一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。該苯丙素類化合物顯示出可以抑制細(xì)胞炎癥因子NO的含量，抑制細(xì)胞炎癥因子TNF?α，IL?1β，IL?6的表達(dá)作用，具有對羥基自由基的(?OH)的抑制作用，進(jìn)而具有抗炎及抗氧化活性，為炎癥性疾病，如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎等疾病的治療藥物的開發(fā)提供方向。
【專利說明】
一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療炎癥 性疾病的藥物中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制 備治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 從天然藥物中提取分離得到的成分結(jié)構(gòu)多樣、活性顯著，對其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu) 修飾、改造和全合成，一直是新藥研發(fā)的一個主要思路。
[0003] TNF-α:是一種能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞無明顯毒性的細(xì)胞因子，是迄 今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，然而其毒副作用也非常嚴(yán) 重。
[0004] IL-Ιβ:在局部低濃度時協(xié)同刺激APC和T細(xì)胞活化，促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體，進(jìn) 行免疫調(diào)節(jié)。大量產(chǎn)生時有內(nèi)分泌效應(yīng):誘導(dǎo)肝臟急性期蛋白合成，引起發(fā)熱和惡病質(zhì)。
[0005] IL-6:人類IL-6基因位于第7號染色體上；IL-6分子量在21~30KD之間。主要由單 核巨噬細(xì)胞、Th2細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。能夠刺激活化B細(xì)胞增殖，分泌抗 體;刺激T細(xì)胞增殖及CTL活化;刺激肝細(xì)胞合成急性期蛋白，參與炎癥反應(yīng);促進(jìn)血細(xì)胞發(fā) 育。
[0006] IL-6可由多種細(xì)胞合成，包括活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞、單核一巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、 上皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等。IL-6作用的靶細(xì)胞很多，包括巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、靜止的T細(xì) 胞、活化的B細(xì)胞和漿細(xì)胞等;其生物效應(yīng)也十分復(fù)雜。
[0007] OH為生物系統(tǒng)中最具活性的活性氧物質(zhì)，能導(dǎo)致細(xì)胞及生物體內(nèi)DNA，蛋白質(zhì)和脂 質(zhì)氧化損傷。
[0008] 巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)，其中，NO為重要的細(xì)胞炎癥因子，NO 參與多種生理病理過程，過量NO會促進(jìn)炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展，并且還能誘導(dǎo)其他炎癥 因子。
[0009] 因此，尋求新的化合物，以抑制細(xì)胞炎癥因子NO的含量，抑制細(xì)胞炎癥因子了冊-a，IL-li3，IL_6的表達(dá)作用，抑制羥基自由基(-OH)的活性，應(yīng)用于炎癥性疾病的治療，是非 常有必要的。
[0010] 千斤拔藥材為豆科(Leguminosae)千斤拔屬(Flemingl .Roxb.或Moghania)植物大 葉千斤拔(Moghaniamacrophylla(Wilid. )0·Kuntze)的干燥根，在我國主要分布于東南部 地區(qū)。該植物在中國植物志（1995，41: 313)、中國臺灣植物志（1977，3 : 258)、海南植物志 (1965,2:311)、《中國高等植物圖鑒》（1972,2:510)、中國主要植物圖說（1955，？?707)和廣 州植物志（1956，pp361)中均有收錄。千斤拔藥材為廣西地區(qū)的道地藥材，史載于《植物名實 圖考》，有著廣泛的民間用藥基礎(chǔ)。其性味甘，微澀，平，具有清熱除濕等功效，主要用于治療 風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、慢性腎炎、痛經(jīng)和白帶多等婦科疾病。該藥材目前已收載入2005年版 《中國藥典》附錄。
[0011] 大葉千斤拔已報道的成分主要有黃酮類、留類、萜類、蒽醌類、揮發(fā)油類成分，均具 有一定的藥理活性，其藥理活性多樣，報道較多的有神經(jīng)保護(hù)作用，抗炎、抗氧化作用，對病 原微生物的驅(qū)蟲作用、類激素作用、細(xì)胞毒作用，抗菌作用以及免疫增強(qiáng)作用、抗疲勞作用。
[0012] 千斤拔目前廣泛應(yīng)用于婦科、風(fēng)濕痹痛等類型的中成藥生產(chǎn)，如婦科千金片、婦科 千金膠囊、金雞沖劑、金雞膠囊等，此類中成藥主要用于婦科病(痛經(jīng)、子宮寒冷不孕、子宮 下垂、盆腔炎、乳腺炎、白帶多、產(chǎn)后血虛、關(guān)節(jié)痛、產(chǎn)后腰膝痛、缺乳和乳瘡等），虛弱貧血 (婦女貧血，氣血虛弱和病后氣虛等）。近年來，臨床報道較多的是婦科千金片在治療婦科炎 癥方面的作用。
[0013] 目前，在千斤拔的文獻(xiàn)中，報道苯丙素類化合物的文獻(xiàn)極少，尋找有效的苯丙素類 新化合物，對其進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)修飾和合成，開發(fā)新藥，應(yīng)用于炎癥性疾病的治療，意義 重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，尋找一種有效成分，其能抑制細(xì)胞炎癥因子NO的含 量，抑制細(xì)胞炎癥因子TNF-α，IL-1 β，IL-6的表達(dá)作用，具有對羥基自由基的(-OH)的抑制作 用，能應(yīng)用于制備治療炎癥性疾病的藥物中。本發(fā)明提供一種苯丙素類化合物，其可以抑制 細(xì)胞炎癥因子NO的含量，抑制細(xì)胞炎癥因子TNF-a，IL-Ιβ，IL-6的表達(dá)作用，具有對羥基自 由基的（-OH)的抑制作用，進(jìn)而具有抗炎及抗氧化活性，為抗炎藥物的開發(fā)提供方向，用于 治療相關(guān)炎癥性疾病，如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎等。
[0015] 本發(fā)明的目的是提供一種苯丙素類化合物的醫(yī)藥應(yīng)用。
[0016] 提供一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽作為制備治療炎癥性疾病的藥 物中的應(yīng)用，所述苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：
[0017]
[0018] 所述苯丙素類化合物藥學(xué)上可接受的鹽的結(jié)構(gòu)如式（Π )或式(ΙΠ )所示：
[0019]
[0020] 其中，R為無機(jī)酸，辦或辦或辦為磺酸根、堿金屬離子或銨根中的任意一種或任意兩 種或任意三種。
[0021] 優(yōu)選地，所述苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抑制細(xì)胞炎癥因子 NO的含量或抑制細(xì)胞炎癥因子TNF-α，IL-1 β，IL-6的表達(dá)或抑制羥基自由基的活性的藥物 中的應(yīng)用，應(yīng)用于治療炎癥性疾病的藥物中。
[0022] 優(yōu)選地，所述炎癥性疾病為宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān) 節(jié)炎。
[0023] 所述藥學(xué)上可接受的鹽為式（I)所示苯丙素類化合物與酸或堿形成的藥學(xué)上可接 受的鹽，其中，式（Π )中，R為無機(jī)酸，式（m)中，R1SR2或R3磺酸根、堿金屬離子或銨根中的 任意一種或任意兩種或任意三種。
[0024] 所述無機(jī)酸為鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸或乳酸;所述 磺酸根為具有芳基的磺酸根;所述堿金屬離子為鉀離子、鈉離子、鈣離子、鎂離子或鋰離子。
[0025] 所述具有芳基的磺酸根為苯磺酸根或?qū)妆交撬岣?br>[0026] 所述苯丙素類化合物藥學(xué)上可接受的鹽為銨鹽。
[0027] 所述藥物含有藥學(xué)上允許的輔料和/或載體。
[0028] 優(yōu)選地，所述藥物還含有其他藥效成分。
[0029] 優(yōu)選地，所述藥物還含有金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參中的 一種或幾種。
[0030] 優(yōu)選地，所述藥物還含有金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參中的 一種或幾種的提取物。
[0031] 所述提取物為按專利公告號 CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、 〇附296071(：、0附321631(：、0附296072(：、0價296073(：的任意一件或幾件專利文件中所述的提 取方法制備得到。
[0032] 所述藥物的劑型為片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、注 射劑、軟膏劑、栓劑或噴霧劑。
[0033] 本發(fā)明的目的是從傳統(tǒng)的中藥處方中，通過從婦科千金片及婦科千金膠囊的處方 中，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化制得一種新苯丙素類化合物，并通過實 驗證實，其可以應(yīng)用于炎癥性疾病，如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān) 節(jié)炎等疾病的治療。
[0034] 具體地，發(fā)明人通過從婦科千金片、婦科千金膠囊的處方中，選取大葉千斤拔的干 燥根，通過溶劑提取、柱層析分離、制備液相分離、純化，得到本發(fā)明所述苯丙素類化合物， 然后對該苯丙素類化合物進(jìn)行細(xì)胞試驗，測定其對細(xì)胞炎癥因子NO，TNF-α，IL-Ιβ，IL-6及 羥基自由基(-OH)的抑制程度，實驗表明，該苯丙素類化合物在濃度(8.75-15.75yg/mL)范 圍內(nèi)對LPS引起的NO含量升高有明顯的抑制作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。在濃度 (8.75-15.75yg/mL)范圍內(nèi)LPS引起的Raw 264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-α，IL-Ιβ，IL-6含量均有 明顯的抑制作用(P <〇. 05)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，在濃度(5.25 -15.75yg/mL)范 圍內(nèi)對LPS引起的OH含量變化有明顯的抑制作用(p <0.05 )，并表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。
[0035]本發(fā)明的有益效果：
[0036] 本發(fā)明從傳統(tǒng)中藥處方角度出發(fā)，從傳統(tǒng)中藥婦科千金片、婦科千金膠囊中提取、 分離、純化得到一種苯丙素類化合物，經(jīng)實驗證明，該苯丙素類化合物顯示出可以抑制細(xì)胞 炎癥因子NO的含量，抑制細(xì)胞炎癥因子TNF-a，IL-Ιβ，IL-6的表達(dá)作用，具有對羥基自由基 的(-OH)的抑制作用，為炎癥性疾病，如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/或 關(guān)節(jié)炎等疾病的治療藥物的開發(fā)提供了方向。
[0037] 本發(fā)明提供的新的苯丙素類化合物結(jié)構(gòu)簡單、純度高，且提取分離方法簡便、易于 合成，可適應(yīng)新藥的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【附圖說明】
[0038] 圖1為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振氫譜圖。
[0039] 圖2為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的核磁共振碳譜圖。
[0040] 圖3為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對細(xì)胞活性的影響圖。
[0041]圖4為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對NO的抑制作用圖。
[0042]圖5為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對TNF-a的抑制作用圖。
[0043]圖6為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對IL-I邱勺抑制作用圖。
[0044]圖7為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對IL-6的抑制作用圖。
[0045] 圖8為本發(fā)明所述苯丙素類化合物對OH的抑制作用圖。
【具體實施方式】
[0046] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。除非特別說明，本實施例所用的原料和設(shè)備均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)市購的原 料和設(shè)備。
[0047] 本發(fā)明的化合物是所述式（I)所示的苯丙素類化合物及式（Π )或式（ΙΠ )所示該化 合物藥學(xué)上可接受的鹽。該化合物可以采用本發(fā)明提供的以大葉千斤拔為原料提取的方法 制備得到，也可以根據(jù)本發(fā)明提供的結(jié)構(gòu)式結(jié)合采用本領(lǐng)域的化學(xué)合成等方法制備得到。
[0048] 作為本發(fā)明所述苯丙素類化合物的鹽，只要是藥學(xué)上可接受的鹽即可，可列舉為 與鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸等無機(jī)酸形成的無機(jī)酸鹽;與 磺酸形成的磺酸鹽;與鉀、鈉、鈣、鎂、鋰等堿金屬的氫氧化物形成的堿金屬鹽，與銨形成的 銨鹽等。
[0049] 本發(fā)明苯丙素類化合物可用作如宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、乳腺炎、咽喉炎和/ 或關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病的治療藥物。
[0050] 本發(fā)明化合物可以與藥學(xué)上允許的輔料和/或載體一起用作藥物組合物，也可以 在加入藥學(xué)上允許的輔料和/或載體的情況下與金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、 當(dāng)歸、黨參中的一種或幾種中藥材或提取物的組合用作藥物組合物，本發(fā)明化合物還可以 與其他藥學(xué)上可接受的藥效成分一起用作藥物組合物。
[0051] 作為藥物組合物，可以是片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿 劑、注射劑、軟膏劑、栓劑、噴霧劑等。
[0052] 進(jìn)一步地，片劑可以是在添加藥學(xué)上允許的輔料和/或載體的情況下制成的糖衣 片、薄膜衣片、腸溶性包衣片或雙層片、多層片。
[0053]本發(fā)明的輔料和/或載體可以如下：
[0054] 制成固體制劑，可以使用添加劑，例如蔗糖、乳糖、纖維素糖、麥芽糖醇、葡萄糖、淀 粉類、瓊脂、海藻酸鹽類、甲殼素、殼聚糖類、果膠類、阿拉伯樹膠類、明膠類、膠原類、酪蛋 白、白蛋白、磷酸鈣、山梨糖醇、甘氨酸、甘油、聚乙二醇、碳酸氫鈉、滑石等。
[0055] 制成半固體制劑，可以使用動植物性油脂(橄欖油、玉米油、蓖麻油等）、礦物性油 月旨(凡士林、白凡士林、固態(tài)石蠟等）、蠟類(霍霍巴油、巴西棕櫚蠟、蜂蠟等）、部分合成或全 合成的甘油脂肪酸酯（月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等）等。
[0056] 制成液體制劑，可使用添加劑，例如氯化鈉、葡萄糖、山梨糖醇、甘油、橄欖油、丙二 醇、乙醇等。尤其制成注射劑的情況下，可以使用無菌水溶液，例如生理鹽水、等滲液、油性 液，如麻油、大豆油。另外，還可以根據(jù)需要，并用適當(dāng)?shù)闹鷳覄玺燃谆w維素鈉，非離子 表面活性劑、助溶劑，如苯甲酸芐酯、苯甲醇等。
[0057]這些制劑的有效成分的量為制劑的0.01~80重量％，適宜為1~50重量％，給藥量 根據(jù)患者的癥狀、體重、年齡等不同而變化。
[0058]實施例1苯丙素類化合物的制備
[0059] 本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0060] Sl.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。經(jīng)8倍量60%的乙醇回流 提取3次，每次2小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0061] S2.將步驟Sl中濃縮后的浸膏溶于IOL水中，采用DlOl大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為水，洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-I，備用；
[0062] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-I用反相ODS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為25:75，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集6個流分，分別命名為:MM-II，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0063] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml/min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為25:75: 0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個流分，分別命名為MM-121，麗-122，麗-123，MM- 124，MM-125，MM-126，MM-127,備用；
[0064] S5.將步驟S4中收集到的流分MM-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0065] 實施例2苯丙素類化合物的制備
[0066] 本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0067] Sl.取大葉千斤拔40kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。經(jīng)6倍量50%的乙醇回流 提取2次，每次1小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0068] S2.將步驟Sl中濃縮后的浸膏溶于5L水中，采用DlOl大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為15:85,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-I，備用；
[0069] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-I用反相ODS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為20:80，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集6個流分，分別命名為:MM-II，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0070] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*25Omm，流速：I OmI /miη，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為3 5: 65:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0071] S5 .將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0072] 實施例3苯丙素類化合物的制備
[0073] 本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0074] Sl.取大葉千斤拔60kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。7倍量70%的乙醇回流提 取4次，每次3小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0075] S2.將步驟Sl中濃縮后的浸膏溶于8L水中，采用DlOl大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為10:90,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-I，備用； [0076] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-I用反相ODS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為30:70，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集6個流分，分別命名為:MM-II，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0077] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*25Omm，流速：I OmI /miη，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為30: 70:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0078] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0079] 實施例4苯丙素類化合物的制備
[0080] 本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0081 ] Sl.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。8倍量60%的乙醇回流提 取2次，每次1.5小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0082] S2.將步驟Sl中濃縮后的浸膏溶于6L水中，采用DlOl大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為5:95,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-I，備用；
[0083] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-I用反相ODS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為25:75，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集6個流分，分別命名為:MM-II，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0084] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*25Omm，流速：I OmI /miη，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為25: 75:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0085] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0086] 實施例5苯丙素類化合物的制備
[0087] 本實施例提供式(I)所示苯丙素類化合物的一種制備方法，包括如下步驟：
[0088] Sl.取大葉千斤拔50kg，以根部為原料，干燥，切成小塊。8倍量80%的乙醇回流提 取2次，每次1.5小時，將提取液合并，濃縮至無醇味，得浸膏備用；
[0089] S2.將步驟Sl中濃縮后的浸膏溶于6L水中，采用DlOl大孔吸附樹脂柱對其進(jìn)行洗 脫，洗脫劑為乙醇與水的體積比為10:90,洗脫3個柱體積，收集洗脫液，命名為MM-I，備用；
[0090] S3.將步驟S2中收集到的流分MM-I用反相ODS柱層析進(jìn)行洗脫，洗脫劑為甲醇-水 系統(tǒng)，其體積比為28:72，洗脫18個柱體積，按每3個柱體積收集一個流分的洗脫液，按順序 收集6個流分，分別命名為:MM-II，MM-12，MM-13，MM-14，MM-15，MM-16備用；
[0091] S4.將步驟S3中的收集到的流分MM-12用制備液相分離，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*25Omm，流速：I OmI /miη，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇：水：乙酸的體積比為10: 90:0.01，按出峰順序收集洗脫液，共收集7個流分，分別命名為麗-121，麗-122，11-123，11-124，ΜΜ-125，ΜΜ-126，ΜΜ-127,備用；
[0092] S5.將步驟S4中收集到的流分ΜΜ-126用制備液相純化，制備液相色譜柱為:YMC， 20mm*250mm，流速:5ml /min，流動相為甲醇-水-乙酸系統(tǒng)，甲醇:水：乙酸的體積比為15:85: 〇. 01，收集洗脫液，重結(jié)晶后得到所述苯丙素類化合物。
[0093] 將實施例1至實施例5制備得到的化合物進(jìn)行質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜 的檢測，結(jié)果證明所得化合物為:4,5_吡喃環(huán)-Γ烯-2'-葡萄糖基-Γ，3'_二羥基-2-甲氧 基-3-羥基苯甲酸。其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：
[0094]
[0095]其質(zhì)譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜的譜圖數(shù)據(jù)如下：
[0096] HR-ES頂S顯示[M+Na]+為m/z 453.1158,結(jié)合核磁特征，可得分子式為C18H22O12，不 飽和度為8。
[0097] 4-^^(60011^,0)300):6.14(8,110,4.73((1,110,4.71^110,3.79(8,3103.00-4.00(H-2'-6'），2.59(d，2H)。
[0098] 13C-匪R(150MHz,CD3OD): 154.6(C-1),153.3(C-2),131.4(C-4),115.6(C-5)， 131 ·4(C-3)，128.2(C-6)，114.7(02'），104.8(C-r)，93.2(C-r)78.7(C-3'），76.8-61.2 (C-2"-6"），50.4(C-4，）。
[0099] 實施例6苯丙素類化合物鹽的制備
[0100] 苯丙素類化合物鹽酸鹽的制備：
[0101] 攪拌下將該苯丙素類化合物甲醇溶液中滴加飽和鹽酸至pH值2-3,攪拌下滴加乙 腈，抽濾，干燥得到白色粉末固體，即為苯丙素類化合物的鹽酸鹽。
[0102] 苯丙素類化合物磺酸鹽的制備：
[0103] 在含有該苯丙素類化合物、溶劑、磺酸、中性油和促進(jìn)劑的反應(yīng)體系中加入堿金屬 的氫氧化物，加入溶劑、低級醇和助促進(jìn)劑，通入二氧化碳，分離得到白色粉末固體，即為苯 丙素類化合物的磺酸鹽。
[0104] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽的制備：
[0105] 將溶于乙醇中的KOH或NaOH加入該苯丙素類化合物中，攪拌下加熱回流反應(yīng)，冷制 室溫，攪拌下滴加乙腈，抽濾，干燥得白色固體，即為苯丙素類化合物的鉀鹽或鈉鹽。
[0106] 苯丙素類化合物銨鹽的制備：
[0107] 攪拌下將該苯丙素類化合物甲醇溶液中滴加飽和氨水至pH值9-11，攪拌下滴加乙 腈，抽濾，干燥得到白色固體，即為苯丙素類化合物的銨鹽。
[0108] 上述化合物鹽的譜圖數(shù)據(jù)：
[0109] 苯丙素類化合物鹽酸鹽：ESIMS顯示m/z 466.89，核磁特征1!1-匪1?(60(^取， CD30D): 1H-NMlKeOOMHz ,CD3OD) :6.17(s，lH)，4.77(d，lH)，4.70(t，lH)，3.78(s，3H)3.00-4.00(H-2'-6'），2.44(d，2H)。
[0110] 苯丙素類化合物磺酸鹽：ESIMS顯示為m/z 494.27，核磁特征咕-麗1?(6001〇^， 0)300):^-^^(60011^,0)300):6.17(8,110,4.78((1,110,4.89(1110,3.66(8, 3H)3.00-4.00(H-2'-6'），2.51(d，2H)。
[0111] 苯丙素類化合物鉀鹽或鈉鹽：
[0112] 鉀鹽：ESMS顯示m/z 468 · 33，核磁特征1H-匪R(600MHz，CD30D): 1H-匪R(600MHz， CD3OD):6.11(s，lH)，4.69(d，lH)，4.66(t，lH)，3.73(s，3H)3.00-4.00(H-2，-6，），2.50(d， 2H)〇
[0113] 鈉鹽:ESMS顯示m/z 452 · 63，核磁特征1H-NMR(600MHz，CD3OD): 6 · 17(s，1H)，4 · 50 (d，lH)，4.61(t，lH)，3.40(s，3H)3.00-4.00(H-2'-6'），2.10(d，2H)。
[0114] 苯丙素類化合物銨鹽:ESMS顯示m/z 445.26，核磁特征咕-匪1?(60010^，0)300): 1H-Nmr(GoOMHz1CD3OD) :6.18(s，lH)，4.78(d，lH)，4.46(t，lH)，3.46(s，3H)3.00-4·00(Η-2，-6，），2.51(d，2H)。
[0115] 上述苯丙素類化合物鹽的結(jié)構(gòu)式如式(IV)~式(VI)所示。
[0116]
[0117]
[0118] 其中，式(IV)為制備得到的苯丙素類化合物鹽酸鹽，式（V)為制備得到的苯丙素 類化合物的其中一種磺酸鹽，式（VI)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鉀鹽，式 (VD)為制備得到的苯丙素類化合物的其中一種鈉鹽，式(VI)為制備得到的苯丙素類化合物 的其中一種銨鹽。
[0119] 實驗例7應(yīng)用試驗
[0120] 本發(fā)明所述化合物以及鹽對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激與炎癥的影 響。（為了實驗過程中記錄方便，以下將本發(fā)明所述的苯丙素類化合物標(biāo)號為:藥物MM-126， 即本發(fā)明中所述的藥物MM-126即是指本發(fā)明式（I)所示苯丙素類化合物或其藥學(xué)上可接受 的鹽。）
[0121] 1材料與方法
[0122] 1.1藥品及儀器
[0123] 脂多糖（Iipopolysaccharide，LPS)，MTT購自 Sigma公司；小鼠巨·細(xì)胞Raw264 · 7 購自湘雅細(xì)胞庫;PBS; DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素與鏈霉素;全自動酶標(biāo)儀;恒溫 CO2培養(yǎng)箱。
[0124] 小鼠白介素 l-f3(IL-1-f3)ELISA檢測試劑盒，批號：2014/06(96T);小鼠白介素6 (IL-6)ELISA檢測試劑盒，批號：2014/06(96T);小鼠腫瘤壞死因子-a(TNF-a)ELISA檢測試 劑盒，批號：2014/06(96T);小鼠一氧化氮(NO)ELISA檢測試劑盒，批號：2014/10(96T);小鼠 羥基自由基(OH)ELISA檢測試劑盒，批號:2014/10(96T)。
[0125] 1.2藥物制備
[0126] 首先用少量DMSO溶解，然后用DMEM稀釋至一定的濃度，使終濃度中DMSO含量少于 1%0 〇
[0127] 1.3細(xì)胞培養(yǎng)
[0128] 小鼠巨噬細(xì)胞Raw 264.7培養(yǎng)于含10%熱滅活（56°(：，3〇1^11)的胎牛血清卬83)、 lOU/mL青霉素鈉、100yg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育生長。
[0129] 1.4細(xì)胞活力測定
[0130] 細(xì)胞活力通過MTT法來測定。將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液接種于96孔板(I X 104個/孔)孵 育24h，再同步化24h，然后將不同濃度的藥物作用于細(xì)胞2h，然后再加入LPS(30yg/mL)刺激 24h，吸棄原培養(yǎng)基，每孔加入IOOyL的MTT(0.5mg/mL)繼續(xù)孵育4h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入 150yL的DMSO，搖床振搖IOmin，在490nm處測定吸光度。
[0131] 1.5 NO含量測定
[0132] Raw 264.7細(xì)胞接種于96孔板24h，再同步化24h，然后將不同濃度的藥物作用于細(xì) 胞2h，然后再加入LPS( 30yg/mL)刺激24h，最后收集上清液，并于1000 Orpm離心5min，分裝上 清并置于-80°C保存?zhèn)溆?。通過小鼠 NO試劑盒測定NO含量。
[0133] 1 · 6炎癥因子TNF-α，IL-Ιβ，IL-6測量
[0134] 樣品取1.5制備好的樣品用于后續(xù)炎癥因子測定。細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a，IL-lf3，IL_6的 量通過小鼠 TNF-a，IL-Ιβ，IL-6試劑盒來測定。
[0135] 1.7 OH含量測定
[0136] 樣品取1.5制備好的樣品用于OH因子測定。通過OH試劑盒測定含量。
[0137] 1.8統(tǒng)計分析
[0138] 采用SPSS17.0軟件，實驗數(shù)據(jù)以（x±s表示;所得數(shù)據(jù)通過用單因素方差分析，方 差齊性用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett T3檢驗。
[0139] 2實驗結(jié)果
[0140] 2.1細(xì)胞活力
[0141] 藥物對細(xì)胞活力的影響通過MTT法來評價。如圖3所示，藥物MM-126在1.75-15.75μ g/mL濃度范圍內(nèi)對Raw 264.7細(xì)胞活力沒有顯著影響；因此在此范圍濃度下的藥物濃度對 于后續(xù)實驗是合適的。
[0142] 2.2藥物抑制NO的產(chǎn)生
[0143] 如圖4所示，通過1^刺激1^￥ 264.7細(xì)胞，其產(chǎn)生^)(65.81±2.9311]/11^)含量與 正常組勵（33.61±2.1911]/11^)相比明顯升高（口<0.01)。藥物1^-126在濃度（8.75-15.754 g/mL)范圍內(nèi)對LPS引起的NO含量升高有明顯的抑制作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系。
[0144] 2.3藥物抑制了陬-€[，幾-10，幾-6的產(chǎn)生
[0145] 如圖5至圖7所示，通過LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞，Raw 264.7細(xì)胞炎癥因子TNF-a (132 · 16 ± 5 · 28pg/mL)，IL-10(358 · 80 ± 24 · 64pg/mL)，IL-6(198 · 39 ± 5 · 97pg/mL)含量與正 常組TNF-a (65 · 41 ±6 · 29pg/mL)，IL-10( 172 · 67 ± 10 · 06pg/mL)，IL-6( 103 · 34± 2 · 88pg/mL) 相比含量明顯升高(P<〇.01);說明LPS能夠刺激Raw 264.7細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子。
[0146] 藥物麗-126在濃度(8.75-15.75以8/1^)范圍內(nèi)對1^3刺激1^￥ 264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥 因子TNF-α，IL-Ιβ，IL-6含量均有明顯的抑制作用(p<0.05)，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān) 系。
[0147] 2.4藥物抑制OH的產(chǎn)生
[0148] 如圖8所示，通過LPS刺激Raw 264.7細(xì)胞，其產(chǎn)生0H(113.58±6.03ng/mL)含量與 正常組0H(63 · 40± 1 · 19ng/mL)相比明顯升高（p<0 · 01)。
[0149] 藥物MM-126在濃度(5.25-15.75yg/mL)范圍內(nèi)對LPS引起的OH含量變化有明顯的 抑制作用(P <〇. 05 )，并表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。
[0150] 本實驗經(jīng)體外培養(yǎng)，研究了藥物麗-126對小鼠巨噬細(xì)胞勵，了冊-€[，11^10，11^6,0!1 生成的影響。
[0151] 藥物MM-126需在中高濃度時對^^冊-€1，幾-1|3，11^6的含量有明顯抑制效果，說 明其發(fā)揮抗炎活性需要較高藥物濃度實現(xiàn);其對OH的抑制活性明顯，說明其有一定的抗氧 化活性。
[0152] 實施例8
[0153] 片劑的制備:按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該化 合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或堿 金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽，按 該化合物或其任意一種鹽與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0154] 實施例9
[0155] 散劑的制備:按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該化 合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或堿 金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽，按 常規(guī)散劑制法制成散劑。
[0156] 實施例10
[0157] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以 及利用該化合物與無機(jī)酸（如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸） 或磺酸或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨 制成的鹽，按該化合物或其任意一種鹽與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑，制成膠 囊劑或顆粒劑。
[0158] 實施例11
[0159] 注射劑的制備：按實施例1方法先制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用該 化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸或 堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的鹽， 按常規(guī)注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射劑。
[0160] 實施例12
[0161] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用 該化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸 或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的 鹽，以及金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參制成的粉末，和輔料。
[0162] 實施例13
[0163] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及金櫻 根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參制成的粉末，和輔料。
[0164] 實施例14
[0165] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及金櫻 根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參的提取物，和輔料。提取物是按專利公告號 CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、CN1296072C、 CN1296073C的任意一件或幾件專利文件中提取方法制備得到。
[0166] 實施例15
[0167] -種藥物組合物，含有實施例1方法制得式（I)所示的苯丙素類化合物，以及利用 該化合物與無機(jī)酸(如鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、羧酸、磷酸、乳酸)或磺酸 或堿金屬的氫氧化物(如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鈣、氫氧化鎂、氫氧化鋰)或銨制成的 鹽，以及金櫻根、單面針、雞血藤、功勞木、穿心蓮、當(dāng)歸、黨參的提取物，和輔料。提取物是按 專利公告號 CN1078079C、CN1170549C、CN1158087C、CN1330335C、CN1296071C、CN1321631C、 CN1296072C、CN1296073C的任意一件或幾件專利文件中提取方法制備得到。
[0168] 以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)勢。本領(lǐng)域的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這對本 領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā) 明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
【主權(quán)項】
1. 一種苯丙素類化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療炎癥性疾病的藥物中的應(yīng) 用，所述苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，是在制備抑制細(xì)胞炎癥因子NO的含量或抑制 細(xì)胞炎癥因子TNF-a，比-1β，比-6的表達(dá)或抑制徑基自由基的活性的藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述炎癥性疾病為宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔 炎、乳腺炎、咽喉炎和/或關(guān)節(jié)炎。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥學(xué)上可接受的鹽為式（I) 所示苯丙素類化合物與酸或堿形成的藥學(xué)上可接受的鹽， 所述苯丙素類化合物藥學(xué)上可接受的鹽的結(jié)構(gòu)如式（Π )或式(虹)所示：其中，R為無機(jī)酸，扣或1?2或R3為橫酸根、堿金屬離子或錠根中的任意一種或任意兩種或 任意Ξ種。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，所述無機(jī)酸為鹽酸、氨漠酸、氨氣酸、氨艦酸、 硫酸、硝酸、簇酸、憐酸或乳酸;所述橫酸根為具有芳基的橫酸根;所述堿金屬離子為鐘離 子、鋼離子、巧離子、儀離子或裡離子。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述應(yīng)用，其特征在于，所述具有芳基的橫酸根為苯橫酸根或?qū)妆?橫酸根。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物含有藥學(xué)上允許的輔料 和/或載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物還含有金樓根、單面針、雞血藤、功 勞木、穿屯、蓮、當(dāng)歸、黨參中的一種或幾種。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物還含有金樓根、單面針、雞血藤、功 勞木、穿屯、蓮、當(dāng)歸、黨參中的一種或幾種的提取物。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物的劑型為片劑、膠囊劑、散劑、顆粒 劑、丸劑、溶液劑、混懸劑、糖漿劑、注射劑、軟膏劑、栓劑或噴霧劑。
【文檔編號】C07H15/203GK106074583SQ201610153535
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年3月17日 公開號201610153535.1, CN 106074583 A, CN 106074583A, CN 201610153535, CN-A-106074583, CN106074583 A, CN106074583A, CN201610153535, CN201610153535.1
【發(fā)明人】張鵬, 彭開鋒, 林麗美, 伍實花, 夏博候, 佘娜, 陽苗
【申請人】株洲千金藥業(yè)股份有限公司