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一種kpv肽及其類似物的多肽的制備方法

文檔序號:9701936閱讀:1348來源:國知局
一種kpv肽及其類似物的多肽的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多肽的制備方法,尤其涉及一種KPV肽及其類似物的多肽的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑色素細(xì)胞激素(英文名melanocyte-stimulatinghormone,縮寫MSH)中的a-MSH 的一段多肽SYSMEHFRWGKPV-NH2,被發(fā)現(xiàn)具有多種生物用途。在過去幾十年,有許多研究報 道,a-MSH用于皮膚消炎和其他炎癥疾病。此多肽序列中,四肽HFRW以及其同系物序列,包括 非多肽類似物,已經(jīng)被許多制藥公司和研究所合成并用于生物醫(yī)療領(lǐng)域。人們還發(fā)現(xiàn),這條 多肽序列的C端,$負(fù)氨酸-脯氨酸-繳氨酸(英文名Lysine-Proline-Valine,縮寫KPV),已經(jīng) 在多項研究中被證明具有預(yù)防和皮膚炎癥的功效。其類似結(jié)構(gòu)的多肽序列:MEHFRWGKPV、 HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV,與三肽KPV有著相同或者相似的功效,可以預(yù)防和治療一系列 復(fù)雜的皮膚適應(yīng)癥,包括皮膚炎癥,水腫,紅斑,機(jī)會性感染和瘙癢,以及牛皮癬等。 MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、OSSYSMEHFRWGKPV比KPV更加穩(wěn)定,藥物半衰期時間更長,藥物藥效 持續(xù)效果更久(W02002080858A2)。表1為氨基酸的縮寫對照表。
[0003] 目前,合成KPV肽的方法有液相法和固相法兩種(專利US20100120699A1)。液相制 備法合成時間長,副產(chǎn)物多,產(chǎn)率低,專利報道中為33%,溶劑消耗量大。
[0004] 現(xiàn)有的固相制備法,以N,N'_二環(huán)己基碳二亞胺(縮寫:DCC)和羥基苯并三唑(縮 寫:HOBt)作為多肽連接的反應(yīng)物質(zhì),以N-乙?;溥颍ㄓ⑽拿?N-acetylimidazole)將N端 羧基化,再通過氫氟酸將多肽從固相樹脂上切割。該方法雖然可以將產(chǎn)率提高到56%,但仍 然相對繁瑣,合成成本高,反應(yīng)物化合物的使用比較危險。

[0007] 表1氨基酸的縮寫對照表

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了獲得更高的產(chǎn)率,提高反應(yīng)速率,反應(yīng)更安全,本發(fā)明提供一種KPV肽及其類 似物的多肽制備方法,以全固相合成法合成,包括以下步驟:
[0009] 步驟一、使用聚合物鍵合型聚氧乙烯-RAM樹脂作為合成的固相基質(zhì)并對其進(jìn)行預(yù) 處理;
[00?0]步驟二、向樹脂中加入N-荷甲氧羰基-ΑΑ-0Η、多肽連接試齊丨」進(jìn)行氨基酸合成,清洗 樹脂,脫去N-芴甲氧羰基保護(hù),再次清洗樹脂;
[0011]步驟三、將步驟二中得到的肽鏈以醋酸、二氯甲烷進(jìn)行羧基化反應(yīng)得到羧基化的 肽鏈;
[0012] 步驟四、以三氟乙酸、三異丙基硅烷、水混合溶液,或者氫氟酸、三異丙基硅烷、水 混合溶液,將步驟三得到的羧基化的肽鏈進(jìn)行切割,切割后得到的多肽溶液用甲基第三丁 基醚清洗,離心沉淀,干燥沉淀物,以制備型HPLC純化得到KPV肽或者其類似物的多肽;
[0013]N-芴甲氧羰基-AA-OH中的AA表示氨基酸,步驟二至少重復(fù)三次再進(jìn)入步驟三,N-芴甲氧羰基-AA-OH至少要以N-芴甲氧羰基-Val-OH、N-芴甲氧羰基-Pro-OH和N-芴甲氧羰 基-Lys-OH形式分別出現(xiàn)一次;
[0014]多肽連接試劑包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N'_二異丙基碳二亞胺、N,N'_二環(huán)己基碳 二亞胺、羥基苯并三唑、〇-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯 烷基六氟磷酸鹽、6-氯-1H-苯并三唑、N,N-二異丙基乙基胺、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N, Ν',N'_四甲基脲六氟磷酸酯中的一種或者多種。
[0015]進(jìn)一步地,多肽連接試劑包括2-肟氰乙酸乙酯、N,N'_二異丙基碳二亞胺。
[0016]進(jìn)一步地,多肽連接試劑包括N,N-二異丙基乙基胺、2-( 7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,Ν',N'_四甲基脲六氟磷酸酯。
[0017] 進(jìn)一步地,多肽連接試劑包括1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽、N,N'_ 二異丙基碳二亞胺。
[0018] 進(jìn)一步地,多肽連接試劑包括N,N二環(huán)己基碳二亞胺和羥基苯并三唑,或者0-苯 并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N'_二異丙基碳二亞胺,或者6-氯-1H-苯并三唑和N, Ν'-二異丙基碳二亞胺。
[0019] 進(jìn)一步地,步驟一中的預(yù)處理是指:以哌啶、二甲基甲酰胺脫去聚合物鍵合型聚氧 乙烯-RAM樹脂的Ν-芴甲氧羰基基團(tuán)保護(hù),以二甲基甲酰胺或者Ν-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯 甲烷清洗樹脂。
[0020] 進(jìn)一步地,步驟二中的清洗樹脂,脫去N-芴甲氧羰基保護(hù),再清洗樹脂具體是指: 以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗樹脂,以哌啶、二甲基甲酰胺脫 去N-芴甲氧羰基基團(tuán)保護(hù),再以二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯甲烷清洗樹 脂。
[0021] 進(jìn)一步地,脫去N-芴甲氧羰基基團(tuán)保護(hù)是在加熱到70°C_90°C條件下進(jìn)行的。
[0022] 進(jìn)一步地,加熱是指用微波、水浴或者油浴加熱。
[0023 ]進(jìn)一步地,脫保護(hù)的反應(yīng)時間是2分鐘。
[0024]進(jìn)一步地,步驟二中的氨基酸合成是在加熱到70°C_90°C條件下進(jìn)行的,反應(yīng)時間 是5分鐘,加熱方式是微波加熱。
[0025]進(jìn)一步地,還包括步驟五、將步驟四得到的得到KPV肽或者其類似物的多肽冷凍干 燥,于-20°C保存。
[0026] 進(jìn)一步地,步驟四中HPLC的流動相為水和乙腈。
[0027] 進(jìn)一步地,其類似物的多肽包括MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV。
[0028] 進(jìn)一步地,步驟二中的氨基酸合成是在加熱到70°C_90°C條件下進(jìn)行的,反應(yīng)時間 是5分鐘,加熱方式是微波加熱;還包括步驟五、將步驟四得到的得到KPV肽或者其類似物的 多肽冷凍干燥,于_20°C保存;步驟四中HPLC的流動相為水和乙腈;其類似物的多肽包括 MEHFRWGKPV、HFRWGKPV、SYSMEHFRWGKPV;
[0029]多肽連接試劑包括2-肟氰乙酸乙酯和N,N'_二異丙基碳二亞胺,或者N,N_二異丙 基乙基胺和2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯,或者lH-苯并三唑- l-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽和N,N'-二異丙基碳二亞胺;
[0030] N-芴甲氧羰基-AA-0H中的AA表示氨基酸,氨基酸包括纈氨酸、脯氨酸、賴氨酸;
[0031] 步驟一和步驟二中清洗樹脂用的二甲基甲酰胺或者N-甲基吡咯烷酮、甲醇、二氯 甲烷的用量為3~5mL/次。
[0032]進(jìn)一步地,N-芴甲氧羰基-ΑΑ-0Η中的AA表示氨基酸,氨基酸包括3-氯-D-苯丙氨 酸。
[0033] 本文中,聚合物鍵合型聚氧乙烯-RAM的英文名是GentaGelSRAM;N-芴甲氧羰基 的英文縮寫是Fmoc;N-芴甲氧羰基-ΑΑ-0Η的英文縮寫是Fmoc-AA-〇H;N-芴甲氧羰基-Val-〇H的英文縮寫是Fmoc-Val-〇H;N-芴甲氧羰基-Pr〇-0H的英文縮寫是Fmoc-Pr〇-0H;N-芴甲氧羰 基-Lys-ΟΗ的英文縮寫是Fmoc-Lys-ΟΗ;二甲基甲酰胺的英文名是dimethylformamide,縮寫 是DMF;N_乙?;溥虻挠⑽拿荖-acetylimidazole;三異丙基硅烷的英文名是 triisopropylsilane; 2_ 月虧氛乙酉愛乙酯的英文名是ethyl(hydroxyimino)cyanoacetate;N, Ν'-二異丙基碳二亞胺的英文名是N,N' -diisopropylcarbodiimide,縮寫是DIEA;N,N'_二 環(huán)己基碳二亞胺的英文名是(1;[05^10116171031'130(1;[;[111丨(16,縮寫是0(^ ;羥基苯并三唑的英文 名是l-hydroxybenzotriazole,縮寫是H0Bt;0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯的英文名 ^0(7Azabenzotriazollyl)NNN'N,tetramethyluroniumhexafluophosphate,縮寫是 冊1!];1!1-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽的英文名是&61^〇^丨 &2〇1-111-oxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorophosphate,縮寫是PyBOP; 6-氯-1H-苯并三挫 的縮寫是PyClock;2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'_四甲基脲六氟磷酸酯的英文名是0_ (7-Aza-lH-benzotriazol_l-yl)-N,N,N',Ν'-tetramethyluronium hexafluorophosphate,縮寫是HATU;叔丁氧羰基的英文名是tert-Butyloxycarbonyl,縮寫 B0C〇
[0034] 有益效果是:
[0035] (1)本方法相對于液相合成法具有更高的產(chǎn)率,總產(chǎn)率可比液相制備法提高近2 倍,達(dá)65%。副產(chǎn)物無論從種類還是質(zhì)量都更少,只需要一步分離即可將純度達(dá)到90%以 上。
[0036] (2)在脫保護(hù)反應(yīng)中,由于常溫法需要20分鐘,微波法需要2分鐘;在連接氨基酸反 應(yīng)中,常溫法需要1小時,微波法需要5分鐘。因此微波法可以將普通固相反應(yīng)速率提高10倍 以上。
[0037] (3)由于微波法副產(chǎn)物非常少,不需要大量溶劑清洗,比如常溫
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