蛋白三維模型已有商品，是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。還有用于描述和展示所選免疫球蛋白序列可能的三維構(gòu)象的計算機程序。通過觀察這些展示結(jié)果可分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中可能發(fā)揮的作用，即分析能影響候選免疫球蛋白與其抗原結(jié)合的能力的殘基，通過這種方法，可從受者和引進序列中選出FR殘基并組合，從而得到所需抗體性質(zhì)，如對耙抗原的親和力增加?？傊?，高變區(qū)殘基直接并且最主要涉及對抗原的結(jié)合。(V)抗體片段已開發(fā)了生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，這些片段通過對完整抗體的蛋白水解性消化獲得(見Morimoto等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)方法雜志(JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods)24:107-117(1992))和Brennan等，Science,229:81(1985))。但現(xiàn)在可直接通過重組宿主細胞產(chǎn)生這些片段。例如，可從上述抗體噬菌體庫分離抗體片段。另外，可從大腸桿菌直接回收Fab，-SH片段，并經(jīng)化學(xué)連接形成F(ab，)2片段(Carter等，生物/技術(shù)10:163-167(1992))。依據(jù)另一種方法，可直接從重組宿主細胞培養(yǎng)中分離F(ab，)2片段。其它產(chǎn)生抗體片段的技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在其它實施方案中，所選抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見W093/16185;美國專利5,571,894;和美國專利5,587,458?？贵w片段也可以是"線性化抗體"，如美國專利5,641,870所述。這類線性化抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。(vi)抗體變體序列本申請考慮了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，可能需要改進抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特點?？贵w的氨基酸序列變體可通過在抗體核酸中引入適當?shù)暮塑账嶙兓蛘咄ㄟ^肽合成制備。這類修飾包括例如抗體的氨基酸序列內(nèi)殘基的缺失、和/或插入和/或取代。可進行缺失、插入和取代的任何組合以獲得最終的構(gòu)建體，只要最終的構(gòu)建體具有所需的特性即可。所述氨基酸變化還可改變抗體的翻譯后加工過程,例如改變糖基化位點的數(shù)目或位置?？梢詫τH本抗體和/或多價抗體進行此類改變，和/或在制備多價抗體氨基酸序列時在序列中引入這些改變。一種鑒別抗體中處于誘變優(yōu)選位置的特定殘基或區(qū)域的有效方法是Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989)所述的"丙氨酸掃描誘變"。這里，鑒定一個殘基或一組靶殘基(例如，帶電荷的殘基如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)并用中性或帶負電荷的氨基酸取代(最優(yōu)選丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影響氨基酸與抗原的相互作用。那些證實對取代具有功能敏感性的氨基酸位置通過在取代位點SI入進一步的或其-他的變體而改進。故，盡管引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但突變性質(zhì)本身不必是預(yù)定的。例如，為測定在指定位點處突變的作用，在所述靶密碼子或區(qū)域?qū)嵭斜彼釖呙杌螂S機誘變，并篩選所表達的具有所需活性的抗體變體。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其長度從一個殘基至包括IOO個或更多殘基的多肽)，以及序列內(nèi)單個或多個氨基酸殘基的插入。末端插入的例子包括帶有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入變體包括使抗體的N-或C-末端與能增加該抗體的血清半衰期的酶(如ADEPT)或多肽融合。另一類變體是氨基酸取代變體。這些變體使抗體分子中至少一個氨基酸殘基被不同殘基取代。最有興趣進行取代誘變的位點包括高變區(qū)，也可以考慮FR的改變。保守取代見表l的"優(yōu)選取代，，欄。如果這些取代引起生物學(xué)活性的改變，則可引入表1中"取代舉例"欄的更實質(zhì)性改變，或進一步參考下文的氨基酸分類并篩選產(chǎn)物。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>對所述抗體的生物學(xué)特性的實質(zhì)性修改可通過選擇性取代來完成，所述取代的效應(yīng)在維持(a)取代區(qū)多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如片層結(jié)構(gòu)或螺旋構(gòu)象，(b)該分子靶位點的電荷或疏水性，(c)側(cè)鏈的大小這幾方面有顯著差異。天然殘基根據(jù)共有的側(cè)鏈特性可分為(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸異亮氨酸(2)中性親水半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)堿性天冬酰胺，谷氨酰胺，組氨酸，賴氨酸，精氨酸(5)影響側(cè)鏈定向的殘基甘氨酸，脯氨酸(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代將限定上述某一類的成員被另一類取代。不參與維持抗體的正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基也可被取代，通常被絲氨酸取代，以提高該分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反，可在該抗體中添加半胱氨酸連接以提高其穩(wěn)定性。區(qū)的一或多個殘基。通常,;斤選用于進二步開發(fā)的變:相^于其親本抗體應(yīng)具有改進的生物學(xué)活性。產(chǎn)生這種取代變體的一個方便方法是利用了噬菌體展示的親和力成熟。簡單地說，使高變區(qū)的幾個位點(如6-7個位點)突變以便在每一位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。這樣產(chǎn)生的抗體變體以單價形式從絲狀噬菌體顆粒展示，其為與每個顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合體。然后篩選噬菌體展示的變體是否具有本文所述生物學(xué)活性(如結(jié)合親和力)。為了鑒定備選的高變區(qū)修飾位點，可通過丙氨酸掃描誘變來鑒定對抗原結(jié)合作出主要貢獻的高變區(qū)殘基?；蛘呋蛄硗?，測定抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以確定抗原與抗體之間的接觸點也較有利。這些接觸殘基及其鄰近殘基是根據(jù)本文所述技術(shù)進行取代的候選位點。一旦產(chǎn)生這樣的變體，如本文所述對它們?nèi)窟M行篩選，選出在一或多個相關(guān)實驗中具有優(yōu)勢特性的抗體以便進一步開發(fā)。所述抗體的另一種氨基酸變體改變了該抗體原來的糖基化基序。所謂改變就是去掉該抗體中的一或多個碳水化合物部分，和/或添加一或多個原本不存在于該抗體中的糖基化位點?？贵w的糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接指將碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈相連。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶促相連的識別序列。因此，多肽中存在上述任一種三肽序列都可產(chǎn)生潛在的糖基化位點。O-連接糖基化指將N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附著于羥基氨基酸，主要是絲氨酸、蘇氨酸，但也可用5-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸。在抗體中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列，使其包含一或多個上述三肽序列而方便地實現(xiàn)(在添加N-連接糖基化位點的情況下)。這種改變也可通過在原始抗體的序列中添加或取代一或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來實現(xiàn)(在添加O-連接的情況下)。編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子由本領(lǐng)域已知的各種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然氨基酸序列變體的情況下)，或通過對抗體之早期制備的變體或非變體形式進行寡核苷酸介導(dǎo)的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。也可預(yù)期修飾本發(fā)明抗體的效應(yīng)物功能，例如使該抗體的抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒作用(ADCC)和/或補體依賴的細胞毒作用(CDC)增強。這可以通過在抗體Fc區(qū)引入一或多個氨基酸修飾而實現(xiàn)，從而產(chǎn)生變體Fc區(qū)。該Fc區(qū)變體可包含含有在一個或多個氨基酸位置上有氨基酸修飾(如取代)的人Fc區(qū)序歹'〗(例如IgGi、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))。在一實施方案中，存在人效應(yīng)器細胞時，變體Fc區(qū)較天然序列Fc區(qū)介導(dǎo)更有效的抗體依賴性細胞-介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)或者對Fcy受體(FcyR)結(jié)合具有更好親和性。此類Fc區(qū)變體可含有在Fc區(qū)氨基酸256、2卯、298、312、326、330、333、334、360、378或430位的任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。具有減少與FcyR結(jié)合特性的Fc區(qū)變體，可含有在Fc區(qū)的氨基酸238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439位的任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。例如，F(xiàn)c區(qū)變體可顯示出減少與FcyRI的結(jié)合，并且其可含有在Fc區(qū)的氨基酸238、265、269、270、327或329位的任一或更多個氨基酸修飾,其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。Fc區(qū)變體可顯示出與FcyRII的結(jié)合減少，其可含有在Fc區(qū)的氨基酸238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439位的任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。有關(guān)Fc區(qū)變體可顯示出與FcyRIII的結(jié)合減少，其含有在Fc區(qū)的氨基酸238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294,、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437位的一個或更多個氨基酸4奮飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)變體顯示出與FcyR的結(jié)合改善并含有在Fc區(qū)的氨基酸255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、298、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、333、334、337、340、360、378、398或430位任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。例如，F(xiàn)c區(qū)變體可顯示出與Fc/RIII結(jié)合增加，而且任選地，可進一步顯示出與FcyRII結(jié)合下降。一例_〖正性此類變體含有Fc區(qū)在298和/或333位的氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。Fc區(qū)變體可顯示出與FcyRII結(jié)合增力口，并含有在Fc區(qū)氨基酸255、256、258、267、268、272、276、280、283、285、286、290、301、305、307、309、312、315、320、322、326、330、331、337、340、378、398或430位任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)編號。此類具有與FcyRII結(jié)合增加特性的Fc區(qū)變體，可任選地進一步顯示與FcyRIII的結(jié)合下降，并可例如含有在Fc區(qū)氨基酸268、272、298、301、322或340位的一個或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)。或者或另外，變體Fc區(qū)具有改變的新生Fc受體(FcRn)結(jié)合親和力。此類變體Fc區(qū)可含有在Fc區(qū)氨基酸238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447位的任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)。具有與FcRn結(jié)合減少特性的Fc區(qū)變體，可含有在Fc區(qū)氨基酸252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或447位的任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)?；蛘撸鲜鎏岬降腇c區(qū)變體可顯示出與FcRn的結(jié)合增加，其含有在Fc區(qū)氨基酸238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434位的任一或更多個氨基酸修飾，其中Fc區(qū)殘基編號是Kabat中的EU指數(shù)。具有改變Clq結(jié)合(即提高或者減少)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)特性的Fc區(qū)變體描述于W099/51642。此類變體可含有在Fc區(qū)氨基酸270、322、326、327、329、331、333或334位的一個或更多個氨基酸取代。有關(guān)Fc區(qū)變體，也參見Duncan和WinterNature322:738-40(1988);美國專利5,648,260;美國專利5，624，821;以及W094/29351。為了延長該抗體的血清半衰期，可在該抗體(尤其抗體片段)中摻入一個補救受體結(jié)合表位,如美國專利5，739,277所述。本文中術(shù)語"補救受體結(jié)合表位，，是指IgG分子(例如IgG,,IgG2、IgG3、或IgG4)Fc區(qū)中負責延長該IgG分子的體內(nèi)血清半衰期的表位。(vii)免疫偶聯(lián)物本發(fā)明還涉及免疫偶聯(lián)物，其中含有與細胞毒劑偶聯(lián)的抗體，所述細胞毒劑如化療藥物、毒素(例如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素，包括其片段和/或變體)或放射性同位素(即放射偶聯(lián)物)等?？捎行в糜谥苽溥@類免疫偶聯(lián)物的化療藥物已如上述。本文還涉及抗體與一或多種小分子毒素，如加利車霉素、美登素(美國專利5,208,020)、單端孢霉烯(trichothene)、CC1065的偶聯(lián)物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使抗體與一或多個美登素分子偶聯(lián)(如每個抗體分子與約1-10個美登素分子偶聯(lián))。美登素可轉(zhuǎn)化成May-SS-Me,然后還原成May-SH3，并與修飾過的抗體反應(yīng)(Chari等，癌癥研究52:127-131(1992))產(chǎn)生美登木素生物堿-抗體偶聯(lián)物。另外，抗體可以與一或多個加利車霉素分子結(jié)合。加利車霉素家族的抗生素能在亞pM濃度水平產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂?？墒褂玫募永嚸顾亟Y(jié)構(gòu)類似物包括，但不限于y/、ex,oc31、N-乙?；?Yi1、psag以及61,(Hinman等，癌癥研究53:3336-3342(1993)和Lode等，癌癥研究58:2925-2928(1998)),這些文獻特別在此引入作為參考。可以應(yīng)用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結(jié)合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌)、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、a-帚曲毒素、油桐(j/e幼'^y/w"必)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(尸/^o/aca爿wen'ca"fl)蛋白(PAPI，PAPII，PAP-S)、苦瓜(momo^z'cac/wrawto)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草Oa/(20加n'fl0^c/"a/的抑制劑，白樹毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。參見例如1993年10月28日公開的W093/21232。本發(fā)明還涉及一種免疫偶聯(lián)物，其由抗體與具有核酸分解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶如脫氧核壽唐核酸酶；DNase)偶聯(lián)。多種放射性同位素可用于制備放射性偶聯(lián)的抗體，實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32以及Lu的放射性同位素?？贵w與細胞毒制劑的偶聯(lián)物可通過多種雙功能蛋白偶聯(lián)劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯(lián)劑如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二巰基)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨甲基)環(huán)己烷-l-羧酸酯，亞氨基硫醇(iminothiolane)(IT)，亞氨酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二曱基己二酸亞氨酯(dimethyladipimidateHCl)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde)),雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲?；?己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯曱酰基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2,6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，科學(xué)238:1098(1987)所述制備。C14標記的l-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯(lián)至抗體的偶聯(lián)劑之一。見W094/11026。這種接頭可能是有利于細胞毒藥物在細胞內(nèi)釋放的"可斷開的接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定型接頭，肽酶敏感型接頭，二曱基接頭或含二硫鍵的接頭(Chari等，癌癥研究52:127-131(1992))?；蛘?，可通過例如重組技術(shù)或肽合成來獲得含有抗體與細胞毒制劑的融合蛋白。在另一實施方案中，抗體可與腫瘤預(yù)靶向中應(yīng)用的"受體"(如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯(lián)，將該抗體-受體偶聯(lián)物給予患者，之后用清除劑除去循環(huán)中未結(jié)合的偶聯(lián)物，再給予已偶聯(lián)了細胞毒制劑(如放射性核苷酸)的"配體"(如抗生物素蛋白)。(viii)抗體依賴性酶介導(dǎo)的前體藥物治療(ADEPT)本發(fā)明的抗體還可與前體藥物活化酶相結(jié)合，然后用于ADEPT,所述活化酶可以將前體藥物(如肽基化療劑，見WO81/01145)轉(zhuǎn)化為活性抗癌藥物。見WO88/07378和美國專利4，975,278。這些用于ADEPT的偶聯(lián)物中的酶組分包括能作用于前體藥物使其轉(zhuǎn)化為活性更強的細胞毒形式的任何酶。本發(fā)明的方法中用到的酶包括，但不限于，能將含磷酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的堿性磷酸酶；可將含硫酸基的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的芳香基硫酸酯酶；將無毒的5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為抗癌藥物，5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；能將含肽的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的蛋白酶，如沙雷氏菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(如組織蛋白酶B和L)等；可轉(zhuǎn)化含D-氨基酸取代基的前體藥物的D-丙氨酰羧肽酶；能將糖基化前體藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的碳水化合物裂解酶類如P-半乳糖苷酶和神經(jīng)氨酸酶；能將P-內(nèi)酰胺衍生的藥物轉(zhuǎn)化為游離藥物的P-內(nèi)酰胺酶；能在藥物中的氨基氮處分別用苯氧乙?；虮揭阴；D(zhuǎn)化而使藥物游離的青霉素酰胺酶如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶?；蛘撸捎帽绢I(lǐng)域稱為"抗體酶"的具有酶活性的抗體，將本發(fā)明的前體藥物轉(zhuǎn)化為游離的活性藥物(見Massey,Nature328:457-458(1987))?？扇绫疚乃鲋苽淇贵w-抗體酶偶聯(lián)物以便將抗體酶運送至腫瘤細胞群。本發(fā)明的酶可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，如上述異源雙功能交聯(lián)試劑的使用而與抗體共價結(jié)合?；蛘撸梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的DNA重組技術(shù)(如Neuberger等，Nature,312:604-608(1984))構(gòu)建含至少本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合區(qū)的融合蛋白，所述抗體與本發(fā)明酶的至少一個功能活性部分連接。(ix)其它抗體修飾本文還涉及對抗體的其它修飾。例如，可以使抗體與一種非蛋白多聚物，如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯(polyoxyalkylene)、或聚乙二醇與聚丙二醇的共聚物交聯(lián)。還可將抗體包裹于微嚢中(可通過凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備，如分別制成羥曱基纖維素或明膠微嚢和聚-(曱基丙烯酸曱酯(methylmethacylate)微嚢))、膠體藥物傳遞系統(tǒng)(如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳膠、納米顆粒和納米膠嚢)中或巨乳膠(macroemulsions)中。這些技術(shù)見Remingtons，sPharmaceuticalSciences,16版，Oslo,A.,Ed.(1980)。本文公開的抗-ErbB2抗體還可配成免疫脂質(zhì)體。含抗體的脂質(zhì)體可通過本領(lǐng)i或已知方法制備,如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82:3688(1985);Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:4030(1980);美國專利4,485,045和4,544，545及1997年10月23日公開的W097/38731。在美國專利5，013，566中公開了循環(huán)時間已增加了的脂質(zhì)體。特別有用的脂質(zhì)體可利用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質(zhì)組合物經(jīng)反相蒸發(fā)法產(chǎn)生。脂質(zhì)體通過確定孔徑大小的濾膜擠壓可獲得具有所需直徑的脂質(zhì)體。本發(fā)明抗體的Fab，片段可如Martin等，生物學(xué)化學(xué)雜志，257:286-288(1982)所述，經(jīng)二硫化物交換反應(yīng)與脂質(zhì)體偶聯(lián)?？扇芜x在所述脂質(zhì)體中包含一種化療藥物。見Gabizon等，J.NationalCancerInst，81(19)1484(1989)。D.載體、宿主細胞和重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明還提供了分離的編碼本文公開的抗體的核酸、含所述核酸的載體和宿主細胞，以及制備所述抗體的重組技術(shù)。為了對抗體進行重組制備，分離其編碼核酸并插入到可復(fù)制載體中，來進一步克隆(DNA擴增)或表達。利用傳統(tǒng)方法(例如利用能與編碼單克隆抗體重鏈或輕鏈的基因特異性結(jié)合的探針)，可容易地分離并測序編碼所述抗體的DNA。許多載體可應(yīng)用。載體組分通常包括但不限于一個或多個下述組分信號序列，復(fù)制起始點，一個或多個標記基因，增強子元件，啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列。(i)信號序列組分本發(fā)明的多價抗體不僅可直接重組制備，而且還可制備成與異源多肽的融合多肽，優(yōu)選所述異源多肽為信號序列或在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特異性裂解位點的其它多肽。優(yōu)選的異源信號序列是被宿主細胞識別并加工(即通過信號肽酶裂解)的信號序列。對于不能識別并加工天然多價抗體信號序列的原核宿主細胞，用選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)區(qū)的原核信號序列取代所述信號序列。對于酵母分泌，可用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)區(qū)、OC因子前導(dǎo)區(qū)(包括糖酵母屬和克魯維酵母屬的OC因子前導(dǎo)區(qū))、酸性磷酸酶前導(dǎo)區(qū)、白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)區(qū)或WO90/13646中所述信號序列等取代上述天然信號序列。在哺乳動物細胞表達時，可使用哺乳動物信號序列以及如單純皰滲gD信號序列等病毒分泌前導(dǎo)區(qū)。將這些前導(dǎo)區(qū)DNA在閱讀框架內(nèi)與編碼多價抗體的DNA連接。(ii)復(fù)制起始點組分表達栽體和克隆栽體中均含有能使載體在一或多種所選宿主細胞中進行復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，此序列是能使載體獨立于宿主染色體DNA而進行復(fù)制的序列，它包括復(fù)制起始點或自主復(fù)制序列。在多種細菌、酵母和病毒中，這樣的序列眾所周知。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起始點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細菌，2)Li質(zhì)粒起始點適合于酵母，而各種病毒(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)復(fù)制起始點可用于哺乳動物細胞中的克隆載體。通常，哺乳動物表達載體不需要復(fù)制組分的復(fù)制起始點(只有SV40起始點常用，因為它含有早期啟動子)。(iii)篩選基因組分表達載體和克隆載體可包含篩選基因(也稱為可篩選標記)。典型的篩選基因編碼蛋白，該蛋白(a)提供對抗生素或其它毒素，如氨節(jié)青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四環(huán)素等的抗性，(b)彌補營養(yǎng)缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不能得到的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)，例如編碼芽孢桿菌屬D-丙氨酸消旋酶的基因。篩選方案的一個實例是利用藥物阻滯宿主細胞的生長。那些被異源基因成功轉(zhuǎn)化的細胞產(chǎn)生能賦予藥物抗性的蛋白，從而在篩選過程中存活。這樣的顯性篩選實例使用新霉素、霉酚酸和潮霉素藥物。另一種適于哺乳動物細胞的可篩選標記實例是那些能對可攝入多價抗體核酸的感受態(tài)細胞進行鑒定的標記，例如DHFR、胸苷激酶、金屬疏蛋白I和II(優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因)、腺普脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等等。例如，首先通過在含氨曱喋呤(Mtx)(DHFR的竟爭性拮抗劑)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所有轉(zhuǎn)化體，鑒定被DHFR篩選基因轉(zhuǎn)化的細胞。當使用野生型DHFR時，適當?shù)乃拗骷毎荄HFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系?；蛘?，通過在含抗可篩選標記的氨基糖苷抗生素(例如卡那霉素、新霉素或G418)等篩選藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞，可篩選用編碼多價抗體、野生型DHFR蛋白和另一個可篩選標記(如氨基糖苷3，-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH))的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細胞。見美國專利4965199。適用于酵母的適當篩選基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因(Stinchcomb等,Nature,282:39(1979))。trpl基因為不能在色氨酸中生長的酵母突變抹(例如ATCC44076或PEP4-1)提供了篩選標記。Jones,Genetics,85:12(1977)。酵母宿主細胞基因組中trp損傷的存在，為通過在無色氨酸的條件下的培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化進行檢測提供了有效的環(huán)境。同樣，Leu2缺陷的酵母林(ATCC20622或38626)被含有Leu2基因的已知質(zhì)粒彌補。另外，可將源自1.6jim環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母屬的酵母。另有關(guān)于用乳酸克魯維酵母大規(guī)模制備重組牛凝乳酶的表達系統(tǒng)的報道。VandenBerg.Bio/Technology,8:135(1990)。用于通過克魯維酵母工業(yè)菌抹分泌成熟的重組人血清白蛋白的穩(wěn)定型多拷貝表達載體也被發(fā)現(xiàn)。Fleer等，Bio/Technology9:968-975(1991)。(iv)啟動子組分表達栽體和克隆載體通常含有可被宿主生物識別并與多價抗體核酸可操作相連的啟動子。適合于在原核宿主中應(yīng)用的啟動子包括phoA啟動子，(3-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)，堿性磷酸酶，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子如tac啟動子。然而，其它已知的細菌啟動子也是適合的。用于細菌系統(tǒng)的啟動子還含有SWne-Dalgamo(S.D.)序列，它與編碼多價抗體的DNA可操作連接。用于真核生物的啟動子序列是已知的。幾乎所有的真核基因在轉(zhuǎn)錄起始位點上游約25-30個石威基處具有一個富含AT的區(qū)域。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始點上游70-80個堿基處發(fā)現(xiàn)的另一個序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'末端是AATAAA序列，它是用于在'編碼序列3'末端添加polyA尾的信號。所有這些序列均被適當?shù)夭迦氲秸婧吮磉_載體o適于在酵母宿主中應(yīng)用的啟動序列實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，例如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。其它的酵母啟動子，即那些能通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子,是下述基因的啟動子區(qū)，即乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73657中進一步敘述了用于酵母表達系統(tǒng)的適當栽體和啟動子。酵母增強子與酵母啟動子一起使用更有利。在哺乳動物宿主細胞中，由載體轉(zhuǎn)錄多價抗體可受下述啟動子調(diào)控，所述啟動子來自病毒基因組(如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，最優(yōu)選猴病毒40(SV40))啟動子，或來自肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子等異源哺乳動物啟動子，或來自熱休克啟動子，只要這些啟動子與宿主細月包系統(tǒng)相容。SV40病毒的早期和晚期啟動子可方便地以SV40限制性片段的形式獲得，它還包括SV40病毒的復(fù)制起始點。人巨細胞病毒的即刻早期啟動子方便地以HindIIIE限制性片段的形式獲得。在美國專利4419446中公開了在哺乳動物宿主中用牛乳頭瘤病毒作為載體的表達系統(tǒng)。在美國專利4601978中敘述了對這個系統(tǒng)改進。另見Reyes等，Nature297:598-601(1982)中關(guān)于在單純皰滲病毒胸苦激酶啟動子控制下在小鼠細胞中表達人P干擾素cDNA?；蛘?，勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)序列可作為啟動子使用。(v)增強子元件組分在載體中插入增強子序列通?？稍黾泳幋a本發(fā)明多價抗體的DNA在高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)知道很多哺乳動物基因(珠蛋白，彈性蛋白酶、白蛋白、a胎蛋白和胰島素)的增強子序列。然而人們通常使用真核細胞病毒的增強子。實例包括在其復(fù)制起始點晚期側(cè)的SV40增強子(bp100-270),巨細胞病毒早期啟動子增強子，在其復(fù)制起始點晚期側(cè)的多瘤增強子，和腺病毒增強子。另見Yaniv,Nature297:17-18(1982)中所述的用于活化真核啟動子的增強元件。所述增強子可以剪接入多價抗體編碼序列的5，或3，端，但優(yōu)選位于啟動子的5'端。(vi)轉(zhuǎn)錄終止組分用于真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細胞生物的有核細胞)的表達載體，還包括對轉(zhuǎn)錄終止和穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)所必須的序列。這些序列通常來自真核或病毒DNA或cDNA的5，(偶爾為3，)非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含核苦酸片段，其轉(zhuǎn)錄為編碼多價抗體的mRNA的非翻譯區(qū)中的聚腺苷酸化片段。一種有效的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長激素聚!^苦酸區(qū)。見WO94/11026及其所公開的表達載體。(vii)宿主細胞的篩選和轉(zhuǎn)化用于克隆或表達本發(fā)明載體中DNA的合適的宿主細胞是上述原核細胞、酵母或高等真核細胞。用于此目的的適合的原核細胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細菌等真細菌，如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的埃希菌屬(例如大腸桿菌)、腸桿菌屬、歐文菌屬、克雷白菌屬、變形菌桿屬、沙門菌屬(例如鼠傷寒沙門菌)、沙雷菌屬(粘質(zhì)沙雷菌)和志賀菌屬等，以及芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌(例如1989年4月12日出版的DD266710中所述地衣芽孢桿菌41P)等，假單胞菌屬的銅綠菌假單胞菌，及鏈霉菌。優(yōu)選大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31446),盡管大腸桿菌B、大腸桿菌X177(ATCC31537)和大腸桿菌W3110(ATCC27325)等其它菌抹也適合。這些實例是用于說明而不是限制于此。除了原核生物，絲狀真菌或酵母等真核微生物也是適于使編碼多價抗體的載體克隆或表達的宿主。釀酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最為常用。然而，多種其它屬、種和林也是可公開得到的并可用于本發(fā)明，例如粟酒裂殖酵母；克魯維酵母屬，例如乳酸克魯維酵母(L/flc&)、脆壁克魯維酵母(尺Zrag仏》(ATCC12424)、保加利亞克魯維酵母(Hw/gan'cw力(ATCC16045)、威克曼氏克魯維酵母(尺.H7'cteram/1)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC56500)、果蠅克魯維酵母(兀.G^w印/"7flnm2)(ATCC36906)、耐熱克魯維酵母(《.AwmoM/era;w)和馬克斯克魯維酵母C^.marw'cm^)等；yarrowia(EP402226);巴斯德畢赤酵母(p/c/"Vz;aWon力(EP183070);念珠菌屬；7hV^o^nmwe^(EP244234);粗糙鏈孢霉；許旺氏酵母屬(scAvwmm'om;yce5)^口西方"i午旺氏酵母(sc/wa"m'om^cesocc/de"tofo)等；和絲狀真菌，例如鏈孢霉屬、青霉屬、Tolypocladium以及曲霉屬如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉等。用于表達糖基化多價抗體的適合宿主細胞來自多細胞生物。無脊推動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經(jīng)從下述宿主中鑒定了大量的桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)的容許型昆蟲宿主細胞，所述宿主包括草地夜蛾(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白玟伊蚊(蚊子)、Drosophilamelanogaster(果蠅)和家蠶蛾等。用于轉(zhuǎn)染的各種病毒抹可以公開地獲得，例如加利福尼亞Y級夜蛾(autographacalifomia)NPV的L-l變體和家蠶蛾NPV的Bm-5抹，并且這些病毒可以在此用作為根據(jù)本發(fā)明的病毒，尤其是用于草地夜蛾細胞的轉(zhuǎn)化。棉花、玉米、土豆、大豆、牽?；ā⑽骷t柿和煙草的植物細胞培養(yǎng)物也可以用作宿主。然而，關(guān)注最多的是脊推動物細胞，而且在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中繁殖脊推動物細胞已經(jīng)成為常M^方法。有效哺乳動物宿主細胞的實例是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎細胞系(293細胞或亞克隆培養(yǎng)成懸浮培養(yǎng)液的293細胞，Graham等，普通病毒雜志(J.GenVirol.)36:59(1977));幼倉鼠腎細胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細胞ADHFR(CHO,Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77:4216(1980》；小鼠足細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細胞(CVlATCCCCL70);非洲綠猴腎細胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細胞(MDCKATCCCCL34);布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細胞(W138,ATCCCCL75);人肝細胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCCCCL51);TRI細胞(Mather等，紐約科學(xué)院年鑒(AnnalsN,YAcad,Sci.)383:44-68(1982));MRC5細胞；FS4細胞；和人肝細胞癌細胞系(HepG2);以及骨髓瘤或淋巴瘤細胞(如Y0、J558L、P3和NSO細胞)(參見美國專利5807715)。宿主細胞用上述用于多價抗體制備的表達或克隆栽體轉(zhuǎn)化，并在改進型傳統(tǒng)營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基經(jīng)改進已適于誘導(dǎo)啟動子、篩選轉(zhuǎn)化體或擴增編碼所需序列的基因。(viii)培養(yǎng)宿主細胞用于制備本發(fā)明多價抗體的宿主細胞可在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。市售培養(yǎng)基如Ham'sF10(Sigma)、最小基本培養(yǎng)基((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良型Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM),Sigma)均適合于培養(yǎng)所述宿主細胞。另外，在Ham等，酶學(xué)方法58:44(1979);Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980);美國專利4767704、4657866、4927762、4560655或5122469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利Re.30985中所述任何培養(yǎng)基可作為所述宿主細胞的培養(yǎng)基。任何所述培養(yǎng)基可在需要時補充激素和/或其它生長因子(例如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉，鈣，鎂，和磷酸鹽)、緩沖液(例如HEPES),核苷酸(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCIN)、痕量元素(定義為通常以微摩爾級終濃度出現(xiàn)的無機化合物)、葡萄糖或一種等價能源。還包括任何其它必須補充物，其相應(yīng)濃度為本領(lǐng)域已知。培養(yǎng)條件如溫度、pH等是現(xiàn)有技術(shù)中應(yīng)用于表達型宿主細胞的那些，本領(lǐng)域技術(shù)人員對此很熟悉。(ix)純化當使用重組技術(shù)時，多價抗體可以在細胞內(nèi)周質(zhì)空間中產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。如果所述多價抗體在細胞內(nèi)產(chǎn)生，第一步通過離心或超濾除去顆粒狀碎片，即宿主細胞或其裂解片段。Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992)中敘述了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的抗體的方法。筒言之，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的條件下融解細胞團超過約30分鐘。通過離心可以將細胞碎片除去。在多價抗體分泌到培養(yǎng)基的情況中，通常首先用市售的蛋白濃縮濾膜(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單位)濃縮此類表達系統(tǒng)的上清。在任何上述步驟中可以包括抑制蛋白裂解的PMSF等蛋白酶抑制劑，并且可以包括抑制外來污染物生長的抗生素。從所述細胞中制備的多價抗體組合物可利用例如羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析等方法純化，優(yōu)選親和層析。蛋白A作為親和配體的適合性取決于該多價抗體上任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純化基于人Y1、Y2或Y4重鏈的抗體(Lindmark等，免疫學(xué)方法雜志，62:l-13(1983))。蛋白G被建議用于所有的小鼠同種型和人y3(Guss等，EMBOJ.5:1567-1575(1986))。與親和配體結(jié)合的基質(zhì)最常用瓊脂糖，但也可利用其它基質(zhì)。具有機械穩(wěn)定性的基質(zhì)如控制孔徑的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比瓊脂糖允許更快的流速且耗時更短。在所述多"f介抗體包括CH3結(jié)構(gòu)域的情況中，BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker,PhilliPBSurg,NJ)有利于純化。根據(jù)待回收的抗體，還可以應(yīng)用其它蛋白純化技術(shù)，例如在離子交換柱上的分級分離、乙醇沉淀、反向HPLC、硅層析、在陽離子或陰離子交換樹脂層析(例如聚天冬氨酸柱)上進行的肝素SEPHAROSE層析、聚焦層析、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀。E.藥物制劑根據(jù)本發(fā)明使用的多價抗體的藥用制劑通過將具有所需純度的多價抗體與任選的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(雷氏藥學(xué)(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版，Osol，A.編(1980))混合而制備，然后以凍干劑或含水劑的形式保存。可藥用載體、賦形劑、穩(wěn)定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，并包括緩沖劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二曱基千基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化千烷銨(benzalkoniumchloride),苯索氯4妄；酚、丁醇或苯曱醇；烷基對羥基苯曱酸酯如曱基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；間曱酚)；低分子量多肽(少于IO個殘基)；蛋白質(zhì)如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA;糖類如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬復(fù)合物(例如鋅-蛋白復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑如吐溫w,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。所述制劑還可根據(jù)所治療的具體情況而包含一種以上活性成分，優(yōu)選具有互補活性但相互無負面影響的那些。在下述標題為"多價抗體體內(nèi)應(yīng)用，，的G部分，給出了活性化合物結(jié)合實例。這些分子以對所需目有效的總量在組合中適當?shù)卮嬖??；钚猿煞忠部扇菁{在通過凝聚技術(shù)或界面聚合作用制備的微膠嚢中，如分別在膠體性質(zhì)的藥物運送系統(tǒng)(如脂質(zhì)體，白蛋白小球體，微乳劑，納米顆粒及納米膠嚢)或大乳劑(macroemulsions)的羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(異丁烯酸甲酯)微膠嚢。這些技術(shù)見雷氏藥學(xué)，第16版Oso1,A.編(腦)。用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這可以通過除菌濾膜過濾而輕易實現(xiàn)。也可制備控釋制劑。控釋制劑的適當實例包括含有抗體的固態(tài)疏水聚合物的半通透性基質(zhì)，所述基質(zhì)為具有一定形狀的制品，如膜或微膠嚢。控釋制劑實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3,773,919)、L-谷氨酸與Y乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如LUPRONDEPOT(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。盡管聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續(xù)釋放分子100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。當膠嚢化的抗體長時間停留在體內(nèi)時，它們會由于暴露在37'C水分下而變性或凝聚，從而導(dǎo)致生物活性損失，且免疫原性可能會改變?？梢愿鶕?jù)涉及的機理來設(shè)計穩(wěn)定化的合理策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成了分子間S-SH則可通過修飾巰基殘基、自酸性溶液中凍干、控制濕度程度、采用合適的添加劑和開發(fā)特殊的聚合物基質(zhì)組合物來達到穩(wěn)定化。F.多^f介抗體的非-治療應(yīng)用本發(fā)明多價抗體可用作親和純化試劑。在這個過程中，可利用本領(lǐng)域已知技術(shù)將多價抗體固定在Sephadex樹脂或濾紙等固相上。使固相化的多價抗體與要純化的包含抗原(或其片段)的樣品接觸，之后用適當溶劑洗滌支持相，使得基本除去樣品中除了與固相化多價抗體結(jié)合的抗原之外的所有其它物質(zhì)。最后，用另一種適當溶液(例如甘氨酸緩沖液，pH5.0)洗滌支持—相，使抗原從多價抗體中釋放。多價抗體也可用于診斷檢測，例如檢測相關(guān)抗原在特異性細胞、組織或血清中的表達。對于it斷性應(yīng)用，通常用可^r測的組分標記抗體。多種標記物可用，它們總體上分為下述幾類(a)放射性同位素，例如"S、14C、1251、311和1311。利用例如在免疫學(xué)最新方案(CurrentProtocolsinImmunology),巻1和2,Coligen等編,Wiley-interscience，紐約，NewYorkPubs.(1991)中所述方法，用放射性同位素對所述抗體進行標記，并且可以利用閃爍計數(shù)器檢測放射活性。(b)可以應(yīng)用熒光標記，例如稀土元素螯合物(銪螯合物)或熒光素及其衍生物，例如羅丹明及其衍生物、丹磺酰、麗絲胺、藻紅蛋白和得克薩斯紅?？梢岳美缭贑urrentProtocolsinImmunology(出處同上)中所述技術(shù)，將所述熒光標記物與所述抗體連接。利用焚光計定量焚光。(c)可以應(yīng)用各種酶-底物標記，在美國專利號4275149中提供了對其中一些的綜述。所述酶通常催化生色底物的化學(xué)變化，可以利用各種技術(shù)測定這些變化。例如，所述酶可以催化底物的顏色變化，其可以被分光光度計所檢測?；蛘?，所述酶可以改變底物的焚光或化學(xué)發(fā)光。用于定量熒光改變的技術(shù)見上面的敘述。化學(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)激發(fā)電子，然后發(fā)出可以被檢測(例如，用化學(xué)發(fā)光儀)或給焚光受體提供能量的光。酶標記的實例包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶或細菌螢光素酶，美國專利號4737456)、螢光素、2，3-二氬二氮雜萘二酮、蘋果酸酯脫氫酶、脲酶、辣根過氧化物酶(HRPO)等過氧化物酶、堿性磷酸酶、P半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氬酶)、雜環(huán)氧化酶(例如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物酶、微過氧化物酶等。在O，Sullivan等，制備酶免疫測定所用酶-抗體偶聯(lián)物的方法,酶學(xué)方法，(J丄angone和H.VanVunakis編)，Academicpress,紐約,73:147-166(1981)中敘述了將酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)。酶-底物組合的實例包括(i)辣4艮過氧化物酶(HRPO)以氫過氧化物酶為其底物，由氬過氧化物酶氧化染料前體(例如鄰苯二胺(OPD)或3,3，，5,5，-四甲基聯(lián)苯胺氫氯化物(TMB));(ii)堿性磷酸酶(AP)，以對硝基苯磷酸鹽為生色底物；和(iii)(3-D-半乳糖苷酶((3-D-Gal)，有生色底物(例如對硝基苯-P-D-半乳糖苦酶)或發(fā)熒光底物4-甲基傘形基(1111*61^6171)-P-D-半乳糖苷酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以應(yīng)用其它多種酶-底物組合。其綜述見美國專利號4275149和4318980。有時，標記物與多價抗體間接連接。技術(shù)人員知道用于此的各種技術(shù)。例如，可使多價抗體與生物素偶聯(lián)，并使上述三類標記物之任一與抗生物素蛋白結(jié)合，反之亦然。生物素與抗生物素蛋白選擇性結(jié)合，使標記物能以這種方式間接與多價抗體相偶聯(lián)。或者，為使標記物與多價抗體間接連接，將多價抗體與小分子半抗原(例如地高辛)偶聯(lián)，并將上述不同類型標記物之一與抗半抗原多價抗體(例如抗地高辛抗體)偶聯(lián)。如此可實現(xiàn)標記物與多價抗體的間接偶聯(lián)。在本發(fā)明另一實施方案中，多價抗體不需要標記，其存在可利用與該多價抗體結(jié)合的標記抗體檢測。本發(fā)明多價抗體可用于任何已知的試驗方法，如竟爭結(jié)合試驗、直接和間接夾心試驗以及免疫沉淀試驗。Zola，單克隆抗體汰術(shù)指南，147-158頁(CRCPress,Inc.1987)。所述多價抗體還可以用于體內(nèi)診斷試驗。通常用放射性核素(例如mIn、"Tc、4C、mI、125I、3H、"P或"S)標記所述抗體，以便該抗原或其表達細胞可利用免疫閃爍成像術(shù)定位。G.多價抗體的體內(nèi)應(yīng)用已經(jīng)考慮到將本發(fā)明多價抗體用于治療患有疾病或病征或者有患病傾向的能夠從施用多價抗體中受益的哺乳動物如患者。當抗體與ErbB受體如HER2結(jié)合時，被治療病征的實例包括良性或惡性腫瘤；白血病和淋巴的惡性疾??；其它疾病，如神經(jīng)細胞、神經(jīng)月交質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、下丘腦、腺體、巨噬細胞、上皮、基質(zhì)、嚢胚腔、炎癥性、血管生成性和免疫性的疾病。通常，用將與ErbB受體結(jié)合的抗體治療的疾病或病癥是癌癥。本文中，所治癌癥的實例包括但不限于癌(carcinoma)、'淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴的惡性病。這些癌的更具體實例包括鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(livercancer)、前列腺癌、外陰癌、曱狀&泉癌，肝癌(hepaticcarcinoma)以及頭頸癌。所述癌癥通常含有表達被抗體結(jié)合的抗原的細胞，從而使所述抗體能與癌結(jié)合。在一個實施方案中，癌以過度表達抗原(例如ErbB受體)為特征。為檢測由癌過度表達的抗原，可使用各種診斷/預(yù)測測定手段。在一實施方案中，抗原是HER2時，通過IHC(例如利用HERCEPTEST(Dako))檢測抗原過度表達。在HER2IHC檢測中，可對腫瘤活檢的石蠟包埋組織切片進4亍IHC檢測，記錄HER2蛋白染色強度的標準如下分值0沒有觀察到染色，或在少于10%的腫瘤細胞中觀察到膜染色。分值1+在多于10%的腫瘤細胞中檢測到微弱/勉強看得見的膜染色。所述細胞僅有膜的一部分被染色。分值2+在多于10%的腫瘤細胞中觀察到從弱到中等強度的完全膜染色。分值3+在多于10%的腫瘤細胞中觀察到從中度到強的完全膜染色。那些HER2過度表達評估分值為0或1+的肺瘤并不以過度表達HER2為特征，而那些分值為2+或3+的腫瘤以過度表達HER2為特征。或者(或另外)，可在甲醛固定且石蠟包埋的腫瘤組織上進行例如INFORM頂(購自Ventana，Arizona)或PATHVISION(Vysis,imnois)等FISH檢測，以測定腫瘤中抗原過度表達的程度(如果有的話)。在一個實施方案中，所述癌癥是表達(并且可能過度表達)選自EGFR、ErbB3和ErbB4之一ErbB受體的癌?？杀磉_/過度表達EGFR、ErbB3和ErbB4的癌的實例包括鱗狀細胞癌，肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌和肺鱗癌)，腹膜癌，肝細胞癌，胃癌(包括胃腸癌)，胰腺癌，成膠質(zhì)細胞瘤，宮頸癌，卵巢癌，肝癌(livercancer),膀胱癌，肝細胞瘤，乳腺癌，結(jié)腸癌，結(jié)直腸癌，子宮內(nèi)膜或子宮癌，唾液腺癌，腎癌，肝癌(livercancer)前列腺癌，夕卜陰癌，甲狀腺癌，肝癌(hepaticcarcinoma)以及頭頸癌和成膠質(zhì)細月包瘤。本文中所治療的癌可以是以ErbB受體(例如EGFR)的過度活化為特點的癌。此過度活化的原因可能是ErbB受體或ErbB配體的過度表達或產(chǎn)量增加。在本發(fā)明的一個實施方案中，進行診斷性或預(yù)后性檢測，以確定患者的癌是否是以ErbB受體過度活化為特點。例如，可檢測所述癌癥中ErbB基因的擴增和/或ErbB受體的過度表達?？蓽y定這種擴增/過度表達的各種試驗為本領(lǐng)域現(xiàn)有，包括IHC、FISH和上述脫落抗原試驗?；蛘?或另外)，可根據(jù)已知方法檢測腫瘤中的或與腫瘤相關(guān)的TGF-cc等ErbB配體的水平。這些試驗可檢測待檢樣品中的蛋白或其編碼核酸。在一個實施方案中，利用免疫組化法(IHC)可檢測腫瘤中ErbB配體的水平；見例如Scher等，臨床癌癥研究1:545-550(1995)?；蛘?或另外)，可通過例如FISH、southern印跡或PCR技術(shù)等評估待檢樣品中編碼ErbB配體的核酸的水平。而且，ErbB受體或ErbB配體的過度表達或擴增可利用體內(nèi)診斷試驗評估，如施用能與待檢分子結(jié)合并帶有可檢測標記(如放射性同位素)的分子(如抗體)，并從外部對患者進行掃描以定位該標記。當抗體與B細胞表面抗原結(jié)合時，抗體可用于治療B細胞淋巴瘤(包括低程度/濾泡性非-何杰金氏淋巴瘤(NHL);小淋巴細胞(SL)NHL;中等程度/濾泡性NHL;中等程度彌散性NHL;高程度免疫母細胞性NHL;高程度成淋巴細胞性NHL;高程度小非-分裂細胞(non-cleavedcell)NHL;bulky疾病NHL;外膜(mantle)細胞淋巴瘤；AIDS-相關(guān)淋巴瘤；以及Waldenstrom's巨球蛋白血癥；慢性淋巴細胞性白血病(CLL);急性淋巴細胞性白血病(ALL);毛細胞白血?。缓吐运枘讣毎园籽。灰约耙撇胖焙?淋巴增生病癥(PTLD)?？贵w，如抗-B細胞表面抗原抗體，也可用于治療自身免疫性疾病。自身免疫性疾病或病癥的實例包括但不限于炎癥性反應(yīng)如炎癥性皮膚疾病，包括牛皮褲和皮炎(如特異性皮炎)；系統(tǒng)性硬皮病和硬化癥；與炎性腸道疾病有關(guān)的反應(yīng)(如克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎)；呼吸窘迫綜合征(包括成年呼吸窘迫綜合征；ARDS);皮炎；腦膜炎；腦炎；眼色素層炎；結(jié)腸炎；腎小球腎炎；變應(yīng)性狀況，如濕滲和哞喘以及涉及T細胞浸潤與慢性炎癥性反應(yīng)的其它病癥；動脈粥樣硬化；免疫粘附缺陷；類風濕性關(guān)節(jié)炎；系統(tǒng)性紅斑狼療(SLE);糖尿病(如I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病)；多發(fā)性硬化；雷諾氏綜合征；自身免疫性曱狀腺炎；變應(yīng)性腦脊膜炎；Sjorgen's綜合征；青少年糖尿??；和由細胞因子和T淋巴細胞介導(dǎo)的與急性和遲發(fā)型超敏反應(yīng)有關(guān)的免疫反應(yīng)，通常見于肺結(jié)核、類肉瘤病、多肌炎、肉芽腫病和結(jié)節(jié)性脈管炎；惡性貧血(阿狄森氏病)；涉及白細胞滲出的疾??；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷沉淀球蛋白血癥或Coombs試驗陽性貧血)；重癥肌無力；抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾?。豢?腎小球基膜疾??；抗磷脂綜合征；變應(yīng)性神經(jīng)炎;格雷夫斯病;Lambert-Eaton月幾無力綜合征；大皰性天皰瘡；天皰瘡；自身免疫性多內(nèi)分泌腺??；萊特爾氏??；強直-人綜合征；貝切特氏?。痪藜毎詣用}炎；免疫復(fù)合物性腎炎；IgA腎??；IgM多神經(jīng)??；特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板減少癥等?？笲細胞表面抗原的抗體也可用于阻斷對外來抗原的免.疫應(yīng)答。本文的"外來抗原"，是指對于接觸之的哺乳動物而言不是內(nèi)源性或天然的分子。外來抗原可引發(fā)免疫應(yīng)答，如在哺乳動物中體液和/或T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。通常，外來抗原將誘導(dǎo)抗所述抗原的抗體產(chǎn)生。本文考慮到的外來抗原的實例包括免疫原性治療劑，例如蛋白如抗體，特別是含有非-人氨基酸殘基的抗體(如嚙齒類動物、嵌合人源化抗體和靈長化抗體)；毒素(任選地與靶向分子如抗體偶合，其中靶向分子也可以是免疫原性的)；基因治療病毒載體,如逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒；移植物；傳染性物質(zhì)(如細菌和病毒)；同種抗原(即在某些成員中存在而在同一物種的其他成員中卻不存在的抗原)，例如在血型、人淋巴細胞抗原(HLA)、血小板抗原、在移植器官上表達的抗原、血液成分、妊娠(Rh;)以及血友病因子(如因子VIII和因子IX)方面的差異?？?B細胞表面抗原的抗體也用于使待移植的哺乳動物脫敏?？筎NF受體超家族的受體的抗體，可用于激活或刺激癌細胞的凋亡。在某些實施方案中，將包括與細胞毒制劑偶聯(lián)的多價抗體的免疫偶聯(lián)物施用于患者。優(yōu)選所述免疫偶聯(lián)物和/或與它結(jié)合的抗原被細胞內(nèi)化(internalize),導(dǎo)致在殺傷與它結(jié)合的癌細胞時增加免疫偶聯(lián)物的治療效果。在優(yōu)選的實施方案中，細胞毒制劑在癌細胞中靶向或干擾核酸。此細胞毒制劑的實例包括本文公開的化療劑(如美登素、加利車霉素)、放射性同位素、或者核糖核酸酶或DNA內(nèi)切核酸酶。如上所述，多價抗體也可用于ADEPT。本申請考慮到了將多價抗體(或其免疫偶聯(lián)物)與一種或多種其它治療劑尤其是腫瘤治療劑聯(lián)合使用。舉例來說，多價抗體可以與另一多價抗體(或另外多個多價抗體)、單價抗體或二價抗體、化療劑(包括化療劑的混合物)、其它細胞毒制劑、抗-血管生成劑、細胞因子和/或生長抑制劑共同給藥。當多價抗體誘導(dǎo)細胞凋亡時，則特別期望多價抗體與一種或更多種也誘導(dǎo)細胞凋亡的其它治療劑聯(lián)合。舉例來說，抗B細胞表面抗原的前-凋亡抗體(如二價或多價抗體)(如RITUXAN、ZEVALIN或BEXXAR抗-CD20抗體)可以與下列抗體聯(lián)合(1)前-凋亡抗體(如抗TNF受體超家族受體的二價或多價抗體，如抗-DR4或抗-DR5抗體)，或(2)細胞因子TNF家族的細胞因子(如Apo2L)。同樣地，抗-ErbB抗體(如HERCEPTIN抗-HER2抗體)可以與(l)和/或(2)聯(lián)合?；蛘?，或另外，患者可接受聯(lián)合的放射治療(如外源光束照射或用放射活性標記試劑如抗體治療)。上述這種聯(lián)合治療包括聯(lián)合給藥(此時兩種或多種試劑包含在同一制劑或者獨立制劑中)和分隔給藥，在后一情況下，多價抗體可在施用輔助治療之前和/或之后施用。可用任何適當?shù)姆椒ㄊ┯枚鄡r抗體(和輔助治療劑)，方法包括非腸道、皮下、腹膜內(nèi)、肺內(nèi)和鼻內(nèi)給藥，如果需要局部治療的話，則可創(chuàng)面內(nèi)給藥。非腸道輸注包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給藥。另外，多價抗體適宜經(jīng)脈沖輸注給藥，特別是使用遞減劑量的多價抗體時。部分取決于藥物是短暫還是長期(慢性)施用，優(yōu)選經(jīng)注射給藥，最優(yōu)選靜脈或皮下注射給藥。除了向患者施用抗體蛋白外，本申請考慮了通過基因治療而給予抗體。編碼抗體的核酸的這種給藥方式包含在術(shù)語"施用治療有效量的抗體，，中。見例如1996年3月14日公布的WO96/07321,其中涉及利用基因治療來產(chǎn)生細胞內(nèi)抗體。有兩種主要途徑使所述核酸(任選包含在載體中)進入患者的細胞中體內(nèi)和回體(e;cv/vo)。在體內(nèi)運輸中，直接向患者注射所述核酸，通常在需要所述抗體的部位注射。在回體治療中，取出患者的細胞，將核酸導(dǎo)入這些離體的細胞中，然后將改良的細胞直接回輸給患者或?qū)⑵浒辉诙嗫啄ぶ幸浦仓粱颊唧w內(nèi)(見例如美國專利4892538和5283187)。有許多技術(shù)可用于將核酸引入活細胞中。根據(jù)所述核酸是在體外轉(zhuǎn)移入培斧細胞中，還是在體內(nèi)轉(zhuǎn)移入目的宿主細胞中，所應(yīng)用的技術(shù)不同。適于在體外將核酸轉(zhuǎn)移入哺乳動物細胞中的技術(shù)包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸釣沉淀法等。基因的回體傳遞常用的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒。目前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括用病毒載體(例如腺病毒、單純皰滲病毒I型或腺伴隨病毒)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)(用于脂質(zhì)介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的有用的脂質(zhì)是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)進行轉(zhuǎn)染。在一些情況中，需要提供核酸來源，及靶向靶細胞的藥劑，例如對細胞表面膜蛋白或靶細胞具有特異性的抗體、靶細胞上受體的配體等等。在使用脂質(zhì)體的情況中，與內(nèi)吞作用相關(guān)的表面膜蛋白結(jié)合的蛋白可用于靶向和/或促進攝取，例如對特殊細胞類型具有定向性的衣殼蛋白或其片段，在循環(huán)中進行內(nèi)化的蛋白的抗體，耙向細胞內(nèi)部位并延長細胞內(nèi)半衰期的蛋白。受體介導(dǎo)的胞吞作用的技術(shù)參見Wu等，生物學(xué)化學(xué)雜志262:4429-4432(1987);Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:3410-3414(1990)。關(guān)于目前已知的基因標記和基因治療方案的綜述見Anderson等，Nature256:8Q8-813(1992)。另見W093/25673,該文獻在此引入作為參考。、-為了預(yù)防或治療疾病，多價抗體的適當劑量取決于所治疾病的類型(如上所述)、疾病的嚴重程度和進程、多價抗體給藥的目的是預(yù)防還是治療、先前的治療、患者的臨床病史和對多價抗體的應(yīng)答、以及主治醫(yī)生的判斷?？贵w可一次或分多次向患者給藥。取決于疾病的類型或嚴重程度，無論是例如一次或多次分別給藥，還是連續(xù)輸注給藥，向患者施用的起始候選劑量是約1lig/kg-15mg/kg(例如0.1-20mg/kg)抗體。取決于上述因素，典型的日給藥劑量范圍是從l]ig/kg到100mg/kg或更多。重復(fù)給藥數(shù)天或更長時間時，視具體情況而將治療持續(xù)至出現(xiàn)對疾病癥狀的所需抑制為止。但其它劑量方案也有效。此治療的進展可通過傳統(tǒng)的技術(shù)和檢測容易地監(jiān)控。按照與良好醫(yī)療實踐一致的方式制備、分配劑量和施用多價抗體組合物。本文中要考慮的因素包括接受治療的具體病癥、接受治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、病征發(fā)生的原因、藥劑釋放的部位、給藥方法、給藥時程表和醫(yī)療實踐者所熟知的其它因素。要施用的多價抗體的"治療有效量"受此考慮控制，并且是預(yù)防、緩解或者治療疾病或病癥所必要的最小劑量。多價抗體并不必需，但任選地，與一種或更多種用于預(yù)防或治療相關(guān)病征的試劑配制在一起。此其它試劑的有效量，取決于制劑中多價抗體的含量、病癥或治療的類型以及上述討論的其它因素。這些試劑一般使用其此前所用相同劑量并按照此前相同給藥途徑施用或者使用此前所用劑量的約1~99%.。H.制品在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供了含用于治療上述病癥的物質(zhì)的制品。所述制品包括一個容器和位于該容器表面的或與該容器相關(guān)的標簽或包裝插頁。適當?shù)娜萜饔衅孔樱∑浚⑸淦鞯?。容器可由各種材料如玻璃或塑料制成。該容器可內(nèi)含一種能有效治療目標疾病的組合物，并具有無菌存取口(例如該容器可以是靜脈溶液袋或帶有能通過皮下注射針穿刺的塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性藥劑是多價抗體。所述標簽或包裝插頁說明所述組合物可用于治療指定的疾病(例如癌)。而且，所述制品可包括(a)其中裝有組合物的第一個容器，所述組合物含有多價抗體；和(b)其中裝有組合物的第二個容器，所述組合物含有其它細胞毒制劑。本發(fā)明的此實施方案中的制品可進一步包括包裝插頁，其說明第一和第二抗體組合物可用于治療癌癥?；蛘?或另外)，所述制品可進一步包括第二個(或第三個)容器，其中含可藥用的緩沖液，例如用于注射的抑細菌水(BWFI),磷酸鹽緩沖液，Ringer's溶液和葡萄糖溶液。還可進一步包括具有商業(yè)需要以及符合用戶需要的其它材料，如其它緩沖液、稀釋劑，濾器，針頭和注射器。I.材料保藏下述雜交瘤細胞已保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA20110-2209，美國(ATCC):抗體命名ATCC編號保藏日7C2(抗畫HER2)ATCCHB-122151996年10月17日7F3(抗-HER2)ATCCHB-122161996年10月17曰4D5(抗-HER2)ATCCCRL104631990年5月24曰2C4(抗-HER2)ATCCHB-126971999年4月8日3F11.39.7(抗-DR5)HB-124561998年1月13日3H3.14.5(抗-DR5)HB-125341998年6月2曰3D5.1,10(抗-DR5)HB-125361998年6月2日3H1.18.10(抗-DR5)HB-125351998年6月2日4E7.24.3(抗-DR4)HB-124541998年1月13日4H6.17.8(抗-DR4)HB-124551998年1月13曰下述實施例只是為了描述的目的而提供，并非旨在以任何方式限定本發(fā)明的保護范圍。本說明書中引證的所有專利和參考文獻，以其全部在此引入作為參考。實施例1構(gòu)建多價抗體本文圖5描述了用于產(chǎn)生四價抗-HER2抗體，稱為"章魚抗體"(OctHER2)的構(gòu)建體。此章魚抗體的骨架是重組、人源化單克隆抗體4D5變體8(rhuMAb4D5-8)(美國專利5,821,337，Carter等,特別在此引入作為參考)。將rhuMAb4D5-8的重鏈亞克隆入pRK5載體中(1989年3月15曰公布的EP307，247)。通過誘變除去重鏈的VH-CH1區(qū)，并插入3個唯一的限制性酶切位點(BamHl;Nhel;BspEl)。將這些位點引入為擴增來源于不同抗體的VH-CH1區(qū)而設(shè)計的PCR引物。產(chǎn)生的片段亞克隆入載體而產(chǎn)生章魚重鏈。pRK5載體中的章魚重鏈與適宜輕鏈在轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞中共表達，產(chǎn)生完全的章魚抗體(圖4)。對包含插在串聯(lián)Fd區(qū)之間的柔性接頭的章魚構(gòu)建體也進行了基因工程改造。通過誘變，編碼"gly-ser"(柔性接頭l)或"gly-ser-gly-ser"(SEQIDNO:IO)(柔性接頭2)的DNA插在編碼重鏈VH-CH1區(qū)的DNA之間。實施例2評價抗-HER2章魚抗體OctHER2在瞬時轉(zhuǎn)染的293細胞表達(Graham等J.Gen.Virol.36:5972(1977))并過蛋白A瓊脂糖凝膠柱進行純化。完全抗體約245kDa,親本抗體分子量為150kDa。章魚重鏈是75kDa(沒有糖)，而輕鏈是30kDa?？乖Y(jié)合使用HER2ELISA測定法，測定OctHER2與抗原、HER2胞外區(qū)(HER2ECD)的結(jié)合(Sias等J.Immunol.Methods132:73-80(1990))。用HER2胞外區(qū)(ECD)包被96孔板(W090/14357),用不同稀釋度的抗-HER2抗體進行溫育。洗滌除去未結(jié)合的抗體后，接著加入偶聯(lián)過氧化物酶的第二抗體以檢測與ECD結(jié)合的抗-HER2抗體。然后，加入適宜的底物，目測纟企驗各孔并在板閱讀器上于562nm處定量測定。圖6A-C顯示OctHER2、293細胞表達的二價人IgGl抗-HER2抗體rhuMAb4D5-8、或二價抗-HER2抗體HERCEPTIN(商購于Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,USA)的ELISA結(jié)果。用ELISA測定時，OctHER2結(jié)合HER2ECD類似于HERCEPTIN⑧。293細胞表達的rhuMAb4D5-8同樣結(jié)合于瓶裝的HERCEPTIN(由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產(chǎn)生)，表明293細胞基本上并不改變抗體的抗原結(jié)合能力。超速離心測定用于檢測OctHER2是否能夠結(jié)合具有4個抗原結(jié)合部位的把。用章魚抗體滴定測量不同量的HER2胞外區(qū)(ECD)(WO90/14357),假定章魚抗體要么具有4個全功能性結(jié)合部位，要么具有3個全功能性結(jié)合部位，基于這些比例，計算復(fù)合物的平均分子量。這些理論值(圓圈，假定OctHER2具有4個功能性結(jié)合部位；正方形，假定OctHER2具有3個功能性結(jié)合部位)與得到的實際實驗值(三角)進行比較。描述于圖7的實驗值更接近代表4個結(jié)合部位的曲線，然而，觀察到的漂移表明4個位點可能并不都具有相同的親和力，生物功能戎增^濤定:在測定HER2過度表達腫瘤細胞系的生長抑制的功能性測定中，對OctHER2與HERCEPTIN⑧進行比較。使用Lewis等CancerImmuno.Immunother.37:255-263(1993)所描述的生長抑制測定法。簡要講，系列稀釋的OctHER2和HERCEPTIN⑧加入到培養(yǎng)板細胞的培養(yǎng)基中，使之繼續(xù)生長5天。此后，移出培養(yǎng)基，用結(jié)晶紫染色細胞并用分光光度測定法定量測定。結(jié)晶紫是使細胞著色的比色染料，從而使得能夠測定處理后的細胞生長情況。在3+HER2過度表達細胞中(HERCEPTIN⑧對此類細胞極為有效)，OctHER2些微較好抑制SKBR3細胞(圖8A)生長，但不如對BT474細胞有效(圖8B)。有趣的是，OctHER2較HERCEPTIN⑧更有效抑制2+過度表達細胞系，MDA361(圖8B)。如圖9所示，柔性接頭章魚構(gòu)建體(OctHER2flexl，OctHER2flex2)較HERCEPTIN更有效抑制細胞生長。力化溯/定為了評定章魚抗體在免疫毒素治療中的應(yīng)用，測定了章魚抗體的內(nèi)化能力。為了抗體裝備(arming)或免疫毒素治療，細胞毒制劑與抗體偶聯(lián)或融合，并且由此產(chǎn)生的免疫毒素特異地結(jié)合其細胞靶標；由此結(jié)合的細胞內(nèi)化該抗體，并分解代謝或者降解該抗體，釋放出殺細胞毒素。在本文進行的內(nèi)化測定中，抗體是放射性碘標記的，而且抗體與細胞溫育不同時間。接下來，測定上清夜中完好無損未結(jié)合抗體的量，結(jié)合到細胞表面的量，內(nèi)化的量，以及最后，分解代謝和降解的量。用3+過度表達細胞系(SKBR3)和2十過度表達細胞系(MDA453)(實線表示2+HER2過度表達，虛線表示3+過度表達)進行的內(nèi)化測定的結(jié)果示于圖10A-B。這些結(jié)果表明，OctHER2在兩個細胞系的內(nèi)化和分解代謝均令人驚奇地較HERCEPTIN⑧快2倍。對于裝備的抗體而言，章魚抗體顯示的快速內(nèi)化和分解代謝性能是理想的。與未結(jié)合型HERCEPTIN⑧相比，在2+過度表達細胞中只有極少量游離的章魚抗體。這些結(jié)果再一次揭示章魚抗體將是偶聯(lián)向腫瘤釋放的細胞毒制劑的出色候選物。^fi凝裙放射《^參為了證實章魚抗體在適合的小嚢泡中被內(nèi)化和降解，而不是僅僅非特異地被內(nèi)化和降解，故而使用了電子顯微鏡(EM)放射自顯影。按照在內(nèi)化測定中相同的方式，將章魚抗體碘化并與細胞溫育。描繪于圖IIA-C的結(jié)果證實，章魚抗體正在內(nèi)化進入合適的小嚢泡(早期內(nèi)體，圖11B;和溶酶體，圖11C)。另外，在這些測定中觀察到的OctHER2和HERCEPTIN內(nèi)化百分比與在內(nèi)化測定中的測量結(jié)果相匹配。實施例3抗-DR5章魚抗體評價DR5是與3價Apo2L/TRAIL(Apo2L)結(jié)合的TNF受體超家族的一個成員。在Apo2L受體結(jié)合Apo2L并集簇之后，受體胞質(zhì)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)caspases以觸發(fā)細胞凋亡。構(gòu)建兩個版本的抗-DR5章魚構(gòu)建體一個來自16E2，是克隆自單鏈人Fv噬菌體文庫的抗-DR5(見W098/51793,特別在此引入作為參考)；第二個抗-DR5章魚抗體由Mab3H3.14.5("3H3"抗體;ATCCHB-12534,W099/64461)制備，Mab3H3.14.5是當交聯(lián)時誘導(dǎo)細胞凋亡的小鼠抗-DR5Mab。既然抗-死亡受體單克隆抗體需要交聯(lián)以觸發(fā)細胞凋亡，那么它們就是章魚抗體構(gòu)建體的候選物。通過用來自16E2或3H3的VL和VH區(qū)替代上述OctHER2構(gòu)建體的可變區(qū)，來制備抗-DR5章魚抗體。在細胞凋亡測定中，使用結(jié)晶紫或者alamarBlue染色法測定抗-DR5章魚抗體。筒言之，將系列稀釋的章魚抗體或Apo2L加入到培養(yǎng)板細胞的培養(yǎng)基中，繼續(xù)生長24小時。到時間后，要么移出細胞進行結(jié)晶紫染色，要么將alamarBlue加入到培養(yǎng)基中并與細胞短暫溫育。結(jié)晶紫染色細胞，而alamarBlue檢測培養(yǎng)基中的代謝活性，因此，這些染料能夠測量處理后細胞的存活情況。用兩種比色染料(結(jié)晶紫和akmarBlue)染色后，用分光光度測定法定量測定。如圖12A-E所示，16E2章魚，在肺(SK-MES-1;HOP92)和結(jié)腸(HCT116;COLO205)腫瘤細胞系，令人驚奇地誘導(dǎo)細胞凋亡，效力堪比Apo2L。然而在正常對照細胞系(HUMEC)不誘導(dǎo)細胞凋亡。由16E2章魚誘導(dǎo)的細胞凋亡是caspase-依賴性的。在無胸腺棵鼠，抗-DR516E2章魚在體內(nèi)也有效i秀導(dǎo)細胞凋亡并且使結(jié)腸腫瘤(人COL0205)縮小。如圖13A-D所示，用蘇木精和伊紅染色的腫瘤組織的組織學(xué)切片，其來自用16E2章魚或者誘導(dǎo)細胞類似水平凋亡的Apo2L處理的小鼠。如圖14所示，16E2章魚-處理的小鼠也顯示顯著減小腫瘤體積，類似于用Apo2L和2個二價抗-DR5mAbs(16E2和3H3)測定的結(jié)果。沒有接受任何抗-DR5抗體或Apo2L(載體)的小鼠，由于無控生長而顯示出腫瘤體積的顯著增加。圖15顯示，小鼠試驗中所用材料的細胞凋亡活性在體外細胞凋亡測定中得以證實。在alamarBlue細胞凋亡測定中，試驗所用抗-DR516E2章魚和Apo2L與Apo2L標準陽性對照及抗-IgEMAb(E25)陰性對照進行了比較。圖16證明另一抗-DR5章魚，3H3章魚，能夠誘導(dǎo)類似于16E2章魚的細胞凋亡。另外，圖16顯示，章魚抗體的細胞凋亡活性不是批量依賴性的，因為在不同日期制備的數(shù)種16E2章魚抗體保持相似的功能。圖17A和B表明，對于肺腫瘤細胞系，SK-MES-1(圖17A)和T細胞肺瘤系，Jurkat(圖17B),16E2和3H3章魚抗體的細^l包凋亡活性均優(yōu)于Apo2L?？?DR5章魚抗體在將DR5集簇于腫瘤細胞表面方面較Apo2L更為有效。對16E2章魚在2-天和6-天時針對國立癌癥研究所(NCI)的一系列人腫瘤細胞系做了篩選測定，以與Apo2L進行比較。圖18A-C描述2-天時的劑量反應(yīng)曲線，表明16E2章魚和Apo2L對數(shù)種人白血病、非-小細胞肺癌、結(jié)腸癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CND)癌、黑色素瘤、卵巢癌、腎癌、前列腺癌和乳腺癌腫瘤細胞系生長的作用，而圖19A-C顯示6天篩選時的劑量反應(yīng)曲線。16E2章魚和Apo2L對抗大多數(shù)腫瘤細胞系方面，觀察到可比擬的結(jié)果，再一次證明抗-DR5章魚功能類似于Apo2L。對肺和結(jié)腸癌細胞系的相似抑制證實了前面細胞凋亡測定中16E2章魚和Apo2L對這些癌細胞系的體內(nèi)體外研究結(jié)果。16E2章魚殺死某些腫瘤細胞系(例如，CNS癌細胞系、SF-295(圖19B)以及2個腎癌細胞系，ACHN和RXF393)的能力是沒有預(yù)想到的(圖19C》NCI胂瘤系列篩選結(jié)果，定量描述于圖20A和B(2天結(jié)果)以及圖21A和B(6-天結(jié)果)，其總結(jié)了16E2章魚與Apo2L對受治腫瘤細胞系生長的抑制(GI50)、停滯(TGI)和毒性(LC50)方面的作用。這些結(jié)果再一次提示，16E2章魚可有效對抗多于前述觀察到的種類的癌癥。實施例4抗-CD20章魚抗體評價在提高嵌合抗-CD20抗體C2B8(RITUXANG);美國專利5,736,137:特別在此引入作為參考)效力的努力中，研究的一個方法是抗體觸發(fā)腫瘤細胞凋亡的能力。按照Koopman等Blood84:1415-1420(1994)所述方法進行細胞凋亡測定。在制備抗-CD20章魚抗體中，使用C2B8VL和VH區(qū)制備章魚抗-CD20抗體(OctCD20)。按照前述實施例描述的方法，在293細胞表達OctCD20抗體并通過蛋白A瓊脂糖凝膠層析法進行純化。如圖22所示，單獨RITUXAN⑧不能觸發(fā)大多數(shù)非-何杰金淋巴瘤B細胞系Wil-2的細胞凋亡，除非它與抗-人IgG(RlTUXAN⑧-lgG)相交聯(lián)。然而，OctCD20能夠在Wil-2細胞誘導(dǎo)非交聯(lián)依賴性的細胞凋亡。但是，使用OctCD20觀察到的細胞凋亡水平低于交聯(lián)的RITUXAN⑧所i秀導(dǎo)的細胞凋亡水平，提示OctCD20的細胞凋亡活性或許通過使用柔性接頭而可以提高。實施例5更多多價抗體的構(gòu)建對實施例:2(抗-HER2)、實施例3(抗-DR"和實施例4(抗-CD20)的帶有抗體鉸鏈區(qū)二聚化結(jié)構(gòu)域(本文設(shè)計的"章魚F(ab')2")的各種章魚抗體進行了抗體基因工程改造。用編碼亮氨酸-拉鏈基序序列代替重鏈cDNA的Fc區(qū)，將抗-HER2章魚F(ab')2構(gòu)建體進行基因工程改造，其中亮氨酸拉鏈基序表達為蛋白時，發(fā)生二聚化以有效連接于章魚Fab臂(圖23C)。章魚F(ab')2可保持亮氨酸拉鏈基序，或者基序能夠例如按照所期望的那樣經(jīng)蛋白水解而去除。如圖24所述，PCR用于擴增雙份VH/CH1區(qū)和用于在章魚重鏈cDNA末端插入限制性酶切位點(NotI)以使得在框架內(nèi)亞克隆入含有亮氨酸-拉鏈基序的載體(VG15)。又一次利用PCR而將另一限制性酶切位點(XhoI)增加到重鏈終止密碼子下游，以使得能夠亞克隆入用于在哺乳動物細胞表達的pRK載體中。使用唯一的限制性酶切位點BamHI、Nhel和BspEI,抗-DR5Mabl6E2和抗-CD20MabC2B8的VH/CH1區(qū)取—代進入OctF(ab)'2重鏈骨架。通過將Fab區(qū)串連重復(fù)地連接在一起以形成線性Fab多聚體，由此而建立"POPoctopus"抗體。"POPoct-3"含有3個連接的Fab區(qū)(圖23D),而"POPoct-4"含有4個Fab重復(fù)單元(圖23E)。象抗-HER2(rhuMab4D5)和抗-DR5(16E2)POPoct-4構(gòu)建體那樣，產(chǎn)生了抗-HER2(rhuMab4D5)、抗畫DR5(16E2)和抗-CD20(C2B8)POPoct-3構(gòu)建體。將POPoct-3抗體基因工程改造成含有和不含有柔性接頭1。圖25描述POPoct-3重鏈cDNA的構(gòu)建體。PCR用于擴增加有5'-BspEl位點和3'-Notl位點的VH/CH1區(qū)。消化該序列并且用BamHI/BspEI一起消化章魚重鏈，連接進入pRK栽體以產(chǎn)生含有3個VH/CH1區(qū)序列的章魚重鏈。BspEl位點編碼絲氨酸和甘氨酸殘基。為了基因工程改造POPoct-4抗體(圖26)，定點寡核苦酸誘變(site-directedoligomutagenesis)用于引入沉寂突變,導(dǎo)致消除章魚重鏈cDNA上雙份VH/CH區(qū)之間的Nhel限制性酶切位點。再次使用寡核苷酸誘變而在緊接第二個VH/CH1序列的下游處加入Nhel限制性酶切位點。該cDNA與POPoct-3構(gòu)建體一起用BamHI/Nhel限制性核酸內(nèi)切酶消化，并與pRK載體連接在一起以產(chǎn)生含有4個VH/CHl區(qū)序列的重鏈cDNA。用適當?shù)妮p鏈cDNA將不同的章魚重鏈瞬時轉(zhuǎn)染入293哺乳動物細胞以表達含有3個Fab區(qū)(POPoct-3Fab)或4個Fab區(qū)的抗體(全長型章魚；章魚F(ab)'2;POPoct-4Fab)。盡管天然IgGMab和全長型章魚抗體經(jīng)蛋白A瓊脂糖凝膠純化，但是章魚F(ab)'2和POPoct-3以及POPoct-4是經(jīng)蛋白G瓊脂糖凝膠柱純化的。章魚F(ab)'2約200kDa(圖23F，泳道4),小于2恥kDa的全長型章魚抗體(圖23F,泳道3),但大于150kDa天然IgGMab(圖23F,泳道1和2)。POPoct-3約140kDa(圖23F,泳道5),略小于天然IgGMab,而190kDa的POPoct-4則略大于天然IgGMab。章魚F(ab)'2的重鏈(圖23G,泳道4)大小與55kDa的天然IgGMab重鏈(圖23Q泳道1和2)大致相同。POPoct-3重鏈(圖23Q泳道5)大小類似于全長型章魚重鏈(圖23G,泳道3),而POPoct-4具有約97kDa的最大重鏈。實施例6抗-HER2多價抗體評價拔增蘭測;t:OctHERF(ab)'2、POPoct誦3HER2、OctHER2、OctHER2flex1和rhuMAb4D5(HERCEPTIN⑧)以等克分子濃度加入到3+HER2過度表達的胂瘤細胞系BT474中，并通過結(jié)晶紫染色測定來評價它們抑制細胞生長的能力。測定結(jié)果示于圖27。盡管所有抗體誘導(dǎo)BT474細胞的某些程度的細胞增殖抑制，但是，POPoct-3HER2和rhuMAb4D5顯示出最有效的抑制而且抑制生長程度相等，而隨著濃度降低，OctHER2F(ab)'2迅速喪失效力。OctHER2flexl顯示出輕微但一致的(consistent)超出OctHER2(n-6)的改善作用，提示改進的柔性可能導(dǎo)致Fab更易進入HER2靶。在結(jié)晶紫細胞增殖抑制測定中，也評價了等克分子濃度OctHER2、OctHER2flex-l、POPoct-3HER2、POPoct-3HER2flex國l和rhuMAb4D5(HERCEPTD^)對另一3+HER2過度表達細胞系-SKBR3的作用。該測定結(jié)果描述于圖28。對于此細胞系，所有受測章魚構(gòu)建體同等程度抑制細胞生長，并優(yōu)于rhuMab4D5(n=4)。由于OctHER2或POPoct-3的Fab臂之間的柔性接頭帶來的效力改善作用對于該細胞系并不明顯。力化^/定在內(nèi)化測定中，比較POPoct-3HER2與OctHER和HERCEPTIN⑧對兩種3+HER2過度表達腫瘤細胞系-SKBR3和BT474的作用，以評定它們在免疫毒素治療中應(yīng)用的候選資格。盡管結(jié)構(gòu)上與全長OctHER2抗體不同，但是兩個細胞系對POPoct-3HER2的內(nèi)化和分解代謝與OctHER2相同(圖29A和B)，并且速度是HERCEPTIN⑧的兩倍。實施例7抗陽DR5多價抗體評價細胞凋亡測定:在該實施例中，評價了多價版本的抗-DR516E2Mab。等克分子濃度的OctlDR5、OctDR5flex-l、OctDR5F(ab)'2、POPoct-3DR5、POPoct-3DR5flex-l和POPoct-4DR5加入到結(jié)腸胂瘤細胞系COLO205中，并在結(jié)晶紫細胞凋亡測定中與16E2MAb進行比較測定(n—)。結(jié)果示于圖30A和B。所有章魚抗體較16E2MAb誘導(dǎo)更多的細胞凋亡，效力等級由最強至'J最弱依次是OctDR5flex腸l>OctDR5=POPoct-4DR5=POPoct畫3flex-lDR5=POPoct畫3DR5>OctDR5F(ab)'2〉16E2Mab。與OctDR5相比，OctDR5flex-l具有提高的效力，尤其是在低濃度時(圖30A),表明Fab臂之間的柔性改善了效力。POPoct-3flex-lDR5誘導(dǎo)等同于OctHER的細胞凋亡(圖30A)并顯示出與POPoctl6-3和POPoctl6-4相似的效力(圖30B)。細/^/,子傳導(dǎo)Apo2L結(jié)合于死亡受體并通過caspase信號傳導(dǎo)通路觸發(fā)細胞的細胞凋亡。如圖31A和31B所示，抗-DR5章魚抗體通過與Apo2L相同的信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡。對肺腫瘤細胞系SK-MES-l,Octl6E2觸發(fā)類似于AP02L水平的細胞凋亡(圖31A，虛線)，但在加入ZVAD(caspase3和9的抑制劑)之后，由Apo2L和Octl6E2觸發(fā)的細胞凋亡均被抑制(圖31B,實線)。用DISC(死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物)測定，得到了抗-DR5章魚抗體通過與Apo2L相同的通路傳導(dǎo)信號的進一步證據(jù)(圖31B)。BJAB細胞，一種表達DR5的B-細胞淋巴瘤系，在兩種不同抗-DR5章魚抗體-Octl6E2和Oct3H3的兩種不同濃度下溫育不同時間。純化抗體-DR5復(fù)合物后，進行Western印跡測定以鑒定與復(fù)合物共純化的分子。如與Apo2L—樣，信號傳導(dǎo)分子caspase8和與DR5相關(guān)的FADD在受體后與Octl6E2和Oct3H3結(jié)合(圖31B)。實施例8抗-CD20章魚抗體評價細乂敏源亡都;t:如圖22所示，RITUXAN⑧并不有效觸發(fā)B-ce11淋巴瘤細胞系WIL-2的體外細胞凋亡，除非首先與抗-IgG抗體交聯(lián)。OctCD20能夠誘導(dǎo)WIL-2細胞非交聯(lián)依賴性的細胞凋亡，水平高于單用RITUXAN時，但是略微低于抗-IgG-交聯(lián)的RITUXAN⑧。當與抗IgG抗體交聯(lián)時,OctCD20較交聯(lián)的RITUXAN⑧誘導(dǎo)更多的WIL-2細胞發(fā)生細胞凋亡(圖32)。既然對RITUXAN⑧體內(nèi)效力的可能解釋為抗體與補體或者FcYR攜帶細胞交聯(lián)，那么該觀察提示OctCD20在體內(nèi)將更為有效。在WIL-2細胞的細胞凋亡測定中，檢測了不同濃度的OctCD20F(ab)'2、POPoct-3CD20和POPoct-3CD20flex-l，最適劑量顯示于圖33的最大反應(yīng)曲線中。將章魚抗體與抗-CD20抗體1F5進行比較(Clark等出處同上)，后者功能與RITUXAN⑧相似，因為它除非與抗-IgG抗體交聯(lián)才誘導(dǎo)細胞凋亡。受測章魚抗體較交聯(lián)1F5抗CD20誘導(dǎo)類似(OctCD20F(ab)'2)或者較高(POPoct-3CD20,POPoct-3CD20flex-l)水平的細胞凋亡。另夕卜，章魚抗體在相當?shù)蜐舛葧r較交聯(lián)的抗-CD20有效。當把交聯(lián)的抗-CD20抗體加入到B細胞淋巴瘤系WIL-2S中，觀察到細胞的同型粘附。細胞集聚是細胞已經(jīng)通過CD20激活的一個指征。章魚抗-CD20抗體誘導(dǎo)與此相同的非交聯(lián)劑依賴性同型粘附現(xiàn)象，并且如圖34所示，POPoct-3CD20的濃度較交聯(lián)的IF5抗-CD20低許多。使用從患有慢性淋巴細胞性白血病(CLL)患者采集的血液，進一步評定了由各種抗-CD20抗體引發(fā)的細胞凋亡誘導(dǎo)。使用葡聚糖沉降法分離PBL's,洗滌，并接種在不含血清的淋巴細胞培養(yǎng)基中，用不含樣本、1F5(20(ag/ml)、1F5+交聯(lián)小鼠抗-IgG(100|ug/ml)、約0.5或1.0|ng/mlOctCD20F(ab')2和0.5pg/mlPOPoct-3CD20處理過夜。使用膜聯(lián)蛋白和PI染色進行細胞凋亡測定。凋亡細胞百分比是<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>數(shù)據(jù)表明，多價抗-CD20抗體(尤其是POPoct-3CD20)以劑量依賴性方式提高細力包凋亡。力化溯〖定在內(nèi)化測定中，也評估了OctCD20作為免疫毒素治療候選物對3種B-細胞淋巴瘤系-DB、WIL-2和Ramos的作用，并且與RITUXAN進行了比較。如圖35所示，與RITUXAN⑧相比，2倍的OctCD20被細胞內(nèi)化，RITUXAN⑧在可評估水平不被細胞內(nèi)化。與RITUXAN相比，由于結(jié)合部位數(shù)量增加，可以預(yù)期多價抗體具有更高的親合力是顯然的。事實上，隨著時間推移，有更多OctCD20保持與細胞的細胞表面結(jié)合。序列表<110>杰南技術(shù)公司(GENENTECH,INC.)<120>多價抗體及其應(yīng)用<130>P17纖lPCT<140>PCT/US01/08928<141>2001-03-20<150>US60/195,819<151>2000-04-11<160>11<210>1<211〉218<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400〉1ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPhePro151015ProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluVal202530ThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGluValLys354045PheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThr505560LysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSer657075ValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyr808590LysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlieGluLys95100105ThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinValTyr110115120ThrLeuProProSerArgGluGluMetThrLysAsnGinValSer125130135LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaVal140145150GluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThr155160165ProProValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLys170175180LeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSer185190195CysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLys200205210SerLeuSerLeuSerProGlyLys215<210〉2<211>2<212〉PRT<213〉人(Homosapiens)<400>2AspLeu1<210>3<211〉217<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400>3ProAlaProProVal15LysProLysAspThr20CysValValVaiAsp35AsnTrpTyrValAsp50ProArgGluGluGin65LeuThrValValHis80CysLysValSerAsn95lieSerLysThrLys110LeuProProSerArg125ThrCysLeuValLys140TrpGluSerAsnGly55ProMetLeuAspSer170AlaGlyProSerValPheLeuPheProPro1015LeuMetlieSerArgThrProGluValThr2530ValSerHisGluAspProGuVaGnPhe4045GlyValGluValHisAsnAlaLysThrLys5560PheAsnSerThrPheArgValValSerVal7075GinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys8590LysGlyLeuProAlaProlieGluLysThr100105GlyGinProArgGluProGinValTyrThr115120GluGluMetThrLysAsnGinValSerLeu130135GlyPheTyrProSerAsplieAlaValGlu145150GinProGluAsnAsnTyrLysThrThrPro160165AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeu175180ThrValAspSerValMetLeuSerLeuLysSerArgTrpGinGin185HisGluAlaLeuHisAsn200SerProGlyLys215<210>4<211〉218<212>PRT<2'13>人(Horaosapiens)<400〉4ProAla1ProLysThrCysPheLysLysProProGluLeuLeuGlyGlyPro5ProLysAspThrLeuMetlie20ValValTrpTyrArgGluValLeuThrValLysCysThrlieLysValThrlxuProProLeuThrCysLeuGluTrpGluSerProProMetLeuLeuThrValAspCysSerValMetVal35Val50Glu65Leu80Ser95Thr110Ser125Val140Ser155Asp170Lys185His200GlyAsn190HisTyr205AspValSerHisAspGlyValGluGinPheAsnSerHisGinAspTrpAsnLysAlaLeuL'/sGlyGinProArgGluGluMetLysGlyPheTyrGlyGinProGluSerAspGlySerSerArgTrpGinGluAlaLeuHisValPheSerThrGinLysSerVal10SerArg25GluAsp40ValHis55ThrPhe70LeuAsn85ProAla100ArgGlu115ThrLys130ProSer145PheLeuPheThrProGluProGluValAsnAlaLysArgValValGlyLysGluProlieGluProGinValAsnGinValAsplieAlaCys195Ser210AsnAsnTyrAsnThr160PhePheLeuTyrSer175GinGlyAsnliePhe190AsnArgPheThrGin205Pro15Val30Gin45Thr60Ser75Tyr90Lys105Tyr120Ser135Val150Thr165Lys180Ser195Lys210SerI>euSerLeuSerProGlyILys215<210〉5<211〉218<212>PRT<213>人(Homosapiens)<400〉5ProAlaProGluPheLeuGlyGlyProSerValPheLeuPhe1ProLysProThrCysValPheAsnTrpLysProArgValLeuThrLysCysLysThrlieSerThrLeuProLeuThrCysGluTrpGlxProProValLeuThrValCysSerValSerLeuSerLysAsp20ValVal35TyrVal50GluGlu65ValLeu80ValSer95LysAla110ProSer125LeuVal140SerAsn155LeuAsp170AspLys185MetHis200LeuSer215ThrLeuMetlieAspAspValSerGinGlyValGluGinPheAsnSerHisAsnLysGinAspTrpLysGlyLeuGlyGinProGinGluGluMetLysGlySerSerGluLeuGlyPheTyrGinProGluAspGlySerArgTrpGinAlaLeuHisGlyLys<210>6<211>215<212>PRT<213>小鼠(Musmusculus)<400>6ThrValProGluValSer10Ser25Glu40Val55Thr70Leu85Pro100Arg115Thr130Pro145Asn160Phe175Glu190Asn205Arg丁hrProGluAspProGluValHisAsnAlaLysTyrArgValValAsnGlyLysGluSerSerlieGluGluProGinValLysAsnGinValSerAsplieAlaAsnTyrLysThrPheLeuTyrSerGlyAsnValPheHisTyrThrGinPro15Val30Gin45Thr60Ser75Tyr90Lys105Tyr120Ser135Yal150Thr165Arg180Ser195Lys210SerValPheliePheProProLysPro1LysAspValLeuValValAspliePheValAspAspGluGluGinPhelieMetHisGinValAsnSerAlaLysThrLysGlyProProLysGluMetlieThrAspTrpAsnGlyGinMetAspThrAspGinLysSerAsnLeuHisGluGlyHisSerProGly510ThrlieThrLeuThrPro2025SerLysAspAspProGlu3540ValGluValHisThrAla5055AsnSerThrPheArgSer6570AspCysLeuAsnGlyLys8085AlaPheProAlaProlie95100ArgProLysAlaProGin110115GinMetAlaLysAspLys125130PhePheProGluAsplie140145ProAlaGluAsnTyrLys155160GlySerTyrPheValTyr170175TrpGluAlaGlyAsnThr185190LeuHisAsnHisHisThr200205Lys215<210>7<211>218<212>PRT<213>小鼠(Musmusculus)<400>7ProAlaPro1ProLyslieThrCysValAsnLeuLeuGlyGlyProSer510LysAspValLeuMetlieSer2025ValValAspValSerGluAsp3540LysValThrCysValGinPheSerGinThrGinProValSerGluLeuGluGluValSerPheGluPheLysCysLysThrlieTyrThrlieValSerLeuThrThrValGluTrpAsnThrGinProLysLeuAsnThrCysSerLysSerLeu15Val30Trp45Arg60Pro75Arg90Ser105Pro120Cys135Gin150lie165Val180Val195Ser210ValPheliePheLeuSerProlieAspProAspValPro15Val30Gin45lieSerTrpPheGinThrHisArgAlaIxuProlieLysCysLysValThrlieSerLysVal50Glu65Gin80Asn95Pro110AsnAsnValGluValHisThrAla55AspTyrAsnSerHisGinAspTrpAsnLysAspLeuLysGlySerValThr70Met85Pro100Arg115LeuSerValLeuProProProGluGluGluMet丁hrLys125130LeuThrCysMetGluTrpThrAsnGluProValLeuLeuArgValGluCysSerValValSerPheSerArgVal140Asn155Asp170Lys185His200Thr215ThrAspPheMetGlyLysThrGluSerAspGlySerLysAsnTrpValGluGlyLeuHisProGlyLysPro145Leu160Tyr175Glu190Asn205<210>8<211>218<212>PRT<213>小鼠(Mus面culus)<400>8ProAla1ProAsnLeuGluGlyGlyProSerValArgValGlyLysAlaProlieAlaProGinLysGinAsplieTyrLysMetTyrArgAsnSerHisHisThrGluAsnPheGinThr60ValSer75GluPhe90GluArg105ValTyr120ValThr135TyrVal150AsnThr165SerLys180TyrSer195ThrLys2105ProAsnlieLysAspValLeuMetlie20ThrCysValValValAspValSerGlu35lieSerTrpPheValAsnAsnValGlu50GinThrHisArgHisLeuProlieGlu65Gin80AspTyrAsnSerHisGinAspTrp10Ser25Asp40Val55Thr70Met85PheliePhePro15LeuThrProLysVal30AspProAspValGin45HisThrAlaGinThr60lieArgValValSer75SerGlyLysGluPhe90LysCysLysValThrlieSerLysAsn95Pro110AsnLysLysAspLeuGlyLeuValThrLeuProProProAlaGluGinLeu125LeuThrCysLeuGluTrpThrSerAlaProValLeuLeuAsnMetLysCysAsnValArgThrlieSerArgVal140Asn155Asp170Thr185His200Ser215ValGlyPheAsnPro100Arg115Ser130Pro145SerProlieGluAlaProGinValArgGlyGlyHisThrGluGluAsn160SerSerGluProAspGlySerLysTrpGluGlyLeuLysGlyLysTyr175Lys190Asn205PheThrTyrLysAspValAsplieSerTyrLysAsplieTyrSerAspSerPheTyrLeuLys1ProLysProLysThrCysValValValSerTrpPheGinProArgGluAlaLeuProlieAsp20Val35Val50Ala65Gin80AlaLeuMetlieAsn95I>ysCysLysValThrlieSerLysThrlieProProProPro110AspAspGinHisAsnLysArgValSerGluAsnLysGluTyrAsnSerGltiAspTrpLysAlaLeuGlyArgAlaGluGinMet10Ser25Asp40Val55Thr70Met85Pro100Gin115LeuAspHisPheArgArg105Tyr120Ser135Val150Thr165Lys180Ser195Lys210<210>9<211>218<212>PRT<213>小鼠(Musmusculus)<400>9ProProGlyAsnlieLeuGlyGlyProSerValPheliePheThrProLysProAspValThrAlaTrpArgValValGlyLysGluAlaProlieGluThrProGinValPro15Val30His45Thr60Ser75Phe90Arg105Tyr120SerLysLysLysValSer125130135LeuThrCysLeuValThrAsnPhePheSerGluAlalieSerVal140145150GluTrpGluArgAsnGlyGluLeuGluGinAspTyrLysAsnThr155160165ProProlieLeuAspSerAspGlyThrTyrPheLeuTyrSerLys170175180LeuThrValAspThrAspSerTrpLeuGinGlyGluliePheThr185190195CysSerValValHisGluAlaLeuHisAsnHisHisThrGinLys200205210AsnLeuSerArgSerProGlyLys215<210>10<211>4<212>PRT<213>人工序列<220><223>序列是合成的<400>10GlySerGlySer1<210>11<211>4<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>序列是合成的<400>11GlyGlyGlySer權(quán)利要求1.一種分離的抗體，其包含(a)一或多條多肽鏈，所述多肽鏈包含VH1-CH1-VH2二聚化結(jié)構(gòu)域，或VH1-VH2-CH1二聚化結(jié)構(gòu)域，其中所述VH1是第一重鏈可變區(qū)，VH2是第二重鏈可變區(qū)；和(b)三個或更多個抗原結(jié)合部位，所述抗原結(jié)合部位結(jié)合在所述二聚化結(jié)構(gòu)域的氨基末端。2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述二聚化結(jié)構(gòu)域包含鉸鏈區(qū)，F(xiàn)c區(qū)，CH2區(qū)，CH3區(qū)，或CH4區(qū)。3.權(quán)利要求1的抗體，其中所述二聚化結(jié)構(gòu)域是Fc區(qū)。4.權(quán)利要求1的抗體，其還包含一或多條多肽鏈，所述多肽鏈包含VL1-CL-VL2二聚化結(jié)構(gòu)域，或VL1-VL2-CL二聚化結(jié)構(gòu)域，其中所述VL1是第一輕鏈可變區(qū)，VL2是第二輕鏈可變區(qū)。5.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述一或多條多肽鏈還在任意兩個所述結(jié)構(gòu)域之間包含至少一個氨基酸或多肽Xn,其中n是0或1。6.權(quán)利要求5的抗體，其中所述一或多條多肽鏈包含VH1-X1-CH1-X2-VH2二聚化結(jié)構(gòu)域，或VH1-X1-VH2-X2-CH1二聚化結(jié)構(gòu)域。7.權(quán)利要求6的抗體，其中所述二聚化結(jié)構(gòu)域包含CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述二聚化結(jié)構(gòu)域還包含CH4結(jié)構(gòu)域。9.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述一或多條多肽^t連還在任意兩個所述結(jié)構(gòu)域之間包含至少一個柔性接頭。10.權(quán)利要求9的抗體，其中所述一或多條多肽鏈包含VHl-柔性接頭-01-柔性接頭々112二聚化結(jié)構(gòu)域，或VHl-柔性接頭-VH2-柔性接頭-CHl二聚化結(jié)構(gòu)域。11.權(quán)利要求10的抗體，其中所述二聚化結(jié)構(gòu)域包含CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域。12.權(quán)利要求ll的抗體，其中所述二聚化結(jié)構(gòu)域還包含CH4結(jié)構(gòu)域。13.權(quán)利要求9-12之一的抗體，其中所述柔性接頭含有選自下組的肽:gly-ser、gly-ser-gly-ser(SEQIDNO:10)、ala-ser和gly-gly-gly-ser(SEQIDNO:11)。14.權(quán)利要求1的抗體，其包含4個抗原結(jié)合部位。15.權(quán)利要求1的抗體，其包含5個或更多個抗原結(jié)合部位。16.權(quán)利要求1的抗體，其包含含有超過兩個重鏈可變區(qū)的多肽鏈。17.權(quán)利要求2的抗體，其包含含有超過兩個輕鏈可變區(qū)的多肽鏈。18.權(quán)利要求1的抗體，其與二價抗體相比，以更快的速度被表達相應(yīng)抗原的細胞內(nèi)化，其中所述相應(yīng)抗原是能與所述抗體結(jié)合的抗原。19.權(quán)利要求1的抗體，其是激動型抗體。20.權(quán)利要求1的抗體，其誘導(dǎo)細胞凋亡。21.權(quán)利要求l的抗體，其中所述抗原結(jié)合部位都結(jié)合相同抗原。22.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗原結(jié)合部位結(jié)合2種或更多種不同的抗原。23.權(quán)利要求l的抗體，其結(jié)合由腫瘤細胞表達的細胞表面蛋白。24.權(quán)利要求23的抗體，其中所述細胞表面蛋白選自表皮生長因子受體(EGFR)、HER2受體、HER3受體、HER4受體和DcR3受體。25.權(quán)利要求23的抗體，其中細胞表面蛋白是HER2受體。26.權(quán)利要求l的抗體，其結(jié)合由腫瘤細胞過度表達的細胞表面蛋白。27.權(quán)利要求1的抗體，其結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族中的受體。28.權(quán)利要求27的抗體，其中所述TNF受體是Apo2L受體。29.權(quán)利要求28的抗體，其中所述Apo2L受體選自DR4、DR5、DcRl和DcR2。30.權(quán)利要求28的抗體，其中所述Apo2L受體是DR4或DR5。31.權(quán)利要求27的抗體，其是激動型抗體。32.權(quán)利要求27的抗體，其誘導(dǎo)細胞凋亡。33.權(quán)利要求1的抗體，其結(jié)合B細胞表面抗原。34.權(quán)利要求33的抗體，其中B細胞表面抗原選自CD19、CD20、CD22和CD40。35.權(quán)利要求33的抗體，其中B細胞表面抗原是CD20。36.權(quán)利要求l的抗體，其與細胞毒制劑偶聯(lián)。37.權(quán)利要求36的抗體，其中所述細胞毒制劑一旦內(nèi)化則具有殺細胞活性。38.權(quán)利要求36的抗體，其中所述細胞毒制劑選自放射性同位素、美登木素生物堿和加利車霉素。39.分離的核酸，編碼權(quán)利要求1的抗體。40.載體，含有權(quán)利要求39的核酸。41.宿主細胞，含有權(quán)利要求39的核酸或權(quán)利要求40的載體。42.產(chǎn)生抗體或多肽鏈的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求41的宿主細胞以使所述核酸表達。43.權(quán)利要求42的方法，還包括從宿主細胞培養(yǎng)物中回收所述抗體或多肽鏈。44.權(quán)利要求43的方法，其中所述抗體或多肽鏈是從宿主細胞培養(yǎng)基質(zhì)中回收的。45.權(quán)利要求1-38之一的抗體在制備用于治療哺乳動物病癥的藥物中的用途。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述病癥是癌癥。47.權(quán)利要求45的方法，所述藥物還包含細胞毒制劑。全文摘要本申請描述具有三個或更多個功能性抗原結(jié)合部位的基因工程抗體，和此類基因工程抗體的用途，例如治療應(yīng)用。文檔編號C07K19/00GK101289511SQ20081009099公開日2008年10月22日申請日期2001年3月20日優(yōu)先權(quán)日2000年4月11日發(fā)明者倫納德·G·普雷斯塔,凱西·L·米勒申請人:杰南技術(shù)公司