專利名稱：雙靶向于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和整合素的轉(zhuǎn)基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，構(gòu)建了一種以聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)為基本骨架，聯(lián)合靶向于腫瘤細(xì)胞表面成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs)和整合素(integrin)的非病毒轉(zhuǎn)基因載體，用于將編碼報(bào)告基因和治療基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入高表達(dá)FGFR和整合素受體的腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明還涉及該非病毒轉(zhuǎn)基因載體的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
基因治療指得是指將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)部，通過(guò)恢復(fù)或增添基因表達(dá)以糾正人自身基因的結(jié)構(gòu)或功能上的錯(cuò)亂，阻止病變的進(jìn)展，殺滅病變的細(xì)胞，或抑制外源病原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，從而達(dá)到治療疾病的目的。基因治療是未來(lái)治療腫瘤等疾病行之有效的治療措施?；蛑委煱ㄈ齻€(gè)重要環(huán)節(jié)，即目的基因、轉(zhuǎn)基因載體和靶細(xì)胞。其中轉(zhuǎn)基因載體是基因治療的核心技術(shù)也是目前基因治療技術(shù)進(jìn)展的瓶頸之一。非病毒轉(zhuǎn)基因載體相對(duì)于病毒載體而言具有安全性高、免疫原性低、易于對(duì)DNA進(jìn)行操作、制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、影響因素容易控制等優(yōu)點(diǎn)，愈來(lái)愈受重視，而非病毒載體的缺點(diǎn)在于轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低和缺乏靶向性，目前主要策略是構(gòu)建以細(xì)胞受體為靶標(biāo)的非病毒轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)，利用細(xì)胞表面表達(dá)特異性的受體或蛋白，將特定的配體分子或片段與載體連接形成分子偶聯(lián)體，使DNA能靶向性地轉(zhuǎn)到表達(dá)受體的細(xì)胞，同時(shí)通過(guò)啟動(dòng)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程，從而達(dá)到提高轉(zhuǎn)染效率的目的。聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是最常用的陽(yáng)離子多聚物非病毒基因轉(zhuǎn)載體[1，2]，含有一級(jí)胺、二級(jí)胺和三級(jí)胺，-NH2具有很強(qiáng)的DNA結(jié)合作用，因此PEI可以通過(guò)電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA分子形成數(shù)百納米大小的復(fù)合物(complexes)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞或吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞，-NH-、＝N-質(zhì)子化后有很強(qiáng)的緩沖作用，可以保護(hù)DNA在細(xì)胞溶酶體中不被核酸酶降解。PEI的緩沖作用有滲透性腫脹效應(yīng)，導(dǎo)致溶酶體破裂，使DNA進(jìn)入胞漿，并促進(jìn)DNA進(jìn)入細(xì)胞核。
成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs)是一個(gè)結(jié)合肝素的多肽家族，至少包括了23個(gè)結(jié)構(gòu)上相關(guān)的多肽，其中bFGF(basic fibroblastgrowth factor，bFGF或稱FGF-2)與腫瘤關(guān)系較密切，bFGF可刺激腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)是強(qiáng)有力的血管生成劑，在腫瘤的血管形成中具有重要作用。研究表明，許多癌細(xì)胞系高表達(dá)FGFR，如Chandler等[3]研究了60株9個(gè)不同類型的人腫瘤細(xì)胞系FGFR的表達(dá)情況，結(jié)果表明90％表達(dá)一種以上的FGFR。在靜息細(xì)胞的細(xì)胞核里，幾乎檢測(cè)不到bFGF及其受體。
在病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的時(shí)候，牽涉到雙受體機(jī)制。一方面需要病毒特異受體，另一方面需要結(jié)合整合素，病毒才能有效地進(jìn)入細(xì)胞。多種病毒通過(guò)顆粒衣殼蛋白的RGD基元(RGD motif)與細(xì)胞表面地整合素結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。整合素是細(xì)胞表面粘附分子，參與細(xì)胞-細(xì)胞基質(zhì)之間的粘附過(guò)程；在腫瘤發(fā)展中參與腫瘤的粘附、侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)。模擬病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞需要的雙受體介導(dǎo)機(jī)制，包含RGD序列的多肽可以模擬整合素的天然配體，而后聯(lián)合靶向FGFR的轉(zhuǎn)基因載體對(duì)腫瘤的基因治療有聯(lián)合靶向作用，聯(lián)合靶向可以有效提高靶向性和轉(zhuǎn)染效率。
不同類型細(xì)胞表面受體的配體例如糖類殘基、肽、蛋白質(zhì)和抗體已用于靶向非病毒載體，如轉(zhuǎn)鐵蛋白、甘露糖、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、葉酸等，bFGF完整分子靶向的病毒載體和多聚賴氨酸載體已有報(bào)道[4-10]。目前在非病毒載體的構(gòu)建方面，多肽配體的應(yīng)用因?yàn)槎嚯暮铣珊?jiǎn)便、可以降低完整分子偶聯(lián)所帶來(lái)的空間位阻效應(yīng)而成為研究方向之一。目前使用bFGF功能域多肽分子聯(lián)合模擬整合素配體的RGD多肽偶聯(lián)的PEI尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供聯(lián)合靶向于細(xì)胞表面FGFR和整合素的聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)，包括與FGFR特異結(jié)合的多肽CR16的設(shè)計(jì)、模擬整合素配體的含RGD多肽CP9的設(shè)計(jì)、多肽CR16/多肽CP9/PEI/外源DNA的非病毒轉(zhuǎn)基因載體復(fù)合物系統(tǒng)的設(shè)計(jì)、各組件的偶聯(lián)率和合成工藝，以及利用該非病毒轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)介導(dǎo)外源基因在治療包括肝癌、前列腺癌、宮頸癌等多種惡性腫瘤中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第一部分提供與細(xì)胞表面堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體特異結(jié)合的多肽CR16和模擬細(xì)胞表面整合素配體的多肽CP9，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了bFGF配體多肽CR16序列NH2-Cys-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-OH，合成的模擬整合素配體的含RGD多肽CP9序列NH2-Cys-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro-OH。多肽通過(guò)固相法合成，在美國(guó)ABI公司的多肽合成儀(431A)上進(jìn)行，采用Fmoc(9-芴甲氧羰基)方案，合成步驟按照ABI公司的多肽合成操作手冊(cè)進(jìn)行。經(jīng)高效液相色譜純化，純度＞95％，序列鑒定通過(guò)質(zhì)譜分析。多肽要與巰基化的大分子作交聯(lián)，合成后寡肽末端的半胱氨酸保持巰基活性，同時(shí)避免多肽之間交聯(lián)，多肽中不含有巰基還原劑，如DTT、二巰基乙醇或二巰基乙烷等。
本發(fā)明的第二部分提供雙多肽/PEI/外源DNA的非病毒轉(zhuǎn)基因載體復(fù)合物系統(tǒng)，其中多肽是CR16和CP9，陽(yáng)離子多聚物是聚乙烯亞胺PEI，外源DNA是報(bào)告基因如編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP的質(zhì)粒pEGFP和編碼蟲熒光素酶的pCAG-Luc等。該非病毒載體復(fù)合物的構(gòu)建方法合成的多肽末端含一個(gè)自由巰基的半胱氨酸(Cysteine，C)，用于與異雙功能交聯(lián)劑活化的PEI形成二硫鍵，保證每條多肽與PEI只有一個(gè)交聯(lián)位點(diǎn)，制備多肽與PEI的偶聯(lián)產(chǎn)物，通過(guò)1H-NMR、紅外、紫外等理化手段鑒定多肽的成功偶聯(lián)，再與帶負(fù)電荷的外源DNA混合形成載體復(fù)合物系統(tǒng)，并通過(guò)電鏡、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)等證實(shí)復(fù)合物系統(tǒng)的形成。
本發(fā)明的第三部分是利用雙多肽/PEI/外源DNA的非病毒轉(zhuǎn)基因復(fù)合物系統(tǒng)在制備治療包括肝癌、前列腺癌、宮頸癌等各種惡性腫瘤腫瘤的藥物中的應(yīng)用，通過(guò)體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)染復(fù)合物最佳的偶聯(lián)率、N/P比和溶媒。
利用上述載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒、pCAG-Luc質(zhì)粒到猴胚腎細(xì)胞COS-7(FGFR陽(yáng)性)，人宮頸癌細(xì)胞HeLa(FGFR陽(yáng)性)，人前列腺癌細(xì)胞PC-3(FGFR陰性)，人肝癌細(xì)胞HepG2(FGFR陽(yáng)性)等并檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，實(shí)驗(yàn)證明CR16-PEI-CP9(偶聯(lián)率為摩爾比0.25∶1∶0.25)可有效地介導(dǎo)pEGFP質(zhì)粒和pCAG-Luc質(zhì)粒FGFR陽(yáng)性的Hela、COS-7、HepG2等細(xì)胞中表達(dá)，與自由PEI以及單多肽配體偶聯(lián)的PEI相比，轉(zhuǎn)染效率增高；而對(duì)FGFR陰性的PC-3細(xì)胞則不能增加轉(zhuǎn)染效率。建立BALB/C裸鼠的荷瘤模型，瘤體內(nèi)注射攜帶外源DNA的載體復(fù)合物系統(tǒng)，觀察目的基因的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)證明，CR16-PEI-CP9轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)可介導(dǎo)pCAG-Luc報(bào)告基因在HepG2肝癌裸鼠模型的瘤體局部有效地表達(dá)。
本發(fā)明非病毒轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)能在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中將外源DNA靶向性地導(dǎo)入表達(dá)FGFRs的腫瘤細(xì)胞，在惡性腫瘤基因治療中具有較好的應(yīng)用前景，為臨床腫瘤基因藥物的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。
向腫瘤釋放藥物或轉(zhuǎn)基因，F(xiàn)GFR是個(gè)潛在的吸引人的靶位點(diǎn)，大多數(shù)癌細(xì)胞以及腫瘤新生血管都高表達(dá)FGFRs。含RGD的多肽能有效模擬病毒轉(zhuǎn)染的第二配體功能，已經(jīng)在其他載體上得到較充分證明。本發(fā)明利用PEI作為非病毒轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)的骨架，同時(shí)利用FGFR和整合素在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞和腫瘤新生血管高表達(dá)的特點(diǎn)，自主設(shè)計(jì)了能與腫瘤細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合的多肽CR16和CP9，利用化學(xué)交聯(lián)技術(shù)將兩多肽與PEI偶聯(lián)，構(gòu)建了新型的非病毒基因載體系統(tǒng)，以增加其對(duì)腫瘤細(xì)胞及其新生血管的靶向性，旨在提供用于惡性腫瘤基因治療藥物制備的研究。利用配體多肽識(shí)別腫瘤細(xì)胞膜上過(guò)量表達(dá)的受體，啟動(dòng)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑，通過(guò)該途徑將外源DNA選擇性地導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，達(dá)到治療腫瘤的目的。bFGF受體結(jié)合區(qū)多肽聯(lián)合整合素結(jié)合功能區(qū)多肽靶向的PEI尚未見應(yīng)用和報(bào)道。
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種能與腫瘤細(xì)胞膜表面成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體特異結(jié)合的合成多肽CR16，聯(lián)合靶向整合素的多肽CP9，構(gòu)建了CR16-CP9肽/陽(yáng)離子多聚物PEI/外源DNA復(fù)合體非病毒基因轉(zhuǎn)移載體；發(fā)明的非病毒基因轉(zhuǎn)移載體能將外源DNA有效地導(dǎo)入高表達(dá)FGFRs的腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，但對(duì)不表達(dá)FGFRs的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率很低，使得載體系統(tǒng)具備了腫瘤靶向性；本發(fā)明非病毒轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)可轉(zhuǎn)移的外源DNA大小范圍可以從幾十bp到幾千kb，克服了病毒載體插入外源基因的大小限制，可用于制備多基因的聯(lián)合轉(zhuǎn)移以治療腫瘤的藥物，同時(shí)也可作為平臺(tái)技術(shù)用于制備治療其他疾病的基因藥物。
說(shuō)明書附1CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)的1H-NMR圖譜；圖2CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)的傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜圖譜；圖3CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)的熱重量分析圖譜；圖4CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)的紫外可見光譜；圖5CR16-PEI-CP9/pEGFP DNA凝膠電泳結(jié)果；圖6CR16-PEI-CP9/pEGFP DNA復(fù)合物(N/P＝10)電鏡結(jié)果；圖7CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)/DNA復(fù)合物粒徑測(cè)定結(jié)果；圖8CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)/pCAG-Luc轉(zhuǎn)染COS-7、HepG2、PC3細(xì)胞后熒光表達(dá)水平；圖9CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)轉(zhuǎn)染pEGFP到COS-7細(xì)胞的熒光照片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例一多肽與PEI通過(guò)異雙功能交聯(lián)劑SPDP(Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate)偶聯(lián)。SPDP與PEI(pH7～8)的氨基作用，形成吡啶二巰基修飾的PEI(PDP-PEI)；后者可與含有巰基的蛋白質(zhì)反應(yīng)。多肽通過(guò)半胱氨酸巰基團(tuán)與PDP-PEI反應(yīng)，產(chǎn)生二硫鍵連接的寡肽-PEI衍生物。取與PEI不同摩爾比的CR16、CP9肽與PEI形成偶聯(lián)產(chǎn)物，通過(guò)各種理化手段表征復(fù)合物，再按照一定N/P比與帶負(fù)電荷的外源DNA通過(guò)靜電作用結(jié)合成CR16肽/CP9肽/PEI/外源DNA載體復(fù)合物，然后將該轉(zhuǎn)染復(fù)合物應(yīng)用于體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，確定轉(zhuǎn)基因的效果和確定轉(zhuǎn)基因條件。
1.CR16、CP9肽的合成多肽通過(guò)固相法合成，經(jīng)高效液相色譜純化，純度＞95％，序列鑒定通過(guò)質(zhì)譜分析。多肽要與巰基化的大分子作交聯(lián)，合成后寡肽末端的半胱氨酸保持巰基活性，同時(shí)避免多肽之間交聯(lián)，多肽中不含有巰基還原劑(如DTT、二巰基乙醇或二巰基乙烷等)。多肽的功能通過(guò)多肽PEI偶聯(lián)物/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選和驗(yàn)證。
2.活化PEI的制備以及與肽的偶聯(lián)50ml圓底燒瓶中各加入2.78ml PEI(9mg/ml)溶液，準(zhǔn)確稱取5.1mg SPDP溶于1600μl生理鹽水和1600μlDMSO的混合液中，平均分為四份，每份800μl，分別加入圓底燒瓶中與PEI溶液混合，室溫下攪拌暗處反應(yīng)3小時(shí)。停止第一步反應(yīng)，準(zhǔn)確稱取相應(yīng)不同摩爾比的CR16和CP9溶于1500μl生理鹽水中(本發(fā)明過(guò)程中，肽和PEI的摩爾比設(shè)了0.25∶1，0.5∶1，1∶1，2∶1四個(gè)比例)，按比例分為四份分別加入上述燒瓶中，進(jìn)行第二步反應(yīng)。室溫，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌暗處反應(yīng)過(guò)夜。停止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物置于透析袋(MWCO為10000)中，流動(dòng)水透析2天，然后冰凍干燥48hr，得到白色粉末狀固體產(chǎn)物。
3.多肽-PEI偶聯(lián)物的鑒定3.11H-NMR通過(guò)NMR鑒定多肽與PEI是否偶聯(lián)成功。取一部分待測(cè)定的多肽-PEI溶液與自由的PEI溶液真空干燥。干燥后的白色粉末溶于氧化氘(deuterium oxide，D2O)，0.22μm針式微型濾器過(guò)濾，在Varian Inova 600MHz波譜儀(Varian，Palo Alto，CA)上應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)子參數(shù)測(cè)定1H-NMR波譜，峰的化學(xué)位移參照HDO(hydrogen deuderium oxide，HDO)的共振峰(4.8ppm)。結(jié)果參見

圖1，其中圖A為PEI的1H-NMR圖譜，圖B為CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)的1H-NMR圖譜。
3.2傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜1mg的固體樣品與10～100倍的溴化鉀(KBr)在瑪瑙研缽中研磨成細(xì)粉末混合物，取適量用壓片機(jī)減壓壓片，壓成直徑10mm，厚10mm薄片，裝入FT-IRBruber Vector22紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)量。取少量的PEI，溶于DMSO有機(jī)溶劑中形成1％～5％的溶液。滴一滴液體夾在兩塊氯化鈉鹽片之間(氯化鈉在4000～625cm-1之間是透明的)，裝入FT-IR Bruber Vector22紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果參見圖2，其中上線為CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)，下線為PEI3.3熱重量分析用Universal V3.8B TA設(shè)備進(jìn)行熱重量分析。樣品以10℃/min的速度在氮?dú)夥罩?流速＝70ml/min)從室溫開始慢慢升溫到600℃，結(jié)果參見圖3，其中圖A為PEI，圖B為CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)。
3.4紫外可見光譜取一定量樣品溶于大約5ml的純水中配成溶液，用HITACHI U-3400型紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果參見圖4，其中圖A為PEI，圖B為CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)。
以上各種理化手段均表明多肽成功偶聯(lián)到PEI上。
4.CR16-CP9肽/PEI/外源DNA復(fù)合物載體的制備，凝膠電泳鑒定，透射電鏡觀察大小和形態(tài)，粒徑測(cè)定。
4.1CR16-CP9肽/PEI/外源DNA復(fù)合物載體凝膠電泳鑒定按PEI/DNAN/P＝0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0，應(yīng)用5％GS作為溶媒，分別配制CR16-CP9肽/PEI/pEGFP DNA混合液，分別取10μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA阻滯情況。電泳條件1％瓊脂糖(含0.5μg/ml溴化乙錠)，1×TAE緩沖液，電壓5V/cm，電泳時(shí)間30min。結(jié)果表明N/P比大于3時(shí)可將質(zhì)粒DNA完全阻滯在加樣孔中。結(jié)果見附圖5。
4.2CR16-CP9肽/PEI/外源DNA復(fù)合物載體透射電鏡觀察大小和形態(tài)CR16-CP9肽/PEI/外源DNA復(fù)合物的大小和形態(tài)通過(guò)負(fù)染透射電鏡檢測(cè)。按N/P＝10制備PEI/DNA復(fù)合物、CR16-CP9肽/PEI/pEGFP DNA復(fù)合物。溫育30min后，將復(fù)合物溶液謹(jǐn)慎地滴在覆有聚乙烯醇縮甲醇支持膜的銅/銠網(wǎng)上。1min后，將銅/銠網(wǎng)放在醋酸雙氧鈾溶液上負(fù)染20s。過(guò)量的溶液用吸水紙小心吸除。樣本在Philips TECNAI 10透射電子顯微鏡下觀測(cè)，電壓80kV。結(jié)果表明形成的復(fù)合物呈圓形，大小為200nm左右。結(jié)果見附圖6，透射電鏡觀察CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)/pEGFP質(zhì)粒復(fù)合物物理形狀和大小(N/P＝10，標(biāo)尺＝200nm)。
4.3CR16-CP9肽/PEI/外源DNA復(fù)合物載體的粒徑測(cè)定將CR16-CP9肽/PEI和質(zhì)粒DNA溶液按不同N/P比分別加入兩個(gè)1.5ml的eppendorf管中，分別用0.9％的生理鹽水將兩溶液都稀釋到最終體積250μl。將DNA溶液在振蕩中逐滴加入到CR16-CP9肽/PEI溶液中，振蕩1min后放置30min，然后用90Plus動(dòng)態(tài)光散射粒徑分析儀測(cè)定復(fù)合物粒徑。在比色皿中加入大約2/3的0.9％生理鹽水，然后將復(fù)合物加入比色皿中，置于儀器中測(cè)定粒徑。測(cè)定10次，每次1min，得出10個(gè)數(shù)據(jù)取其平均值。結(jié)果表明載體/DNA復(fù)合物在N/P為10時(shí)候，可以形成200nm左右大小的顆粒，N/P繼續(xù)增大，粒徑進(jìn)一步減少，但減少幅度不明顯。結(jié)果見附圖7。
5.CR16-CP9肽/PEI/外源DNA復(fù)合物載體系統(tǒng)用于COS-7細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及荷瘤裸鼠的基因治療5.1不同多肽偶聯(lián)率的CR16-PEI-CP9轉(zhuǎn)染pCAG-Luc到COS-7、HepG2、PC3細(xì)胞，確定最佳偶聯(lián)率和轉(zhuǎn)染N/P比。
將COS-7、HepG2、PC3細(xì)胞分別接種在48孔板，每孔2.5×104細(xì)胞。培養(yǎng)24h，待細(xì)胞60～80％融合時(shí)轉(zhuǎn)染。每孔轉(zhuǎn)染2μgpCAG-Luc質(zhì)粒，按PEI/DNAN/P＝5、(7.5)、10、20、30分別應(yīng)用PEI、CR16-PEI-CP9(肽與PEI摩爾比分別為0.25∶1、0.5∶1、1.0∶1、2.0∶1)制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1ml無(wú)血清DMEM，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加到細(xì)胞上，水平緩慢搖動(dòng)30min，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)6～8h后，吸去轉(zhuǎn)染液，每孔加入1ml含10％血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)36h后，倒掉上清，加入200ulPBS，-80℃反復(fù)凍融3次，取細(xì)胞懸液離心，取上清5ul，采用Promega公司的Luciferase檢測(cè)試劑盒，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，定量相應(yīng)體積上清的總蛋白量，計(jì)算單位蛋白(mg)的熒光表達(dá)量，結(jié)果表明CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)在N/P＝10時(shí)候，在FGFRs陽(yáng)性的COS-7和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高，高于對(duì)照PEI，反之，在FGFRs陰性的PC3細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率要低于PEI，結(jié)果見附圖8，其中圖A為CR16-PEI-CP9轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞的熒光值、圖B為轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞的熒光值、圖C為轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞的熒光值。
5.2CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)轉(zhuǎn)染pEGFP(N/P＝10)到COS-7細(xì)胞的熒光蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)染過(guò)程同5.1，質(zhì)粒采用pEGFP，轉(zhuǎn)染后36hr，采用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白發(fā)出的綠色熒光，結(jié)果顯示pEGFP被轉(zhuǎn)到COS-7細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)綠色熒光蛋白，發(fā)出綠色熒光。結(jié)果見附圖9。
5.3CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)用于荷瘤裸鼠的體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞株、PC3細(xì)胞株接種于裸鼠皮下，建立腫瘤模型，瘤塊長(zhǎng)至直徑約1.0cm時(shí)，瘤體內(nèi)注射攜帶pCAG-Luc質(zhì)粒的CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)載體復(fù)合物，注射質(zhì)粒量為50ug，N/P＝10，36hr后犧牲裸鼠，取出腫瘤，用1mlPBS制成勻漿，-80℃反復(fù)凍融3次，離心，取10ul上清采用Promega公司的Luciferase檢測(cè)試劑盒，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，定量相應(yīng)體積上清的總蛋白量，計(jì)算單位蛋白(mg)的熒光表達(dá)量。結(jié)果表明雖然體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率要低于體外實(shí)驗(yàn)，但是CR16-PEI-CP9(0.25∶1∶0.25)在體內(nèi)仍顯示轉(zhuǎn)染效率高于PEI對(duì)照。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.雙靶向于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和整合素的聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)基因載體，由多肽/多聚乙烯亞胺/外源質(zhì)粒DNA組成，其特征是由堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的受體結(jié)合區(qū)多肽和整合素結(jié)合區(qū)多肽聯(lián)合靶向。
2.如權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因載體，其特征是由堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子配體多肽和整合素配體多肽/聚乙烯亞胺/外源質(zhì)粒DNA組成的非病毒載體復(fù)合物系統(tǒng)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因載體，其特征是所述的多肽是與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體特異結(jié)合的多肽CR16和與整合素特異結(jié)合的多肽CP9。
4.如權(quán)利要求1或2所述的轉(zhuǎn)基因載體，其特征是所述的外源DNA，是含報(bào)告基因、細(xì)胞因子基因、抑癌基因的真核重組表達(dá)質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因載體，其特征是所述CR16的氨基酸序列為NH2-Cys-Tyr-Arg-Ser-Arg-Lys-Tyr-Thr-Ser-Trp-Tyr-Val-Ala-Leu-Lys-Arg-OH，所述CP9的氨基酸序列為NH2-Cys-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp-Thr-Pro-OH。
6.如權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)基因載體，其特征是所述的寡肽CR16和CP9，每條多肽末端含有一個(gè)半胱氨酸，包含自由的巰基，用于與交聯(lián)劑活化的聚乙烯亞胺偶聯(lián)。
7.權(quán)利要求1-6任一所述的轉(zhuǎn)基因載體在制備治療腫瘤的基因藥物中應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供雙靶向于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體和整合素的轉(zhuǎn)基因載體，包括與堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體特異結(jié)合的多肽CR16、與整合素特異結(jié)合的多肽CP9、CR16/CP9/陽(yáng)離子多聚物PEI/外源DNA的基因轉(zhuǎn)移非病毒載體復(fù)合物系統(tǒng)。本發(fā)明提供的載體能將外源DNA有效地導(dǎo)入高表達(dá)FGFRs的腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，對(duì)不表達(dá)FGFRs的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率很低，具備了腫瘤靶向性；提供的非病毒轉(zhuǎn)基因載體系統(tǒng)可轉(zhuǎn)移的外源DNA范圍從幾十bp到幾千kb，克服了病毒載體插入外源基因的大小限制，可用于制備多基因的聯(lián)合轉(zhuǎn)移以治療腫瘤的藥物，同時(shí)也可作為平臺(tái)技術(shù)用于制備治療其他疾病的基因藥物。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1757738SQ20051005082
公開日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月22日
發(fā)明者王青青, 李達(dá), 李經(jīng)忠, 湯谷平, 余海, 曹雪濤 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)