一種化合物在制備rtki和/或抗血管生成藥物中應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于天然藥物領(lǐng)域，具體地說，涉及海洋松節(jié)藻有效成分雙-(2, 3-二 漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的受體酪氨酸激酶抑制活性及在制備抗血管生成藥物中的應(yīng) 用。具體為，海洋松節(jié)藻有效成分雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的受體酪氨酸 激酶抑制活性及在制備抗血管生成藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管生成是指在現(xiàn)有的血管系統(tǒng)中，在特定的條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)過活化、增 殖、遷移和血管生成等一系列變化而形成新的微血管的復(fù)雜生物學(xué)過程。自Fo化man于 1971年首次提出腫瘤血管生成理論之后，腫瘤血管生成已成為腫瘤標(biāo)志物之一。
[0003] 研究顯示，血管生成的發(fā)生依賴于多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。因此，祀向血管生成小 分子抗腫瘤藥物的研發(fā)主要集中在尋找特異性的血管生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 (RTKI)上。目前研究最多的是針對血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR)抑制劑的研發(fā)，已有7 種祀向抑制VEGFR的小分子藥物被抑A批準(zhǔn)上市，使成千上萬的腫瘤患者受益于抗腫瘤血 管生成療法。
[0004] 隨著抗腫瘤血管生成藥物獲得巨大成功，抗血管生成藥物的研發(fā)范圍逐漸擴(kuò)大， 海洋來源天然藥物是其中的重要研發(fā)方向。
[0005] 雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼是從海洋紅藻松節(jié)藻中產(chǎn)生的次級代謝 產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0006]
[0007] 有關(guān)雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的藥理活性研究報道較少。Kazuya 等對其生物拒食性進(jìn)行了報道，Lee等報道了其具有酶抑制作用和抗菌活性。課題組前期 中國專利CN 1853618 A公開了"漠酪類化合物在蛋白質(zhì)酪氨酸磯酸脂酶抑制劑中的應(yīng)用"， 中國專利CN101597213 B公開了 "一種漠酪類PTPlB抑制劑的化學(xué)合成方法"。目前關(guān)于 雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼抑制血管生成相關(guān)受體酪氨酸激酶的活性及抗血 管生成方面的用途未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的新的藥用用 途，具體涉及在制備腫瘤血管相關(guān)受體酪氨酸激酶抑制劑（RTKI)及抗血管生成藥物中的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明所采用的雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼是從海洋紅藻松節(jié)藻中 產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，目前已體外合成，其化學(xué)機(jī)構(gòu)式如下：
[0010]
[0011] 本發(fā)明將上述雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼進(jìn)行了激酶活性實(shí)驗(yàn)、 HUVEC增殖實(shí)驗(yàn)和HUVEC血管生成實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所述的雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基 苯基）-甲焼可有效抑制FGFR2、FGFR3、VEGFR2和PDGFR a激酶的活性，并能有效的抗血管 生成。
[0012] 海洋松節(jié)藻有效成分雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼的受體酪氨酸激酶 抑制活性及在制備抗血管生成藥物中的應(yīng)用；
[0013] 所述的雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼可W作為藥物有效成分，加 W藥 學(xué)上可接受的載體，制備FGFR2、FGFR3、VEGFR2和PDGFR a激酶抑制劑W及抗血管生成的藥 物組合物。尤其用于制備抗腫瘤血管生成或其他血管生成有關(guān)疾病的藥物。
[0014] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0015] 本發(fā)明經(jīng)激酶活性實(shí)驗(yàn)證明化合物對血管生成相關(guān)的受體酪氨酸激酶活性的影 響，結(jié)果證實(shí)雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼可抑制多種激酶的活性；利用人廝靜 脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和血管生成實(shí)驗(yàn)觀察了化合物對血管生成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明 化合物能有效抗血管生成。
【附圖說明】
[0016] 圖1為雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有選擇性抑制FGFR2, FGFR3， PDGFR- a和VEGFR2激酶的作用，激酶抑制活性圖。
[0017] 圖2為雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有較強(qiáng)的HUVEC細(xì)胞增殖抑制 作用，其ICs。為2. 23 U g/ml。細(xì)胞增殖抑制活性圖。
[0018] 圖3為雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼顯著抑制HUVEC的體外毛細(xì)管形 成，其抑制活性圖。
【具體實(shí)施方式】 [001引 實(shí)施例1
[0020] 雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼激酶活性的研究：
[00川 1.實(shí)驗(yàn)藥品
[0022] 雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼（制備過程參見實(shí)驗(yàn)室之前申請專利CN 101597213B)，采用DMSO助溶，配置成50mg/ml儲存液長期保存，實(shí)驗(yàn)用濃度為5 U g/ml。
[0023] 2.激酶活性檢測
[0024] FGFRl，F(xiàn)GFR2, FGFR3, FGFR4, PDGFR- a，PDGFR-目和 VEGFR2 的激酶域在含有 如下物質(zhì)的 buffer 中測定。buffer 包含 50mM肥陽S(抑 7. 0)，2mM MgC12，10mM MnC12， ImM NaF，lmM DTT(二硫蘇糖醇），lmg/mL BSA(牛血清清蛋白），0. 25uM生物膚段基質(zhì) (CAGAGAIETDKEYYTV?。Ｔ?0 U 1 buffer中加入終濃度為12. 5 U M的ATP，再分別加入 5 U 1 的 FGFR1，F(xiàn)GFR2, FGFR3, FGFR4, PDGFR- a，PDGFR-目和 VEGFR2,于 37°C 賠育比進(jìn)行 激酶反應(yīng)。反應(yīng)完成后將上述溶液移到含有封閉緩沖液（含25mM邸TA和50mM肥PES，抑 為7. 5)，且包被鏈霉親和素的微量滴定板上。使用與96孔過濾器相配的萬能采集器收集， 通過閃爍計(jì)數(shù)器測定混合物的放射能。采用如下公式計(jì)算抑制率；抑制率（％)= 100-(化 合物組測量值/對照組測量值*100)。
[00巧]結(jié)果顯示：雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有選擇性抑制FGFR2， FGFR3，PDGFR-a和VEGFR2激酶的作用，激酶抑制活性見下圖1。
[002引 實(shí)施例2
[0027] 雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼對HUVEC增殖的研究：
[002引 1.細(xì)胞株
[0029] 人廝靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（HUVEC)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。用含質(zhì)量濃度10%胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% C〇2、完全飽和濕度條件下空氣中常規(guī)培養(yǎng)， 4化更換培養(yǎng)基，細(xì)胞生長達(dá)飽和狀態(tài)時，用0. 25%膜蛋白酶消化傳代，2-3d傳代1次，實(shí)驗(yàn) 選用對數(shù)生長期細(xì)胞。
[0030] 2.實(shí)驗(yàn)藥品
[0031] 雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼和Sunitinib,采用DMSO助溶，并W DMEM 培養(yǎng)基稀釋至 0. 3,0. 6,1. 25, 2. 5, 5,10 和 6. 25 U g/ml。
[0032] 3. HUVEC細(xì)胞增殖的檢測
[0033] 取對數(shù)生長期的HUVEC細(xì)胞按4 X 1〇3個細(xì)胞每孔接種于96孔培養(yǎng)板。在使用之 前，用含質(zhì)量濃度0. 2% FBS的DMEM培養(yǎng)液饑餓16h ;然后加入10% FBS，0. 3、0. 6、1. 25、 2.5、5、1〇11邑/1111的雙-(2,3-二漠-4,5-二居基苯基）-甲焼和6.2511邑/1111的511111^11比 后繼續(xù)賠育72h。之后參照GellTiter 96? A如eous單溶液細(xì)胞增殖檢測試劑盒說明書操 作，檢測雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼對FBS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞增殖的抑制作 用，計(jì)算出半數(shù)抑制濃度（ICJ。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍W上。
[0034] HUVEC細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果顯示；雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼具有 較強(qiáng)的HUVEC細(xì)胞增殖抑制作用，其ICw為2. 23 U g/ml。細(xì)胞增殖抑制活性見下圖2。
[00對 實(shí)施例3
[003引雙-化3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼抗HUVEC血管生成的研究：
[0037] 材料與方法
[00測 1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：
[00測 同實(shí)施例2
[0040] 2.實(shí)驗(yàn)藥物：
[00川 同實(shí)施例2
[004引 3.實(shí)驗(yàn)方法：
[0043] 含生長因子的Matrigel稀釋于膠原蛋白（1比6,體積對體積），保持低溫操作（冰 上）。將此混合液加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板巧Oul/孔），37°C賠育比使溶液充分凝固。
[0044] 將不混合或者混合I. 25, 2. 5, 5,10 y g/ml雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲 焼和6. 25 U g/ml Sunitinib的HUVEC細(xì)胞懸液接種到送些孔中，繼續(xù)培育化，照相。應(yīng)用 IPP 6. 0軟件測量每孔的毛細(xì)管總長度來評價雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼對 毛細(xì)管形成的影響。
[0045] 結(jié)果顯示：雙-(2, 3-二漠-4, 5-二居基苯基）-甲焼顯著抑制HUVEC的體外毛細(xì) 管形成，其抑制作用呈劑量依賴性，其抑制活性見下圖3。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種化合物在制備RTKI和/或抗血管生成藥物中應(yīng)用，其特征在于： 所述化合物為雙-(2, 3-二溴-4, 5-二羥基苯基）-甲烷，其具有受體酪氨酸激酶抑制 活性，可作為有效成分用于制備受體酪氨酸激酶抑制劑和/或抗血管生成藥物中。2. 按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述化合物為具有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)的海洋松節(jié)藻有效成分雙_(2, 3-二溴-4, 5-二羥基 苯基）_甲燒，3. 按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 其中所述的血管生成是腫瘤血管生成，并能有效的抗血管生成。4. 按照權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述的雙_(2, 3-二溴-4, 5-二羥基苯基）-甲烷可以作為藥物有效成分，用于制備抗 腫瘤血管生成或其他血管生成有關(guān)疾病的藥物。5. 按照權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述的雙-(2, 3-二溴-4, 5-二羥基苯基）-甲烷可有效抑制FGFR2、FGFR3、VEGFR2和 I3DGFR α激酶中的一種或二種以上的活性，作為FGFR2、FGFR3、VEGFR2和I3DGFR α激酶中的 一種或二種以上的抑制劑。6. 按照權(quán)利要求1或5所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述的雙-(2, 3-二溴-4, 5-二羥基苯基）-甲烷可以作為藥物有效成分，加以藥學(xué)上 可接受的載體，制備FGFR2、FGFR3、VEGFR2和I3DGFR α激酶中的一種或二種以上的抑制劑。
【專利摘要】本發(fā)明屬海洋天然藥物領(lǐng)域，涉及海洋松節(jié)藻有效成分雙-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯基)-甲烷的新的藥用用途。本發(fā)明經(jīng)激酶活性實(shí)驗(yàn)證明化合物對血管生成相關(guān)的受體酪氨酸激酶活性的影響，結(jié)果證實(shí)雙-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯基)-甲烷可抑制多種激酶的活性；利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和血管生成實(shí)驗(yàn)觀察了化合物對血管生成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明化合物能有效抗血管生成。所述雙-(2,3-二溴-4,5-二羥基苯基)-甲烷可以作為藥物有效成分，加以藥物學(xué)上可接受的載體，制備抗血管生成的藥物組合物。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/055
【公開號】CN105476977
【申請?zhí)枴緾N201410471853
【發(fā)明人】史大永, 王帥玉, 王立軍, 江波, 吳寧
【申請人】中國科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2014年9月16日