與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(vegfr-3)蛋白特異性結(jié)合的多肽，其篩選方法，鑒定和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種多膚的篩選及其應(yīng)用，尤其設(shè)及一種能 與人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-3(VEGFR-3)特異性結(jié)合的多膚及上述多膚的衍生產(chǎn)品在腫瘤 祀向給藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，針對(duì)腫瘤細(xì)胞特有的分子信號(hào)通路的開發(fā)的分子祀向藥物，層出不窮。但 是隨著研究的深入，其局限性開始突顯，基因突變產(chǎn)生的耐藥性問題的存在限制了其在臨 床的應(yīng)用。祀向給藥系統(tǒng)（targeted化Ug deliveiT system,TDDS)，是指載體將藥物通過 局部給藥或全身血液循環(huán)而選擇性地濃集定位于病變組織、器官、細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的新 型給藥系統(tǒng)，可使病變部位的藥物濃度明顯提高，從而減少用藥量，增加用藥安全性，是目 前較有前景的研究方向。其中，祀向給藥系統(tǒng)按作用方式不同，可分為被動(dòng)祀向（passive 1:argeting)和主動(dòng)祀向（active targeting);被動(dòng)祀向是一種基于腫瘤組織的EPR(增強(qiáng)滲 透和滯留）效應(yīng)使遞藥系統(tǒng)祀向分布于腫瘤組織的策略，但是不均勻的粒徑分布使得微粒 進(jìn)入血液循環(huán)后，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)攝取而蓄積于肝、脾等器官產(chǎn)生毒性，而致密的 腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)W及較高的腫瘤間質(zhì)壓極大地阻礙了藥物進(jìn)入腫瘤深層，造成腫瘤內(nèi)藥物 的不均勻分布，為腫瘤的治愈又增加了難度。因而，借助腫瘤組織高表達(dá)的特異性受體的介 導(dǎo)作用，增加遞藥系統(tǒng)在腫瘤組織、細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)分布的主動(dòng)祀向給藥系統(tǒng)的開發(fā)顯得 尤為重要。
[0003] 小分子多膚具有相對(duì)分子質(zhì)量小、活性高、免疫原性低、易于制備等特點(diǎn)，近年來 廣泛應(yīng)用于腫瘤主動(dòng)祀向治療。利用腫瘤組織某些異常表達(dá)的蛋白，研究人員篩選出能特 異性識(shí)別腫瘤組織的高活性小分子膚段，通過氨基酸側(cè)鏈的功能基團(tuán)連接于藥物載體，能 夠顯著提高腫瘤藥物治療的療效。例如，祀向整合素受體的RGD多膚，祀向血管生成受體的 K237多膚，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和淋己管生成影響較大的Lyp-I多膚等修飾的多膚祀向給藥系統(tǒng)在 癌癥治療領(lǐng)域研究較為深入。腫瘤祀向多膚不僅在祀向治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其還 可W通過與分子成像試劑偶聯(lián)，應(yīng)用于腫瘤分子成像，提高腫瘤診斷的靈敏度和特異性。
[0004] 目前，小分子多膚的發(fā)現(xiàn)主要有組合化學(xué)膚庫(kù)，表面展示技術(shù)和基于結(jié)構(gòu)的計(jì)算 機(jī)輔助設(shè)計(jì)，其中，組合化學(xué)膚庫(kù)的篩選合成周期長(zhǎng)，效率較低，不易純化，不適合大規(guī)模篩 選;表面展示技術(shù)應(yīng)用較多的有隧菌體展示，酵母展示，細(xì)菌展示等，W隧菌體展示技術(shù)為 例，它是一種將編碼多膚的外源基因或隨機(jī)序列的DNA分子群與負(fù)責(zé)表達(dá)隧菌體外殼蛋白 的基因融合后，使外源DNA所編碼的蛋白質(zhì)W融合蛋白形式表達(dá)在隧菌體外殼表面，導(dǎo)入各 種外源基因的一組隧菌體集合構(gòu)成一個(gè)展示各種外源多膚的隧菌體展示膚庫(kù)，之后，將隧 菌體集合與其各種祀分子(細(xì)胞表面受體、荷瘤小鼠等)進(jìn)行多輪淘選(panning)，實(shí)現(xiàn)高通 量親和篩選活性多膚的方法。但構(gòu)建庫(kù)容量大、具有更多生物學(xué)意義的氨基酸序列仍需進(jìn) 一步的改進(jìn)，且篩選過程繁瑣，費(fèi)時(shí)。計(jì)算機(jī)模擬篩選方法是一種計(jì)算機(jī)輔助篩選和化學(xué)合 成篩選相結(jié)合的方法，基于腫瘤過度表達(dá)的蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，選取可能具有活性的氨基酸 片段組成多膚庫(kù)，用分子對(duì)接的方法進(jìn)行評(píng)估虛擬篩選，縮小實(shí)驗(yàn)對(duì)象、提高實(shí)驗(yàn)篩選命中 率。利用化學(xué)合成多膚，通過實(shí)驗(yàn)的手段進(jìn)行驗(yàn)證，為尋找腫瘤祀向分子治療藥物或輸送導(dǎo) 向"彈頭"開辟一條新穎、快捷、經(jīng)濟(jì)的途徑。
[0005] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(vascuLar endothelia growth factor recepto;r-3， VEGFR-3，又稱化T4)屬于HI型受體酪氨酸激酶(RTKs)亞家族，是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體家 族的一員，目前該家族已發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體還有VEGFR-UVEGFR-2,人們普通認(rèn) 為，VEGFR-I主要介導(dǎo)細(xì)胞骨架重排引起細(xì)胞遷移，并引起單核細(xì)胞趨化，調(diào)節(jié)VEGF與 VEGFR-2的結(jié)合;VEGFR-2則主要介導(dǎo)與腫瘤有關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，引起血管通透性 升高，并有抗內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡、維持內(nèi)皮細(xì)胞存活的作用，在誘導(dǎo)腫瘤新血管的形成過程中發(fā) 揮著最為重要的作用；而VEGFR-3主要介導(dǎo)淋己內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，與淋己血管的生成 和和腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。與RTK家族其它成員類似，VEGFR-3結(jié)構(gòu)上有如下特征： (1)胞外區(qū)由7個(gè)免疫球蛋白（Immunoglobulin)樣區(qū)構(gòu)成，其中第1~3個(gè)Ig樣區(qū)之間為其與 配體VEGF的結(jié)合位點(diǎn)，第4~7個(gè)Ig為受體二聚化位點(diǎn)，與激酶活性有關(guān)；（2)單次跨膜區(qū)； (3)胞內(nèi)區(qū)分為近膜區(qū)，催化區(qū)酪氨酸激酶域，激酶插入域和C末端激酶自身憐酸化區(qū)。Kari ALi化Lo等人在2013年解析了 VEGFR-3胞外區(qū)化1-D2，D4-D5 )，胞外結(jié)構(gòu)域中第5個(gè)免疫球蛋 白樣折疊在合成時(shí)被切割，切割后由一個(gè)二硫鍵連接。兩個(gè)單體的VEGFR-3通過第四個(gè)免疫 球蛋白域相互形成同源或異源二聚體，發(fā)揮生理活性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)VEGFR-3在許 多腫瘤中過度表達(dá)，如肺癌、乳腺癌、Kaposi^ S肉瘤、肝癌和鼻咽癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等。由 于腫瘤細(xì)胞遺傳的不穩(wěn)定性，傳統(tǒng)的細(xì)胞毒類抗腫瘤藥物極易產(chǎn)生耐藥性;已經(jīng)證實(shí)，腫瘤 的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移必須依賴于新血管和淋己管的形成，因此祀向抑制介導(dǎo)腫瘤的血管和淋己管 生成為抗腫瘤治療和防止腫瘤轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)非細(xì)胞毒性的重要途徑，同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞 在遺傳學(xué)上是穩(wěn)定的，不易產(chǎn)生變異而導(dǎo)致耐藥性。目前已有許多公司正在運(yùn)方面進(jìn)行積 極祀向治療的嘗試，并取得了積極的結(jié)果。抓D073抗體通過抑制VEGFR3的作用，成功抑制了 皿L細(xì)胞的增殖。除了抗體之外，針對(duì)VEGFR-3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路設(shè)計(jì)的小分子激酶抑制劑的研 究也在進(jìn)行之中，比如AZD2171 ,BIBF 1120等正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)，但是無論是抗體還是小分 子，均不是VEGFR-3特異性抑制劑，治療效果不佳，臨床進(jìn)展緩慢。
[0006] 針對(duì)VEGFR-3目前分子祀向藥物研究的缺陷和局限性，可W對(duì)其研究思路進(jìn)一步 拓寬和改造，充分利用VEGFR-3胞外區(qū)晶體結(jié)構(gòu)提供的S維信息，進(jìn)行基于祀標(biāo)結(jié)構(gòu)的合理 祀向多膚設(shè)計(jì)，將祀向多膚與生物相容性好，載藥量高的聚合物膠束相結(jié)合，W多膚為祀頭 將活性藥物輸送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，提高藥物的選擇性和安全性。運(yùn)一理念與近年來抗腫瘤 新藥研究的最新思路不謀而合，可謂是殊途同歸。但是運(yùn)一策略的研究關(guān)鍵依賴于多膚的 特異性和高親和力。目前已有針對(duì)VEGFR-3的多膚的出現(xiàn)，并在細(xì)胞水平上有效的祀向 VEGFR-3信號(hào)通路，但并未有進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)道，因此，本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步的新型 祀向多膚和多膚給藥系統(tǒng)的開發(fā)和研究，也可能為腫瘤的成像和診斷提供新的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和化學(xué)合成相結(jié)合的 方法，合理篩選出與VEGFR-3高親和力，分子量小，容易到達(dá)腫瘤組織部位的特異性多膚，并 進(jìn)行部分體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在腫瘤祀向給藥、癌癥診斷等方面彰顯出較強(qiáng)的優(yōu)越性，為 WVEGFR-3為祀點(diǎn)的多膚抗腫瘤祀向藥物系統(tǒng)的開發(fā)和設(shè)計(jì)提供有效的開發(fā)途徑。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過W下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：WVEGFR-3的晶體結(jié)構(gòu)（4BSJ)為基 礎(chǔ)，全面分析其作用模式，利用FTmap軟件尋找潛在的結(jié)合位點(diǎn)，并在遠(yuǎn)離VEGFR-3天然配體 的潛在結(jié)合口袋附近，考慮氨基酸的理化性質(zhì)和空間位置排序，構(gòu)建傾向性多膚庫(kù)，利用多 種對(duì)接軟件進(jìn)行虛擬篩選，互為驗(yàn)證，同時(shí)綜合考慮對(duì)接排名順序、氨鍵成鍵能力、空間構(gòu) 象、靜電互補(bǔ)、疏水作用和合成難易程度等因素，最終選出9條代表性的多膚進(jìn)行合成并投 入生物親和力實(shí)驗(yàn)，其中有3條多膚表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞親和活性。本發(fā)明氨基酸序列通式為 CXXPFXP，X為20種天然氨基酸中的任一種或其D型氨基酸，優(yōu)選