專利名稱：死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及死亡受體激動(dòng)性抗體的制備，具體為死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體的制備及其在抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(Tumor necrosis factor-related apoptosisinducing ligand, TRAIL)是willy等于1995年發(fā)現(xiàn)的TNF超家族新成員。實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRAIL對幾乎所有系統(tǒng)惡性腫瘤的大部分細(xì)胞系均有殺傷作用，而對正常組織無殺傷作用(NatMed, 1999，5: 157-63)，因此以TRAIL受體為靶點(diǎn)的腫瘤治療已成為研究的熱點(diǎn)。 TRAIL的生物學(xué)效應(yīng)主要是通過與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合而產(chǎn)生的。目前在細(xì)胞膜已發(fā)現(xiàn)4種TRAIL受體二種為死亡受體DR4 (Death receptor-4), DR5(Death receptor-5), 二種受體為誘騙受體DcRl (Decoy receptor-1)、DcR2 (Decoyreceptor-2)。當(dāng)TRAIL與死亡受體DR4與DR5結(jié)合后，DR4與DR5可以形成同源/異源三聚體，通過其含有的胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域(death domain, DD)傳導(dǎo)凋亡信息至胞質(zhì)內(nèi)，激活caspase系統(tǒng)最終引起細(xì)胞凋亡。TRAIL與誘騙受體DcRl與DcR2結(jié)合后，可以形成異源三聚體。由于DcRl、DcR2缺乏有功能的胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，形成的異源三聚體無法激活caspase系統(tǒng)，因此當(dāng)誘騙受體過表達(dá)時(shí)，細(xì)胞對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受。腫瘤細(xì)胞通常主要表達(dá)死亡受體，低表達(dá)誘騙受體。然而有些腫瘤細(xì)胞卻可以高表達(dá)誘騙受體，對TRAIL誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生耐受[Science, 1997，277: 818 - 821; CellSignal, 2004, 16:139-44]。為此有些研究小組研發(fā)出單死亡受體激動(dòng)性抗體,這些抗體與DR4或DR5特異性結(jié)合后，模擬TRAIL的作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。由于激動(dòng)性抗體只與死亡受體特異性結(jié)合，而不與誘騙受體結(jié)合，因此對于那些高表達(dá)誘騙受體、躲避TRAIL殺傷作用的腫瘤細(xì)胞仍然有效[Oncogene. 2008, 27: 6207-15; Curr OpinPharmacol, 2008, 8: 433 - 439]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體，尤其是死亡受體5激動(dòng)性四價(jià)抗體在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。死亡受體5多價(jià)抗體,針對死亡受體5的單鏈抗體通過寡聚化的結(jié)構(gòu)域,形成多價(jià)抗體，該多價(jià)抗體可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對正常細(xì)胞無毒性，其氨基酸序列為(詳見SEQID NO. I)
DIVMTQSPSSLAVSAGERVTMSCKSSQSLLNSRTRKNCLAWYQQKPGQFPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQSFDLPTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAEPVKSGASVKLSCTASGFNIKDTFIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTVYLQFSSLTSEDAAVYYCSRGTTVYYFDHWGQGSTLTVSS。
所述的死亡受體5多價(jià)抗體，針對死亡受體5的單鏈抗體通過p53結(jié)構(gòu)域連接，形成四價(jià)抗體，該四價(jià)抗體可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對正常細(xì)胞無毒性，其氨基酸序列為(詳見 SEQ ID NO. 2)
DIVMTQSPSSLAVSAGERVTMSCKSSQSLLNSRTRKNCLAWYQQKPGQFPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSG
SGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQSFDLPTFGGGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGAEPVKSGA
SVKLSCTASGFNIKDTFIHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQGKATITADTSSNTVYLQFSSLTSEDAAV
YYCSRGTTVYYFDHWGQGSTLTVSSTPLGDTTDTSGKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPo所述的死亡受體5多價(jià)抗體，其氨基酸序列與SEQ ID NO. 2的同源性大于80%，且可以形成四價(jià)抗體，與死亡受體5結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對正常細(xì)胞無毒性。
所述的死亡受體5多價(jià)抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明中，采用基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù)，利用TRAIL受體DR5免疫小鼠，采用噬菌體展示技術(shù)，獲得一株單鏈抗體，利用P53結(jié)構(gòu)域使其多聚化，形成多價(jià)抗體。現(xiàn)有的死亡受體激動(dòng)性抗體大多為完整的抗體(如中國專利申請?zhí)?00680009970. I ；200410070093. I ；200580018426. 9)，本發(fā)明多價(jià)抗體與現(xiàn)有的死亡受體激動(dòng)性抗體不同，該多價(jià)抗體去除了抗體的恒定區(qū)，可以減輕免疫原性，可以采用酵母或大腸桿菌表達(dá)；該多價(jià)抗體可以在體外強(qiáng)烈誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對正常細(xì)胞無毒性。因此該抗體可以用于新型抗腫瘤藥物的研發(fā)。本發(fā)明還涉及了一種抗人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體的四價(jià)抗體的制備方法，它主要包括以下步驟以DR5胞外區(qū)蛋白免疫小鼠，利用噬菌體展示技術(shù)，得到親和抗體。利用P53蛋白結(jié)構(gòu)域，將其構(gòu)建為四價(jià)抗體。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)其中一種四價(jià)抗體具有使Jurket細(xì)胞凋亡的能力，更多體外實(shí)驗(yàn)表明該四價(jià)抗體可以殺死白血病細(xì)胞、食道癌細(xì)胞，對永生化細(xì)胞無作用。本發(fā)明與國內(nèi)外類似專利相比，其可變區(qū)序列為未見報(bào)道的抗體序列，該序列多聚化后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所想象不到。


圖I顯示DR5在白血病細(xì)胞的表達(dá)情況；A Jurkat ；B K562 ；
圖2顯示DR5在人食管癌細(xì)胞、人食管上皮永生化細(xì)胞的表達(dá)情況；A: EC9706 ；Β:
NEC ；
圖3 Westen blot鑒定四價(jià)抗體表達(dá)；43KD :四價(jià)抗體；34KD:單鏈抗體；
圖4顯示2. 5mg/L死亡受體5四價(jià)抗體作用于Jurket細(xì)胞20h作用結(jié)果；a為死亡受體5激動(dòng)性四價(jià)抗體，b為對照單鏈抗體；
圖5顯示2. 5mg/L死亡受體5四價(jià)抗體作用于K562細(xì)胞20h作用結(jié)果；a為死亡受體5激動(dòng)性四價(jià)抗體，b為對照單鏈抗體；
圖6顯示2. 5mg/L死亡受體四價(jià)抗體作用于腫瘤細(xì)胞EC9706 20h作用結(jié)果；a為死亡受體5激動(dòng)性四價(jià)抗體，b為對照單鏈抗體；
圖7顯示2. 5mg/L死亡受體四價(jià)抗體作用于永生化細(xì)胞NEC 20h作用結(jié)果；a為死亡受體5激動(dòng)性四價(jià)抗體，b為對照單鏈抗體；
圖8顯示不同濃度四價(jià)死亡受體激動(dòng)性抗體作用于Jurket細(xì)胞的死亡率；圖9顯示不同濃度四價(jià)死亡受體激動(dòng)性抗體作用于K562細(xì)胞的死亡率；
圖10顯示不同濃度四價(jià)死亡受體激動(dòng)性抗體作用于EC9706細(xì)胞的死亡率；
圖11顯示不同濃度四價(jià)死亡受體激動(dòng)性抗體作用于永生化細(xì)胞NEC的死亡率。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。實(shí)施例I DR5單鏈抗體的制備
以DR5抗原(peproTech公司)100 μ I (100 μ g)與等體積弗氏完全佐劑乳化后，常規(guī)免疫。取小鼠脾臟，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)《重組抗體》(沈倍奮，科學(xué)出版社)方案，以cDNA為模板，擴(kuò)增全套VH和VL基因，將擴(kuò)增得到的重、輕鏈產(chǎn)物進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增出ScFv片段。ScFv片段和載體PAK100經(jīng)Sfi I酶切后，T4連接酶連接，電轉(zhuǎn)化 入E. coli XLl-Blue感受態(tài)細(xì)胞，制備噬菌體抗體庫。用DR5抗原包被96孔板(第I輪100 yg/ml,第 2 輪 30 yg/ml,第 3 輪 10 yg/ml,第 4 輪 I 4區(qū)/1111,第5輪0.5 μ g/ml),1%BSA封閉后每孔加50 μ I噬菌體庫，37°C放置2 h，用TBST洗5遍(第2輪10遍，后幾輪20遍)。將得到的噬菌粒送上海英駿生物公司測序。(I)輕鏈正向引物
LBl:gccatggcggactacaaagayatccagctgactcagccLB2 gccatggcggactacaaagayattgttctcwcccagtcLB3 gccatggcggactacaaagayattgtgmtmactcagtcLB4 gccatggcggactacaaagayattgtgytracacagtcLB5 gccatggcggactacaaagayattgtratgacmcagtcLB6 gccatggcggactacaaagayattmagatramccagtcLB7 gccatggcggactacaaagayattcagatgaydcagtcLB8 gccatggcggactacaaagayatycagatgacacagacLB9 gccatggcggactacaaagayattgttctcawccagtcLBlO gccatggcggactacaaagayattgwgctsacccaatcLBlI gccatggcggactacaaagayattstratgacccartcLB12 gccatggcggactacaaagayrttktgatgacccaracLB13 gccatggcggactacaaagayattgtgatgacbcagkcLB14 gccatggcggactacaaagayattgtgataacycaggaLB15 gccatggcggactacaaagayattgtgatgacccagwtLB16 gccatggcggactacaaagayattgtgatgacacaaccLB17 gccatggcggactacaaagayattttgctgactcagtcLB λ gccatggcggactacaaagatgctcttgtgactcaggaatc
(2)輕鏈反向引物
LFl ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttkatttccagcttggLF4 ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgttttatttccaactttgLF5 ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacgtttcagctccagcttggLF λ ggagccgccgccgccagaaccaccaccaccagaaccaccaccaccacctaggacagtcagtttgg(3)重鏈正向引物
HBl ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgakgtrmagcttcaggagtcHB2 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtbcagctbcagcagtcHB3 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtgcagctgaagsartcHB4 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtccarctgcaacartcHB5 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtycagctbcagcartcHB6 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtycarctgcagcartcHB7 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtccaggtgaagcartcHB8 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgaasstggtggartcHB9 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgavgtgawgstggtggagtcHBlO ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgcagstggtggartcHBll ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgakgtgcamctggtggartcHB12 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgaagctgatggartcHBI3 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgcarcttgttgartcHB14 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgargtraagcttctccartcHBI5 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaagtgaarsttgaggartcHB16 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggttactctraaasartcHB17 ggcggcggcggctccggtggtggtggatcccaggtccaactvcagcarccHB18 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgatgtgaacttggaasartcHB19 ggcggcggcggctccggtggtggtggatccgaggtgaaggtcatcgartc
(4)重鏈反向引物
HFl ggaattcggcccccgaggccgaggaaacggtgaccgtggtHF2 ggaattcggcccccgaggccgaggagactgtgagaatggtHF3 ggaattcggcccccgaggccgcagagacagtgaccagagtHF4 ggaattcggcccccgaggccgaggagacggtgactgaggt
注Y=C，T ；ff=A, T ；B=C, G，T ；M=A, C ；R=A, G ；K=G, T ；S=G, C。以上引物序列左邊為 5'
立而，右邊為3'立而。實(shí)施例2四價(jià)抗體表達(dá)載體的構(gòu)建
以DR5單鏈抗體基因?yàn)槟０?，以LI、H2為引物，PCR擴(kuò)增得到ScFv，反應(yīng)條件95°C3min,95°C 30 sec,60°C 40 sec,72°C 30 sec，30 個(gè)循環(huán)。以 P53a、P53b 為引物，PCR擴(kuò)增得到P53片段，反應(yīng)條件95°C 30 sec,60°C 40 sec,72°C 30 sec，30個(gè)循環(huán)。以上述產(chǎn)物為模板，以L1、P532為引物，重疊延伸PCR，反應(yīng)條件95°C 3min，95°C 30 sec,60°C 40sec,72°C 30 sec，30個(gè)循環(huán)。取目的基因回收產(chǎn)物VL+VH2+P53，利用限制性內(nèi)切酶Xho I和Hind III，作為片段雙酶切體系。取空載體質(zhì)粒pcDNA3. 1，利用限制性內(nèi)切酶Xho I及Hind III，雙酶切。切膠回收目的基因，T4連接酶連接，電轉(zhuǎn)化入E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選，挑取陽性克隆測序。LIGGCAAGCTTAGATATTGTGATGACACAGT ；
H2 GTTGTGTCACCAAGTGGGGTTGAGGAGACAGTGAGAGTGGA ；
P53a ACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATCCGGAAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCA·GATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCG ；
P53b TGGCTCCTTCCCAGCCTGGGCATCCTTGAGTTCCAAGGCCTCATTCAGCTCTCGGAACATCTCGAAGCGCTCACGCCCACGGATCT ；
P532 CGCCTCGAGTGGCTCCTTCCCAGCCT ；
實(shí)施例3激動(dòng)性四價(jià)抗體的篩選
瞬時(shí)轉(zhuǎn)染各克隆四價(jià)抗體質(zhì)粒到C0S7細(xì)胞，48h后收獲上清，westenblot證實(shí)四價(jià)抗體表達(dá)(結(jié)果見圖3)。收集并制備Jurkat細(xì)胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞終濃度為I X IO5/孔，置37°C，5%C02條件培養(yǎng)12 hr,加入C0S7細(xì)胞培養(yǎng)上清50 μ I ；陰性對照孔用RPMI1640培養(yǎng)液。于37°C和5%C02的條件下培養(yǎng)20 h，收集每孔所有細(xì)胞于相應(yīng)的離心管中。PBS洗滌細(xì)胞后，每孔細(xì)胞分別懸浮于100 μ I的AnnExin V結(jié)合液中，分別加5 μ IAnnExin V-FITC溶液和5 μ I PI溶液，混勻后，于室溫避光溫育20 min，用結(jié)合液補(bǔ)至400 μ I。利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品檢測I萬個(gè)細(xì)胞，用CellQuest軟件分析細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。確定可以使腫瘤細(xì)胞凋亡的四價(jià)抗體。實(shí)施例4四價(jià)抗體的制備
將四價(jià)抗體質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞，48 h后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入2 ml DMEM完全培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，平均分至6孔板的兩個(gè)孔中，同時(shí)將未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作為陰性對照，各加入400 μ g/ml的Zeocin加壓篩選。一周后,在倒置顯微鏡下可以看到,未轉(zhuǎn)染加壓孔細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染孔細(xì)胞仍有細(xì)胞存活，繼續(xù)加壓培養(yǎng)。待孔里細(xì)胞基本長滿時(shí)，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用胰蛋白酶消化，含400 μ g/ml Zeocin的DMEM完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按照5孔3個(gè)細(xì)胞的原則，10 ml培養(yǎng)液60個(gè)細(xì)胞鋪96孔板，每孔100 μ I。在培養(yǎng)過程中可以觀察到細(xì)胞單克隆的形成情況，無細(xì)胞孔和多細(xì)胞克隆孔在培養(yǎng)的過程中棄掉，只繼續(xù)培養(yǎng)形成單克隆孔里的細(xì)胞。并且細(xì)胞培養(yǎng)逐漸由96孔板向24孔板然后向6孔板過渡。根據(jù)ELISA結(jié)果選擇蛋白表達(dá)量最高的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中繼續(xù)維持200 μ g/ml的Zeocin加壓。放大培養(yǎng)后，收獲上清。將收集備用的細(xì)胞上清液以I ml/min的流速通過鎳柱，上完樣品后，用20 mM咪唑平衡柱子至基線平穩(wěn)，然后用50 mM咪唑洗脫未結(jié)合蛋白以及雜蛋白。接著用250 mM咪唑洗脫目的蛋白，同時(shí)收集洗脫液。將上述收集的洗脫液取30 μ I再加入30 μ I 2XLoading Buffer，混懸裂解，冰上孵育20 min，然后于沸水中煮10 min，4°C，12 000 g，離心5 min，取上清轉(zhuǎn)入新的EP管內(nèi)，待SDS-PAGE分析后，合并所有含目的蛋白的洗脫液，用BCA法測定蛋白濃度,并用western blot驗(yàn)證純化的目的蛋白。實(shí)施例5細(xì)胞表面DR5的表達(dá)檢測
I將生長狀態(tài)良好的人食管癌細(xì)胞EC9706、人食管上皮細(xì)胞NEC、人白血病細(xì)胞Jurkat, K562常規(guī)培養(yǎng)于含10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。2將細(xì)胞調(diào)整為3X106個(gè)/ml，每種細(xì)胞各取3份，200 μ I/份細(xì)胞懸液，以PBS洗滌細(xì)胞3次。3試驗(yàn)管加濃度為5 yg/ml的DR5單抗(RD公司)200 μ 1，同型對照組加入小鼠正常血清200 μι (I 200稀釋)，陰性對照加等量的PBS，冰浴45 min。4以預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，每次每管加入3 ml PBS,棄去上清。5加入50 μ I PBS和FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG (I 50稀釋)50 μ I混合，冰浴40 min，用PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測DR5的表達(dá)，用Cellquest軟件分析細(xì)胞DR5表達(dá)(結(jié)果見圖1、2)。實(shí)施例6四價(jià)抗體對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用 I細(xì)胞凋亡率的檢測
收集并制備EC9706、NEC、Jurkat, K562細(xì)胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板，2 ml/孔，細(xì)胞終濃度為I X 105/孔，置37°C，5%C02條件培養(yǎng)12 hr,分別加入單鏈抗體、四價(jià)抗體使其終濃度為2. 5 mg/L ;陰性對照孔用RPMI1640培養(yǎng)液。于37°C和5%C02的條件下培養(yǎng)20 h，收集每孔所有細(xì)胞于相應(yīng)的離心管中。PBS洗滌細(xì)胞后，每孔細(xì)胞分別懸浮于100 μ 的AnnExin V結(jié)合液中，分別加5 μ I AnnExin V-FITC溶液和5 μ I PI溶液，混勻后，于室溫避光溫育20 min，用結(jié)合液補(bǔ)至400 μ I。利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品檢測I萬個(gè)細(xì)胞，用CellQuest軟件分析細(xì)胞的凋亡率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(結(jié)果見圖4、5、6、7)。2劑量依賴性測定 于96孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板分別加入EC9706、NEC、Jurkat, K562細(xì)胞懸液，每孔加200μ I (I X IO4/孔)細(xì)胞懸液，于37°C和5%C02的條件下繼續(xù)培養(yǎng)12 hr。離心棄上清，分別加入不同濃度(O. 25,0. 5、1、2、2. 5、3 μ g/ml)的目的蛋白溶液繼續(xù)培養(yǎng)16 hr ;陰性對照組僅加入RPMI1640培養(yǎng)液。每孔終體積200 μ I。離心更換不含目的蛋白的培養(yǎng)液，終體積仍為200 μ 1，加入MTT工作液(5 mg/ml) 20 μ I/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 hr。離心棄上清，每孔加入150 μ I DMS0，振蕩5 min裂解細(xì)胞。用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測0D570吸光度值。每一濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(結(jié)果見圖8、9、10、11)。計(jì)算細(xì)胞抑制率=(I 一實(shí)驗(yàn)組0D570/對照 0D570) X 100%ο
權(quán)利要求
1.死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體，其特征在于，針對死亡受體5的單鏈抗體通過寡聚化的結(jié)構(gòu)域，形成多價(jià)抗體，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.如權(quán)利要求I所述的死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體，其特征在于，針對死亡受體5的單鏈抗體通過p53結(jié)構(gòu)域連接,形成四價(jià)抗體,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體，其特征在于，其氨基酸序列與SEQID NO. 2的同源性大于80%，且可以形成四價(jià)抗體，與死亡受體5結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對正常細(xì)胞無毒性。
4.如權(quán)利要求I一 3任一所述的死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體的受體DR5(deathreceptor5)胞外區(qū)的抗體。死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體，針對死亡受體5的單鏈抗體通過寡聚化的結(jié)構(gòu)域，形成多價(jià)抗體，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。針對死亡受體5的單鏈抗體通過p53結(jié)構(gòu)域連接，形成四價(jià)抗體，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。該抗體多聚化后可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，對正常細(xì)胞無毒性。本發(fā)明還提供了該死亡受體5激動(dòng)性多價(jià)抗體在制備抗腫瘤藥物方面的應(yīng)用。
文檔編號A61P35/00GK102924600SQ20121045734
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者馬遠(yuǎn)方, 劉峰濤, 張軍, 季澤俊, 劉廣超, 李淑蓮 申請人:河南大學(xué)