一種二膦酸化合物及其制備方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種二膦酸化合物，具有式Ⅱ的結構：其中，R1為H、OH或者鹵素，R2是烴基基團M，烴基基團M結構是線性的、具有支鏈的、環(huán)的或具有芳香族環(huán)的，該烴基基團M具有1～20個碳原子；R3是?H、?OH、?CN或具有1～20個碳原子的烴基基團N。本發(fā)明提供了一種新型二膦酸鹽化合物對老年骨質疏松患者，可使骨細胞的骨形成和骨破壞維持一個較為理想的動態(tài)平衡。
【專利說明】
一種二麟酸化合物及其制備方法與應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種新的二膦酸化合物，以及制備所述新的二膦酸鹽化合物的方法， 屬于生物醫(yī)藥領域。
【背景技術】
[0002] 骨質疏松癥(osteoporosis，0P)是一種以骨量低下、骨微結構損壞，導致骨脆性增 加，易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。目前骨質疏松癥在全球常見病、多發(fā)病中居第7位，患 者總數(shù)超過2億人，我國超過9000萬人患不同程度骨質疏松，60歲以上老人骨質疏松患病率 約 50 % ~60 %。
[0003] 二膦酸已被廣泛應用于治療骨質疏松癥、惡性腫瘤相關性疾病如高鈣血癥和骨痛 癥、變形性骨炎等代謝性骨病。二膦酸分子基本結構為由兩個膦酸根與一個中心碳原子連 接，基本的P-C-P結構(式1)可取代骨內的Ρ-0-Ρ結構，成為在體內不易被酶分解的化合物， 不發(fā)生生物降解。
[0004]
[0005] 在式1結構中，其中心碳原子上有兩個可變的側鏈(R'、R〃），通過改變這些側鏈的 化學修飾來增加骨親和力和抗骨重吸收的強弱。二膦酸是一類主要用于增加骨質疏松患者 骨量、減少骨折危險、減緩Paget's病骨轉換、治療腫瘤骨轉移并對癌癥患者升高的血鈣水 平有降低作用的藥物。二膦酸應用和發(fā)展前景十分廣闊，但是仍有很多亟待研究和解決的 問題。主要有：
[0006] 1、二膦酸治療骨質疏松主要是通過抑制破骨細胞的活性達到治療目的，但其對成 骨細胞的促進作用卻不明顯，這導致患者長期治療后會引起骨脆性增加，增加骨折的風險。 因此增強二膦酸對成骨細胞的促進作用是必要的；
[0007] 2、目前上市的二膦酸長期服用都會存在一定的肝、腎毒性等毒副作用，因此開發(fā) 具有高效、低毒、副作用小的二膦酸是廣大骨質疏松患者的福音并且應用前景廣闊。
[0008] 硒是人體必須的微量礦物營養(yǎng)元素，常取代含硫氨基酸中的硫而成為含硒氨基 酸，參與體內的正常生理生化過程。最常見的含硒氨基酸為硒蛋氨酸和硒半胱氨酸。硒可以 通過改善鈣磷代謝增加血鈣含量和骨鈣沉積、減少骨鹽分解，降低機體對鋁的吸收，對高鋁 引發(fā)的骨質疏松有一定的保護作用，因而降低骨質疏松的發(fā)生和發(fā)展。補硒可使機體的抗 氧化能力得到優(yōu)化，從而降低發(fā)生動脈粥樣硬化、癌癥和骨質疏松的可能性。此外，硒蛋白 對于骨代謝十分重要，缺硒往往同骨量減少以骨關節(jié)病密切相關。骨質疏松患者血清中谷 胱甘肽過氧化物酶以及其它抗氧化物質含量也較對照組低。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術中的二膦酸藥物所存在的毒副作用問題，結合二 膦酸類藥物和硒元素，開發(fā)出一種新的含硒烷基的二膦酸鹽，同時兼顧二膦酸獨特的抗骨 質疏松活性和硒的抗氧化能力。該新型化合物具有更好的抗骨質疏松活性和更佳的生理效 應，同時對肝腎等器官的毒副作用更小。
[0010] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術方案：
[0011] -種二膦酸化合物，具有式π的結構：
[0012]
[0013] 式中，
[0014] 辦為!1、0!1或者鹵素。
[0015] R2是烴基基團M，烴基基團Μ結構是線性的、具有支鏈的、環(huán)的或具有芳香族環(huán)的， 該烴基基團Μ具有1~20個碳原子。烴基基團Μ任選地被一個或多個獨立選自!1、-0?3、-卩、-(：1、-31?、4(1〇 2、-3021?和-01?的基團取代。顯然，烴基基團1應該是二價烴基基團。當烴基基團 Μ上的取代基團為Η的時候，等價于烴基基團Μ沒有其他的取代基，即烴基基團可以是沒有被 取代的烴基基團。
[0016] R3是-H、-〇H、-CN或具有1~20個碳原子的烴基基團Ν，該烴基基團Ν是線性的、支鏈 的、環(huán)的或芳香族的烴基基團。其中，烴基基團N具有1~20個碳原子。烴基基團N任選地被一 個或多個選自^? 3、4、-(：1、-31?、4(1〇2、-3021?和-01?的基團取代。當烴基基團~上的取代 基團為Η的時候，等價于烴基基團N沒有其他的取代基。
[0017] 優(yōu)選的，烴基基團Μ和烴基基團Ν可以是C1-C6的烷基、C1-C6的烯基、C1-C6的炔基， C5-C7的雜環(huán)或芳環(huán)，所述的雜環(huán)基團可以包含1~4個獨立的選自氮、硫和氧的雜原子，以 使得這些雜環(huán)或者雜芳環(huán)的單一雜原子的數(shù)量至少為2。
[0018] 所述的取代基R各自獨立的選自：氫原子、-C00R'、-C0R'、-C0N(R'）2，C1~C1(^^^ 基、Cl~CIO的取代烷基、C2~C6的烯基、C2~C6的取代烯基、C2~C6的炔基、C2~C6的取代 炔基、芳基或取代芳基；
[0019]其中，R'各自獨立地選自：氫、C1~C6的烷基、芳基、取代基R"取代的C1~C6的烷基 或取代基R"取代的芳基；
[0020] 其中，取代基R"獨立地選自-OH、鹵原子、-NH2、-CN、C1-C4的烷基，C2-C4的烯基。 [0021] 優(yōu)選的，還可以進一步的優(yōu)選取代基R為：Η、-C00H、-⑶0CH3、-COOC2H 5、-C00C3H7、_ COOC4H9、-COOCH2X、-COOC2H4X、-C0H、-COCH3、-COC2H5、-COC3H7、-C0C6H5、-⑶CH 2X、-COC2H4X、- CONH (CH3)、-CON (CH3) 2、-CON (CH3) C2H5、-CON (C2H5) 2、-CON (CH3) C3H7、-CON (C2H5) C3H7、甲基、 乙基、丙基、丁基、鹵取代甲基、鹵取代乙基、鹵取代丙基、鹵取代丁基、乙烯基、丙烯基、丁烯 基、齒取代乙烯基、齒取代丙烯基、齒取代丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、苯基、甲基苯基、 乙基苯基、丙基苯基、二甲基苯基、三甲基苯基、甲乙基苯基、二乙基苯基、甲丙基苯基、鹵取 代苯基、氣基苯基、氛基苯基等。其中X為鹵素原子。
[0022]進一步，所述的化合物中，RAH或0H。
[0023]進一步，所述的化合物中，為鹵素。優(yōu)選的，R^F、Cl、BrSl。
[0024] 進一步，所述的式Π 化合物，在辦中，烴基基團Μ是具有1-10個碳原子的烴基基團。 最好是具有1-5個碳原子的烴基基團，其上至少有1個氨基或N(R) 2取代基。此N(R)2基團上的 取代基R表示以支鏈、線性、環(huán)狀、芳香族、雜環(huán)或者芳雜環(huán)的構型存在的具有1~12單元組 的烷基基團、或者氫。兩個R基團之間相互獨立，互不影響。進一步的，取代基R選擇范圍與上 述取代基R的選擇范圍一樣。
[0025] 進一步，所述的化合物中，烴基基團Μ多個N(R)2基團取代。
[0026] 進一步，所述的化合物中，烴基基團Μ是帶支鏈的烴基基團，且烴基基團Μ具有1~5 個碳原子，其上至少有1個氨基或N(R) 2取代基。此N(R)2基團上的取代基R選擇范圍與上述R 取代基的選擇范圍一樣。
[0027]進一步，優(yōu)選的所述的辦為以下基團之一 ：1_氨基-1，2-亞乙基，1-氨基-1，3-亞丙 基，氨基亞甲基，二甲氨基亞甲基，1-氨基-2-氯-1，2-亞乙基，1-二甲氨基-1，2-亞乙基，-CH2-、-C2H5-、C3H5、_CH( CH2NH2) CH2-、_CH( CH = CHNH2) CH2-、-CH2CH (NH2) CH2-、-CH (C6H5) CH (NH2) CH2-、_CH (CH3) CH (NH2) CH2-、_CH (NH2) CH (NH2) CH2-、_CH (CH2NH2) CH2CH2-、_CH (CH3) CH (CH2NH2) CH2-、-CH (CH2NH2) CH (CH3) CH2-、-CH2CH (NH2) CH2CH2-、_CH( CH3) CH2CH2CH (NH2)-、-CH2CH(CH3)CH2CH(NH2)-、-CH(CH = CH2)CH(NH2)CH2-、-CH(CH = CH2)CH2CH(NH2)-、-CH (CONHCH3)-、-C(CON(CH3)2)-、-C(⑶ N(CH3)C2H5)-、-C(CON(C2H5)2)-、-C(CON(CH3)C3H7)-、-C (⑶ N(C2H5)C3H7)-、-CH(CH2(NH2)CH = CH2)-、-CH(CH = CH2)CH(NH2)-、-CH(NH2)C5H4-、-CH (NH2) CH2C5H4-、-CH2CH (NH2) C5H4-、-CH2C5H4CH (NH2)-等。
[0028] 進一步，所述的化合物中，R3為H、0H、CN或帶支鏈的烴基基團N，烴基取代基N具有1 ~10個碳原子。
[0029] 進一步，所述的R3為以下基團之一:-!1、-0!1、-01甲基、乙基、丙基、環(huán)丙基、丁基、 環(huán)丁基、戊基、環(huán)戊基、環(huán)己基、庚基、乙烯基、丙烯基、丁烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、1-環(huán) 戊基-乙基、2-甲硫基-丙基、2-甲氧基-丙基、2-二氣甲基-丙基、環(huán)丙基、-〇?3、-〇12〇?3、 _ CH2CH2CF3、_CH( CH3) CF3、-CH2X、-C2H5X、-C3H6X、-C4H7X、-CH2SCH3、-CH2SCH2X、-CH2SC2H5、-CH2SC3H7、-CH2SC4H9、-CH2CH2SCH3、-CH2CH2SCH2X、-CH2CH2SC2H5、-CH2CH2SC3H7、-CH2CH2SC4H9、- CHNHCH3、_CHN( CH3) 2、-CHNHC2H5、-CHNHCH2CH2CH3、_CHNHCH( CH3) 2、_CHN( CH3) C2H5、_CHN( CH3) C3H7、-CHN(CH3)C4H9、-CH2C0NHCH3、-CH2C0NHC2H5、-CH2C0NHC3H7、-CH2C0NHC4H9、-CH2CH2CONHCH3、-CH2CH2 ⑶ NHC2H5、-CH2CH2CONHC3H7、-CH2CH2CONHC4H9、_CH( CH3) C0NHCH3、-CH (CH3) CONHC2H5、_CH( CH3) CONHC3H7、_CH( CH3) CONHC4H9、-CH2SO2CH3、-CH2SO2C2H5、-CH2SO2C3H7、-CH2SO2C4H9、-CH2CH2SO2CH3、-CH2CH2SO2C2H5、-CH2CH2SO2C3H7、-CH2CH2SO2C4H9、_CH( CH3) SO2CH3、_ CH( CH3) SO2C2H5、_CH( CH3) SO2C3H7、_CH( CH3) SO2C4H9、-C3H6SO2CH3、-C3H6SO2C2H5、-C3H6SO2C3H7、-C3H6SO2C4H9、-CH2OCH3、-CH2OC2H5、-CH2OC3H7、-CH2CH2OCH3、-CH2CH2OC2H5、-CH2CH2OC3H7、-CH (CH3) OCH3、_CH (CH3) OC2H5、_CH (CH3) OC3H7、-C3H6〇CH3、-C3H6OC2H5、-C3H 60c3H7，其中 X為鹵原子。
[0030] 進一步，所述的化合物中，含硒二膦酸選自以下品質表現(xiàn)最佳。
[0031]
[0032]
[0033] 本發(fā)明還提供了上述具有式Π 結構的二膦酸化合物的三種制備方法。
[0034] 一種制備上述具有式Π 結構二膦酸化合物的方法，先合成一種含硒有機羧酸m， 結構如下：
[0035] HOOC-R2-Se-R3
[0036] 式m
[0037] 通過式m合成含硒的二膦酸化合物。
[0038] 方法一：
[0039] 含硒有機羧酸(式m)中加入硼烷類的醚類溶液，將有機羧酸上面的氫取代形成硼 烷酯，反應時間約30min~120min，反應溫度為0°C~60°C，其中式m化合物與硼烷的摩爾比 為1:1~1:5。再加入烷基類亞磷酸酯進行親核取代，反應時間為2h~24h，式ΙΠ 化合物與烷 基亞磷酸酯的摩爾比為1:2~1:6。最后加入醇，發(fā)生醇水解反應，繼續(xù)反應lh~4h。最終得 到式Π 結構的二膦酸。
[0040] 進一步，所述的硼烷類的醚類溶液中的醚類為四氫呋喃和/或1，4-二氧六環(huán)。
[0041] 進一步，所述的的醇水解中的醇為甲醇、乙醇、丙醇和丁醇中的一種或幾種。
[0042] 按照上述制備方法一，可以制備得到式Π 結構的二膦酸化合物。上述制備方法的 過程如下：
[0043]
[0044] 本發(fā)明還提供了另外一種方法合成式Π 結構二膦酸。
[0045] 方法二：
[0046] 將式ΙΠ 化合物與亞磷酸、三氯化磷在80°C~120°C溫度下反應2h~8h，向反應物中 加入水，1 g化合物m中加入lmL~40mL水，于90 °C~120 °C回流lh~6h，化合物m與亞磷酸的 摩爾比為1:1~1:6，化合物m與三氯化磷摩爾比為1:2~1:6，反應液過濾，濾液中加入醇溶 液并于-5 °C~5 °C放置12h~48h，抽濾，固體用水洗滌，60 °C~120 °C真空干燥4h~10h，得到 具有式Π 結構的二膦酸。
[0047] 進一步，濾液中加入醇溶液中的醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等試劑。
[0048]按照上述制備方法二，可以制備得到式Π 結構的二膦酸化合物。上述制備方法的 過程如下：
[0049]
[0050] 二膦酸鹽類藥物用于治療骨質疏松，其主要作用是通過抑制破骨細胞活性、誘導 破骨細胞的凋亡起到抑制骨吸收，阻止骨吸收及骨微結構的破壞。盡管上市的二膦酸類化 合物對破骨細胞的抑制作用越來越強，但其對成骨細胞增殖作用的影響較弱，這可能會導 致患者骨折的風險相應地增加。
[0051] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果：
[0052]本發(fā)明提供了一種新型二膦酸鹽化合物以及制備所述化合物的方法和用途，并且 已經(jīng)鑒別出該化合物的結構特征。在細胞藥理實驗中，使用已經(jīng)上市并廣泛使用的阿倫膦 酸鈉和唑來膦酸作為陽性對照藥。通過系列SCDP化合物對體外成骨細胞和破骨細胞功能的 評價研究表明，SCDP化合物不僅保持與阿倫膦酸鈉和唑來膦酸相似的抑制破骨細胞活力， 還具有比阿侖膦酸鈉和唑來膦酸較好的促進成骨細胞增殖作用。故可以初步推斷，對老年 骨質疏松患者，可使骨細胞的骨形成和骨破壞維持一個較為理想的動態(tài)平衡。
【具體實施方式】
[0053] 本發(fā)明中未特別說明的百分比均為重量百分比。
[0054] 下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。但不應該將此理解為本發(fā)明 上述主題范圍僅限于以下的實施例，凡基于本
【發(fā)明內容】
所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范 圍。
[0055]實施例1:合成SCDP-1化合物
[0056]本實施例舉二膦酸化合物為:3_硒羥基-2-氨基-1-羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結構 式如下
[0057]
[0058]該化合物具體制備方法如下：
[0059] 將3-硒羥基2-氨基-丙酸1.68g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后加 入兒茶酚硼烷2.4g，反應2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9.0g，反應2h后，加入甲醇 40mL反應2h。減壓蒸餾至油狀物產生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結晶得到白 色固體3-硒羥基-2-氨基-1-羥基亞丙基-1，1-二膦酸。
[0060] 該白色固體鑒定：
[0061] 4-^^(4001^,020)32.65(1^10,31.41-1.72(0,21015^51,111/2)315.88(?) [0062]經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-硒羥基-2-氨基-1-羥基亞丙基-1，1-二膦酸。 [0063]實施例2:合成S⑶P-2化合物
[0064]本實施例舉二膦酸化合物為:3_甲硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結構式 如下
[0065]
[0066]該化合物具體制備方法如下：
[0067] 將3-甲硒基-2-氨基-丙酸1.82g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后加 入兒茶酚硼烷2.4g，反應2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9. Og，反應2h后，加入甲醇 40mL反應2h。減壓蒸餾至油狀物產生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結晶得到白 色固體3-甲硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。
[0068] 該白色固體鑒定：
[0069] 4-^^(40011^,020)32.68(1^10,31.43-1.74(0,210 4,0.98(5,31015^51,111/ ζ)329·89(+Η)
[0070] 經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-甲硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1_二膦酸。 [0071]實施例3:合成SCDP-3化合物
[0072]本實施例舉二膦酸化合物為:4_甲硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結構 式如下：
[0073；
[0074]該化合物具體制備方法如下：
[0075] 將4-甲硒基-2-氨基-丁酸1.96g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后加 入兒茶酚硼烷2.4g，反應2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9. Og，反應2h后，加入甲醇 40mL反應2h。減壓蒸餾至油狀物產生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結晶得到白 色固體4-甲硒基-氨基-1羥基亞丁基-1，1-二膦酸。
[0076] 該白色固體鑒定：
[0077] 1H-NMR(400MHz,D20)52.68(TaH),5l.53(Q,2H) ,5l.32(T,2H)5,0.99(S,3H)〇MS (ESI，m/z)343.87(+H)
[0078] 經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為4-甲硒基-2-氨基-1羥基亞丁基-1，1_二膦酸。 [0079] 實施例4:合成S⑶P-4化合物
[0080]本實施例舉二膦酸化合物為：3_烯丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結 構式如下：
[0081]
[0082]該化合物具體制備方法如下：
[0083] 將3-烯丙硒基-2氨基-丙酸2.08g加入50mL三口瓶中。加入四氫呋喃10mL，攪拌后 加入兒茶酚硼烷2.4g，反應2h，再加入三-(三甲基硅烷基)亞磷酸酯9.0g，反應2h后，加入甲 醇40mL反應2h。減壓蒸餾至油狀物產生，再加入300mL乙醚析出沉淀，沉淀用水重結晶得到 白色固體3-硒丙硒基-2氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。
[0084] 該白色固體鑒定：
[0085] 1H-NMR(400MHz,D20)55.68(MaH)55.08(D,2H),52.63(TaH),52.10(D,2H),52.02 (D,2H)〇MS(ESI,m/z)355.87(+H)
[0086] 經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-烯丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1_二膦酸。 [0087] 實施例5:合成S⑶P-5化合物
[0088]本實施例舉二膦酸化合物為:3_丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1-二膦酸。結構 式如下-
[0089]
[0090]該化合物具體制備方法如下：
[0091] 將3-丙硒基-2-氨基-丙酸2. lg、亞磷酸3.9g和甲苯10ml的混合物加熱至80°C，緩 慢滴入三氯化磷5.6g，滴畢同溫反應4h，加入水20mL，加熱回流反應4h。反應液冷卻后加至 無水乙醇30ml中，冷凍析晶，過濾，濾餅用水重結晶，得白色固體。
[0092] 該白色固體鑒定：
[0093] 4-^1^(40010^,020)32.73(1^11)41.45-1.73(0,210 41.33(1211)41.42(]^ 2H),5l.02(T,3H)〇MS(ESI,m/z)37.88(+H)
[0094]經(jīng)上述鑒定可以確定該化合物為3-丙硒基-2-氨基-1羥基亞丙基-1，1_二膦酸。
[0095] S⑶P系列化合物骨顯像研究
[0096] 99Tcm標記化合物的制備及穩(wěn)定性研究
[0097] 99Tcm 標記 SCDP 化合物：各 SCDP 濃度為 5mg/mL，SnCl2 為 50mg/mL。
[0098] 分別向 0 · 4mL SCDP-1、SCDP-2、SCDP-3、SCDP-4和SCDP-5溶液中加入PBS緩沖液 1.5mL，再加入SnCl 2溶液30yL，最后加入"Tcm〇4-淋洗液20yL(74MBq)，用PBS定容至2mL，震蕩 混勻靜置l〇min，并用濾頭過濾。最后將標記溶液進行紙薄層掃描(TLC)，標記率大于95%方 可進行體內注射。
[0099] 對照藥99Tcm標記亞甲基二膦酸(MDP):向5mg MDP中加入2.4mL PBS，然后向其中加 入"Tcm〇4-淋洗液25yL(93MBq)，用PBS定容至2.5mL，震蕩混勻靜置lOmin，并用濾頭過濾。最 后將標記溶液進行紙薄層掃描(TLC)，標記率大于95%方可進行體內注射。
[0100] 標記化合物穩(wěn)定性研究：經(jīng)研究各SCDP化合物及對照藥MDP在標記后其標記率皆 大于95%。
[0101] 99Tcm標記化合物兔骨顯像結果
[0102] 用雙探頭電子發(fā)射計算機斷層掃描成像系統(tǒng)對給與99Tcm#記藥物的各組進行掃 描，通過固定的感興趣區(qū)域做骨與肌肉、骨與血、骨與肝、骨與腎、骨與膀胱的放射性計數(shù)比 值，分別計算30、60、120、180、240min時，骨與組織對放射性物質的攝取比值結果見表1。 [0103]表1兔感興趣區(qū)域放射性計數(shù)比值表
[0104]
[0105]
[0106]從表1可見，各SCDP系列化合物其趨骨性與對照藥MDP相當，故SCDP化合物可開發(fā) 為一種供臨床診斷用骨顯像劑。
[0107]通過細胞實驗評價系列SCDP化合物的抗骨質疏松能力。
[0108] 采用成骨細胞（OBs)及破骨細胞（OCs)兩種體外細胞模型對這五種SCDP化合物 (SCDP-1、SCDP-2、SCDP-3、SCDP-4和SCDP-5)的體外抗骨質疏松能力進行初步評價，并以目 前臨床上被公認治療骨質疏松藥物阿侖膦酸(ALN)和唑來膦酸(Z0L)作為陽性對照。系列 SCDP化合物對成骨細胞功能的影響用KM種（昆明種)24h內新出生乳鼠顱蓋骨為源代的成骨 細胞，評價藥物對促成骨細胞增殖能力和促成骨細胞礦化能力影響。系列SCDP化合物對破 骨細胞功能的影響用購自日本C0SM0BI0公司的大鼠破骨細胞前體試劑盒，評價藥物對抑制 破骨細胞活力的影響。
[0109] 成骨細胞的分離培養(yǎng)，取24h內新出生乳鼠10只左右，拉頸處死后投入盛有75%乙 醇的燒杯內消毒5min。成骨細胞原代培養(yǎng)采用通用的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)出符合實驗要求數(shù)量 和質量的成骨細胞。
[0110] 實驗分為空白對照組（CTL組）、唑來膦酸組（Z0L組）、阿侖膦酸組（ALN組）和5個 SCDP化合物組，各實驗組濃度為HTVol/L。數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件的t檢驗進行分析，P< 0.05認為與對照組(CTL組)有顯著性差異。
[0111] 促成骨細胞增殖能力
[0112] 大鼠成骨細胞以3 X103/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積100μΙ，每組設6個平行 孔進行測定。過夜培養(yǎng)后(37°C，5%C02)，待細胞貼壁完全，吸干培養(yǎng)基，按照實驗分組情況 每孔分別加入含對應藥物的培養(yǎng)基1〇〇μ1，繼續(xù)培養(yǎng)后第1、2、3天取每組6孔樣本進行檢測。 增殖能力測定采用CCK-8試劑盒在測定，原理為CCK-8溶液中的WST-8可被活細胞內的脫氫 酶氧化還原后生成的橙黃色甲臢染料溶解在培養(yǎng)基中，生成的甲臢量與活細胞的數(shù)量成正 比，測定溶液的吸光度值(0.D)即可間接反應細胞的數(shù)量，即增殖能力。以成骨細胞增殖促 進率為評價結果。成骨細胞增殖促進率=[(0. D^n/0. -1 ] X 100 %。結果見下表2:
[0113]表2促成骨細胞增殖平均促進率（％ )
[0114]
[0115] 促成骨細胞礦化能力
[0116] 每組設3個平行孔進行測定，大鼠成骨細胞以4X104/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，每 孔體積500μ1。過夜培養(yǎng)后（37 °C，5 %⑶2)，待細胞貼壁完全，吸干培養(yǎng)基。每孔分別加入含 對應藥物濃度的培養(yǎng)基500μ1，向加樣培養(yǎng)基中加入礦化誘導劑(含2πιΜβ-甘油磷酸鈉(β- GP)，10nM地塞米松和50yg/mL抗壞血酸），每3d換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)至第21天，每組3孔樣本 進行檢測。
[0117]礦化能力測定用細胞的茜素紅染色，其中礦化結節(jié)被染成橘紅色。再向染色的成 骨細胞中加入10 %西吡氯胺溶液，每孔加200μ1，靜置30min，橘紅色紅色結節(jié)逐漸被溶解， 溶液呈現(xiàn)紫紅色。將溶液轉入96孔板中，每孔100μΙ，于570nm波長處測定各孔吸光度(0.D)。 礦化結節(jié)形成促進率（％) = [ (0. Dffia/o. -1 ] X 100 %。結果見下表3:
[0118]表3促成骨細胞礦化能力平均促進率（％ )
[0119]
[0120]系列SCDP化合物藥物對促成骨細胞增殖能力和促成骨細胞礦化能力影響結果表 明，對成骨細胞增殖能力各SCDP藥物與Z0L和ALN比較，皆具有一定的促進成骨細胞增殖作 用;在反映藥物對骨形成作用的礦化能力，各SCDP藥物促進作用顯著優(yōu)于Z0L和ALN。從上述 結果表明，各SCDP化合物皆有促成骨能力。
[0121] 對破骨細胞功能影響的實驗研究
[0122] 破骨細胞的骨吸收能力測定采用日本C0SM0BI0公司的破骨細胞骨吸收檢測試劑 盒進行測定。取出骨吸收檢測試劑盒中的48孔板，每孔小心沿孔壁加入0.25mL試劑盒中的 BONE RESORPTION ASSAY FACS，每孔接種細胞懸液500yL，每孔接種細胞6.5X103cells/ mL。每孔加入100 X藥物母液各5yL。連續(xù)培養(yǎng)4~7天，中間不換液。連續(xù)培養(yǎng)4天后，從骨吸 收檢測板各孔中取l〇〇yL細胞培養(yǎng)上清至96孔板中。96孔板各孔中加入50yL試劑盒中的 BONE RESORPTION ASSAY BUFFER，輕輕混勻。用熒光酶標儀檢測各孔的吸光度值，若骨吸收 效果不明顯，可將骨吸收檢測板全部更換新鮮無酚紅的培養(yǎng)基，再相應加入藥物，再連續(xù)培 養(yǎng)至7d后重復檢測。抑制破骨細胞活力抑制率（％) = [1-(0.1)|^/0.0?0]\100%。結果見 下表4:
[0123] 表4抑制破骨細胞活力平均抑制率（％ )
[0124]
[0125] 系列SCDP化合物藥物對破骨細胞抑制活力，從表4結果可見，除SCDP-1、與SCDP-5 外，在第4天抑制破骨細胞抑制活力低于Z0L和ALN外，其它各SCDP都優(yōu)于Z0L和ALN。在第7天 各SCDP藥物的抑制破骨細胞活力與Z0L和ALN相當。
[0126] 總之，通過系列SCDP化合物對體外成骨細胞和破骨細胞功能的評價研究，表明， S⑶P化合物不僅保持與Z0L和ALN相似的抑制破骨細胞活力，還具有比Z0L和ALN較好的促進 成骨細胞增殖作用。故可以初步推斷，對老年骨質疏松患者，可使骨細胞的骨形成和骨破壞 維持一個較為理想的動態(tài)平衡。
[0127] 實施例6
[0128] 按照實施例1的合成方法一，合成以下二膦酸化合物：
[0129]
【主權項】
1. 一種二麟酸化合物，具有式π的結構：式中， 化為Η、ΟΗ或者面素。 R2是控基基團Μ，控基基團Μ結構是線性的、具有支鏈的、環(huán)的或具有芳香族環(huán)的，該控 基基團Μ具有1~20個碳原子;控基基團Μ任選地被一個或多個獨立選自H、-CF3、-F、-C1、- SR、-N(R)2、-S02R和-OR的基團取代;顯然，控基基團Μ應該是二價控基基團； R3是-H、-〇H、-CN或具有1~20個碳原子的控基基團Ν，該控基基團Ν是線性的、支鏈的、 環(huán)的或芳香族的控基基團；其中，控基基團N具有1~20個碳原子;控基基團N任選地被一個 或多個選自H、-C的、斗、-(：1、-51?、-則1〇2、-5〇21?和-〇如勺基團取代； 所述的取代基R各自獨立的選自：氨原子、-C00R'、-C0R'、-C0N(R'）2，C1~CIO的烷基、 Cl~CIO的取代烷基、C2~C6的締基、C2~C6的取代締基、C2~C6的烘基、C2~C6的取代烘 基、芳基或取代芳基； 其中，R '各自獨立地選自：氨、C1~C6的烷基、芳基、取代基r取代的C1~C6的烷基或取 代基R"取代的芳基； 其中，取代基護獨立地選自-OH、面原子、-畑2、-CN、Cl-C4的烷基，C2-C4的締基。2. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，控基基團Μ和控基基團N是C1-C6的燒 基、C1-C6的締基、C1-C6的烘基，C5-C7的雜環(huán)或芳環(huán)，所述的雜環(huán)基團可W包含1~4個獨立 的選自氮、硫和氧的雜原子，W使得運些雜環(huán)或者雜芳環(huán)的單一雜原子的數(shù)量至少為2。3. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，優(yōu)選取代基R為:H、-C00H、-C00C曲、- C00C2 也、-C00C3 出、-C00C姐9、-C00CH2X、-COOC2H4X、-C0H、-C0C 曲、-C0C2 也、-C0C3 出、-C0C6曲、- C0CH2X、-COC2H4X、-C0NH (邸3)、-CON (邸3) 2、-CON (邸3) C2也、-CON (C2也）2、-CON (邸3) C3出、-CON (C2曲)C3出、甲基、乙基、丙基、下基、面取代甲基、面取代乙基、面取代丙基、面取代下基、乙 締基、丙締基、下締基、面取代乙締基、面取代丙締基、面取代下締基、乙烘基、丙烘基、下烘 基、苯基、甲基苯基、乙基苯基、丙基苯基、二甲基苯基、Ξ甲基苯基、甲乙基苯基、二乙基苯 基、甲丙基苯基、面取代苯基、氨基苯基、氯基苯基等;其中X為面素原子。4. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，Ri為面素原子、Η或 OHo5. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的式Π 化合物，在R2中，控基基團Μ 是具有1-10個碳原子的控基基團；最好是具有1-5個碳原子的控基基團，其上至少有1個氨 基或N(R)2取代基;此N(R)2基團上的取代基R表示W(wǎng)支鏈、線性、環(huán)狀、芳香族、雜環(huán)或者芳雜 環(huán)的構型存在的具有1~12單元組的烷基基團、或者氨；兩個R基團之間相互獨立，互不影 響。6. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，控基基團Μ被多個N (R)2基團取代。7. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，控基基團Μ是帶支鏈 的控基基團，且控基基團Μ具有1~5個碳原子，其上至少有1個氨基或N(R)2取代基。8. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，優(yōu)選的所述的R2為W下基團之一 ：1-氨 基-1,2-亞乙基，1-氨基-1,3-亞丙基，氨基亞甲基，二甲氨基亞甲基，1-氨基-2-氯-1,2-亞 乙基，1-二甲氨基-1,2-亞乙基，-畑2-、-C2出-、C油5、-CH (C出畑2) C出-、-CH( CH = CHN出） C出-、-C此 CH (N此）C此-、-CH (C6曲）CH (N此）C此-、-CH (C曲）CH (N出）C出-、-CH (畑2) CH (N出） CH2-、-CH (C此畑2) CH2C出-、-CH (CH3) CH (C此畑2) C此-、-CH (CH2N出）CH (CH3) CH2-、-CH2CH (畑2) CH2C此-、-CH (CH3) CH2C出 CH (畑2) -、-OfeCH (CH3) CH2CH(畑2) -、-CH (CH=CH2) CH (畑2) C出-、-CH (CH = CH2^H2CH(NH2)-、-CH(CONHCH3)-、-C(CON(Ol3)2)-、-C(CON(CH3)C2H5)-、-C(CON (C2 也）2)-、-C(C0N(CH3)C3 出）-、-C(C0N(C2 也）C3 出）-、-CH(C 出（N 出）CH=CH2)-、-CH(CH = CH2) CH (畑2) -、-CH (畑2) C5H4-、-CH (畑2) CH2C5H4-、-CH2CH (畑2) C5H4-、-CH2C5H4CH (畑2 )-等。9. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，R3為H、0H、CN或帶支 鏈的控基基團N，控基取代基N具有1~10個碳原子。10. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的R3為W下基團之一 CN、甲基、乙基、丙基、環(huán)丙基、下基、環(huán)下基、戊基、環(huán)戊基、環(huán)己基、庚基、乙締基、丙締基、下 締基、乙烘基、丙烘基、下烘基、1-環(huán)戊基-乙基、2-甲硫基-丙基、2-甲氧基-丙基、2-二氣甲 基-丙基、環(huán)丙基、-CF3、-C此 CF3、-C此 C此 CF3、-CH (C曲）CF3、-C此X、-C2曲X、-C抽6X、-C祖7乂、- 畑25畑3、-畑25畑2乂、-畑25〔2出、-畑25〔3化、-畑25〔姐9、-畑2畑25畑3、-畑2畑25畑2乂、- C出 C出 SC2 也、-C出 C出 SC3 出、-C出 C出 SC姐9、-CHNHC出、-CHN( C出）2、-CHNHC 抽5、-CHNHC出 C出 C出、- CHNHCH (C曲）2、-CHN (C出）C2曲、-CHN (C出）C3出、-CHN (C出）C姐9、-C此 CON肥曲、-C出 C0NHC2曲、- 畑2CONHC3H7、-CH2CONHC4H9、-CH2CH2CONH畑3、-CH2CH2CONHC2H5、-CH2CH2CONHC3H7、- CH2CH2CONHC姐9、-畑（畑3) C0NHCH3、-畑（畑3) CONHC2H5、-畑（畑3) CONHC3H7、-畑（畑3 ) CONHC4H9、-C出S化C出、-C出S化C2也、-C出S化C3出、-OfeS化C4H9、-C出C出S化C出、-C出C出SO2C2也、- C出 C此 S化 C3出、-C出 C此 S化 C姐9、-CH (C出）S〇2C出、-CH (C曲）S化 C2曲、-CH (C出）SO2C3出、-CH (C出） S〇2C姐 9、-C3H6SO2C 出、-C3H6SO2C2H5、-C3H6SO2C3H7、-C3H6SO2C姐9、-C 出 0C出、-C 出 OC2H5、- C此0。化、-C此C出0C曲、-C此C出0。曲、-C此C此0。出、-CH (C出）0C出、-CH (C出）0。也、-CH (C出） 0C3出、-C3也0C出、-C3也0C2也、-C3也Oc抽7，其中X為面原子。11. 如權利要求1所述二麟酸化合物，其特征在于，所述的化合物中，含砸二麟酸是W下 之一：12.-種制備上述具有式π結構二麟酸化合物的方法，先合成一種含砸有機簇酸虹，結 構如下： 冊 OC-R2-Se-R3 式虹 通過式虹合成含砸的二麟酸化合物。13. 根據(jù)權利要求12制備上述具有式Π 結構二麟酸化合物的方法，其特征在于， 含砸有機簇酸（式虹）中加入棚燒類的酸類溶液，將有機簇酸上面的氨取代形成棚燒 醋，反應時間約30min~120min，反應溫度為0°C~60°C，其中式虹化合物與棚燒的摩爾比為 1:1~1:5。再加入烷基類亞憐酸醋進行親核取代，反應時間為化~2地，式虹化合物與烷基 亞憐酸醋的摩爾比為1:2~1:6。最后加入醇，發(fā)生醇水解反應，繼續(xù)反應化~地。 最終得到式Π 結構的二麟酸。14. 根據(jù)權利要求12制備上述具有式Π 結構二麟酸化合物的方法，其特征在于， 將式虹化合物與亞憐酸、Ξ氯化憐在80°C~120°C溫度下反應化~化，向反應物中加入 水，1 g化合物虹中加入ImL~40血水，于90 °C~120 °C回流化~化，化合物虹與亞憐酸的摩爾 比為1:1~1:6,化合物虹與Ξ氯化憐摩爾比為1:2~1:6,反應液過濾，濾液中加入醇溶液并 于-5 °C~5 °C放置1化~48h，抽濾，固體用水洗涂，60°C~120°C真空干燥地~lOh，得到具有 式Π 結構的二麟酸。15. 上述的二麟酸化合物在治療骨質疏松的藥物中的應用。
【文檔編號】C07F9/38GK106083925SQ201610539886
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月11日
【發(fā)明人】李明起, 潘俊男, 王翰, 曾永龍, 曹剛, 文德仲, 程作用, 鄧啟民, 段玉春, 蔣雪, 劉媛媛
【申請人】成都云克藥業(yè)有限責任公司