專利名稱：Cd20－結(jié)合多肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與CD20抗原結(jié)合的多肽組合物。更具體地，本發(fā)明涉及與人CD20抗原結(jié)合的多肽組合物和該組合物的使用方法。這些多肽組合物包括嵌合抗體、抗體片段以及抗體或抗體片段與細(xì)胞因子的融合蛋白。
背景技術(shù)：
在很多情況下，治療蛋白質(zhì)的功效受限于對治療蛋白質(zhì)的不需要的免疫反應(yīng)。一些鼠單克隆抗體有望用于許多人類疾病的治療，但在某些情況下由于誘導(dǎo)了顯著程度的人抗鼠抗體(HAMA)應(yīng)答而失敗(Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535)。對于單克隆抗體，已經(jīng)發(fā)展了大量試圖減弱HAMA應(yīng)答的技術(shù)(WOA8909622、EPA0239400、EPA0438310、WOA9106667、EPA0699755)。這些重組DNA方法一般在減少最終的抗體構(gòu)建體中的鼠遺傳信息的同時增加最終構(gòu)建體中的人遺傳信息，以產(chǎn)生通常稱為“人源化”抗體的抗體分子。
多數(shù)情況下人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中受者的高變區(qū)殘基被非人物種(如小鼠、大鼠、兔或靈長類動物)來源的高變區(qū)殘基(供體抗體)取代，該方法有時稱為“CDR嫁接”。通常用相應(yīng)的非人殘基取代人免疫球蛋白額外的Fv構(gòu)架區(qū)(FR)，一些情況下還進(jìn)行其他替換以進(jìn)一步恢復(fù)抗體功能。一般將人源化抗體重建到含有兩個可變區(qū)的完整抗體分子中，其中全部或基本全部的高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白，而全部或基本全部的FR區(qū)為人免疫球蛋白序列。人源化抗體通常還含有人源免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)的至少一部分(Jones等(1986)，Nature 321522-525；Reichmam等(1988)，Nature 332323-329)。盡管如此，在一些情況下人源化抗體仍然會在患者中引發(fā)免疫應(yīng)答(Issacs J.D.(1990)Sen.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420)。
誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的關(guān)鍵是蛋白質(zhì)內(nèi)存在能夠通過呈遞于第二類MHC分子而刺激T細(xì)胞活性的多肽，即所謂“T細(xì)胞表位”。這類T細(xì)胞表位通常定義為具有結(jié)合第二類MHC分子能力的任一氨基酸殘基序列。無疑地，“T細(xì)胞表位”指當(dāng)與MHC分子結(jié)合時能被T細(xì)胞受體(TCR)識別的表位，并且其(至少原則上)能夠通過與TCR銜接引起這些T細(xì)胞的活化，以促進(jìn)T細(xì)胞應(yīng)答。
第二類MHC分子是在輔助T細(xì)胞的選擇和活化中起中心作用的一組高多態(tài)性蛋白質(zhì)。人白細(xì)胞抗原組DR(HLA-DR)是該組蛋白質(zhì)的主要同種型，同種型HLA-DQ和HLA-DP表現(xiàn)相似的功能。在人種群中，個體攜帶二到四個DR等位基因、兩個DQ和兩個DP等位基因。已經(jīng)解出了大量DR分子的結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為具有大量疏水口袋的開口的肽結(jié)合溝(Brown等Nature(1993)36433；Stern等(1994)Nature 368215)，所述疏水口袋與肽的疏水殘基(口袋殘基)銜接。標(biāo)明不同同種異型第2類分子的多態(tài)性造成了肽結(jié)合溝內(nèi)肽的不同結(jié)合表面的廣泛多樣性，并在種群水平保證了識別異種蛋白質(zhì)和引起對病原生物的免疫應(yīng)答的最大靈活性。
對治療蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答通過第二類MHC肽呈遞途徑發(fā)生。這時外源蛋白質(zhì)被吞入并加工以進(jìn)行與DR、DQ或DP型第二類MHC分子相關(guān)的呈遞。第二類MHC分子由專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)表達(dá)，所述細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞等。第二類MHC肽復(fù)合物與T細(xì)胞表面的相關(guān)T細(xì)胞受體的接合以及與某些其他共同受體(如CD4分子)等交叉結(jié)合可以在T細(xì)胞中誘導(dǎo)活化態(tài)。活化引起細(xì)胞因子的釋放，這些因子進(jìn)一步活化其他淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞)產(chǎn)生抗體或作為完全細(xì)胞免疫應(yīng)答而活化T殺傷細(xì)胞。
T細(xì)胞表位鑒定是表位消除的第一步?？梢酝ㄟ^恰當(dāng)?shù)陌被崽鎿Q或其他修飾策略消除鑒定出的表位。這樣的方法在WO98/52976和WO00/34317中得到了認(rèn)可，其中后者描述了以計(jì)算穿引技術(shù)(computational threading technique)作為鑒定可能與人第二類MHC DR同種型亞組結(jié)合的多肽序列的方法，并通過目的蛋白質(zhì)內(nèi)的氨基酸替換去除預(yù)測的T細(xì)胞表位。
在一個給定的(原則上為有治療價值的)但本來為免疫原性的肽、多肽或蛋白質(zhì)中鑒定和去除或至少減少T細(xì)胞表位可能是需要的。這些有治療價值的分子之一是對人B細(xì)胞抗原CD20具有結(jié)合特異性的單克隆抗體。本發(fā)明優(yōu)選地單克隆抗體為抗體2B8和Leu16的修飾形式。抗體2B8描述于U.S專利NO.5,736,137，其公開內(nèi)容在本文中引入作為參考。抗體Leu16描述于Wu等Protein Engineering(2001)141025-1033，其公開內(nèi)容在本文中引入作為參考。
CD20是35000道爾頓的非糖基化磷蛋白，一般命名為人B淋巴細(xì)胞限制性分化抗原Bp35B。該蛋白質(zhì)是表達(dá)于前B和成熟B細(xì)胞(包括90％以上的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)B細(xì)胞)的高度細(xì)胞特異性表面分子。靶向CD20的單克隆抗體和放射性免疫綴合物已經(jīng)作為NHL的新療法出現(xiàn)。最重要的實(shí)例包括本發(fā)明的親本抗體，即單克隆抗體2B8(Reff，M.E.等(1994)Blood 83435-445)。已經(jīng)克隆了2B8的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域并與人恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域組合以產(chǎn)生命名為C2B8的嵌合抗體，所述嵌合抗體在美國稱為RITUXANTM上市，在歐洲稱為MABTHERA(利妥希瑪)上市。C2B8已經(jīng)公認(rèn)為是對于NHL和其他B細(xì)胞疾病的治療有價值的治療劑(Maloney，D.G.等(1997)J.Clin.Oncol.153266-3274；Maloney，D.G.等(1997)Blood 902188-2195)。
抗CD20治療的其他實(shí)例由抗體B1提供，述于US專利NO.6,090,365。類似地，該抗體已經(jīng)獲準(zhǔn)用于NHL治療，盡管在這種情況下分子(BEXXARTM)是131I放射性免疫綴合物。天然B1(非綴合的)抗體可用于淋巴瘤和耐受性白血病的自體骨髓移植治療的離體清除療法(Puryingregimen)中(Freedman，A.S.等(1990)，J.Clin.Oncol.8784)。
盡管有成功的抗體如C2B8(利妥希瑪)和BEXXARTM，仍然需要具有增強(qiáng)特性的抗CD20類似物。尤其需要在施用于人受試者時增強(qiáng)體內(nèi)特征。為此非常需要提供在人受試者中減弱或缺乏誘導(dǎo)免疫應(yīng)答潛能的抗CD20抗體。這些蛋白質(zhì)將在人受試者中表現(xiàn)出增加的循環(huán)時間，并在長期使用(如抗CD20分子的治療用途)中特別有益。本發(fā)明提供在體內(nèi)顯示增強(qiáng)特性的修飾的抗CD20抗體。
發(fā)明概述本發(fā)明提供與CD20抗原(優(yōu)選人CD20抗原)結(jié)合的多肽組合物。CD20組合物含有一個或多個抗CD20重鏈和/或輕鏈可變區(qū)多肽片段，所述片段可以是選自抗CD20抗體2B8重鏈可變區(qū)(Vh)的修飾形式、抗CD20抗體2B8輕鏈可變區(qū)(Vk)的修飾形式、抗CD20抗體Leu16重鏈可變區(qū)(Vh)的修飾形式和抗CD20抗體Leu16輕鏈可變區(qū)(Vk)的修飾形式的多肽。修飾的Vh和Vk多肽通過2B8和Leu16Vh和/或Vk區(qū)天然序列中一個或多個氨基酸殘基的替換區(qū)別于抗體的天然Vh或Vk區(qū)。相對于天然2B8和Leu16抗體Vh或Vk區(qū)的免疫原性，Vh或Vk多肽的氨基酸殘基替換賦予本發(fā)明的Cd-20結(jié)合組合物較低水平的免疫原性。
本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物含有至少一個選自以下的多肽片段具有SEQ ID NO1(2B8抗體的Vh)的氨基酸殘基序列，但在SEQ IDNO1中含有選自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的至少一個氨基酸殘基替換的多肽；具有SEQ ID NO4(2B8抗體的Vk)的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO4中含有選自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一個氨基酸殘基替換的的多肽；具有SEQ ID NO9(Leu16抗體的Vh)的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO9中含有選自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的至少一個氨基酸殘基替換的多肽；具有SEQ ID NO11(Leu16抗體的Vk)的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO11中含有選自L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一個氨基酸殘基替換的多肽。
本文和附加的權(quán)利要求書中使用的氨基酸殘基替換的命名通過列出序列中的天然氨基酸殘基的單字母代碼，然后是該殘基的位置編號(下標(biāo))，然后是取代該天然氨基酸的氨基酸殘基的單字母代碼。因此SEQ ID NO4中的替換L11I指SEQ ID NO4(從N端編號)中位置11的亮氨酸(L)被異亮氨酸(I)取代(即替換)。
優(yōu)選本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物對人CD20抗原的結(jié)合親和力與單克隆抗體2B8或Leu16對人CD20的結(jié)合親和力相當(dāng)或更強(qiáng)。
本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方案包括多肽片段例如含有SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的本文稱為VhC的重鏈，SEQ ID NO2QVQLQQPGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWTGAIYPGNGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA；含有SEQ ID NO3的氨基酸殘基序列的本文稱為VhD的單克隆抗體V區(qū)重鏈，SEQ ID NO3QVQLQQPGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA；含有SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列本文稱為VhY的單克隆抗體V區(qū)重鏈，SEQ ID NO10EVQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKTTLTADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSNYYGSSYWFFDVWGTGTTVTVSS。
本發(fā)明其他優(yōu)選地實(shí)施方案包括多肽片段例如含有SEQ ID NO5的氨基酸殘基序列本文稱為VkA的單克隆抗體V區(qū)輕鏈，SEQ ID NO5QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSASYIHWFQQKPTSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；
含有SEQ ID NO6的氨基酸殘基序列的本文稱為VkB的單克隆抗體V區(qū)輕鏈，SEQ ID NO6QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSVSYIHWFQQKPTSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；含有SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的本文稱為VkC的單克隆抗體V區(qū)輕鏈，SEQ ID NO7QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASTSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；含有SEQ ID NO8的氨基酸殘基序列的本文稱為VkD的單克隆抗體V區(qū)輕鏈，SEQ ID NO8QIVLSQSPAIITASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIK；含有SEQ ID NO12的氨基酸殘基序列的本文稱為VkZ的單克隆抗體V區(qū)輕鏈，SEQ ID NO12DIVLTQSPAIITASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTTYSMTISSLEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK。
本發(fā)明提供了對人CD20陽性B細(xì)胞疾病的治療具有治療潛力的多肽組合物。本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物可以是以下形式完整抗體、Fab片段或含有完整抗體和細(xì)胞因子的融合蛋白、抗體片段和細(xì)胞因子的融合蛋白，或結(jié)合CD20抗原的任何其他形式。
本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物優(yōu)選包含共同結(jié)合CD20抗原的重鏈(Vh)抗CD20抗體可變區(qū)和輕鏈(Vk)抗CD20抗體可變區(qū)的組合。Vh/Vk組合可以裝配為完整抗體、Fab片段或含有完整抗體和細(xì)胞因子的融合蛋白、抗體片段或細(xì)胞因子的融合蛋白或與CD20抗原結(jié)合的任何其他構(gòu)型。在另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，V區(qū)通過多肽主鏈彼此連接。
優(yōu)選地，本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物包含裝配為完整抗體的Vh和Vk多肽，所述抗體包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈CH1、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。另外，Vh和/或Vk多肽可以裝配成Fab片段或具有CH3結(jié)構(gòu)域但缺少CH2結(jié)構(gòu)域的“微型抗體”(參閱例如Wu等，US 5,837,821)。另外，Vh和Vk多肽可以通過接頭彼此連接以形成“單鏈Fv”抗體分子。在一組優(yōu)選地實(shí)施方案中，將人恒定區(qū)與結(jié)合CD20的Vh和Vk多肽組合。這些恒定區(qū)包括來自IgA、IgD、IgM、IgE或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型免疫球蛋白。當(dāng)結(jié)合CD20的多肽組合物中包含CH2結(jié)構(gòu)域時，優(yōu)選包括人IgG結(jié)構(gòu)域，如IgG1 CH2結(jié)構(gòu)域。其他優(yōu)選地實(shí)施方案缺少見于IgGCH2結(jié)構(gòu)域的N-連接的寡糖糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選通過突變相關(guān)的天冬酰胺、絲氨酸或蘇氨酸或毗鄰的氨基酸或用酶如(PNGase F)處理含有CH2的蛋白質(zhì)以除去寡糖來設(shè)計(jì)缺失N-連接糖基化位點(diǎn)。
優(yōu)選地Vh和Vk區(qū)組合包括含有重鏈V區(qū)VhC(SEQ ID NO2)和輕鏈VkA(SEQ ID NO5)的多肽組合物；含有重鏈V區(qū)VhC(SEQ IDNO2)和輕鏈V區(qū)VkB(SEQ ID NO6)的多肽組合物；含有重鏈V區(qū)VhC(SEQ ID NO2)和輕鏈V區(qū)VkC(SEQ ID NO7)的多肽組合物；含有重鏈V區(qū)VhC(SEQ ID NO2)和輕鏈V區(qū)VkD(SEQ ID NO8)的多肽組合物；含有重鏈V區(qū)VhD(SEQ ID NO3)和輕鏈V區(qū)VkB(SEQID NO6)的多肽組合物；含有重鏈V區(qū)VhD(SEQ ID NO3)和輕鏈V區(qū)VkD(SEQ ID NO8)的多肽組合物和含有重鏈V區(qū)VhY(SEQ ID NO10)和輕鏈V區(qū)VkZ(SEQ ID NO12)的多肽組合物。
本發(fā)明的一個優(yōu)選地多肽組合物包括抗體2B8的V區(qū)重鏈(SEQ IDNO1)，其中包括在SEQ ID NO1中一個或多個選自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的氨基酸殘基替換。
另一個優(yōu)選地多肽組合物含有抗體2B8的V區(qū)輕鏈(SEQ ID NO4)，所述輕鏈經(jīng)修飾以在SEQ ID NO4中包含選自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的一個或多個氨基酸殘基替換。

圖16以下劃線標(biāo)出了優(yōu)選地氨基酸殘基替換的位置。
另一個優(yōu)選地本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物包括抗體Leu16的V區(qū)重鏈(Vh)(SEQ ID NO9)，所述輕鏈經(jīng)修飾以在SEQ ID NO9中包含選自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的一個或多個替換。
另一個優(yōu)選地本發(fā)明多肽組合物包括抗體Leu16的V區(qū)輕鏈(Vk)(SEQ ID NO11)，所述輕鏈經(jīng)修飾以包含L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L中的一個或多個氨基酸殘基替換。圖16以下劃線標(biāo)出了優(yōu)選地氨基酸殘基替換的位置。
本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物還包括具有一個或多個抗CD20抗體重鏈V區(qū)的組合物，所述重鏈V區(qū)含有選自SGAELKKPGAS(SEQ ID NO15)、VSCKASGYT(SEQ ID NO16)、LEWTGAIY(SEQ ID NO17)、YNQKFKGKT(SEQ ID NO18)、FKGKTTLTA(SEQ ID NO19)、YMELSSLRS(SEQ ID NO20)、SSLRSEDTAV(SEQ ID NO21)、和DWGTGTTVT(SEQ ID NO22)的多肽片段。
類似地，本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物還包括具有一個或多個抗CD20抗體輕鏈V區(qū)的組合物，所述輕鏈V區(qū)含有選自IITASPGEKV(SEQ ID NO23)、CRASTSASY(SEQ ID NO24)、QQKPTSSP(SEQ ID NO25)、LASGVPSRF(SEQ ID NO26)、FSGSGSGTT(SEQ ID NO27)、和YSMTISSLE(SEQ ID NO28)的多肽片段。
例如，V區(qū)重鏈和輕鏈可以裝配為完整抗體、抗體片段、抗體與細(xì)胞因子的融合蛋白、抗體片段-細(xì)胞因子融合蛋白、Fab分子、單鏈Fv分子和微型抗體。優(yōu)選地，CD20結(jié)合組合物裝配為完整抗體，更優(yōu)選含有具IgG重鏈恒定區(qū)同種型的人恒定區(qū)的抗體、最優(yōu)選包含IgG1重鏈恒定區(qū)并具有完整的效應(yīng)子功能、如抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。
在另一優(yōu)選地實(shí)施方案中，CD20結(jié)合組合物裝配為抗體-細(xì)胞因子融合蛋白，優(yōu)選包含具IgG1同種型的人恒定區(qū)并具有完整效應(yīng)子功能，如抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。在這些優(yōu)選地抗體-細(xì)胞因子融合蛋白中，可以有用地包含白細(xì)胞介素(如白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16和IL-18)、血細(xì)胞生成因子(如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、紅細(xì)胞生成素)、腫瘤壞死因子(TNF)(如TNFα)、淋巴因子(如淋巴細(xì)胞毒素)、代謝過程調(diào)節(jié)劑(如瘦素)、干擾素(如干擾素α、干擾素β和干擾素γ)或趨化因子。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體-細(xì)胞因子融合蛋白表現(xiàn)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性(例如刺激免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞或B細(xì)胞)。
本發(fā)明的多肽組合物具有多種有用的生物學(xué)特性，包括結(jié)合人B細(xì)胞的能力；結(jié)合CD20抗原的能力；相對于抗體Leu16、2B8或1H4降低的免疫應(yīng)答能力；針對B細(xì)胞增殖紊亂(如非白血病、淋巴瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)和其他自身免疫疾病的活性。本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物的診斷用途也在考慮中，所述用途中組合物可以是全長抗體、抗體片段(例如F(ab’)2)、放射性標(biāo)記的抗體、固定抗體或與綴合異源化合物的抗體。這些診斷方法可以用于檢測呈遞CD20的細(xì)胞的存在，純化或分離呈遞CD20的細(xì)胞等等。
本發(fā)明還提供含有的如上文定義的CD20結(jié)合組合物連同可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物，以及產(chǎn)生該多肽組合物的方法。
附圖簡述圖1以單字母代碼顯示2B8抗體V區(qū)重鏈蛋白質(zhì)天然氨基酸殘基序列和基于天然序列的修飾的氨基酸殘基序列VhC和VhD。
圖2以單字母代碼顯示2B8抗體V區(qū)輕鏈蛋白質(zhì)天然氨基酸殘基序列和基于天然序列的修飾的序列VkA、VkB、VkC和VkD。
圖3以單字母代碼顯示Leu16Vh重鏈可變區(qū)和命名為VhY的修飾的Leu16Vh區(qū)的氨基酸殘基序列。
圖4以單字母代碼顯示Leu16Vk輕鏈可變區(qū)和命名為VhZ的修飾的Leu16Vk的氨基酸殘基序列。
圖5為實(shí)施例3中描述的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)裂解測定的圖示表示。測試的蛋白質(zhì)為嵌合Leu16抗體(chLeu16；實(shí)心三角)、chLeu16和IL2的融合蛋白(chLeu16-IL2；實(shí)心方塊)、LeuVhY/VkZ-IL2融合蛋白(實(shí)心方塊)、嵌合2B8抗體(C2B8，實(shí)心圓)、C2B8-IL2融合蛋白(空心方塊)和非靶向CD20的KS-IL2免疫細(xì)胞因子融合蛋白(空心圓)。X軸濃度(ng/ml)；Y軸裂解百分比。
圖6展示結(jié)合CD20的多肽組合物和免疫細(xì)胞因子(IC)的抗CD20結(jié)合能力。將人Daudi淋巴瘤細(xì)胞與不同濃度的多肽組合物和IC孵育并如實(shí)施例2所述通過流式細(xì)胞術(shù)評估細(xì)胞的相對結(jié)合。圖6A顯示平均熒光強(qiáng)度(MFI，Y軸)，其作為多肽濃度(X軸)的函數(shù)增長。圖6B顯示以下測量的熒光強(qiáng)度不呈遞初級抗原的Daudi細(xì)胞樣品(最左邊的峰)、針對Daudi細(xì)胞中不表達(dá)的EGF受體的抗體-IL2融合物(左邊中間的峰)和Leu16VhY/VkZ-IL2(最右邊的峰)。X軸10μg/ml的熒光強(qiáng)度；Y軸事件數(shù)目。
圖7展示抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。圖7A和7B顯示與圖5相比獨(dú)立的ADCC測試。在使用51Cr標(biāo)記的Daudi靶細(xì)胞和人PBMC作為效應(yīng)器(E∶T＝100)的4小時測定法中測定ADCC。圖7A測試的抗體為2B8(實(shí)心圓)、chLeu16(實(shí)心菱形)和Leu16VhY、VkZ(空心三角)。圖7B測試的免疫細(xì)胞因子為chLeu16-IL2(實(shí)心方塊)和Leu16VhY/VkZ-IL2(實(shí)心三角)、去糖基化的Leu16VhY/VkZ-IL2(X)和作為非結(jié)合對照的huKS-IL2(空心圓)。Y軸裂解百分比，X軸濃度(ng/ml)。
圖7C顯示如實(shí)施例4所述使用51Cr標(biāo)記的Daudi細(xì)胞和人血漿作為補(bǔ)體來源的CDC活性。使用相同的抗體和免疫細(xì)胞因子孵育1小時。測試的抗體為2B8(實(shí)心圓)、chLeu16(實(shí)心菱形)、chLeu16-IL2(實(shí)心方塊)和Leu16VhY/VkZ-IL2(實(shí)心三角)和作為非結(jié)合對照的huKS-IL2(空心圓)。
圖8展示如實(shí)施例5所述的消除表位的Leu16免疫細(xì)胞因子在小鼠中的藥代動力學(xué)。每種免疫細(xì)胞因子的靜脈(i.v.)給藥后進(jìn)行時間-濃度分析。通過檢測完整形式的天然(實(shí)心方塊)和去糖基化的蛋白質(zhì)(空心圓)的ELISA測定血清濃度。對小鼠注射25mg標(biāo)明的免疫細(xì)胞因子，通過后眼眶采血取樣并通過用抗人IgG H&L抗血清捕獲和抗人IL2抗體檢測進(jìn)行測定。以每個小鼠注射后立刻采集的血清中的起始濃度將結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。X軸小時。Y軸殘留ID的百分比。
圖9顯示SCID小鼠中的抗腫瘤模型評估。對SCID小鼠靜脈注射2×106個CD20+Daudi淋巴細(xì)胞，接著從第3天(圖9A)或第7天(圖9B)開始連續(xù)5天每天注射免疫細(xì)胞因子。使用高劑量的EGFR特異性非靶向?qū)φ彰庖呒?xì)胞因子425-IL2展示由于改變的IL-2半衰期導(dǎo)致的不完全活性。圖9A的處理在第3、4、5、6和7天進(jìn)行，包括只有PBS(實(shí)心菱形)、425-IL2(暗的X)和5微克(mcg)(亮的X)、10mcg(實(shí)心三角)和20mcg(實(shí)心方塊)每日劑量的Leu16VhY/VkZ-IL2。在圖9A中，后三個劑量都顯示出對小鼠的完全保護(hù)，且數(shù)據(jù)點(diǎn)是重疊的。圖9B的處理在第7、8、9、10和11天進(jìn)行，包括只有PBS(實(shí)心菱形)和5mcg(淺色X)和20mcg(實(shí)心方塊)每日劑量的Leu16VhY/VlcZ-IL2。X軸天數(shù)，Y軸存活百分比。
圖10顯示SCID小鼠中抗腫瘤模型評估的結(jié)果(2B8與chLeu16-IL2)；對SCID小鼠注射Daudi淋巴瘤細(xì)胞并如圖9所述在7天后開始用標(biāo)明的抗體或免疫細(xì)胞因子進(jìn)行處理。處理包括只有PBS(X，第7-11天)、利妥?，?C2B8，實(shí)心圓，第7、9和11天25mg/kg)、高劑量Leu16VhY/VkZ-IL2(大方塊、第7-11天1mg/kg)、低劑量Leu16VhY/VkZ-IL2(小方塊，第7-11天0.25mg/kg)。(A)健康小鼠(B)存活小鼠，X軸天數(shù)，Y軸健康小鼠(A)百分比，存活小鼠(B)百分比。
圖11顯示SCID小鼠中抗腫瘤模型評估的結(jié)果(chLeu16-112對去免疫的(DI)-Leu16-IL2)。對SCID小鼠注射Daudi淋巴瘤細(xì)胞并如圖9所述在7天后開始用標(biāo)明的抗體或免疫細(xì)胞因子處理。處理包括只有PBS(交叉X，第7-11天)、利妥希瑪(實(shí)心圓，第7、9和11天25mg/kg)、高劑量Leu16VhY/VkZ-IL2(大方塊、第7-11天1mg/kg)、低劑量Leu16VhY/VkZ-IL2(小方塊，第7-11天0.25mg/kg)、高劑量chLeu16-IL2(大三角，第7-11天1mg/kg)和低劑量chLeu16-IL2(小三角，第7-11天0.25mg/kg)。(A)健康小鼠，(B)存活小鼠。X軸天數(shù)，Y軸健康小鼠(A)百分比，存活小鼠(B)百分比。
圖12展示ADCC活性的喪失只對Leu16VhY/VKZ-IL2介導(dǎo)的抗腫瘤活性具有部分影響(DI-Leu16-IL2對去糖基化DI-Leu16-IL2)。如圖9所述在注射Daudi淋巴瘤細(xì)胞后7天用兩種不同劑量的天然的和酶去糖基化的Leu16VhY/VKZ-IL2處理SCID小鼠。處理包括只有PBS(交叉X，第7-11天)、利妥?，?實(shí)心圓，第7、9和11天25mg/kg)、高劑量Leu16VhY/VkZ-IL2(大三角、第7-11天1mg/kg)、低劑量Leu16VhY/VkZ-IL2(小三角，第7-11天0.25mg/kg)、高劑量去糖基化的Leu16VhY/VkZ-IL2(粗線的大X，第7-11天1mg/kg)和低劑量去糖基化的Leu16VhY/VkZ-IL2(細(xì)線的小X，第7-11天0.25mg/kg)。(A)健康小鼠，(B)存活小鼠。X軸天數(shù)，Y軸健康小鼠(A)百分比，存活小鼠(B)百分比。
圖13說明抗原特異性對最佳抗腫瘤活性非常重要。通過比較DI-Leu16-IL2和對在Daudi淋巴瘤細(xì)胞中只有低水平表達(dá)的分子——EGFR具有結(jié)合特異性的另一個免疫細(xì)胞因子的活性來測試腫瘤細(xì)胞靶向的作用。處理包括只有PBS(X，第7-11天)、利妥?，?實(shí)心菱形，第7、9和11天25mg/kg)、DI-Leu16抗體(空心菱形，第7、9和11天，25mg/kg)、中等劑量DI-Leu16-IL2(實(shí)心方塊，第7-11天，1mg/kg)、降低劑量的DI-Leu16-IL2(空心圓，第7和10天，1mg/kg)、低劑量DI-Leu16-IL2(空心方塊，第7-11天，0.25mg/kg)和中等劑量抗EGFR-IL2(實(shí)心三角，第7-11天，1mg/kg)。結(jié)果以無疾病存活率進(jìn)行評分。X軸天數(shù)，Y軸無疾病百分比。
圖14說明Leu16VhY/VkZ-IL2比組合游離IL-2的高劑量抗CD20抗體更有效。將中等劑量的Leu16VhY/VkZ-IL2(實(shí)心方塊，第7-11天，20mg/小鼠)和相應(yīng)劑量的單體抗體及IL-2組分(空心方塊，第7-11天靜脈給藥16.7mg Leu16VhY、VkZ和3.3mg IL-2)的抗腫瘤活性與高劑量利妥?，敽推は?s.c.)給藥IL-2(空心菱形，第7天500mg利妥希瑪和第7、9和11天，10mg IL-2)、僅利妥?，?實(shí)心菱形，第7天，500mg)或PBS對照進(jìn)行比較。X軸天數(shù)，Y軸無疾病百分比。
圖15說明正?？笴D20+B細(xì)胞的存在沒有消除Leu16VhY/VkZ-IL2的抗腫瘤活性。如在方法中所述，在同一SCID/Daudi淋巴瘤模型中測試了先前植入的正常CD20+B細(xì)胞的效果。用單獨(dú)的高劑量利妥?，?菱形，第7天，25mg/kg)、Leu16VhY/VkZ-IL2(方塊、第11-15天，1mg/kg)、兩種給藥方案的組合(三角、第7天為利妥?，敚又?1-15天為Leu16VhY/VkZ-IL2)或者在全部給藥日中僅使用PBS。處理小鼠組。半數(shù)組在第5天被靜脈注射4.5×106個PBMC(空心符號)或僅接受PBS(實(shí)心符號)通過測量所有小鼠血清中的人抗體水平確認(rèn)B細(xì)胞的植入。X軸天數(shù)，Y軸無疾病百分比。
圖16顯示抗CD20抗體2B8、Leu16和1H4的重鏈和輕鏈V區(qū)以及2B8表位消除的衍生物V區(qū)(VhC、VhD、VkA、VkB、VkC和VkD和表位消除Leu16V區(qū)VhY和VkZ的比對。
圖17顯示本申請中使用的所有序列標(biāo)識號(SEQ ID NO1-43)的概述。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本文及附帶權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“多肽組合物”指單鏈多肽以及多鏈多肽，所述多鏈多肽中多肽鏈彼此化學(xué)結(jié)合，如通過一條鏈中的半胱氨酸殘基和另一條鏈中的半胱氨酸殘基間的一個或多個二硫鍵、通過酯鍵、酰胺鍵或任何其他適當(dāng)?shù)倪B接。
結(jié)合CD20的多肽組合物含有至少一個選自以下的多肽片段具有SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO1中含有選自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的重鏈可變區(qū)多肽(Vh)；具有SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO4中含有選自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的輕鏈可變區(qū)多肽(Vk)；具有SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列，但在SEQID NO9中含有選自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的Vh；和具有SEQ ID NO11的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO11中含有選自L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的Vk。
優(yōu)選地，結(jié)合CD20的多肽組合物包括至少一個具有選自SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO15和SEQ ID NO28的氨基酸殘基序列的多肽片段。
在優(yōu)選地實(shí)施方案中，結(jié)合CD20的多肽組合物含有修飾的重鏈可變區(qū)多肽和修飾的輕鏈可變區(qū)多肽。更優(yōu)選地，結(jié)合CD20的多肽組合物為嵌合抗體的形式并且還包括人重鏈恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)。優(yōu)選地人重鏈恒定區(qū)為IgG恒定區(qū)，更優(yōu)選IgG1恒定區(qū)。人輕鏈恒定區(qū)優(yōu)選為人κ輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物的另一優(yōu)選實(shí)施方案為含有多肽組合物的融合蛋白，所述多肽組合物包含如前述與細(xì)胞因子融合的修飾的重鏈或輕鏈可變區(qū)片段。優(yōu)選地細(xì)胞因子為IL2。
本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物的另一優(yōu)選實(shí)施方案為如前述包含至少一個修飾的Vh或修飾的Vk片段的抗體分子，如Fab抗體片段、單鏈Fv抗體片段或微型抗體。
特別優(yōu)選地結(jié)合CD20的多肽組合物含有至少一個具有選自SEQ IDNO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的Vh多肽片段。
另一特別優(yōu)選地結(jié)合CD20的多肽組合物含有至少一個具有選自SEQID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12的氨基酸殘基序列的Vk多肽片段。
更優(yōu)選地，結(jié)合CD20的多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO2、SEQID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的Vh多肽片段和具有選自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ IDNO12的氨基酸殘基序列的Vk多肽片段。
其他優(yōu)選地本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物含有選自以下的修飾的Vh和修飾的Vk片段的組合(a)具有SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO5的氨基酸殘基序列的Vk片段；(b)具有SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO6的氨基酸殘基序列的Vk片段；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO7的氨基酸殘基序列的Vk片段；(d)具有SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO8的氨基酸殘基序列的Vk片段；(e)具有SEQ ID NO3的氨基酸殘基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO6的氨基酸殘基序列的Vk片段；(f)具有SEQ ID NO3的氨基酸殘基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO8的氨基酸殘基序列的Vk片段；和(g)具有SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的Vh片段和具有SEQ IDNO12的氨基酸殘基序列的Vk片段。
本發(fā)明的另一方面為含有與可藥用載體、賦形劑、稀釋劑共存的本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物的藥物組合物。藥物組合物也可以包含額外的藥理學(xué)效應(yīng)藥物。
公開的序列來自對在本文中稱為“親本”抗體的小鼠單克隆抗體2B8和Leu16V區(qū)序列的分析，關(guān)于所述抗體體外和體內(nèi)的效用在US專利NO.5,736,137、US專利NO.5,776,456、US專利NO.6,399,061、US專利NO.6,455,043和外國等價物，以及Wu等(Protein Enginering(2001)141025-1033)及其參考文獻(xiàn)中完全公開。
以鑒定在人類中能作為第二類MHC配體并因而發(fā)揮T細(xì)胞表位功能的序列中所含有的多肽為導(dǎo)向進(jìn)行序列分析。本發(fā)明目的是提供親本抗體的改進(jìn)形式。因此對可能的第二類MHC表位位置的認(rèn)識是改造過程中重要的第一步。按照本文中整體引為參考的WO 02/069232中詳細(xì)描述的方案，用計(jì)算機(jī)進(jìn)行表位鑒定。第一步之后，本發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)了滿足所有在親本抗體中引入所需修飾的若干不同標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸替換組。
親本抗體V區(qū)內(nèi)的替換組產(chǎn)生具有降低第二類MHC配體數(shù)的多肽，因而降低了多肽作為T細(xì)胞表位的可能。同樣地，所述替換組使多肽序列保持了親本抗體的結(jié)構(gòu)和功能特性，對于在宿主細(xì)胞中保持并穩(wěn)定表達(dá)所特別需要的兩種特性而言確是如此，多肽序列還保留了特別重要的結(jié)合人CD20抗原、特別是體外結(jié)合人B細(xì)胞的能力。
值得注意的是，盡管為獨(dú)立來源，2B8和Leu16以及抗CD20抗體B1的Vh和Vk氨基酸殘基序列非常相似。不限于任何理論的，本發(fā)明的見解如下。CD20胞外小肽的一部分，側(cè)翼為可能形成二硫鍵的半胱氨酸的人CD20中的序列CEPANPSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO29)相應(yīng)于小鼠CD20中的序列CEPSNSSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO38)。小鼠NSS序列可能是N連接的糖基化位點(diǎn)，而人中相應(yīng)的NPS序列可能不是N連接的糖基化位點(diǎn)。小鼠和人CD20序列中的該差異將從鼠免疫系統(tǒng)的有利位置中揭示人序列中的表位。因此可以對所有針對人CD20產(chǎn)生的小鼠抗體進(jìn)行選擇以識別非常精細(xì)限定的表位，對此可能存在一個小鼠V區(qū)的最優(yōu)組。
因此本發(fā)明提供一組對識別人CD20重要的免疫原性減弱的共同V區(qū)序列。例如在重鏈中，本發(fā)明的修飾重鏈中的序列片段VSCKASGYT(SEQID NO16)在與CD20結(jié)合的抗體中是有用的；具體而言，該片段比來自2B8和Leu16抗體的相應(yīng)片段MSCKASGYT(SEQ ID NO30)具有更低的免疫原性。類似地，序列YNQKFKGKT(SEQ ID NO18)、FKGKTTLTA(SEQ ID NO19)和YMELSSLRS(SEQ ID NO20)在CD20抗體中是有用的，并比見于親本2B8和Leu16抗體的相應(yīng)序列YNQKFKGKA(SEQ ID NO31)、FKGKATLTA(SEQ ID NO32)和YMQLSSLRS(SEQ ID NO33)具有更低的免疫原性。
對輕鏈而言，本發(fā)明的修飾輕鏈中的序列片段IITASPGEKV(SEQ IDNO23)在與CD20結(jié)合的抗體中是有用的，具體而言，該片段比來自親本2B8和Leu16抗體的相應(yīng)片段ILSASPGEKV(SEQ ID NO34)具有更低的免疫原性。類似地，序列LASGVPSRF(SEQ ID NO26)、FSGSGSGTT(SEQ ID NO27)和YSMTISSLE(SEQ ID NO28)在CD20抗體中是有用的，并比見于親本2B8和Leu16抗體的序列LASGVPVARF(SEQ ID NO35)、FSGSGSGTS(SEQ ID NO36)和YSLTISRVE(SEQ ID NO37)具有更低的免疫原性。
本文及附帶的權(quán)利要求書中使用的“基本非免疫原性”或“減弱的免疫原性潛能”包括與副本或“親本”抗體(即非修飾的鼠或嵌合單克隆抗體，如2B8或Leu16)相比較減弱的免疫原性。術(shù)語“免疫原性”包括引發(fā)、誘導(dǎo)或促進(jìn)宿主動物(特別是人)中體液和/或T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的能力。
術(shù)語“抗體分子”指能夠與抗原組合、相互作用或結(jié)合的免疫球蛋白家族的多肽，包括完整抗體。
本文中使用的術(shù)語“抗原”指能夠與抗體分子相互作用的物質(zhì)，在本發(fā)明上下文中指CD20。本發(fā)明的CD20是人CD20或呈現(xiàn)抗體2B8的抗原的任何CD20。CD20可以是可溶的CD20衍生物或膜結(jié)合的CD20。
本文中使用的術(shù)語“免疫球蛋白”指由一個或多個基本由免疫球蛋白基因編碼的多肽組成的蛋白質(zhì)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4恒定區(qū)基因和天然的多種免疫球蛋白可變區(qū)基因。免疫球蛋白的一種天然形式是含有兩個相同的配對的四聚體，其中每個配對有一條輕鏈和一條重鏈。每個配對中重鏈和輕鏈可變區(qū)共同提供能與抗原相互作用的結(jié)合表面。本文中使用的術(shù)語Vh指重鏈可變區(qū)，本文中使用的術(shù)語Vk指輕鏈可變區(qū)且在該情況下眾多單克隆抗體共同輕鏈普遍為“κ”型鏈。
V區(qū)包括來自“互補(bǔ)性決定區(qū)”或“CDR”(即如Kabat等(Kabat等，《Sequences of Proteins of Immunological Interest)》，第5版。Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))所定義的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的約24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)氨基酸殘基和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的約31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸殘基)的氨基酸殘基。CDR的其他定義也為本領(lǐng)域所公認(rèn)，例如按照Chothia(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196901-917)的方案，CDR見于輕鏈中的約26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)氨基酸殘基和重鏈中的約26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸殘基?！皹?gòu)架”或“FR”殘基為如本文中定義的CDR殘基之外的V區(qū)殘基。
本文中使用的Vh指序列與本文中任一指定的Vh鏈相應(yīng)的、長度約為110到125個氨基酸殘基的多肽，所述多肽與Vk的組合后能夠結(jié)合人CD20。類似地，Vk指序列與本文中任一特定的Vk鏈相應(yīng)的長度約為95-130個氨基酸殘基的多肽，所述多肽與Vh組合后能夠結(jié)合人CD20。全長免疫球蛋白重鏈分子量約為50kDa，N端由Vh基因編碼，C端由恒定區(qū)基因之一編碼。類似地，全長輕鏈分子量約為25kDa，N端由V區(qū)基因編碼，C端由恒定區(qū)基因編碼。
除了完整抗體(四聚體)以外，免疫球蛋白還以從應(yīng)用重組DNA技術(shù)或蛋白質(zhì)化學(xué)得來的大量其他形式存在。這些形式包括例如Fv、Fab、Fab’和(Fab)2分子并且都可以含有本發(fā)明的任一Vh或Vk序列。其他實(shí)例可以包括“雙特異”抗體，即含有與具有不同抗原特異性的另一Vh/Vk組合相組合的本發(fā)明Vh/Vk組合。
本文及附帶的權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“T細(xì)胞表位”指能夠結(jié)合第二類MHC、能夠刺激T細(xì)胞和/或與第二類MHC形成復(fù)合物后還能結(jié)合(不一定顯著激活)T細(xì)胞的氨基酸序列。
本文及附帶的權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“肽”為包括兩個或及更多氨基酸殘基的化合物。氨基酸殘基通過(下文定義的)肽鍵彼此連接。有20種通用的天然存在氨基酸與肽的生物產(chǎn)生相關(guān)，任何數(shù)量的所述氨基酸可以以任何順序連接形成肽鏈或環(huán)。肽的生物產(chǎn)生中使用的天然存在氨基酸都是L-構(gòu)型。也可以使用常規(guī)合成方法利用L-氨基酸以及D-氨基酸或兩種構(gòu)型的氨基酸的各種組合制備合成肽。有些肽只含有少量氨基酸殘基。例如具有小于十個氨基酸殘基的短肽有時稱為“寡肽”。其他肽含有大量氨基酸殘基例如多至100或更多，稱為“多肽”。
約定俗成地，“多肽”可以認(rèn)為是含有三個或更多氨基酸殘基的肽鏈，而“寡肽”通常認(rèn)為是“短”多肽的特殊類型。因此，本文中提到的任何“多肽”應(yīng)該理解為也包括寡肽。另外，任何時候提到的“肽”包括多肽、寡肽和蛋白質(zhì)。氨基酸殘基的每種不同排列形成不同的多肽或蛋白質(zhì)?？梢孕纬傻亩嚯牡臄?shù)量(以及由此產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)的數(shù)量)實(shí)際上是無限的。
術(shù)語“肽組合物”指至少含有一個來自抗CD20抗體(優(yōu)選為2B8和Leu16)的多肽的組合物。多肽可以以單鏈(例如重鏈或其部分，輕鏈或其部分或單鏈Fv)或二聚體形式存在。二聚體形式可以是完整抗體、Fab片段、微型抗體或任何雙鏈分子，其中單鏈僅通過一條化學(xué)鍵連接。組合物可以只含有若干不通過化學(xué)或半胱氨酸鍵連接的單鏈多肽。
本發(fā)明還涉及抗CD20單克隆抗體，其中在分子V區(qū)內(nèi)的位置引入了至少一個氨基酸殘基的替換，以使蛋白質(zhì)中一個或多個可能的T細(xì)胞表位的活性顯著降低或消失。最優(yōu)選提供這樣的修飾抗體分子，其中在親本分子免疫原性最強(qiáng)的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行氨基酸修飾(例如替換)。本發(fā)明主要優(yōu)選地實(shí)施方案含有修飾的抗體分子，其中改變了任何第二類MHC配體以消除結(jié)合或減少肽可以結(jié)合的MHC同種異數(shù)目。為了消除T細(xì)胞表位，在預(yù)測能夠?qū)崿F(xiàn)顯著降低或消除T細(xì)胞表位活性的肽序列中的適當(dāng)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸替換。實(shí)際上適當(dāng)?shù)奈稽c(diǎn)優(yōu)選等同于在第二類MHC分子結(jié)合溝內(nèi)提供的口袋之一中結(jié)合的氨基酸殘基。
最優(yōu)選在豁口的第一個口袋內(nèi)肽的所謂P1或P1錨位置改變結(jié)合。肽的P1錨殘基和第二類MHC結(jié)合溝的第一個口袋的結(jié)合相互作用的質(zhì)量公認(rèn)是整個肽的總體結(jié)合親合力的主要決定因素。在肽的該位置的適當(dāng)?shù)奶鎿Q是用不容易適應(yīng)口袋的殘基進(jìn)行的，例如替換為更親水的殘基。肽中等同于結(jié)合MHC結(jié)合豁口中其他口袋區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基也在考慮中，并屬于本發(fā)明的范圍。
應(yīng)該理解在給定的潛在T細(xì)胞表位中的單個氨基酸替換是消除表位的最優(yōu)途徑?？梢钥紤]單個表位內(nèi)替換的組合，例如當(dāng)單獨(dú)定義的表位彼此重疊時特別適用。另外，可以不在等同于關(guān)于二類MHC結(jié)合溝的“口袋殘基”的位置，而在肽序列中的任何位點(diǎn)進(jìn)行給定表位中的單個氨基酸替換或與單個表位內(nèi)組合的氨基酸替換。所有這樣的替換都屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的修飾抗體分子的重要的和有意義的特征是它們保留了非修飾親本抗體的功能性活性。因此特別需要產(chǎn)生表現(xiàn)親本非修飾抗體中與治療效力相關(guān)的全部有益技術(shù)特征的修飾抗體或修飾抗體分子。這與本發(fā)明設(shè)想的用途相關(guān)，即提供在大量人類重要疾病中具有治療效果的組合物，所述疾病尤其是包括B細(xì)胞淋巴瘤和其他B細(xì)胞介導(dǎo)的病癥。這樣的治療用途是本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方案。
因此，本發(fā)明的修飾抗體分子對其靶抗原表現(xiàn)的親合力與親本抗體表現(xiàn)的親合力相似。因此該抗體分子識別CD20陽性人B細(xì)胞。親本分子的治療效力認(rèn)為是通過抗體誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的能力來介導(dǎo)。抗體恒定區(qū)(即Fc結(jié)構(gòu)域)結(jié)合人血清補(bǔ)體組分C1q的能力對該活性是至關(guān)重要的。ADCC和C1q結(jié)合通過完整抗體分子的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)，本發(fā)明設(shè)想產(chǎn)生含有與ADCC誘導(dǎo)相容的人Fc的完整抗體分子。這些恒定區(qū)最優(yōu)選與人κ輕(如Km3)鏈組合的IgG1重鏈。
本發(fā)明涉及修飾的抗CD20抗體分子、含有修飾的抗體或修飾抗體的片段的組合物并且相關(guān)的組合物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明因此設(shè)想產(chǎn)生和使用包括例如Fv、Fab、Fab’和F(ab’)2片段的抗體片段。這些片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法(例如Coligan等(《Current Protocols in Immunology》，JohnWiley & Sons 1991-1997))制備。本發(fā)明還設(shè)想來自本領(lǐng)域熟知的分子種類的抗體分子的多種重組形式。這些種類包括穩(wěn)定化的Fv片段，其包括含有連接Vh和Vk結(jié)構(gòu)域的肽接頭的單鏈Fv形式(例如scFv)，或通過鏈間二硫鍵穩(wěn)定并含有設(shè)計(jì)用來促進(jìn)Vh和Vk結(jié)構(gòu)域連接的額外的半胱氨酸殘基的Fv(dsFv)。同樣地，其他組合物為本領(lǐng)域所熟悉并包括稱為“微型抗體”的種類和單獨(dú)的可變區(qū)“dAb”。還可以通過例如整合入其他種類以提高修飾的抗體V區(qū)結(jié)構(gòu)域的效價，即通過改造二聚化結(jié)構(gòu)域(例如“亮氨酸拉鏈”)或化學(xué)修飾策略而具有多抗原結(jié)合位點(diǎn)的種類。
另一方面，本發(fā)明涉及在其中偶聯(lián)了本發(fā)明的抗CD20V區(qū)和非免疫球蛋白融合配偶伴蛋白質(zhì)(如抗癌蛋白質(zhì))的融合蛋白。這些蛋白的實(shí)例包括毒素(如假單胞菌(Pseudomonas)外毒素)、酶(如抗體依賴性的前體藥物療法(“ADEPT”)的細(xì)菌蛋白酶)或細(xì)胞因子。特別有用的細(xì)胞因子是IL-2、IL-12的野生型和突變形式、IL-2和IL-12的融合形式和其他白細(xì)胞介素、干擾素和腫瘤壞死因子。Gillies和其同事(US5,150,650、WO98/25978、WO01/10912、WO02/72605、WO03/48334)、Epstein(WO03/15697)和Halin等(Cancer Res.(2003)633202-10)已經(jīng)描述了抗癌抗體V區(qū)和細(xì)胞因子的大量構(gòu)型。這些方法和構(gòu)型在本文中引入作為參考。含有本發(fā)明V區(qū)的融合蛋白的免疫球蛋白恒定區(qū)可以通過突變進(jìn)行其他修飾，如影響補(bǔ)體固定的突變、影響Fc受體結(jié)合的突變、影響FcRn結(jié)合的突變和影響融合蛋白血清半衰期的突變。這些突變的實(shí)例描述于引入作為參考的WO09943713和WO01/58957。
另一方面，本發(fā)明涉及編碼結(jié)合CD20的多肽組合物的分離核酸，例如編碼修飾的抗CD20抗體分子、修飾的重鏈可變區(qū)多肽、修飾的輕鏈可變區(qū)多肽、抗CD20抗體融合蛋白等等的核酸。圖17顯示了編碼Leu16輕鏈的多核苷酸DNA序列(SEQ ID NO39)。編碼Leu16輕鏈優(yōu)選地表位消除形式的DNA序列在圖17中以SEQ ID NO40顯示。圖17顯示了編碼Leu16重鏈的多核苷酸DNA序列(SEQ ID NO41)。編碼Leu16重鏈優(yōu)選地表位消除形式(即包括VhY和人恒定區(qū))的DNA序列在圖17中以SEQ ID NO42顯示。編碼融合了IL-2的Leu16重鏈優(yōu)選地表位消除形式(即包括VhY、人恒定區(qū)和結(jié)合于恒定區(qū)C末端的IL-2)的DNA序列在圖17中顯示為SEQ ID NO43。
本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物治療人的方法。實(shí)施例說明了如何將本發(fā)明的多肽組合物用于治療鼠模型中的人癌細(xì)胞，以下得到的結(jié)果是可能用于治療人類癌癥(如B細(xì)胞淋巴癌和其他表達(dá)CD20的癌癥)的策略的一般性描述。
本發(fā)明結(jié)合CD20的多肽組合物(如抗CD20-IL2融合蛋白)按如下使用對患表達(dá)CD20的癌癥(如B細(xì)胞淋巴癌)的患者施用本發(fā)明的多肽組合物。優(yōu)選地給藥途徑為靜脈注射或皮下注射，但也可以采用肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或其他注射途徑。還可以采用吸入、口服或栓劑作為給藥途徑。優(yōu)選在四周的循環(huán)中每周三次給藥，接著三個星期不進(jìn)行處理。取決于給定的個體中融合蛋白的藥代動力學(xué)行為，治療頻率可以更高或更低。約70千克的成人優(yōu)選地劑量在每劑約1到約100毫克的范圍內(nèi)，優(yōu)選范圍為每劑約4到約20毫克。對每月治療一次的70kg的成人最優(yōu)選地劑量約為10毫克。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序監(jiān)控病人的反應(yīng)。
實(shí)施例實(shí)施例描述了產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)的某些具體方法，但蛋白質(zhì)表達(dá)領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到可以使用多種熟知的技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。例如，優(yōu)選在真核細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞，如NS/0細(xì)胞、BHK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、293細(xì)胞或PERC6細(xì)胞)中產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以例如依次使用以下步驟中的一些或全部進(jìn)行純化Abx Mixed Resin柱層析、重組A蛋白層析和Q Sepharose柱層析，接著進(jìn)行Pellicon 2切向流動透析以將緩沖液更換為配方緩沖液。病毒失活和去除步驟在這些步驟中交叉進(jìn)行。病毒失活和去除對于純化本身不是必要的，而是用于滿足調(diào)節(jié)因素。本發(fā)明的另一方面涉及使用修飾的抗CD20抗體分子治療人的方法。實(shí)施例說明了如何將本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于處理鼠模型中的人類癌細(xì)胞，以下得到的結(jié)果是可能用于治療人類癌癥(如B細(xì)胞淋巴瘤和其他表達(dá)CD20的癌癥)的策略的一般性描述。
本發(fā)明的融合蛋白按如下使用。治療患表達(dá)CD20的癌癥如B細(xì)胞淋巴瘤的病人。優(yōu)選地給藥途徑為靜脈注射或皮下注射，但也可以采用肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)或其他注射途徑。還可以采用吸入、口服或栓劑作為給藥途徑。優(yōu)選在四周的循環(huán)中每周三次給藥，接著三個星期不進(jìn)行處理，但取決于給定個體中抗CD20-IL2融合蛋白的藥代動力學(xué)行為，治療頻率也可更高或更低。約70千克的成人優(yōu)選地劑量在每劑約1到約100毫克的范圍內(nèi)，優(yōu)選范圍為每劑約4到約20毫克。對每月治療一次的70kg的成人最優(yōu)選地劑量約為10毫克。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序監(jiān)控病人的反應(yīng)。
實(shí)施例1.表達(dá)去免疫的Leu16抗體的方法和試劑1A細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染為得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，通過電穿孔法將質(zhì)粒DNA引入小鼠骨髓瘤NS/0細(xì)胞中。一次洗滌約5×106個細(xì)胞并用磷酸緩沖溶液(PBS)重懸浮。然后將10μg線性化的質(zhì)粒DNA在Gene Pulser杯(0.4cm電極間距，BioRad)中與細(xì)胞在冰上孵育10分鐘。使用GenePulser(BioRad)并設(shè)定為0.25V和500RF實(shí)施電穿孔。使細(xì)胞在冰上復(fù)原10分鐘，然后在生長培養(yǎng)基中重懸浮并置于96孔板上。通過在轉(zhuǎn)染后兩天引入的100nM氨甲喋呤(MTX)存在下進(jìn)行培養(yǎng)來選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆。以每3天一次的頻率再給細(xì)胞添加2到3次營養(yǎng)，MTX抗性克隆在2到3周內(nèi)出現(xiàn)。通過抗人FC的ELISA和分析型高壓液相色譜(HPLC)測定來自克隆的上清液以鑒定高生產(chǎn)者(Gillies等(1989)J.Immunol.Methods 125191)。分離高生產(chǎn)的克隆(在培養(yǎng)基規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)物中每毫升細(xì)胞培養(yǎng)物上清液產(chǎn)生約100μg純化蛋白質(zhì))并在含有100mM MTX的生長培養(yǎng)基中增殖。
1BELISA使用ELISA測定MTX抗性克隆上清液中蛋白質(zhì)產(chǎn)物的濃度。使用抗huFc ELISA測量含有人Fc的蛋白質(zhì)的量?？筯u-Fc ELISA在下文有詳細(xì)描述。
A.包被平板使用PBS中5μg/ml的AFFINIPURETM山羊抗人IgG(H+L)(Jackson Immuno Research)以96孔平板(Nunc ImmunoPlate Maxisorp)中100μl/孔包被ELISA平板。蓋上包被過的平板并在4℃孵育過夜。然后用OBS中0.05％的Tween(Tween 20)洗滌平板4次并用PBS中1％的牛血清白蛋白(BSA)/1％的山羊血清以200μl/孔封閉平板。在37℃用封閉緩沖液/孵育兩小時后，用0.05％的Tween洗滌4次并在紙巾上敲干。
B.與測試樣品和第二抗體孵育在樣品緩沖液中將測試樣品稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛龋鰳悠肪彌_液在PBS中含有1％ BSA/1％山羊血清/0.05％Tween。用已知濃度的(攜帶人Fc的)嵌合抗體制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。為了制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，在樣品緩沖液中進(jìn)行連續(xù)稀釋以得到從125ng/ml到3.9ng/ml范圍那的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稀釋的樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣以100μl/孔加入平板中，并在37℃孵育平板2小時。
C.孵育后，用PBS中的0.05％ Tween洗滌平板8次。然后在每孔中加入100μl第二抗體在樣品緩沖液中約1∶120,000稀釋的辣根過氧化酶(HRP)綴合抗人IgG(Jackson Immune Research)。第二抗體的準(zhǔn)確稀釋倍數(shù)必須對每一批HRP綴合抗人IgG進(jìn)行分別測定。在37℃孵育2小時后，用PBS中的0.05％ Tween洗滌平板8次。
D.顯色將制就的底物溶液(TMB Substrate，BioFX Laboratories，MD)以100μl/孔加入平板，并在室溫顯色10分鐘。加入1N HCl(100μl/孔)終止反應(yīng)。使用設(shè)置為450nm波長的平板讀數(shù)器閱讀平板。
1C基于分析型HPLC的測定蛋白質(zhì)濃度的方法蛋白質(zhì)濃度也使用分析HPLC測定。以KS-IL2免疫綴合物作為標(biāo)準(zhǔn)，在Agilent 1100 HPLC系統(tǒng)上用POROS柱(Perceptive Biosystems)使用基于pH的洗脫程序確定范圍0.78到50.0μg/ml蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
實(shí)施例2.表位消除的Leu-16抗體-IL2融合蛋白對表達(dá)CD20抗原的Daudi腫瘤細(xì)胞相對結(jié)合親合力的測定使用流式細(xì)胞術(shù)分析將表位消除的Leu16-IL2融合蛋白與表達(dá)CD20抗原的Daudi腫瘤細(xì)胞的結(jié)合同其他已知抗CD20抗體的結(jié)合進(jìn)行比較。每個測試的樣品在100μl體積中使用約106個Daudi細(xì)胞與不同濃度的抗體。此分析顯示帶有VHY和VKZ可變區(qū)的修飾的抗體-IL2融合蛋白與表達(dá)CD20的細(xì)胞的結(jié)合至少與相應(yīng)的嵌合Leu16-IL2融合蛋白一樣好。這顯示引入Leu16V區(qū)以產(chǎn)生VHY和VKZ可變區(qū)的突變不干擾抗體結(jié)合。還有利的將帶有VHY和VKZ可變區(qū)的抗體-IL2融合蛋白與RITUXAN(C2B8)以及含有鼠2B8 V區(qū)的2B8-IL2融合蛋白進(jìn)行了比較。以下表1顯示流式細(xì)胞儀測定的暴露于不同濃度的抗體或抗體-IL2融合蛋白的Daudi細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，該數(shù)據(jù)代表了一組典型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表1
實(shí)施例3.由攜帶減弱免疫原性突變的抗CD20-IL2融合蛋白驅(qū)動的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)將表達(dá)CD20的NS/0細(xì)胞暴露于各種濃度的抗體或抗體-IL2融合蛋白并按照標(biāo)準(zhǔn)程序測試ADCC裂解。典型數(shù)據(jù)集在圖5中顯示。測試的蛋白質(zhì)如下chLeu16為由Leu16小鼠V區(qū)和人IgG1恒定區(qū)組成的嵌合抗體、chLeu16-IL2為由Leu16小鼠V區(qū)和人IgG1恒定區(qū)組成的嵌合抗體，并且抗體重鏈C端融合了人IL-2部分；除了圖3和4中列出的VhHY和VkZ可變區(qū)代替鼠Leu16V區(qū)存在外，Ab(VhY/VkZ)-IL2與chLeu16-IL2相同；該圖中的2B8是由小鼠288 V區(qū)和人IgG1恒定區(qū)組成的嵌合抗體；該圖中的2B-IL2是由小鼠2B8 V區(qū)和人IgG1恒定區(qū)組成的嵌合抗體并且抗體重鏈的C端融合有人IL-2部分；以及KS-IL2是抗體重鏈C端融合了人IL-2部分的抗EpCAM抗體。KS-IL2蛋白質(zhì)作為陰性對照。某些抗體-IL2融合蛋白具有如Gillies(WO02/66514)等所述的C端重鏈氨基酸突變。這些突變對ADCC數(shù)據(jù)沒有影響。
數(shù)據(jù)表明攜帶VhY和VkZ可變區(qū)的融合蛋白與攜帶結(jié)合CD20的鼠V區(qū)的類似分子對刺激ADCC具有同等活性。通過若干不同細(xì)胞試驗(yàn)測定IL2活性。結(jié)果示于下文表2。
表2
另外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，至少在不存在表達(dá)相同表面抗原的正常人B細(xì)胞時，靶向CD20的基于IL-2的免疫細(xì)胞因子在良好建立淋巴瘤的SCID小鼠模型中非常有效，還發(fā)現(xiàn)盡管缺乏功能性T細(xì)胞(已在眾多臨床前試驗(yàn)中鑒定為免疫細(xì)胞因子抗腫瘤活性的首要效應(yīng)器的細(xì)胞)，使用免疫細(xì)胞因子對于延長患彌散性疾病(disseminated disease)的小鼠的存活的療效遠(yuǎn)高于裸抗體。
實(shí)施例4.由攜帶減弱免疫原性的突變的抗CD20-IL2融合蛋白驅(qū)動的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)為測定本發(fā)明的抗體和融合蛋白的CDC活性，將51Cr標(biāo)記的Daudi細(xì)胞與作為補(bǔ)體來源的人血漿(稀釋8倍)孵育1小時。通過從實(shí)驗(yàn)值中減去背景放射性并除以用去垢劑裂解得到的總釋放的放射性，再乘以100來計(jì)算特異性裂解的百分比。
嵌合Leu-16抗體CDC活性與相應(yīng)具有表位消除V區(qū)的Leu16抗體的比較表明這兩種抗體的活性基本相同。嵌合Leu-16抗體-IL2融合物和具有表位消除V區(qū)的相應(yīng)Leu16抗體-IL2融合物之間類似地比較表明這兩中融合蛋白的活性也基本相同。
與ADCC相反，H鏈C端融合了IL-2后CDC有所減弱(圖2B)。先前報(bào)道了使用抗GD2免疫細(xì)胞因子的類似效果(Gillies SD，等CancerRes.(1999)；592159-2166)。典型結(jié)果在圖7C中顯示。
實(shí)施例5.表位去除的Leu16-IL2融合蛋白的藥代動力學(xué)圖譜在特別有用的Leu16VhY/YkZ-IL2構(gòu)建體中，通過使用Cg1重鏈同種型保留了FcR結(jié)合和ADCC活性，但在H鏈和IL-2之間整合了修飾的連接區(qū)以減弱細(xì)胞內(nèi)蛋白水解(WO01/58957)。具體而言，使用了相應(yīng)于抗體重鏈C端氨基酸的賴氨酸到丙氨酸的改變。得到的蛋白質(zhì)良好的遵循靜脈注射給藥的藥代動力學(xué)譜，特別是在分配相(圖8)。通過在同一實(shí)驗(yàn)中測試酶去糖基化的Leu16VhY/VkZ(Lys-Ala)-IL2來考查FcR結(jié)合對藥代動力學(xué)譜的影響。結(jié)果表明FcR結(jié)合的喪失在一定程度上改善了藥代動力學(xué)行為。取決于應(yīng)用和需要的給藥頻率，可以優(yōu)選使用CH2結(jié)構(gòu)域中帶有N-連接糖基化位點(diǎn)的Leu16VhY/VkZ-IL2分子，其具有ADCC活性但血清半衰期相對較短，或是使用CH2結(jié)構(gòu)域中缺乏N-連接糖基化位點(diǎn)的Leu16VhY/VkZ-IL2分子，其不具ADCC活性但具有相對較長的血清半衰期。
實(shí)施例6.表位消除的Leu16-IL2融合蛋白的療效譜對SCID小鼠靜脈注射5×106個CD20+Daudi淋巴瘤細(xì)胞(第0天)，接著在第7天開始靜脈注射免疫細(xì)胞因子(5次5或20mg日劑量)或?qū)φ湛贵w(每隔一天500mg，共3次)。以高劑量使用對EGFR(對照)特異的低靶向?qū)φ彰庖呒?xì)胞因子425-IL2以說明活性主要由改變的IL-2半衰期決定。結(jié)果記錄為一般健康(例如死亡10-14天前出現(xiàn)的癱瘓)和小鼠存活。圖9-12顯示了典型結(jié)果。圖10-12的數(shù)據(jù)來自單個大規(guī)模試驗(yàn)，但數(shù)據(jù)在不同的圖中顯示以便于閱讀。在第一個抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，將Daudi細(xì)胞靜脈注射進(jìn)SCID小鼠，引起廣泛的彌散性疾病并在第30天內(nèi)引起全部小鼠的癱瘓。將處理延緩到第7天以保證腫瘤細(xì)胞完全植入。我們使用5種日劑量的免疫細(xì)胞因子和3種隔日劑量的抗體將低和中等劑量的嵌合和Leu16VhY/VkZ-IL2免疫細(xì)胞因子與高劑量的利妥?，斶M(jìn)行了比較。選擇這一安排是由于利妥希瑪?shù)难h(huán)半衰期(數(shù)天)與免疫細(xì)胞因子(約8小時)相比長很多。在這些條件下，利妥?，?25mg/kg×3)與PBS對照相比將協(xié)帶腫瘤小鼠的50％存活率從39天延長到56天(圖4)。低劑量嵌合和Leu16VhY/VkZ-IL2組(0.25mg/kg×5)具有與高劑量利妥?，斚嗨频拇婊钋€(50％存活率為64天)。用更高劑量免疫細(xì)胞因子(1mg/kg×5)處理的組顯示出存活率的明顯提高，在試驗(yàn)終止時(第110天)Leu16VhY/VkZ-IL2組的小鼠沒有出現(xiàn)死亡，且在chLeu16-IL2組中只有八分之一的小鼠死亡。因此，在基于IL-2的免疫細(xì)胞因子中，Leu16抗體表位消除的V區(qū)與鼠Leu16抗體對于SCID小鼠中彌散性淋巴瘤的治療同樣有效。同一實(shí)驗(yàn)中還使用上文已顯示喪失ADCC活性的酶去糖基化Leu16VhY/VkZ-IL2測試了抗體效應(yīng)子功能對抗腫瘤活性的貢獻(xiàn)(圖7B)。如圖12所示，盡管喪失ADCC活性，抗腫瘤活性的絕大部分得到了保留。在后面的時間點(diǎn)中，在高劑量組中觀察到了完整的和去糖基化的形式之間明顯的差異。因此，盡管ADCC看來在該模型中發(fā)揮作用，該模型中抗腫瘤活性的一大部分可以單獨(dú)歸因于IL-2對腫瘤的靶向遞送。為了說明表位消除的免疫細(xì)胞因子與靶細(xì)胞實(shí)際結(jié)合的重要性，而不是簡單的延長IL-2血清半衰期的效果，測試了靶向在該細(xì)胞系中表達(dá)水平很低(圖6B)的EGFR的對照IL-2免疫細(xì)胞因子(Cruz等J Biotechnol.(2002)26；96169-183)。發(fā)現(xiàn)即使連續(xù)5天給予較高劑量(1mg/kg)，該模型中的抗腫瘤活性也遠(yuǎn)低于同劑量的靶向CD20的免疫細(xì)胞因子(圖13)。EGFR靶向的免疫細(xì)胞因子的活性也顯著低于間隔3天只給藥兩次(第7天和第10天)或以低四倍的劑量給藥5天的同劑量的Leu16VhY/VKkIL2。這些結(jié)果說明了特異性腫瘤細(xì)胞靶向作用對抗腫瘤活性的重要性。
分離的抗體和IL-2組分的抗腫瘤活性。組合利妥?，敽虸L-2的臨床試驗(yàn)已顯示出提高的應(yīng)答率(Friedberg等Br.J.Haematol.(2002)；117828-834)。使用兩種不同方法在同一Daudi淋巴瘤模型中測試了該組合，并與Leu16VhY/VkZ-IL2處理進(jìn)行比較。在第一種情況下，給動物連續(xù)5天靜脈注射與20mg Leu16VhY/VkZ-IL2中所含有的摩爾量相等的Leu16VhY/VkZ抗體和IL-2。在第二種情況下，每隔一天經(jīng)皮下給藥25mg/kg利妥希瑪和10mcg IL2，共3次。后一種給藥方案由于皮下給藥的駐留作用可保證高抗體水平和持續(xù)的IL-2活化。結(jié)果表明兩種組合方案得到大致相同程度的抗腫瘤活性，具有63天的50％存活率(圖14)。低劑量組合組中使用的等量Leu16VhY/VkZ-IL2免疫細(xì)胞因子處理引起所有小鼠的長期存活。這一點(diǎn)尤其值得注意，因?yàn)橛梅蛛x的抗體和IL-2處理的組由于其長得多的半衰期可以比Leu16VhY/VkZ-IL2接觸抗體的時間長的多。另外，比較使用的IL-2的量是基于質(zhì)量而不是IL-2活性單位。如上文表2所示，當(dāng)用表達(dá)高親合力IL-2R的小鼠細(xì)胞系進(jìn)行衡量時，自由的rIL-2比Leu16VhY/VkZ-IL2中含有的等摩爾量的等價物活性高約3倍。對于只表達(dá)中等IL-2R的小鼠免疫細(xì)胞，對這一差異超過10倍有利于自由rIL-2。
實(shí)施例7.用人免疫細(xì)胞重建的小鼠中Leu16VhY、VKZ的抗腫瘤活性在用人B細(xì)胞重建的SCID模型中，在第0天對小鼠靜脈注射5×106個CD20+Daudi淋巴瘤細(xì)胞，在第5天靜脈注射4.5×107個人PBMC。一組小鼠(n＝8)只接受PBS、一組只接受抗體(第7、9和11天，500mg)、一組只接受免疫細(xì)胞因子(第11-15天，20mg)、一組接受抗體(第7、9和11天500mg)和免疫細(xì)胞因子(第11-15天20mg)的組合。在第21和34天通過抗人IgG ELISA檢查所有小鼠血清中人抗體的存在。由于CD20在正常B細(xì)胞表面表達(dá)，靶向B淋巴瘤細(xì)胞表面的該抗原是復(fù)雜的。因此，治療涉及大量正常B細(xì)胞背景中的腫瘤細(xì)胞的靶向消除。由于IL-2免疫細(xì)胞因子劑量可能受限于IL-2組分的毒性，裸抗體引起正常B細(xì)胞消除所需的高劑量不太可能用于Leu16VhY、VKZ-IL2。組合治療是可能的臨床方案，其中Leu16VhY、VKZ-IL2治療可以隨利妥希瑪治療首先去除大量(de-bulk)的CD20+腫瘤細(xì)胞和正常B細(xì)胞后進(jìn)行。在建立更真實(shí)的腫瘤模型的嘗試中，對小鼠注射含有人B細(xì)胞的PBMC，然后比較利妥?，敾騆eu16VhY/VkZ-IL2的單一療法及其組合，所述組合中抗體在第7天以單劑給藥，接著在第11天開始用Leu16VhY/VkZ-IL2進(jìn)行治療療程。第二組小鼠未植入PBMC但接受同樣的治療方案。通過在所有小鼠組中測定人IgG水平確定B細(xì)胞的植入。表3中的數(shù)據(jù)顯示接受人PBMC的小鼠都存在高于500μg/ml水平的人IgG，說明植入有效。
表3.植入人PBMC的SCID小鼠的人抗體產(chǎn)生
通過抗IgG ELISA對人抗體定量并表示為mcg/ml。
-B細(xì)胞組中檢測的抗體顯示了rituimab和DI-Leu16-IL2(均為人IgG)對總循環(huán)抗體的貢獻(xiàn)。所有治療組(包括Leu16VhY/VkZ-IL2單治療組)在第21天的抗體水平顯示出顯著下降，而IgG水平到第34天略為上升，表明B細(xì)胞的繼續(xù)產(chǎn)生。另一方面，利妥?，敾蚪M合治療到第34天引起人抗體產(chǎn)生的消除。由于在未植入PBMC的相應(yīng)組中觀察到同樣的水平，在利妥希瑪和組合治療組的小鼠血中檢測到的殘留水平顯然是利妥?，敱旧怼＝Y(jié)果還顯示所有治療組的抗腫瘤活性沒有受到存在CD20+人B細(xì)胞的顯著影響(圖15)。不限于任何理論，這可能部分因?yàn)長eu16VhY/VkZ-IL2單獨(dú)清除大部分植入的B細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞的能力。由于治療開始的推遲(第11天和第7天)，該模型中Leu16VhY/VkZ-IL2的活性水平與先前的實(shí)驗(yàn)相比顯著降低，然而，應(yīng)該注意只在單療程中比較了不同分子，而臨床上可能使用額外的治療周期。我們還發(fā)現(xiàn)利妥?，攩未谓o藥與接著的Leu16VhY/VkZ-IL2單療程的組合至少具有加和的抗腫瘤活性，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(第120天)大部分小鼠仍未患病。
實(shí)施例8.從抗CD20抗體中去除T細(xì)胞表位的一般方法Haisma等(Blood 92184(1998))已經(jīng)描述了稱為1H4的另一抗CD20抗體，其V區(qū)與Leu16的V區(qū)約95％是相同的。圖16顯示了2B8、Leu16、它們的本發(fā)明表位消除衍生物和1H4的重和輕(κ)V區(qū)的比對。由于抗體2B8、Leu16和1H4的序列非常相似，本發(fā)明的推論為所有這些抗體識別CD20中同樣的表位。不限于任何理論，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CD20是在小鼠和人中高度保守的蛋白質(zhì)，CD20的胞外結(jié)構(gòu)域中存在一段與小鼠CD20的序列CEPSNSSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO29)相應(yīng)的序列CEPANPSEKNSPSTQYC(SEQ ID NO38)。在人CD20中，序列NPS未被N-糖基化，而小鼠CD20中相應(yīng)的序列NSS是N-糖基化的。根據(jù)本發(fā)明的這一理論，人CD20缺乏N-糖基化揭示了鼠CD20中不存在的抗體表位，因此當(dāng)用人CD20免疫小鼠時，該表位不會被小鼠免疫系統(tǒng)識別為自身。因此，根據(jù)本發(fā)明，針對CD20的單克隆抗體的起始V區(qū)與Leu16或2B8的V區(qū)至少80％序列一致，更經(jīng)常為至少90％序列一致?？贵w1H4就是這樣的一個實(shí)例。根據(jù)本發(fā)明抗CD20抗體(例如1H4)的T細(xì)胞表位的去除是通過首先與Leu16、2B8和圖16所示的相應(yīng)表位消除變體的重鏈和輕鏈V區(qū)進(jìn)行比對，然后在CD20抗體(如1H4)的V區(qū)引入與表位消除的Leu16和/或2B8中所引入的突變相應(yīng)的突變?？梢酝ㄟ^手工比對或使用熟知的比對程序如BLAST進(jìn)行比對。例如使用圖16的比對，顯然分別產(chǎn)生了具有一個或多個以下氨基酸片段的抗CD20Vh結(jié)構(gòu)域SGAELKKPGAS、VSCKASGYT、LEWTGAIY、YNQKFKGKT、FKGKTTLTA、YMELSSLRS、SSLRSEDTAV和DWGTGTTVT，即SEQID NO15-22。類似地，使用圖16的比對，顯然分別產(chǎn)生了具有一個或多個以下氨基酸片段的抗CD20 VL結(jié)構(gòu)域IITASPGEKV、CRASTSASY、QQKPTSSP、LASGVPSRF、FSGSGSGTT和YSMTISSLE，即SEQ IDNO23-28。具體地說，產(chǎn)生了具有一個或多個本段前述氨基酸片段的抗體1H4的變體。可以使用鑒定T細(xì)胞表位活性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢查T細(xì)胞表位確實(shí)被去除，以確證新引入的突變的有效性。例如，可以使用Carr等(US專利申請20030153043和WO02/069232)的方法。另外，可以向免疫細(xì)胞(優(yōu)選人免疫細(xì)胞)中加入與可能的T細(xì)胞表位相應(yīng)的肽，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測試刺激細(xì)胞增殖的能力。相應(yīng)的含有V區(qū)的蛋白質(zhì)可以裝配為完整抗體、抗體融合蛋白、Fabs、Fab融合蛋白、單鏈Fv蛋白或抗體V區(qū)的其他標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)型。然后如前面的實(shí)施便所述，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)表達(dá)方法產(chǎn)生相應(yīng)的含有V區(qū)的蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.具有結(jié)合CD20抗原的能力的多肽組合物，其含有至少一個選自以下的多肽片段(i)具有SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO1中含有選自V12K、A14P、M20V、I48T、A68T、Q82E、T87R、S91T和T106W的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的重鏈可變區(qū)多肽；(ii)具有SEQ ID NO4的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO4中含有選自L11I、S12T、S27T、V29A、G40T、V59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的輕鏈可變區(qū)多肽；(iii)具有SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO9中含有選自V12K、M20V、A68T、Q82E、T87R、S91T、D93V和A114T的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的重鏈可變區(qū)多肽；和(iv)具有SEQ ID NO11的氨基酸殘基序列，但在SEQ ID NO11中含有選自L11I、S12T、A59S、S69T、L72M、R76S和V77L的至少一個氨基酸殘基替換的修飾的輕鏈可變區(qū)多肽；
2.權(quán)利要求1的結(jié)合CD20的多肽組合物，其含有修飾的重鏈可變區(qū)多肽和修飾的輕鏈可變區(qū)多肽。
3.權(quán)利要求2的結(jié)合CD20的多肽組合物，其以嵌合抗體并另外包含人重鏈恒定區(qū)和人輕鏈恒定區(qū)的形式。
4.權(quán)利要求3的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中人重鏈恒定區(qū)為IgG恒定區(qū)。
5.權(quán)利要求4的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中IgG恒定區(qū)為IgG1恒定區(qū)。
6.權(quán)利要求3的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中人輕鏈恒定區(qū)為人κ輕鏈恒定區(qū)。
7.具有結(jié)合CD20抗原能力的多肽組合物，所述多肽組合物含有至少一條具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的多肽片段。
8.具有結(jié)合CD20抗原能力的多肽組合物，所述多肽組合物含有至少一條具有選自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12的氨基酸殘基序列的多肽片段。
9.具有結(jié)合CD20抗原能力的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO3和SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的多肽片段，和具有選自SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8和SEQ ID NO12的氨基酸殘基序列的多肽片段。
10.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的多肽片段和具有選自SEQ IDNO5的氨基酸殘基序列的多肽片段。
11.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的多肽片段和具有選自SEQ IDNO6的氨基酸殘基序列的多肽片段。
12.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的多肽片段和具有選自SEQ IDNO7的氨基酸殘基序列的多肽片段。
13.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的多肽片段和具有選自SEQ IDNO8的氨基酸殘基序列的多肽片段。
14.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO3的氨基酸殘基序列的多肽片段和具有選自SEQ IDNO6的氨基酸殘基序列的多肽片段。
15.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO3的氨基酸殘基序列的多肽片段和具有選自SEQ IDNO8的氨基酸殘基序列的多肽片段。
16.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，所述多肽組合物含有具有選自SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的多肽片段和具有選自SEQ IDNO12的氨基酸殘基序列的多肽片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中多肽與細(xì)胞因子融合。
18.權(quán)利要求17的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中細(xì)胞因子為IL2。
19.權(quán)利要求17或18的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中多肽的C端與細(xì)胞因子的N端融合。
20.權(quán)利要求9的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中細(xì)胞因子為IL2。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中多肽為完整抗體、Fab抗體片段、單鏈Fv抗體片段或微型抗體的形式。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-21中任一項(xiàng)的結(jié)合CD20的多肽組合物，其中組合物包括具有選自SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17、SEQID NO18、SEQ ID NO19、SEQ ID NO20、SEQ ID NO21、SEQ ID NO22、SEQ ID NO23、SEQ ID NO24、SEQ ID NO25、SEQ ID NO26、SEQ ID NO27、SEQ ID NO15和SEQ ID NO28的氨基酸殘基序列的多肽片段。
23.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的結(jié)合CD20的多肽組合物和可藥用載體、賦形劑、稀釋劑。
24.權(quán)利要求23的藥物組合物，其還含有額外的藥理學(xué)效應(yīng)藥物。
25.DNA分子，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的組合物中的多肽。
26.權(quán)利要求25的DNA分子，其選自SEQ ID NO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43。
27.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的多肽組合物或權(quán)利要求23或24的藥物組合物在制造治療自身免疫疾病的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及與CD20抗原(特別是人CD20抗原)結(jié)合的多肽組合物。多肽組合物具有已知的抗CD20抗體(如2B8和Leu16)的生物活性，但與非修飾分子相比表現(xiàn)出降低的免疫原性。多肽組合物包括嵌合抗體、抗體片段和抗體或抗體片段與細(xì)胞因子的融合蛋白。
文檔編號C07K16/30GK1835977SQ200480023372
公開日2006年9月20日 申請日期2004年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月14日
發(fā)明者F·J·卡爾, S·威廉斯, S·D·吉利斯 申請人:默克專利有限公司