與整合素受體ανβ3相關(guān)的5肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域和蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及針對(duì)整合素受體α νβ 3具有高親和力多肽及其應(yīng)用，例如用于癌癥診斷和治療中。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，癌癥已經(jīng)成為引起人類(lèi)死亡的主要原因之一，而化療仍然是治療癌癥的主要方法，但是，由于傳統(tǒng)的化藥缺少針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性，導(dǎo)致了對(duì)病人的一些器官毒性。
[0003]整合素在體內(nèi)細(xì)胞中都有廣泛的表達(dá)，大多數(shù)細(xì)胞表面都可表達(dá)一種以上的整合素，這些整合素不僅參與著一些細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及凋亡等生理功能，而H在多種病理過(guò)程中也發(fā)揮著極為重要的作用。整合素家族包括18種α亞型和8種β亞型，而α β亞型的配對(duì)決定了配體的特異性。整合素超級(jí)家族中，整合素受體ανβ 3在成像與靶向治療中起著主要的作用。由于整合素受體ανβ 3在多種腫瘤如膠質(zhì)瘤，乳腺癌，黑色素瘤，前列腺癌及卵巢癌中都是高表達(dá)的，因此整合素受體ανβ 3成為比較重要的藥物靶點(diǎn)。目前3肽(序列為精氨酸-色氨酸-精氨酸)是證明對(duì)整合素ανβ 3具有高親和力的多肽(詳見(jiàn)專(zhuān)利:與整合素α νβ 3受體具有高親和力的多肽，申請(qǐng)?zhí)?01310019870.9)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供能夠與整合素受體α νβ 3相關(guān)的靶向多肽，使其能夠?qū)φ纤厥荏wα νβ 3高表達(dá)的腫瘤進(jìn)行診斷。
[0005]本發(fā)明所述的5肽是在3肽基礎(chǔ)上由5個(gè)氨基酸組成，其具有精氨酸-色氨酸-精氨酸-天冬酰胺-蛋氨酸的氨基酸序列。
[0006]為了檢測(cè)本發(fā)明多肽的藥理活性，體外實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光染料羅丹明B對(duì)多肽進(jìn)行標(biāo)記，以檢測(cè)其對(duì)腫瘤的靶向性。在體外細(xì)胞親和力實(shí)驗(yàn)和攝取實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的5肽展現(xiàn)出了其良好的對(duì)腫瘤細(xì)胞整合素受體ανβ3的靶向能力，且能力強(qiáng)于3肽。在體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，本發(fā)明的5肽為表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞的毒性。
[0007]下面是本發(fā)明部分藥效學(xué)實(shí)驗(yàn):
[0008]一、標(biāo)記熒光染料
[0009]本發(fā)明應(yīng)用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的熒光染料為羅丹明B(Rhodamine 8)，簡(jiǎn)稱(chēng)他8，分別與上述3肽，及本發(fā)明5肽通過(guò)酰胺鍵連接，簡(jiǎn)稱(chēng)分別為RWr-RhB與RWrNM-RhB，連接方法具體為取Img羅丹明B(詳見(jiàn)參考文獻(xiàn):Cao，J.，et al.，F(xiàn)ast clearing RGD-basednear-1nfrared fluorescent probes for in vivo tumor diagnosis.Contrast MediaMol Imaging, 2012.7(4):p.390-402)溶于 Iml PBS (pH 為 7.4)中，加入 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)(摩爾比RhodamineB: EDC: NHS = I: 1.5: 1.5)，避光反應(yīng)4h，活化。分別稱(chēng)取Immol 3肽及5肽溶入含有熒光染料羅丹明B的Iml PBS緩沖液(pH7.4)中，室溫避光攪拌過(guò)夜。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液濃縮后通過(guò)葡聚糖凝膠G-25柱，PBS緩沖液(pH7.4)作洗脫液，得到純化的RWr-RhB及RWrNM-RhB，_20°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩－h(huán)狀RGD作為對(duì)照也使用相同的方法標(biāo)記簡(jiǎn)稱(chēng)為c(RGDyK)-RhB0
[0010]二、體外細(xì)胞親和力實(shí)驗(yàn)
[0011 ] 將培養(yǎng)好的人腦膠質(zhì)瘤U87MG細(xì)胞從12孔板上洗脫后重懸于PBS溶液，分別與羅丹明B標(biāo)記的3肽，5肽(500umol/L)共孵育2小時(shí)，并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其平均熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)證明對(duì)細(xì)胞的親和力越強(qiáng)。當(dāng)探針與細(xì)胞上的受體親和力強(qiáng)時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值高。體外親和力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示濃度相同的標(biāo)記了 RhB的3肽，5肽的探針?lè)謩e與整合素受體高表達(dá)的U87MG細(xì)胞孵育后，在U87MG細(xì)胞中3肽探針平均熒光強(qiáng)度為98，5肽探針平均熒光強(qiáng)度為123，空白染料平均熒光強(qiáng)度為25，結(jié)果表明這些探針在與U87MG細(xì)胞親和力強(qiáng)弱對(duì)比中，本發(fā)明5肽的強(qiáng)度最大。
[0012]三、體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)
[0013]將培養(yǎng)好的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG，人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231，人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和正常肝細(xì)胞L02轉(zhuǎn)移到共聚焦皿中，過(guò)夜孵育后分別加入相同濃度的羅丹明B標(biāo)記的5肽(500umol/L)，加入羅丹明B標(biāo)記的環(huán)狀RGD作為陽(yáng)性對(duì)照，37°C孵育2小時(shí)后，加入染核試劑12 μ g/mL Hochest33342染色，最后用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)探針的攝取情況。在整合素受體α V β 3高表達(dá)的U87MG和MDA-MB-231細(xì)胞中(圖1所示)，環(huán)狀RGD和5肽探針顯示出了很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，而在整合素受體α V β 3低表達(dá)的MCF-7和L02細(xì)胞(圖2所示)，這兩種探針的熒光強(qiáng)度不強(qiáng)，這一結(jié)果說(shuō)明5肽探針對(duì)整合素受體α V β 3高表達(dá)的細(xì)胞有靶向性而對(duì)整合素受體α νβ 3低表達(dá)的細(xì)胞靶向性不強(qiáng)。
[0014]四、體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
[0015]U87MG細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞與正常肝L02細(xì)胞，待長(zhǎng)至90%以上時(shí)，用0.25%胰蛋白酶液消化后，制備成單細(xì)胞懸液(完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基)，以3000個(gè)細(xì)胞/孔鋪96孔板，于37°C，含5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)24h后換為1% FBS的低血清培養(yǎng)液，然后加入不同濃度梯度的5肽，使他們的終濃度為2.5，5，10，20，40，80，100和200 μ Mo結(jié)果顯示(圖3所示)5肽對(duì)這幾種細(xì)胞的存活率均在80%以上，說(shuō)明5肽對(duì)這些細(xì)胞基本無(wú)毒。
[0016]綜上所述，本發(fā)明的5肽能夠靶向到整合素受體α νβ 3高表達(dá)的細(xì)胞上，而對(duì)整合素受體α V β 3低表達(dá)的細(xì)胞基本無(wú)靶向性，并且5肽對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒性。由此可見(jiàn)5肽能夠成為對(duì)整合素受體α νβ 3高表達(dá)腫瘤進(jìn)行體外診斷。
[0017]本發(fā)明的5肽可以?xún)?yōu)選用實(shí)施例1固相合成的方法制備。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1激光共聚焦細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)觀察羅丹明B標(biāo)記的探針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的攝取(Α為U87MG細(xì)胞，B為MDA-MB-231細(xì)胞)
[0019]圖2激光共聚焦細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)觀察羅丹明B標(biāo)記的探針對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的攝取(A為MCF-7細(xì)胞，B為L(zhǎng)02細(xì)胞)
[0020]圖3體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察5肽對(duì)不同細(xì)胞的毒性【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例1
[0022]5肽的合成
[0023]1:偶聯(lián)
[0024]先將Fmoc-Met-Rink amide MBHA resin (荷甲氧幾?；?苯丙氨酸-rink氨基樹(shù)脂)0.33/2mmol6.06g溶脹于二甲基甲酰胺中，10ml/g樹(shù)脂，接著用20 %六氫吡啶/ 二甲基甲酰胺溶液脫去Fmoc保護(hù)基(以下稱(chēng)之為脫帽)，用二甲基甲酰胺洗滌脫帽子后的樹(shù)脂，加入原料Fmoc-Asn (tBU)-OH 2.3g，縮合劑用HBTU 1.44g，反應(yīng)時(shí)間30分鐘，kaiser法檢測(cè)，如檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)完成，則接下去進(jìn)行脫帽，時(shí)間30分鐘，如檢測(cè)結(jié)果仍為陽(yáng)性，則說(shuō)明偶聯(lián)反應(yīng)未完成或反應(yīng)不完全，需要延長(zhǎng)偶聯(lián)時(shí)間或重新投料偶聯(lián)，直至偶聯(lián)反應(yīng)完成。重復(fù)上述操作，依次偶聯(lián)；Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH ；Fmoc-Trp-OH ；Fmoc-Arg(Pbf) -OH,完成所有直鏈肽合成后，用甲醇洗滌所得到的peptidyl resin,真空干燥箱里充分干燥。
[0025]2:樹(shù)脂與肽的分離裂解
[0026]將120ml裂解液(10ml/g peptidyl resin)加入樹(shù)脂中，25 °C條件下，磁力攪拌2.5h后用砂芯漏斗將裂解液與樹(shù)脂分離，棄去樹(shù)脂，保留濾液。將濾液緩慢滴加到1eq體積的冰無(wú)水乙醚中，滴加完畢后，自然沉降30min。然后用高速離心機(jī)離心1min (4000rpm)，棄去上清液，保留沉淀，將所得沉淀在干燥箱中干燥8_10h，得到干粉粗品O
[0027]3:純化
[0028]取上述干粉粗品lg，用0.1 %三氟乙酸/水溶解。經(jīng)過(guò)濾后，上樣到C18制備柱，用高效液相進(jìn)行梯度洗脫，收集目標(biāo)肽的洗脫液體，檢測(cè)液體純度。把合格的樣品混合后旋蒸，最后用凍干機(jī)凍干，得到Arg-Trp-Arg-Asn-Met，純度大于98%。
[0029]序列為:Arg-Trp-Arg-Asn-Met
[0030]質(zhì)譜圖中可以看出Arg-Trp-Arg-Asn-Met 分子量是 381.7*2-2 = 761.4
[0031]紫外光譜圖中273nm處有肽的吸收峰。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種與整合素α νβ 3具有高親和力的多肽，其序列為:Arg-Trp-Arg-Asn-Met。
2.權(quán)利要求1的多肽用于診斷腫瘤疾病的用途。
3.權(quán)利要求1的多肽用于治療腫瘤疾病的用途。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物工程制藥技術(shù)領(lǐng)域或蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物及生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體涉及一種對(duì)整合素受體具有高親和力的多肽及其應(yīng)用，例如用于癌癥診斷和治療中。本發(fā)明所述的多肽由5個(gè)氨基酸組成其序列為精氨酸-色氨酸-精氨酸-天冬酰胺-蛋氨酸(Arg-Trp-Arg-Asn-Met)。體外流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定親和力實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的多肽對(duì)整合素受體高表達(dá)的細(xì)胞有很強(qiáng)的靶向性；體外激光共聚焦細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的多肽能夠靶向到整合素受體αvβ3高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞上，而對(duì)整合素受體αvβ3低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞基本無(wú)靶向作用。體外細(xì)胞毒性結(jié)果顯示本發(fā)明的5肽對(duì)細(xì)胞基本無(wú)毒性，在癌癥的診斷和治療中，有著很好的應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】A61K47-48, A61P35-00, C07K7-06, C12Q1-04
【公開(kāi)號(hào)】CN104774247
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510190462
【發(fā)明人】顧月清, 張聰穎, 趙夢(mèng)路, 王茜, 田彩平, 劉雨溪
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年4月20日