一種同時定量檢測多個受體的抗體芯片試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術領域，尤其涉及一種同時定量檢測多個受體的抗體芯片 試劑盒。 技術背景
[0002] 受體（receptor)是一種能與細胞外專一信號分子（配體）結合引起細胞反應的蛋 白質。
[0003] 受體分為細胞表面受體和細胞內受體。受體與配體結合即發(fā)生分子構象變化，從 而引起細胞反應，如介導細胞間信號轉導、細胞間黏合、細胞胞吞等細胞過程。受體在細胞 膜上或細胞內能識別生物活性分子并與之結合，把識別和接受的信號正確無誤地放大并傳 遞到細胞內部，從而激活或啟動一系列生物化學反應，最后導致該信號物質特定的生物效 應。通常受體具有兩個功能：一是識別特異的信號物質一配體，識別的表現(xiàn)在于兩者結合。 配體，是指這樣一些信號物質，除了與受體結合外本身并無其他功能，它不能參加代謝產生 有用產物，也不直接誘導任何細胞活性，更無酶的特點，它唯一的功能就是通知細胞在環(huán)境 中存在一種特殊信號或刺激因素；二是把識別和接受的信號準確無誤的放大并傳遞到細 胞內部，啟動一系列胞內生化反應，最后導致特定的細胞反應，促進祀細胞的增殖和分化， 增強抗感染和殺腫瘤細胞效應，促進或抑制細胞因子的合成，促進炎癥過程，影響細胞代謝 等。
[0004] 受體研究具有非常重要的理論和實用意義，它從分子水平來闡明激素、遞質、藥 物、抗體的作用機制及生理和病理過程的，已成為科學技術的前沿陣地之一。
[0005] 目前常用的受體檢測方法主要包括：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)，放射免疫分析 (radioimmunoassay，RIA)，免疫印跡法（western blot)，流式細胞儀（Flow-Cytometry)等。 其中，酶聯(lián)免疫吸附法是最普遍的方法，具靈敏度高、特異性較好、操作簡便等優(yōu)點。但一次 試驗只能檢測單一指標，通量低、成本高，在具有多指標特性的受體檢測中，該方法存在明 顯的不足；放射免疫分析（RIA)雖然靈敏度高，是由于具有放射性污染，現(xiàn)在已很少采用； 免疫印跡法能測定分子的大小，且無非特異的反應，但操作繁瑣，靈敏度低，且只能檢測單 一指標，不適合運用于受體的檢測；流式細胞儀能在細胞水平上檢測受體的水平，但卻存在 低靈敏、低通量、高成本等缺點。
[0006] 有鑒于此，有必要開發(fā)一種新型的多種受體定量檢測試劑盒，以克服現(xiàn)有技術中 亟待解決的問題，實現(xiàn)多種受體的高通量、高靈敏度、高特異性和低成本檢測。在本發(fā)明中， 我們選用沒有空間限制的標準組織玻片作為載體，可使點在同一微陣列上檢測受體的數(shù)目 可以不受空間的限制。由于玻片具有非常低的自身熒光，而且熒光信號不具擴散性，不同點 間的熒光信號不會彼此干擾，所以一次可以同時檢測幾十個受體。本發(fā)明采用抗體夾心法 原理在玻片表面進行多重ELISA反應，不僅一次可以檢測多達幾十個受體，并且所檢測的 受體靈敏度可達單因子的ELISA檢測靈敏度。

【發(fā)明內容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種同時定量檢測多個受體的抗體 芯片試劑盒，能在標準組織玻片上進行高通量、高靈敏度、高特異性和低成本的受體定量檢 測。
[0008] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明所述的一種定量檢測多個受體的抗體芯片試劑 盒，包括：抗體芯片，包括標準組織玻片和在玻片表面上固定的40種受體的特異性抗體、兩 種陽性對照；四個所述的抗體芯片放于與常規(guī)96孔酶標板尺寸相符的芯片固定框上進行 標準ELISA系統(tǒng)的自動化操作；受體標準品混合物，是將40種受體標準品按照一定的量混 合在一起的凍干混合物；生物素標記的受體檢測抗體混合物；和熒光染料Cy3標記的鏈霉 親和素。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述的標準組織玻片是用活性 氨基包被處理。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述的標準組織玻片是用非接 觸性點樣儀將多種抗原特異性抗體點成2X8個相同的抗體微陣列，并用相配套可拆裝的 2X8孔框架把微陣列分割在16個互不干擾的小區(qū)內；玻片和框架之間通過兩側的邊框夾 緊扣形成抗體芯片。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述框架是由三部分組成：上 層塑料框架、下層乳膠封閉框和兩側的邊框夾；乳膠封閉框通過高透明雙面膠貼于表面點 有微陣列的玻片上，乳膠封閉框的另一面貼上塑料框架，再用邊框夾將它們兩邊夾緊，形成 孔間互不交叉污染的反應器，如圖1所示。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述的抗體芯片是用濃度分別 為200ug/ml的40種抗體點樣；每種抗體是用含有0. 01-10g/100ml牛白蛋白的特異性PBS 緩沖液配制；每個抗體在每個微陣列中有四次的重復點樣，以致從單一微陣列中得到該受 體四倍于ELISA的實驗數(shù)據(jù)。所述點樣是采用全自動點樣儀完成點樣操作，使各特異性抗 體獨立排布于所述玻片。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述特異性抗體為選自針對如 下受體的抗體：腫瘤壞死因子受體4-1BB、白細胞活化黏附因子、刺激分子B7-1、B細胞成熟 因子、髓系細胞特異性富含亮氨酸糖蛋白、腫瘤壞死因子受體CD30 ;腫瘤壞死因子配體-5、 癌胚抗原相關細胞黏附分子1、死亡受體6、酪氨酸激酶、細胞膜糖蛋白、受體型酪氨酸激酶 ErbB3、E-選擇素、腫瘤壞死因子受體超家族成員6、人FMS樣酪氨酸激酶3配體、糖皮質 激素誘導的腫瘤壞死因子受體家族相關蛋白、皰疹病毒侵入介體、細胞間黏附分子3、白介 素-1受體4、白介素-1受體1、白介素-2受體γ、白介素-10受體β、白介素-17受體、白 介素-21受體、溶酶體膜蛋白2、載脂蛋白-2、L-選擇素、淋巴管內皮透明質酸受體1、主要 組織相容性復合物I類鏈相關蛋白Α、主要組織相容性復合物I類鏈相關蛋白Β、紐蘭格林 蛋白1受體1、血小板衍生生長因子受體、血小板內皮細胞粘附分子1、人類晚期糖化終產物 受體、細胞免疫球蛋白粘蛋白1、腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體、Trappin-2蛋白、尿激 酶型纖溶酶原激活劑受體、血管細胞粘附分子、X性連鎖外胚層發(fā)育不良-A2受體。上述各 種特異性抗體分別點樣于所述玻片形成若干個獨立識別位點。每個獨立識別位點上分別固 定有單一濃度的一種特異性抗體。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體芯片試劑盒的進一步特征，所述點樣包括：將100-1000pl 特異性抗體蛋白質的PBS緩沖液(含有0.01-10g/100ml牛白蛋白）點樣于所述玻片上，將點 樣好的玻片放于室溫條件下靜置過夜，于2-8°C保存?zhèn)溆谩?br>[0015] 本發(fā)明采用不同的特異性抗體作為定量檢測受體的探針，這些抗體之間的性質差 異大，穩(wěn)定性也差，為了確保制備芯片的抗體具有較高的純度和完好的生物活性，本發(fā)明采 用了合適的點樣液，即含有0. 01-10g/100ml牛白蛋白的PBS緩沖液，來溶解抗體。實驗表 明，該點樣液可有效防止抗體變性，從而維持其生物活性。
[0016] 現(xiàn)有的檢測芯片，點樣后處理通常包括水合、紫外交聯(lián)、洗脫、封閉等步驟。由于本 發(fā)明所采用優(yōu)良的點樣液，使得抗體芯片制備的步驟等到了極大的簡化，無需現(xiàn)