一種成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽及其應(yīng)用，具體涉及具有抑制成纖維細(xì) 胞生長因子，治療惡性腫瘤的多肽。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管生成是惡性實體腫瘤突破上皮基底膜后進(jìn)一步生長所必須的。腫瘤中新形成 的血管具有其自身獨特的結(jié)構(gòu)特點，表現(xiàn)為管壁不完整，無平滑肌成分，僅由有孔的內(nèi)皮細(xì) 胞和片狀的基膜構(gòu)成。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，新生血管的結(jié)構(gòu)特點使惡性腫瘤組織發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移 成為可能。因此，惡性實體腫瘤中新生血管的定量被認(rèn)為是一種重要的獨立的預(yù)后標(biāo)志。
[0003] 成纖維細(xì)胞生長因子，對腫瘤細(xì)胞有明顯的趨向活性，刺激成纖維細(xì)胞，血管內(nèi)皮 細(xì)胞等向病灶部位移動。當(dāng)細(xì)胞迀移至病灶部位時，開始進(jìn)入增殖和修復(fù)期，其中最關(guān)鍵的 步驟之一是肉芽組織的形成，肉芽組織的本質(zhì)是大量的毛細(xì)血管和豐富的成纖維細(xì)胞，是 成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞的高效促生長劑，能夠強烈促進(jìn)新生毛細(xì)血 管的形成，顯著增加肉芽組織毛細(xì)血管數(shù)量和血液流量，為腫瘤組織提供所需要的氧及豐 富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的生長。抑制成纖維細(xì)胞生長因子，可以有效抑制腫瘤組織中血管 的新生，斷絕腫瘤組織生長需要的氧及營養(yǎng)物質(zhì)，將腫瘤細(xì)胞"餓死"。從而，達(dá)到治療腫瘤 的效果。
[0004] 目前，沒有成熟開發(fā)的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽問世，用于治療惡性腫瘤。
[0005] 本專利中的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽已證明在結(jié)腸癌病中有效，具有在其他 腫瘤模型中開發(fā)的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的
[0007] 本發(fā)明提供全新的序列，該序列為成纖維細(xì)胞生長因子拮抗劑，對惡性腫瘤具有 很好的療效。
[0008] 技術(shù)方案
[0009] 成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽，其特征在于其序列為 GMLGGQEMWSWKCLLFWLKRRNFffQG 〇
[0010] 所述的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0011] 所述的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
[0012] 一種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多 肽。
[0013] 所述的試劑盒，其特征在于還有
[0014] (1)包被液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液；
[0015] (2) PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液；
[0016] (3)抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS 和 0? 2% BSA ;
[0017] (4)封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0% BSA
[0018] (5)洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05% Tween-20 ;
[0019] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0020] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液；
[0021] (8)成纖維細(xì)胞生長因子抗體；
[0022] (9)山羊抗小鼠IgG。
[0023] 有益效果
[0024] 利用固相合成法化學(xué)合成成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽，該多肽具有全新的序 列，該多肽可體外抑制成纖維細(xì)胞生長因子，治療惡性腫瘤，如結(jié)腸癌。我們發(fā)現(xiàn)的成纖維 細(xì)胞生長因子抑制多肽可以同時抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力，并在體內(nèi)試驗中提高荷瘤小鼠 生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【具體實施方式】
[0025] 成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽由吉爾生化（上海）有限公司合成。
[0026] 實施例1
[0027] 成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽對體外培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長和存活I(lǐng)C50。
[0028] 采用MTT比色法。將對數(shù)生長的人結(jié)腸癌細(xì)胞，以1. 0X 105加入96孔培養(yǎng)板中， 培養(yǎng)24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物成纖維細(xì)胞生長因子抑制 多肽（上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個 復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在他、211、811、1411、2011、2411、3611、，4811每孔加入1〇'1'，作用411后，加入 DMSO,孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式人結(jié)腸癌細(xì)胞生長抑制率= (1-實驗組吸光值/對照組吸光值）X 100%。計算出實驗藥物的IC50為5. 8 y M，陽性對照 藥的 IC50 為 4. 2yM。
[0029] 實施例2
[0030] 成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽對體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞的生長和存活I(lǐng)C50。
[0031] 采用MTT比色法。將對數(shù)生長的人肝癌IfepG2細(xì)胞，以1. 0X 105加入96孔培養(yǎng) 板中，培養(yǎng)24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物成纖維細(xì)胞生長因 子抑制多肽（上海生工合成）和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔 設(shè)五個復(fù)孔，培養(yǎng)48h，分別在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h每孔加入MTT，作用4h后， 加入DMSO,孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式人H印G2細(xì)胞生長抑制 率=(1-實驗組吸光值/對照組吸光值）X100%。計算出實驗藥物的IC50為7.9yM，陽 性對照藥的IC50為4. 9 y M。
[0032] 實施例3
[0033] 用腫瘤模型檢測成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽的體內(nèi)活力。
[0034] 建立結(jié)腸癌腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇5mg/Kg;空白組加入相同體積的溶 劑，實驗組多肽設(shè)3個劑量：0. 75、1.5、3mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計算存活率。 結(jié)果顯示，成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率， 0? 75、1. 5、3mg/Kg生存率達(dá)到 98. 12%，91. 23%，88. 4%，對應(yīng)的紫杉醇 42. 2%。
[0035] 實施例4含有成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽的ELISA試劑盒檢測：酶連免疫吸附 實驗（ELISA)試劑盒包括如下試劑：
[0036] (1)包被液：0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)。稱取0? 75g碳酸鈉，1. 46g碳酸氫 鈉，加去離子水定容至500ml ;
[0037] (2)PBS緩沖液：0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7. 4)。稱取0? 2g磷酸二氫鉀，2. 90g 磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml;
[0038] (3)抗體稀釋液：0?02mol/LPBS (pH7. 4)和0?2% BSA。稱取0?2gBSA 加入配好的 0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0039] (4)封閉液：0?05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)和2.0%BSA。2. OgBSA加配好的 0. 05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100ml ;
[0040] (5)洗滌液：0?02mol/LPBS(pH7. 4)和0?05 % Tween-20。將 50ulTween-20 溶入 100ml0. 02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻；
[0041] (6)底物液：可溶性單組份TMB底物溶液；
[0042] (7)終止液：2mol/L硫酸溶液。10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至 100ml，室溫保存；
[0043] (8)成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽
[0044] (9)成纖維細(xì)胞生長因子抗體購自上海一研生物科技有限公司
[0045] (10)二抗（山羊抗小鼠IgG)購自艾美捷科技有限公司
[0046] 使用方法：1、血清樣本制備：取3只荷瘤裸鼠，進(jìn)行眼眶取血，每只200 yL，迅速 離心 12000rpm 3min，取上清，按體積比 1 :2 加 PBS，80°C水浴 30min，12000rpm 3min 取上 清，-20°C凍存?zhèn)溆谩?、成纖維細(xì)胞生長因子抗體為包被抗體，將成纖維細(xì)胞生長因子抗體 溶于包被稀釋液中，濃度為100 u g/mL。96孔酶標(biāo)板每孔加入100 y L，4°C包被過夜。棄去 包被液，加入封閉液200 y L，37°C封閉lh。棄去封閉液，分別加入樣品稀釋液稀釋的血清樣 本100yL(稀釋比1 :50)和成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽100yL(10μg/ml)及上述血清 樣本50 y L和成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽50 y L的混合物，分成3組，37°C孵育lh。棄去 血清，PBST和自來水間隔洗滌三次。洗滌后，每孔加入樣品稀釋液稀釋酶標(biāo)二抗100 y L (稀 釋比1 :10000)，37°C孵育lh。棄去二抗，洗滌。洗滌后，每孔加入100yL底物液（50yL底 物A，50yL底物B)，37°C反應(yīng)30min后，加入50yL 2M H2S0j#止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450nm 波長測定每孔的光密度值〇D45tol。
[0047] 結(jié)果：成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽可以和成纖維細(xì)胞生長因子抗體結(jié)合，并可 以競爭血清中成纖維細(xì)胞生長因子，故說明成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽用競爭法檢測 Notch，實現(xiàn)腫瘤預(yù)測；
【主權(quán)項】
1. 成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽，其特征在于其序列為 GMLGGQEMWSffKCLLFffLKRRNFffQG〇
2. 如權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3. 如權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
4. 一種檢測腫瘤的試劑盒，其含有權(quán)利要求1所述的成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽。
5. 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于還有 (1) 包被液：p!19. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液； (2)PBS緩沖液：pH7. 4的0? 02mol/L磷酸鹽緩沖液； (3) 抗體稀釋液：pH7. 4 的 0? 02mol/LPBS和 0? 2%BSA; (4) 封閉液：pH9. 6的0? 05mol/L碳酸鹽緩沖液和2. 0%BSA (5) 洗滌液：0? 02mol/LPBS(pH7. 4)和 0? 05%Tween-20 ; (6) 底物液：可溶性單組份TMB底物溶液； (7) 終止液：2mol/L硫酸溶液； (8) 成纖維細(xì)胞生長因子抗體； (9) 山羊抗小鼠IgG。
【專利摘要】本發(fā)明一種成纖維細(xì)胞生長因子抑制多肽及其應(yīng)用，涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有抑制成纖維細(xì)胞生長因子，治療惡性腫瘤的多肽。其序列為GMLGGQEMWSWKCLLFWLKRRNFWQG是全新的序列，它們可以在體外抑制結(jié)腸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖，并在體內(nèi)試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【IPC分類】G01N33-574, G01N33-68, C07K14-00, A61P35-00, A61K38-16
【公開號】CN104693288
【申請?zhí)枴緾N201510149467
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2015年3月31日