一種麒麟菜多肽提取物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種牒麟菜多膚提取物及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 牒麟菜（Eucheuma)，也叫雞腳菜、雞膠菜，屬藻類的藻體肥厚多肉，圓柱狀，扁壓或 扁平，福射或兩側(cè)分枝，該屬約有20種，中國(guó)約有5種，為熱帶性海藻，具有很高的藥用價(jià) 值。牒麟菜多膚組份來(lái)源于牒麟菜。
[0003] 血栓性疾病是一類嚴(yán)重影響健康的疾病，常表現(xiàn)為屯、肌梗死、缺血性腦梗死、靜脈 血栓栓塞。目前臨床上治療血栓性疾病的藥物主要分為抗血小板類藥物、抗凝血藥物和溶 血栓藥物?？寡“孱愃幬锞哂幸种蒲“宓恼掣?、聚集和釋放功能，從而防止血栓形成。 抗血小板藥物可W有效地防止屯、血管疾病的發(fā)生，并可延長(zhǎng)患者的生存期，抗血小板藥物 在臨床應(yīng)用日益廣泛。從天然活性物質(zhì)中尋找新的抗血小板藥物是篩選新型抗血小板聚集 藥物或藥物前體的一個(gè)重要策略。
[0004] 而目前暫無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道牒麟菜多膚組份抗血栓的功能，在國(guó)內(nèi)外均未發(fā)現(xiàn)用牒麟菜 多膚組份作抗血栓藥物或保健品使用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種牒麟菜多膚提取物及其制 備方法。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開一種牒麟菜多膚提取物的新用途，改牒麟菜多膚提取 物能夠顯著地抑制血小板聚集，防止血栓形成。
[0007] 本發(fā)明的上述目的通過(guò)如下技術(shù)方案予W實(shí)現(xiàn)： 一種牒麟菜多膚提取物的制備方法，具體步驟如下： 51. 取新鮮牒麟菜粉碎，加入濃度為15~25mmol/L的肥1溶液勻漿制得粗制液，所述HC1溶液的加入量按每千克牒麟菜加入8~12L; 52. 粗制液中加入適量飽和氯化鐘溶液（20°C條件下，飽和氯化鐘溶液的質(zhì)量濃度約 為25%)，至氯化鐘的濃度為1. 3~1. 8%，將粗制液的粘度適度降低，便于后續(xù)處理； 53. 將步驟S2的粗制液離屯、分離，取上清液，上清液粗過(guò)濾后采用凝膠柱層析分離， 使用濃度為15~25mmol/L的肥1溶液洗脫，洗脫峰有兩組； 54. 收集第二組洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至pH值6. 0~7. 0后，離屯、分離，上清液冷凍 干燥制得所需提取物。
[000引優(yōu)選地，所述凝膠柱層析采用的凝膠柱為葡聚糖G-50凝膠柱（S巧hadexG-50)。
[0009] 更優(yōu)選地，所述葡聚糖G-50凝膠柱的柱高為28~32cm,內(nèi)徑寬度為1. 8~2. 2畑1。
[0010] 優(yōu)選地，所述凝膠柱層析分離時(shí)，粗制液的上樣高度為凝膠柱柱高的5~10%。
[001U 優(yōu)選地，所述凝膠柱層析分離時(shí)，洗脫液的流速控制為0. 8~1. 2mL/min。
[0012] 所述上清液粗過(guò)濾具體為采用2~4層紗布過(guò)濾，所述紗布為本領(lǐng)域過(guò)濾常用的紗 布。
[0013] 步驟S1或S3所述離屯、分離為低速離屯、分離，具體離屯、的轉(zhuǎn)速為8000~12000轉(zhuǎn)/ min,離屯、時(shí)間為13~18min。
[0014] 一種通過(guò)本發(fā)明所述制備方法制得的牒麟菜多膚提取物。本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)， 如十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)證實(shí)提取物是單一電泳條帶，主要成 分為分子量低于10KDa的多膚組份。
[0015] 牒麟菜多膚提取物在制備抗血小板聚集或抗血栓藥物中的應(yīng)用。
[0016] 牒麟菜多膚提取物在制備抗血小板聚集或抗血栓保健品中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)試，發(fā)現(xiàn)牒麟菜多膚提取物具有抑制血小板聚集，延長(zhǎng)出血時(shí) 間和凝血時(shí)間，抑制血栓形成的新性能，可W應(yīng)用于制備抗血栓藥物或保健品，用于防止血 栓造成的屯、肌梗死、缺血性腦梗死、靜脈血栓栓塞等。
[0018] 本發(fā)明所述牒麟菜多膚提取物的具體使用形式包括W下幾種；1、可制成粉劑，用 生理鹽水溶解口服；2、可制成注射針劑，按注射針劑要求使用；3、可制添加糖飲料，制成口 服液產(chǎn)品。
[0019] 本發(fā)明對(duì)所述牒麟菜多膚提取物的使用條件無(wú)特殊要求，可在室溫條件下使用， 劑量約為；1〇~400yg/kg/每天，按蛋白多膚組份類食品或藥物的條件使，同時(shí)參照目前市 面的抗血栓藥物和保健品的適用范圍。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果： 本發(fā)明成功從牒麟菜原料中制得多膚提取物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該提取物具有很好的抗血 小板聚集，延長(zhǎng)出血時(shí)間和凝血時(shí)間，抑制血栓形成的新性能，可W將該提取物應(yīng)用于制備 抗血小板聚集或抗血栓的藥物、藥物組分、藥物前體或保健品。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明 作任何限定。除非特別說(shuō)明，實(shí)施例中所設(shè)及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。
[0022] 實(shí)施例1牒麟菜多膚提取物的制備 (1)稱取20g牒麟菜機(jī)械粉碎，用160mL25mmol/L的肥1溶液勻漿制得粗制液。
[0023] (2)粗制液較粘稠，加入適量的飽和氯化鐘溶液（20°C條件下，飽和氯化鐘溶液的 質(zhì)量濃度約為25%)到粗制液中，使得氯化鐘的濃度為1. 3%。
[0024] (3)將步驟（2)的粗制液離屯、分離（8000轉(zhuǎn)/min,離屯、18min),收集上清液，用S 層紗布過(guò)濾上清液后，采用葡聚糖G-50凝膠柱層析分離，凝膠柱的柱高為28cm,內(nèi)徑寬度 為1.8cm,上樣高度為凝膠柱柱高的5%。待平衡后，使用濃度為25mmol/L的肥1溶液洗 脫，洗脫液的流速控制為0. 8mL/min，得到兩組洗脫峰。
[0025] (4)收集第二組洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至抑值6. 0~7. 0后，離屯、分離（8000轉(zhuǎn) /min,離屯、18min),取上清液冷凍干燥，制得牒麟菜多膚提取物。
[0026] 采用十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)證實(shí)本實(shí)施例制得的牒 麟菜多膚提取物是單一電泳條帶，主要成分為分子量低于10KDa的多膚組份。
[0027] 實(shí)施例2牒麟菜多膚提取物的制備 (1)稱取200g牒麟菜機(jī)械粉碎，用2200mL15mmol/L的肥1溶液勻漿制得粗制液。 [002引（2)粗制液較粘稠，加入適量的飽和氯化鐘溶液到粗制液中，使得氯化鐘的濃度為 1. 8%0
[0029] (3)將步驟（2)的粗制液離屯、分離（12000轉(zhuǎn)/min,離屯、13min),收集上清液，用 S層紗布過(guò)濾上清液后，采用葡聚糖G-50凝膠柱層析分離，凝膠柱的柱高為32cm,內(nèi)徑寬 度為2. 2cm,上樣高度為凝膠柱柱高的7%。待平衡后，使用濃度為15mmol/L的肥1溶液 洗脫，洗脫液的流速控制為1. 2mL/min，得到兩組洗脫峰。
[0030] (4)收集第二組洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至抑值6. 0~7. 0后，離屯、分離（12000 轉(zhuǎn)/min,離屯、13min),取上清液冷凍干燥，制得牒麟菜多膚提取物。
[0031] 采用十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)證實(shí)本實(shí)施例制得的牒 麟菜多膚提取物是單一電泳條帶，主要成分為分子量低于10KDa的多膚組份。
[0032] 實(shí)施例3牒麟菜多膚提取物的制備 (1)稱取lOOOg牒麟菜機(jī)械粉碎，用10L20mmol/L的肥1溶液勻漿制得粗制液。
[0033] (2)粗制液較粘稠，加入適量的飽和氯化鐘溶液到粗制液中，使得氯化鐘的濃度為 1. 5%〇
[0034] (3)將步驟（2)的粗制液離屯、分離（10000轉(zhuǎn)/min,離屯、15min),收集上清液，用 S層紗布過(guò)濾上清液后，采用葡聚糖G-50凝膠柱層析分離，凝膠柱的柱高為30cm,內(nèi)徑寬 度為2. 0cm,上樣高度為凝膠柱柱高的10%。待平衡后，使用濃度為20mmol/L的肥1溶液 洗脫，洗脫液的流速控制為1.0mL/min，得到兩組洗脫峰。
[0035] (4)收集第二組洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至抑值6. 0~7. 0后，離屯、分離（10000 轉(zhuǎn)/min,離屯、15min),取上清液冷凍干燥，制得牒麟菜多膚提取物。
[0036] 采用十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)證實(shí)本實(shí)施例制得的牒 麟菜多膚提取物是單一電泳條帶，主要成分為分子量低于10KDa的多膚組份。
[0037] 實(shí)施例4牒麟菜多膚提取物對(duì)全血血小板聚集的影響實(shí)驗(yàn) 采用現(xiàn)有技術(shù)獲取兔全血血小板，具體為；用塑料管收集兔血并添加兔血體積15%的ACD(86mmol/L巧樣酸鋼，lllmmol/L葡萄糖，53mmol/L巧樣酸)抗凝。取全血0. 5ml與藥 物(實(shí)施例1制得的牒麟菜多膚提取物）解育5min，然后用凝血酶巧00U/L)或20ymol/L 腺巧二磯酸（ADP)處理，用全血血小板聚集儀記錄聚集情況，記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢 驗(yàn)。具體藥物用量及測(cè)試結(jié)果如下表1和表2所示。
[003引表1牒麟菜多膚提取物對(duì)凝血酶誘導(dǎo)的兔全血血小板聚集的影響（n=4)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種麒麟菜多肽提取物的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：
51. 取新鮮麒麟菜粉碎，加入濃度為15~25mmol/L的HCl溶液勻漿制得粗制液，所述 HCl溶液的加入量按每千克麒麟菜加入8~12L;
52. 粗制液中加入適量飽和氯化鉀溶液至氯化鉀的濃度為I. 3~1. 8% ;
53. 將步驟S2的粗制液離心分離，取上清液，上清液粗過(guò)濾后采用凝膠柱層析分離， 使用濃度為15~25mmol/L的HCl溶液洗脫，洗脫峰有兩組； S3.收集第二組洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液酸堿度至pH值6. 0~7. 0后，離心分離，上清液冷凍 干燥制得所需提取物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麒麟菜多肽提取物的制備方法，其特征在于，所述凝膠柱層析 采用的凝膠柱為葡聚糖G-50凝膠柱。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述麒麟菜多肽提取物的制備方法，其特征在于，所述葡聚糖G-50 凝膠柱的柱高為28~32cm，內(nèi)徑寬度為I. 8~2. 2cm。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麒麟菜多肽提取物的制備方法，其特征在于，所述凝膠柱層析 分離時(shí)，粗制液的上樣高度為凝膠柱柱高的5~10%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麒麟菜多肽提取物的制備方法，其特征在于，所述凝膠柱層析 分離時(shí)，洗脫液的流速控制為〇. 8~1. 2mL/min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麒麟菜多肽提取物的制備方法，其特征在于，所述上清液粗過(guò) 濾具體為采用2~4層紗布過(guò)濾。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述麒麟菜多肽提取物的制備方法，其特征在于，步驟Sl或S3所 述離心分離的轉(zhuǎn)速為8000~12000轉(zhuǎn)/min，離心時(shí)間為13~18min。
8. -種根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述制備方法制得的麒麟菜多肽提取物。
9. 權(quán)利要求8所述麒麟菜多肽提取物在制備抗血小板聚集或抗血栓藥物中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求8所述麒麟菜多肽提取物在制備抗血小板聚集或抗血栓保健品中的應(yīng) 用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種麒麟菜多肽提取物及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明從麒麟菜原料中制得一種多肽提取物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明該提取物具有很好的抗血小板聚集，延長(zhǎng)出血時(shí)間和凝血時(shí)間，抑制血栓形成的新性能，可以將該提取物應(yīng)用于制備抗血小板聚集或抗血栓的藥物、藥物組分、藥物前體或保健品。
【IPC分類】C07K1-18, A23L1-29, A61K36-02, A61K38-00, A61P7-02
【公開號(hào)】CN104774243
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510163788
【發(fā)明人】張海濤, 林向陽(yáng), 劉彬, 伍俊
【申請(qǐng)人】張海濤
【公開日】2015年7月15日
【申請(qǐng)日】2015年4月9日