專利名稱：穩(wěn)定性改善的多肽組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人類醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本發(fā)明屬于用于治療各種疾病(包括糖尿病和高血糖癥)的藥用組合物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
已經(jīng)利用多種多肽藥用組合物來(lái)治療人類和其它哺乳動(dòng)物的疾病。由于多肽藥物在口服傳遞后的高度不穩(wěn)定性，通常必須通過(guò)胃腸外途徑傳遞它們。胃腸外途徑主要有皮下途徑、肌肉內(nèi)途徑和靜脈內(nèi)途徑。
傳統(tǒng)上將多肽藥物產(chǎn)品以溶液、懸浮液或凍干產(chǎn)品提供給藥房、醫(yī)院和患者。當(dāng)多肽藥物制劑采用液體形式時(shí)，每種制劑需要在規(guī)定時(shí)間內(nèi)保持某個(gè)最低水平的化學(xué)和物理穩(wěn)定性，保持穩(wěn)定性的時(shí)間由治療方案、患者便利性、患者安全和管理指南決定。
為避免疼痛或可能的組織損傷，設(shè)計(jì)液體多肽藥物組合物，使其提供與給予位點(diǎn)或給予位點(diǎn)周圍的體液相似張力或摩爾滲透壓濃度。為此常常使用賦形劑如甘油、葡萄糖、甘露醇、乳糖以及鹽如氯化鈉。使用甘油作為等滲劑的多肽藥物產(chǎn)品實(shí)例包括含人類胰島素、胰島素lispro、胰島素aspart和胰高血糖素作為活性成分的產(chǎn)品。
甘油還用作藥用組合物中的增溶劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、溶劑、膨脹物質(zhì)、抗氧化劑、螯合劑和防腐劑[Spiegel，A.J.等，J.Pharm.Sci.52917-927(1973)；Wang，Y-C.J等，J.Parenteral Drug Assoc.34452-462(1980)；Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，第十八版，第1316頁(yè)(1990)；Li，S.等，J.Pharm.Sci.85868-872(1996)；Sieger，G.M.等，1977年4月5日頒布的美國(guó)專利第4,016,273號(hào)；Heinz，D.N.，WIPO公開(kāi)WO98/29131，1998年7月9日]。
對(duì)于一些多肽制劑，物理性不穩(wěn)定性不能使用鹽等滲化，常常使用甘油來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。然而，已知甘油造成多肽產(chǎn)品化學(xué)不穩(wěn)定性。具體地說(shuō)，據(jù)信甘油中存在的雜質(zhì)如醛引起形成多肽二聚體和多聚體的共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)。見(jiàn)例如，Bello，J.等[Arch.Biochem.Biophys.172608-610(1976)]。對(duì)于胰島素產(chǎn)品，已經(jīng)將這樣的二聚體和多聚體與免疫原性與皮膚的變態(tài)反應(yīng)聯(lián)系起來(lái)，如Robbins，D.C.等[Diabetes 36838-841(1987)]；Robbins，D.C.等，[Diatetes 36147-151(1987)]；Ratner，R.E.等[Diabetes 39728-732(1990)]所述。Brange，J.等[Pharm.Res.9727-734(1992)]得出結(jié)論應(yīng)當(dāng)最小化共價(jià)胰島素二聚體和多聚體以避免這些變態(tài)反應(yīng)，但沒(méi)有公開(kāi)或建議達(dá)到這個(gè)目標(biāo)的方法。
對(duì)于制備用于胃腸外給予的包含甘油的可靠穩(wěn)定的多肽組合物的問(wèn)題，可以進(jìn)行三項(xiàng)觀察。第一，缺乏簡(jiǎn)單而精確的測(cè)定方法來(lái)確定甘油中存在的引起交聯(lián)多肽雜質(zhì)的活性醛水平。第二，在先技術(shù)沒(méi)有這樣的教導(dǎo)或建議應(yīng)當(dāng)評(píng)估不同來(lái)源生產(chǎn)的不同批號(hào)甘油，確定某些來(lái)源對(duì)于最小化所述多肽交聯(lián)反應(yīng)是否比其它來(lái)源更好。第三，以前沒(méi)有降低甘油活性醛含量的簡(jiǎn)便有效的方法，以去除或最小化水性藥用多肽組合物中醛引起的交聯(lián)反應(yīng)。下面將更詳細(xì)地描述這三項(xiàng)觀察中的每一項(xiàng)。
測(cè)量甘油中的活性醛缺乏簡(jiǎn)單可靠的測(cè)定方法測(cè)定甘油中引起交聯(lián)多肽雜質(zhì)形成的活性醛雜質(zhì)，這阻礙了解決含甘油制劑的多肽交聯(lián)問(wèn)題。
甲醛可以通過(guò)活性亞胺鍵引起多肽交聯(lián)[Schwendeman，S.P.等，PNAS 9211234-11238(1995)和Fraenkel-Conrat，H.等，JACS 702673-2684(1948)]。甘油醛和乙醇醛與多肽溶液中的氨基基團(tuán)反應(yīng)，形成交聯(lián)的多肽，如Acharya，A.S.等[PNAS 803590-3594(1983)]和Acharya，A.S.等[Biochemistry 274522-4629(1988)]所述。
據(jù)推測(cè)，甘油中的醛雜質(zhì)涉及胰島素制劑中的高分子量多聚體形成[Brange J.等，Pharm.Res.9727-734(1992)；Brange，J.，Stability ofInsulin，Kluwer Academic Publishers，Boston，第23-36頁(yè)(1994)；Brangem，J.等，Hormone Drugs，US Pharmacopoeial Convention出版，Rockville，Maryland，第95-105頁(yè)(1982)]，但沒(méi)有公開(kāi)定量測(cè)量或去除醛雜質(zhì)以改善胰島素制劑化學(xué)穩(wěn)定性的方法。
文獻(xiàn)中有許多測(cè)定醛的方法，但使用它們測(cè)量作為藥用制劑中多肽交聯(lián)指標(biāo)的甘油活性醛含量是值得懷疑的。
歐洲藥典附錄(European Pharmacopoeia Supplement 2000)2000[歐洲委員會(huì)，Strasbourg，法國(guó)，第747-751頁(yè)(1999)]在其甘油專論中描述了醛測(cè)試。該測(cè)試使用鹽酸副品紅試劑和作為參比的5ppm甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液。
英國(guó)藥典1999[英國(guó)藥典委員會(huì)，倫敦，第710-711頁(yè)(1999)]公開(kāi)了測(cè)定甘油中醛和還原物質(zhì)的測(cè)試，該測(cè)試使用鹽酸副品紅并與含5ppm甲醛的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行目測(cè)比較。
“Purpald”試劑4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三唑[Dickinson，R.G.等，Chem.Commun.第1719頁(yè)(1970)]與醛反應(yīng)，已經(jīng)使用該試劑測(cè)定空氣、乙二醇、疫苗、樹(shù)脂和塑料制品中的醛，并用于檢測(cè)肝組織切片和水果中的乙醛[Aldrich Technical Information Bulletin No.AL-145，Aldrich Chemical Co.；Hopps，H.B.，Aldrichimica Acta 3328-29(2000)]。
Nash，T.描述了甲醛與乙酰丙酮反應(yīng)，形成有色產(chǎn)物[Biochem.J.55416-425(1953)]。乙酰丙酮試劑看起來(lái)對(duì)于甲醛具有相當(dāng)特異性，因?yàn)橐胰┑母蓴_在一摩爾的基礎(chǔ)上僅有1％。
國(guó)際藥典[第三版，WHO，4176-181(1994)]的甘油專論描述了使用品紅/亞硫酸溶液檢測(cè)醛和還原物質(zhì)的測(cè)試。將顯色強(qiáng)度與0.2M高錳酸鉀溶液相比較。
在Dow Chemical Company(Freeport，TX，USA)名為“發(fā)現(xiàn)某些世界上最恒定純產(chǎn)品的來(lái)源合成甘油產(chǎn)品”的促銷公報(bào)第10-11頁(yè)中，使用UV光譜法將OPTIMTM甘油99.7％和純度差一些的甘油樣品進(jìn)行比較。沒(méi)有提供醛或其它有機(jī)雜質(zhì)水平的定量評(píng)估。
甘油醛與3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽(MBTH)反應(yīng)。在Sawicki，E.等[Anal.Chem.3393-96(1961)]中，顯示MBTH試劑與DL-甘油醛反應(yīng)，但僅公開(kāi)了測(cè)量汽車尾氣和污染空氣中的甲醛。Paz，M.A.等[Arch.Biochem.Biophys.109548-559(1965)]證實(shí)L-甘油醛與MBTH反應(yīng)，公開(kāi)了在生化反應(yīng)進(jìn)行過(guò)程中、在酮、酮酸和各種類型吡喃糖的存在下測(cè)量痕量醛的測(cè)定方法。Eberhardt，M.A.等[MarineChemistry 17199-212(1985)]公開(kāi)了使用MBTH測(cè)量海水和細(xì)菌培養(yǎng)物中的醛，尤其是甲醛。在一個(gè)使用戊二醛或1，5-戊二醇作為標(biāo)準(zhǔn)品的商業(yè)測(cè)試[GT-1型戊二醛檢測(cè)試劑盒，Hach(Loveland，CO，USA)]中使用MBTH。該測(cè)試使用色輪測(cè)量低至1mg/L的戊二醛水平。
Bailey，B.W.等[Anal.Chem.43782-784(1971)]表明試劑對(duì)苯二胺與甲醛、乙醛和苯甲醛反應(yīng)，但對(duì)甲醛具有高度選擇性。使用該試劑測(cè)量空氣中的低濃度甲醛。
驚人的是，我們發(fā)現(xiàn)一種使用甘油醛作為標(biāo)準(zhǔn)品的新型MBTH測(cè)試，該測(cè)試可以有效用于準(zhǔn)確測(cè)定甘油樣品中存在的活性醛水平。我們還發(fā)現(xiàn)含甘油的多肽制劑交聯(lián)水平與用于制備所述制劑的甘油中的活性醛水平(用上述測(cè)定方法測(cè)定)呈密切線性關(guān)系。因此，我們的新型MBTH測(cè)試可以用于容易地預(yù)測(cè)包含甘油的水性胃腸外多肽組合物的相對(duì)化學(xué)穩(wěn)定性，并且可以用于選擇用于制備所述制劑的合適批號(hào)甘油。
不同來(lái)源的甘油另一個(gè)阻礙解決包含甘油的制劑中多肽交聯(lián)問(wèn)題的障礙是以前沒(méi)有認(rèn)識(shí)到考慮以下因素的重要性商品甘油的生產(chǎn)來(lái)源以及甘油的生產(chǎn)方法。具體地說(shuō)，以前沒(méi)有這樣的教導(dǎo)或建議應(yīng)當(dāng)評(píng)估不同來(lái)源生產(chǎn)的不同批號(hào)的商品甘油，確定某些來(lái)源對(duì)于最小化所述多肽交聯(lián)反應(yīng)是否比其它來(lái)源更好。
甘油中的醛通過(guò)自身催化氧化或熱氧化形成，如Mohr，J.等所述[加拿大專利申請(qǐng)2,242,591，1998年7月13日公布]。Ziels，N.W.[J.Amer.Oil Chemists’Soc.33556-565(1956)]報(bào)道，不管原料如何，工業(yè)生產(chǎn)和純化甘油的方法對(duì)于甘油的最終純度有重大影響。已經(jīng)從許多來(lái)源生產(chǎn)甘油，包括動(dòng)物脂肪、植物、發(fā)酵、從更小的有機(jī)分子化學(xué)合成以及從丙烯合成。從這些來(lái)源和其它來(lái)源生產(chǎn)甘油的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。然而，還沒(méi)有系統(tǒng)研究或確定什么因素使來(lái)源對(duì)許多工業(yè)生產(chǎn)甘油存在的活性醛水平產(chǎn)生影響，以及來(lái)源對(duì)包含甘油的水性胃腸外多肽組合物的最終化學(xué)穩(wěn)定性產(chǎn)生的影響。
Rohde，T.D.等[Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs，33316-318(1987)]公開(kāi)了含有約80％甘油的植入泵式新型胰島素制劑，其中使用非特定合成來(lái)源并且作者用混合離子交換柱床進(jìn)一步純化的甘油，取代在以前制劑中使用的動(dòng)物精煉甘油。新型制劑和以前的制劑的pH也不同，而pH是影響胰島素制劑中交聯(lián)反應(yīng)程度的一個(gè)關(guān)鍵因素。在治療糖尿病患者時(shí)，使用新制劑的流動(dòng)循環(huán)(flow cycle)更長(zhǎng)，胰島素用量更少，說(shuō)明新制劑的穩(wěn)定性改善，人們將這歸因于pH差異和合成甘油的額外純化。
使用本文所述的MBTH測(cè)試，我們最令人驚奇的發(fā)現(xiàn)是非動(dòng)物來(lái)源生產(chǎn)的各批商品甘油比動(dòng)物來(lái)源的各批甘油含有更低水平的活性醛。植物來(lái)源和丙烯來(lái)源的甘油證明了這一點(diǎn)。丙烯來(lái)源的甘油含有尤其低水平的活性醛。我們還發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加，植物來(lái)源和丙烯來(lái)源的工業(yè)生產(chǎn)各批甘油的每月平均活性醛含量比動(dòng)物來(lái)源的甘油低得多，提示動(dòng)物來(lái)源的甘油中活性醛水平隨時(shí)間的增加比植物和丙烯來(lái)源的甘油要快。
此外，我們發(fā)現(xiàn)含丙烯來(lái)源甘油的水性胃腸外藥用多肽組合物與用動(dòng)物來(lái)源甘油制備的類似組合物相比，化學(xué)穩(wěn)定性得到改善。
降低甘油中的活性醛水平最后，以前沒(méi)有公開(kāi)降低甘油中活性醛水平以改善包含甘油的藥用多肽組合物的化學(xué)穩(wěn)定性的簡(jiǎn)單有效方法。
Bello，J.[Biochemistry 84535-4541(1969)]和Bello，J.等[Arch.Biochem.Biophys.172608-610(1976)]尋求通過(guò)純化甘油來(lái)預(yù)防包含甘油的蛋白質(zhì)溶液中的交聯(lián)。首先用還原劑硼氫化鈉處理甘油。在該還原步驟后，用MB-3樹(shù)脂處理甘油，除去無(wú)機(jī)鹽，最后真空蒸餾。沒(méi)有指出在該處理之前和之后的活性醛水平。通過(guò)該甘油純化步驟獲得的交聯(lián)降低是短暫的。
在以下文獻(xiàn)中也描述了各種甘油純化技術(shù)Riddick，J.A.等[Techniques of Chemistry IIOrganic Solvents，Physical Properties andMethods of Purification，Wiley-Interscience，New York，第689-690頁(yè)(1970)]，Diaz，Z.等[美國(guó)專利第4,683,347號(hào)，1987年7月28日頒布]，Stromquist，D.M.等[Ind.Eng.Chem.431065-1070(1951)]和Ziels，上文引用，但沒(méi)有一份文獻(xiàn)涉及通過(guò)使甘油接觸包含自由氨基基團(tuán)的聚合物樹(shù)脂而降低活性醛的水平。
Washabaugh，M.W.等[Anal.Biochem.134144-152(1983)]描述了一種降低乙二醇中醛水平的繁瑣方法，該方法涉及用硼氫化鈉還原，用水稀釋4倍并使所述水溶液通過(guò)裝載有不同樹(shù)脂的四個(gè)層析柱。據(jù)使用MBTH和甘油醛標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定，溶液中的醛減少了86％。
Mohr，J.等，上文引用，描述了使溶液與還原性磷化合物接觸而純化乙二醇。根據(jù)MBTH測(cè)量，該方法降低了醛水平。Murao等[美國(guó)專利第5,969,175號(hào)，1999年10月19日頒布]描述了純化含有醛的腈的方法使所述腈與載有多胺的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂接觸。當(dāng)時(shí)沒(méi)有建議這些方法中的任何一種將可用于降低甘油的活性醛含量以改善包含甘油的多肽組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。
我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種降低甘油樣品中活性醛水平的簡(jiǎn)單有效的方法，該方法改善了包含甘油的多肽組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。該方法不需要使用還原劑，不必稀釋甘油，并且適合純化甘油直接用于包含多肽的制劑。
綜合上述各項(xiàng)發(fā)現(xiàn)獲得了用于胃腸外給予的含甘油新型多肽組合物制劑，該制劑與以前已知的多肽組合物相比化學(xué)穩(wěn)定性得到改善。這些穩(wěn)定的多肽組合物為使用它們治療疾病或病癥的患者提供更高的安全性。
發(fā)明簡(jiǎn)述因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是使用非動(dòng)物來(lái)源的甘油作為包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物中的甘油成分，以改善所述組合物的化學(xué)穩(wěn)定性?；瘜W(xué)穩(wěn)定性改善是指由于用于制備所述組合物的甘油中的活性醛水平降低，因此降低形成共價(jià)交聯(lián)的多肽水平。更具體地說(shuō)，本發(fā)明提供使用植物來(lái)源或丙烯來(lái)源的甘油改善包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。
本發(fā)明的另一方面是使用活性醛含量低于8ppm的甘油作為包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物中的甘油成分，以改善所述組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。
本發(fā)明的又一方面是包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物，其中所述甘油源自非動(dòng)物來(lái)源。
本發(fā)明的再一方面是包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物，其中所述甘油的活性醛含量低于8ppm。
本發(fā)明的另一方面是制備水性胃腸外藥用組合物的方法，該方法包含將水、多肽和非動(dòng)物來(lái)源甘油組合在一起。
本發(fā)明的另一方面是制備水性胃腸外藥用組合物的方法，該方法包含將水、多肽和活性醛含量低于8ppm的甘油組合在一起。
本發(fā)明的又一方面是降低甘油中活性醛水平的方法，該方法包括使甘油與固體干燥劑以及包含自由氨基基團(tuán)的聚合物樹(shù)脂接觸。
本發(fā)明的組合物可以為溶液形式或者其中多肽在所述組合物中部分或完全不溶的懸浮液形式。所述組合物也可以由兩種包裝生產(chǎn)產(chǎn)品構(gòu)成，其中在胃腸外給予前將固體形式的多肽與獨(dú)立包含甘油的稀釋液混合。
可以化學(xué)合成或使用重組DNA技術(shù)生物合成本發(fā)明藥用組合物中的多肽。
本發(fā)明包括使用本發(fā)明的組合物用作藥物，或使用本發(fā)明的組合物制備用于治療哺乳動(dòng)物疾病的藥物。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了采用本發(fā)明MBTH測(cè)試和改良10X-GST測(cè)試得到的對(duì)非動(dòng)物來(lái)源商業(yè)批號(hào)甘油的分析之間的線性關(guān)系(R2＝0.90)。
發(fā)明詳述術(shù)語(yǔ)“甘油”指化學(xué)品丙烷-1，2，3-三醇，CAS注冊(cè)號(hào)[56-81-5]。甘油的實(shí)驗(yàn)式是C(3)H(8)O(3)，結(jié)構(gòu)是OH-CH2-CH(OH)-CH2-OH。在一些文獻(xiàn)報(bào)道中，術(shù)語(yǔ)“glycerol”用于指該化合物，“glycerin”指包含95％或更多甘油的純化商業(yè)產(chǎn)品，而“glycerine”用作其主要成分是甘油的產(chǎn)品的商品名。在本說(shuō)明書(shū)中，使用任何包含化學(xué)品丙烷-1，2，3-三醇的溶液，可以將甘油(指化學(xué)品丙烷-1，2，3-三醇)摻入本發(fā)明的水性胃腸外藥用組合物。在本發(fā)明藥用多肽組合物中的甘油濃度定義為每毫升組合物所含丙烷-1，2，3-三醇的毫克數(shù)，并且該濃度低于500mg/mL。
Carl W.Scheele在1779年首次發(fā)現(xiàn)甘油，他加熱橄欖油和一氧化鉛獲得甘油。自那時(shí)開(kāi)始，人們已經(jīng)使用至少5種不同材料來(lái)源生產(chǎn)甘油。
甘油的一種來(lái)源是動(dòng)物。在一種方法中，人們酯化動(dòng)物如牛和綿羊的牛脂或脂肪，然后皂化，這種方法產(chǎn)生作為肥皂生產(chǎn)副產(chǎn)品的甘油。人們也直接水解或皂化動(dòng)物脂肪來(lái)生產(chǎn)甘油。
甘油的第二種商業(yè)來(lái)源是植物。一般地說(shuō)，人們使用與動(dòng)物脂肪生產(chǎn)甘油相似的方法，用椰子油、棕櫚油、低芥酸菜籽油、大豆油或其它植物油生產(chǎn)甘油。
甘油的第三種來(lái)源是發(fā)酵。從天然來(lái)源如甜菜糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)甘油，或使用重組DNA技術(shù)改造的微生物發(fā)酵生產(chǎn)甘油，如Bulthuis，B.A.等[WIPO公開(kāi)WO98/21340，1998年5月22日]和Nair，R.V.等[WIPO公開(kāi)WO98/28480，1999年6月10日]所述。
甘油的第四種來(lái)源是從含有少于三個(gè)碳原子的有機(jī)分子開(kāi)始化學(xué)合成。一種這樣的方法使用甲醇，該方法見(jiàn)Owsley，D.C.等[美國(guó)專利第4,076,758號(hào)，1978年2月28日頒布]。
甘油的第五種來(lái)源是丙烯，而丙烯本身是從石油產(chǎn)品中獲得。從約1948年開(kāi)始由丙烯生產(chǎn)的甘油?？梢岳迷S多轉(zhuǎn)化丙烯成為甘油的合成途徑，包括在Owsley，D.C.等，前面引用，Kirk-Othmer[Encyclopedia of Chemical Technology 12681-694(1994)]和Remington’s Pharmaceutical Science[Mack Publishing Company，第18版，第1316頁(yè)(1990)]中所述的途徑。例如，在一種合成途徑中，丙烯氯化成為烯丙基氯，然后用次氯酸轉(zhuǎn)化形成二氯丙醇，與氫氧化鈣反應(yīng)生成表氯醇，最后水解成為甘油。
在商業(yè)上，可以從多種來(lái)源、不同的供應(yīng)商和分銷商獲得甘油[見(jiàn)Chemical Week，Special Issue Buyer’s Guide，159321-322(1997)，和Chemical Industry Europe 93；The Leading Guide for Today’s EuropeanChemical Industry(1993)]。
用植物生產(chǎn)的甘油產(chǎn)品包括Pricerine 9091[Unichema NorthAmerica，Chicago，IL，美國(guó)]、Kosher Superol甘油[Proctor and GambleChemicals，Cincinnati，OH，美國(guó)]、甘油-99.7％[Chemical Associates ofIllinois，Inc.，Copley，OH，美國(guó)]、Emery甘油-99.7％ Kosher[HenkelCorporation，Cincinnati，OH，美國(guó)]和無(wú)水超純甘油[EM Industries，Hawthorne，NY，美國(guó)]。
丙烯來(lái)源的甘油產(chǎn)品包括OptimTM甘油99.7％USP[DowChemical Company，F(xiàn)reeport TX，美國(guó)]、合成甘油[Solvay Fluorides，IncGreenwich，CT，美國(guó)]和OptimTM甘油99.7％[Dow Chemical Company，Stade，Germany]。已經(jīng)使用丙烯來(lái)源的甘油作為包被爆米花仁的香味促進(jìn)劑[Schellhaass，S.R.，美國(guó)專利第5,750,166號(hào)，1998年5月12日頒布]以及以低濃度用于外科洗液中[Scholz，M.T.等，美國(guó)專利第5,951,993號(hào)，1999年9月14日頒布]。也已經(jīng)在食品和藥用制劑中使用丙烯來(lái)源的甘油[Food Engineering，International Edition(ChiltonCompany)，第14頁(yè)(1997)]。
術(shù)語(yǔ)“非動(dòng)物來(lái)源的甘油”指不是從動(dòng)物脂肪或任何其它動(dòng)物原料成分得到的甘油。非動(dòng)物來(lái)源甘油的生產(chǎn)來(lái)源包括植物、丙烯、發(fā)酵和從小有機(jī)分子化學(xué)合成。
本發(fā)明提供包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物，其中所述組合物中的甘油濃度低于500mg/mL。甘油濃度指化學(xué)品丙烷-1，2，3-三醇的濃度。所述藥用組合物中的甘油濃度最好約1mg/mL到約300mg/mL。更優(yōu)選所述藥用組合物中的甘油濃度約3mg/mL到約100mg/mL。更優(yōu)選所述水性藥用多肽組合物中的甘油濃度約10mg/mL到約30mg/mL。更優(yōu)選所述組合物中的甘油濃度約20mg/mL到約25mg/mL。更優(yōu)選所述組合物中的甘油濃度約22mg/mL。所述組合物中另一個(gè)優(yōu)選甘油濃度范圍約15mg/mL到約18mg/mL。更優(yōu)選所述組合物中的甘油濃度約16mg/mL。
術(shù)語(yǔ)“醛”指包含CHO基團(tuán)或官能團(tuán)的有機(jī)化合物類。
術(shù)語(yǔ)“活性醛”指下列醛a)在各批商品甘油中作為雜質(zhì)存在，和b)與水性藥用組合物中多肽的氨基基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致形成共價(jià)多肽二聚體和/或多聚體?；钚匀┑囊粋€(gè)實(shí)例是甘油醛。
術(shù)語(yǔ)“MBTH”指化合物3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽，CAS注冊(cè)號(hào)[14448-67-0]。
術(shù)語(yǔ)“MBTH測(cè)試”指使用甘油醛作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)量甘油樣品中活性醛含量的方法，該方法作為方法1詳細(xì)描述。
縮寫(xiě)“ppm”指質(zhì)量百萬(wàn)分率。對(duì)于本發(fā)明目的，ppm指甘油樣品中活性醛的百萬(wàn)分率。更具體地說(shuō)，ppm指相對(duì)于甘油質(zhì)量的活性醛質(zhì)量。例如，具體批號(hào)甘油的MBTH測(cè)試值是2ppm，這指在一百萬(wàn)份質(zhì)量的甘油中含有2份質(zhì)量的活性醛。這等于在甘油中濃度為2ug/g或2mg/kg。假如在分析前用其它溶劑稀釋甘油樣品，則該測(cè)試的ppm結(jié)果必須乘上稀釋倍數(shù)才能反映在一百萬(wàn)份原始未稀釋的甘油中活性醛的份數(shù)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供包含非動(dòng)物來(lái)源甘油的水性藥用多肽組合物。人們可以制備本發(fā)明該實(shí)施方案內(nèi)的藥用組合物，而不必在使用前測(cè)量甘油中的醛含量。然而，最好在使用前測(cè)量用于制備多肽組合物的甘油，所述甘油的活性醛含量低于33ppm。更優(yōu)選所述甘油的活性醛含量低于24ppm。更優(yōu)選所述甘油的活性醛含量低于15ppm或更低。更優(yōu)選所述甘油的活性醛含量低于8ppm。最優(yōu)選在本發(fā)明多肽組合物中使用的甘油的活性醛含量為3ppm或更低。
如果人們決定測(cè)量在制備本發(fā)明的多肽組合物中使用的甘油中的活性醛含量，那么可以使用多種測(cè)試方法。一種測(cè)試方法是在本文方法4中描述的新型HPLC方法。或者，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的醛測(cè)定方法。最好使用其中使用甘油醛作為標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定方法，測(cè)量本發(fā)明多肽組合物中使用的甘油的活性醛含量。更優(yōu)選通過(guò)本文所述的MBTH測(cè)試測(cè)量甘油的活性醛含量。
術(shù)語(yǔ)“10X-GST”指甘油應(yīng)激測(cè)試，該測(cè)試在可溶性胰島素制劑中加入正常使用量約10倍的甘油，其目的是加速形成胰島素共價(jià)二聚體和多聚體。該測(cè)試在下面作為方法2詳細(xì)描述。
術(shù)語(yǔ)“改良10X-GST”指甘油應(yīng)激測(cè)試，該測(cè)試在胰島素懸浮液組合物中加入正常使用量約10倍的甘油，該測(cè)試設(shè)計(jì)為加速胰島素共價(jià)二聚體和多聚體的形成。該測(cè)試在下面作為方法3詳細(xì)描述。
術(shù)語(yǔ)“多肽”指包含三個(gè)或更多氨基酸以及至少一個(gè)自由氨基基團(tuán)的化合物，并且包括它們的類似物和衍生物。可以通過(guò)化學(xué)合成和/或使用重組DNA技術(shù)生物合成產(chǎn)生多肽。多肽可以包含一條氨基酸鏈或通過(guò)共價(jià)鍵(如二硫鍵)或通過(guò)非共價(jià)相互作用連接在一起的多條氨基酸鏈。在本文中小多肽也可稱為“肽”。在本文中大多肽也可稱為“蛋白質(zhì)”。
摻入本發(fā)明組合物的多肽可以含有天然L-氨基酸或非天然氨基酸如D-氨基酸。所述多肽的氨基酸序列可以與動(dòng)物或其它生物天然多肽氨基酸序列相同，或者可以是其中以不同方法改變所述序列的類似物。在多肽類似物中，可以添加、缺失或用其它氨基酸取代在所述多肽N末端、C末端或內(nèi)部部分的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。多肽類似物是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。
也可以在要摻入本發(fā)明組合物的多肽的氨基酸側(cè)鏈、N末端氨基基團(tuán)或C末端羧基基團(tuán)上帶有有機(jī)化學(xué)基團(tuán)。這樣的化合物是多肽“衍生物”實(shí)例。多肽衍生物的其它實(shí)例包括糖肽，其中天然多糖連接在氨基酸天冬酰胺或蘇氨酸的側(cè)鏈上。其它可以連接到多肽上的衍生基團(tuán)包括酰基基團(tuán)和聚乙二醇。多肽衍生物是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。
摻入本發(fā)明組合物的多肽可以以多種形式存在，包括藥學(xué)上可接受的鹽形式。多肽的藥學(xué)上可接受的鹽形式是指在所述多肽的任何一個(gè)或多個(gè)帶電基團(tuán)與任何一種或多種藥學(xué)上可接受的無(wú)毒陽(yáng)離子或陰離子形成的鹽。有機(jī)鹽和無(wú)機(jī)鹽包括例如銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、Tris、鈣鹽、鋅鹽或鎂鹽以及由酸制備的鹽如鹽酸鹽、硫酸鹽、磺酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、乙醇酸鹽、檸檬酸鹽、馬來(lái)酸鹽、磷酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽、硝酸鹽、苯甲酸鹽、抗壞血酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽、苯磺酸鹽、萘磺酸鹽、丙酸鹽、碳酸鹽等等。
摻入本發(fā)明組合物的多肽可以從諸如轉(zhuǎn)基因植物或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等來(lái)源分離，或者可以用化學(xué)合成技術(shù)制備，所述化學(xué)合成技術(shù)包括經(jīng)典(液相)方法、固相方法、半合成方法或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法。
也可以使用重組DNA技術(shù)生物合成產(chǎn)生摻入本發(fā)明組合物的多肽。例如，見(jiàn)Chance，R.E.等，美國(guó)專利第5,514,646號(hào)，1996年5月7日頒布；Chance，R.E.等，EPO公布號(hào)383,472，1996年5月7日頒布；EPO公布號(hào)214,826，1987年3月18日；和Belagaje，R.M.等，美國(guó)專利第5,304,473號(hào)，1994年4月19日頒布。使用rDNA技術(shù)，可以在任意數(shù)量的宿主細(xì)胞中生物合成多肽或其前體，所述宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、酵母或真菌。更優(yōu)選在細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行的生物合成。最優(yōu)選是在大腸桿菌(E.coli)或酵母中進(jìn)行的生物合成。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中進(jìn)行生物合成實(shí)例見(jiàn)Hakola，K.[Molecular and Cellular Endocrinology，12759-69，(1997)]。
明確排除不能摻入本發(fā)明組合物的多肽是從非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的組織、腺體、器官、血液、尿或任何其它主要組分分離的天然多肽。被排除的多肽的一個(gè)實(shí)例是用豬胰腺產(chǎn)生的豬胰島素。
據(jù)信本發(fā)明可以應(yīng)用于任何多肽，其中包括抗體、細(xì)胞因子、受體、多肽激素和它們的片段。本發(fā)明的組合物也可以包含一種以上多肽。在不限制本發(fā)明范圍普遍性的同時(shí)，可以舉出幾種特定的多肽和多肽類以更好地指導(dǎo)讀者。
本發(fā)明組合物包含的優(yōu)選多肽類包括重組人類胰島素、重組豬胰島素和重組牛胰島素。
另一類優(yōu)選的本發(fā)明組合物包含的多肽包括單體胰島素類似物。例如，見(jiàn)Balschmidt，P.等，美國(guó)專利第5,164,366號(hào)，1992年11月17日頒布；Brange，J.等，美國(guó)專利第5,618,913號(hào)，1997年4月8號(hào)頒布；Chance，R.E.等，美國(guó)專利第5,514,646號(hào)，1996年5月7日頒布；和Ertl，J.等，EPO公布號(hào)885,961，1998年12月23號(hào)。尤其優(yōu)選的是這樣的單體胰島素類似物B28位的氨基酸殘基是Asp、Lys、Ile、Leu、Val或Ala，B29位的氨基酸殘基是Lys或Pro。最優(yōu)選的單體胰島素類似物是Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素、Asp(B28)-人胰島素和Lys(B3)Ile(B28)-人胰島素。
另一類優(yōu)選的本發(fā)明組合物包含的多肽包括等電點(diǎn)約7.0到約8.0的胰島素類似物。這些類似物稱為pI漂移胰島素類似物。一類最優(yōu)選的pI漂移類似物包括Arg(B31)Arg(B32)-人胰島素和Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰島素。
另一類優(yōu)選本發(fā)明組合物包含的多肽包括胰島素的衍生物和胰島素類似物的衍生物。一類更優(yōu)選本發(fā)明組合物包含的多肽包括胰島素的?；苌锖鸵葝u素類似物的?；苌?。一類更優(yōu)選的多肽包括胰島素的?；苌锖鸵葝u素類似物的?；苌铮渲兴鲺；鶊F(tuán)包括直鏈飽和脂肪酸。直鏈飽和脂肪酸實(shí)例包括碳鏈長(zhǎng)度C4、C6、C8、C10、C12、C14、C16和C18的脂肪酸。一類最優(yōu)選本發(fā)明組合物包含的多肽包括棕櫚酰-ε-Lys(B29)-人胰島素和肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰島素，其中棕櫚酰(C16)和肉豆蔻酰(C14)直鏈脂肪酸與Lys(B29)殘基的ε殘基連接。
另一類優(yōu)選摻入本發(fā)明組合物的多肽包括胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)、GLP-1類似物、GLP-1衍生物和GLP-1類似物的衍生物。根據(jù)本領(lǐng)域習(xí)慣，GLP-1(7-37)OH的氨基末端指定為7號(hào)，而羧基末端指定為37號(hào)。關(guān)于GLP-1類似物和衍生物的更詳細(xì)描述見(jiàn)Hoffmann，J.A.[WO99/29336，1999年6月17日公布]和Knudsen，L.B.等[J.Med.Chem.431664-1669(2000)]。GLP-1類似物的衍生物的一個(gè)實(shí)例是Nielson，J.等[WO00/07617，2000年2月17日公布]所述的Arg(34)、N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH。一類更優(yōu)選摻入本發(fā)明組合物的多肽包括天然GLP-1(7-36)NH2、天然GLP-1(7-37)OH、Val(8)-GLP-1(7-37)OH、(Gly(8)-GLP-1(7-37)OH和Arg(34)、N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH。
另一類優(yōu)選包括入本發(fā)明組合物的多肽包括exendin、exendin類似物、exendin衍生物和exendin類似物的衍生物。Exendin多肽和類似物包括exendin-3和exendin-4，如Young，A.等[WIPO公開(kāi)WO00/41546，2000年7月20日]所述。Exendin衍生物和exendin類似物的衍生物實(shí)例如Knudsen等[WIPO公布WO99/43708，1999年9月2日]所述。更優(yōu)選在本發(fā)明組合物中使用的多肽是exendin-4。
另一類優(yōu)選摻入本發(fā)明組合物的多肽包括如Goldenberg，M.S.等[WIPO公布WO00/38652，2000年7月6日]所述的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，以及G-CSF類似物、G-CSF衍生物和G-CSF類似物的衍生物。本發(fā)明的G-CSF組合物可以采用溶液形式或懸浮液形式。優(yōu)選G-CSF懸浮液組合物。
另一類優(yōu)選摻入本發(fā)明組合物的多肽包括苗條蛋白、苗條蛋白類似物、苗條蛋白衍生物和苗條蛋白類似物的衍生物。一類更優(yōu)選的多肽包括糖基化苗條蛋白類似物。關(guān)于天然苗條蛋白序列和苗條蛋白類似物實(shí)例的詳細(xì)介紹見(jiàn)Beals，J.M.等[EPO公布號(hào)849,276，1998年6月24日]。
另一類優(yōu)選摻入本發(fā)明組合物的多肽包括全長(zhǎng)人甲狀旁腺素PTH(1-84)、片段如PTH(1-38)和PTH(1-34)以及它們的類似物和衍生物[見(jiàn)Chang，C-M.等，WIPO公布WO99/29337，1999年6月17日]。一類更優(yōu)選的多肽包括人PTH(1-34)和人PTH(1-84)。
另一類優(yōu)選摻入本發(fā)明組合物的多肽包括重組促卵泡激素(FSH)及其重組類似物和衍生物。FSH是異二聚體糖蛋白，其中α亞單位和β亞單位非共價(jià)結(jié)合，如Shome等[J.Prot.Chem.，7325-339，(1988)]所述。一類更優(yōu)選的多肽包括重組人FSH和其中缺失天然編碼β亞單位一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)C末端氨基酸殘基的重組FSH類似物，以及它們的糖基化衍生物。
另一類優(yōu)選摻入本發(fā)明組合物的多肽包括重組人生長(zhǎng)激素(HGH)、重組牛生長(zhǎng)激素(BGH)和它們的類似物和衍生物。一類更優(yōu)選的多肽包括重組HGH和重組BGH。
優(yōu)選摻入本發(fā)明的水性胃腸外藥用組合物的多肽是FSH或其類似物或衍生物、PTH或其片段、類似物或衍生物、HGH或其類似物、人苗條蛋白或其類似物或衍生物、GLP-1或其類似物或衍生物、人胰島素或其類似物或衍生物、或人胰島素類似物的衍生物。
可以在本發(fā)明的水性胃腸外藥用組合物中摻入一種以上多肽。這樣的組合實(shí)例其中包括糊精或糊精激動(dòng)劑肽與胰島素的混合物，如Cooper，G.J.S.[美國(guó)專利第5,124,314號(hào)，1992年6月23日頒布]和L’Italien，J.等[美國(guó)專利第6,136,784號(hào)，2000年10月24日]所述。
本發(fā)明藥用組合物中的多肽是生物活性多肽。所述活性在體外或在體內(nèi)呈現(xiàn)，源于所述多肽與受體和/或其它細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外位點(diǎn)相互作用產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。
術(shù)語(yǔ)“水性”描述了包含水的液體溶劑。水性溶劑系統(tǒng)可以只包含水，或者可以包含水以及一種或多種可混溶溶劑，并且可以包含溶解的溶質(zhì)如糖或其它賦形劑。
本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)“水性胃腸外藥用組合物”指用于胃腸外給予的藥用組合物，其中水含量是500mg/mL或更高。
術(shù)語(yǔ)“藥用的”指含有用于治療疾病的藥用物質(zhì)或制品。本發(fā)明的藥用組合物含有具有生物學(xué)活性的多肽。以適合所述組合物的藥用用途并且與藥用用途一致的方式制備所述組合物。
術(shù)語(yǔ)“胃腸外”指通過(guò)腸道以外的途徑將藥物傳遞或給予其需要患者。本發(fā)明多肽組合物的優(yōu)選胃腸外給予途徑是皮下途徑、肌肉內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、頰途徑、鼻途徑、肺途徑、眼內(nèi)途徑和經(jīng)皮途徑。
術(shù)語(yǔ)“化學(xué)穩(wěn)定性”指多肽組合物中由活性醛引起的共價(jià)結(jié)合多肽二聚體和多聚體形成的相對(duì)速率?！胺€(wěn)定”制劑是這樣的制劑其中共價(jià)多肽二聚體和多聚體的形成速率受到合適的控制，并且不隨時(shí)間超標(biāo)性增加。關(guān)于特定組合物化學(xué)穩(wěn)定性的術(shù)語(yǔ)“改善”指其高分子量多肽二聚體和多聚體在一段時(shí)間后增加的水平低于對(duì)比制備和處理的組合物水平?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法評(píng)估化學(xué)穩(wěn)定性。本文描述的10X-GST和改良-10X-GST方法包括通過(guò)尺寸排阻HPLC測(cè)量化學(xué)穩(wěn)定性實(shí)例。
早期發(fā)展藥用多肽制劑時(shí)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)確定在所述制劑中應(yīng)當(dāng)包括那些賦形劑。通常設(shè)計(jì)制劑以便包含滿足患者和管理機(jī)構(gòu)的安全和穩(wěn)定性需要的有效產(chǎn)品所需的最少數(shù)目和數(shù)量的賦形劑。穩(wěn)定性要求包括物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性。
在使用甘油的制劑中，在制造產(chǎn)品的正常貯藏過(guò)程中必須最小化活性醛引起的多肽共價(jià)交聯(lián)。例如對(duì)于胰島素溶液，在產(chǎn)品的冷藏保存期內(nèi)，必須保持高分子量蛋白的水平低于1.5％[USP 2000，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，MD，美國(guó)(1999)]。生產(chǎn)商爭(zhēng)取始終如一地滿足這種保存期要求，以保證產(chǎn)品對(duì)于患者的安全性。
對(duì)于含有甘油的多肽組合物，活性醛引起的共價(jià)聚合反應(yīng)是關(guān)注的問(wèn)題。在沒(méi)有進(jìn)行適當(dāng)活性測(cè)試的情況下就將任何批號(hào)的商品甘油摻入人用多肽制劑是不謹(jǐn)慎的。事實(shí)上，可以用某種方法評(píng)估從商業(yè)來(lái)源獲得的每一批甘油，以保證用其配制的多肽產(chǎn)品滿足穩(wěn)定性技術(shù)要求。
一種測(cè)試甘油合適性的方法是制備小批的實(shí)際藥品，然后在正常貯藏條件下，一般通過(guò)HPLC評(píng)估整個(gè)正常保存期內(nèi)的聚合體形成。Underberg，W.J.M.等[J.Chromatography B 742401-409(2000)]描述了在穩(wěn)定性研究中分析多肽的多種分離和檢測(cè)技術(shù)。然而，該測(cè)試方法不是切實(shí)可行的，因?yàn)樵摲椒ê臅r(shí)太長(zhǎng)，并且需要過(guò)多分析資源。
一種評(píng)估商業(yè)化成批甘油的合適性的更好方法是加速共價(jià)多肽多聚物的形成速率?？梢酝ㄟ^(guò)增加貯藏溫度[Brange，J.，Galenics ofInsulin，Springer-Verlag(1987)]、增加甘油到正常水平以上或使用這二者來(lái)加速所述反應(yīng)。加速“應(yīng)激”測(cè)試的兩個(gè)實(shí)例是下面方法2和方法3所述的10X-GST測(cè)試和改良10X-GST測(cè)試。
在典型的U100胰島素產(chǎn)品中，胰島素濃度為3.5mg/mL或約600nM/mL。在正常胰島素制劑中的甘油水平是16mg/mL或約174,000nM/mL。假如一批甘油的活性醛水平是例如10ppm，那么活性醛在正常胰島素制劑中的濃度將僅約1.74nM/mL，或比胰島素的濃度低345倍。增加該甘油濃度10倍將提供其中活性醛摩爾數(shù)仍比胰島素摩爾數(shù)低34倍的組合物，但將增加活性醛和胰島素分子之間反應(yīng)的速率。對(duì)于在方法2和方法3中描述的加速測(cè)試，同時(shí)增加溫度(30℃)和甘油水平(10倍)。
在適當(dāng)控制的條件下，加速穩(wěn)定性測(cè)試可靠地預(yù)期所生產(chǎn)的多肽制劑的相對(duì)穩(wěn)定性。這是因?yàn)闇y(cè)試溶液中包含所有在最終溶液中使用的成份。
根據(jù)加速穩(wěn)定性測(cè)試的結(jié)果，共價(jià)多聚物形成的相對(duì)速率與在正常貯藏條件下的形成速率相關(guān)。這種相關(guān)關(guān)系建立在分析判斷的基礎(chǔ)上，例如使用Arrhenius方程計(jì)算溫度范圍、基于提出的每個(gè)活性醛分子與最多2個(gè)多肽分子反應(yīng)的機(jī)制的定量計(jì)算、和/或比較制劑相對(duì)多聚體形成速率。建立多肽組合物穩(wěn)定性的技術(shù)要求限制的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。根據(jù)這些考慮，加速測(cè)試中最高水平多聚體形成可以作為技術(shù)要求限制，例如30℃每周1％，必須滿足該技術(shù)要求限制，以高度保證在正常保存期條件下可以獲得滿意的穩(wěn)定性。
盡管獲得了可靠的結(jié)果，評(píng)估各批制劑的加速方法仍有許多缺點(diǎn)。首先，藥用組合物的多個(gè)樣品制備費(fèi)時(shí)，尤其是假如必須以用于制備生產(chǎn)組合物的相同方法制備所述樣品時(shí)更是這樣。由于在每種不同制劑中活性醛與每種肽的反應(yīng)速率是無(wú)法預(yù)期的，因此必須分別獨(dú)立測(cè)試每種多肽制劑。第二，制備多肽組合物的多個(gè)樣品浪費(fèi)寶貴的材料，尤其浪費(fèi)治療性多肽本身。第三，雖然可以加速交聯(lián)反應(yīng)，但產(chǎn)生足夠交聯(lián)雜質(zhì)以便可靠定量所需的時(shí)間可能需要一周或更長(zhǎng)。第四，確定多肽組合物中交聯(lián)產(chǎn)物水平的測(cè)定程序是復(fù)雜、費(fèi)時(shí)和昂貴的。測(cè)定方法一般涉及HPLC分析，這需要專門的柱子、對(duì)操作者進(jìn)行專業(yè)訓(xùn)練，并且需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間運(yùn)行測(cè)定、收集數(shù)據(jù)和解釋結(jié)果。
直接分析每批甘油則避免了加速穩(wěn)定性測(cè)試的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的一方面是測(cè)定甘油中活性醛成分和水平的方法。具體地說(shuō)，開(kāi)發(fā)了新型HPLC程序(方法4)來(lái)測(cè)定在各批商品甘油中存在哪些醛以及它們的相對(duì)濃度。結(jié)果顯示對(duì)于所測(cè)試的所有來(lái)源甘油，甘油醛是主要的醛雜質(zhì)，同時(shí)存在水平低得多的甲醛和甚至更低水平的乙醇醛。植物來(lái)源甘油中的甲醛水平比動(dòng)物來(lái)源和丙烯來(lái)源甘油中的水平要稍高一些。
然而，作為各批甘油的篩選測(cè)試，該方法具有與上文所述HPLC分析相關(guān)的缺點(diǎn)。
本發(fā)明的另一方面提供使用甘油醛作為標(biāo)準(zhǔn)品的新型比色測(cè)定，該方法簡(jiǎn)單可靠地定量各批商品甘油中的活性醛含量。該測(cè)定是作為下文的方法1而詳細(xì)描述的MBTH測(cè)試。如實(shí)施例1所述，該測(cè)定在與甘油醛反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生非常高的摩爾吸光系數(shù)，而HPLC分析(方法4)鑒定甘油醛為各批商品甘油中主要醛。
最有用的是，MBTH測(cè)試顯示甘油活性醛含量與加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(即改良10X-GST測(cè)試)測(cè)量到的共價(jià)二聚體和多聚體升高水平具有極好的線性相關(guān)關(guān)系(見(jiàn)實(shí)施例2和圖1)。從動(dòng)物來(lái)源、植物來(lái)源和丙烯來(lái)源的各批甘油獲得了良好的相關(guān)因子。已經(jīng)發(fā)明了使用MBTH測(cè)定對(duì)各批甘油進(jìn)行簡(jiǎn)單直接的分析，以取代使用多肽制劑、長(zhǎng)溫育時(shí)間和復(fù)雜HPLC系統(tǒng)的缺乏效率的加速測(cè)試。
為了獲得MBTH測(cè)試確定的活性醛水平技術(shù)要求限制，人們可以簡(jiǎn)單地使用相關(guān)直線(如圖1所示)了解MBTH活性醛水平，該水平與加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)確定的技術(shù)要求限制在相關(guān)直線上相交。例如，由圖1看到，由改良10X-GST測(cè)試確定的1％多聚體生長(zhǎng)的技術(shù)要求限制獲得的MBTH測(cè)試技術(shù)要求限制是14ppm。技術(shù)要求限制是用于制備制造多肽組合物的各批甘油中允許的最高活性醛水平(如根據(jù)MBTH測(cè)試測(cè)量)。假如需要交聯(lián)多肽的水平更低或更大程度地保證所述組合物可以達(dá)到所需的保存期穩(wěn)定性，那么可以建立更低的技術(shù)要求限制。
根據(jù)這些考慮，如果進(jìn)行測(cè)定，則用于制備本發(fā)明水性胃腸外藥用組合物的非動(dòng)物來(lái)源甘油活性醛含量的最大一般技術(shù)要求限制是33ppm。非動(dòng)物來(lái)源甘油更優(yōu)選的技術(shù)要求限制是24ppm。更優(yōu)選的技術(shù)要求限制是15ppm。更優(yōu)選的技術(shù)要求限制是8ppm。最優(yōu)選的技術(shù)要求限制是3ppm。假如在使用甘油制備組合物前測(cè)量所述甘油中活性醛的含量，則該測(cè)定最好使用甘油醛作為標(biāo)準(zhǔn)品。假如在使用甘油制備組合物前測(cè)量所述甘油中活性醛的含量，更優(yōu)選所使用的測(cè)定是本文所述的MBTH測(cè)試。
我們已經(jīng)使用MBTH測(cè)試評(píng)估了從幾個(gè)生產(chǎn)商獲得的新鮮和陳化的各批商品甘油。最驚人的是，我們發(fā)現(xiàn)動(dòng)物來(lái)源甘油活性醛含量范圍(10-1069ppm，n＝19)比植物來(lái)源甘油(4-153ppm，n＝29)或丙烯來(lái)源甘油(0-169ppm，n＝41)更高。動(dòng)物來(lái)源各批甘油的平均活性醛水平也比非動(dòng)物來(lái)源各批甘油高。
也使用本文所述的MBTH測(cè)試來(lái)評(píng)估已知生產(chǎn)日期的各批商品甘油，它們的生產(chǎn)日期在測(cè)定前1-48月。在實(shí)施例3中描述的這些測(cè)試清楚地表明在可比較的時(shí)期，植物來(lái)源或丙烯來(lái)源的各批甘油的平均活性醛水平比從動(dòng)物生產(chǎn)的各批甘油低得多。由于甘油生產(chǎn)商、供應(yīng)商和銷售商所使用的生產(chǎn)方法和貯藏時(shí)間以及貯藏條件固有的不確定性，這些數(shù)據(jù)顯示了選擇非動(dòng)物來(lái)源的甘油制備胃腸外使用多肽組合物的明顯益處。由于活性醛水平隨保存時(shí)間增加而增加，甚至對(duì)于非動(dòng)物來(lái)源甘油也是如此(見(jiàn)表2)，因此選擇最新鮮的可獲得的各批甘油用于制備多肽組合物也是有利的。
在考慮用于制備多肽組合物的各種商業(yè)化來(lái)源甘油時(shí)，非動(dòng)物來(lái)源甘油明顯是優(yōu)選的。更優(yōu)選的是丙烯來(lái)源或植物來(lái)源的各批商品甘油。在水性胃腸外藥用多肽組合物中使用非動(dòng)物來(lái)源甘油而不是動(dòng)物來(lái)源甘油一般由于甘油活性醛含量降低而使化學(xué)穩(wěn)定性改善。在本文所述的實(shí)施例4-8中，針對(duì)苗條蛋白類似物組合物、人類胰島素組合物和胰島素類似物組合物，舉例說(shuō)明了化學(xué)穩(wěn)定性改善與甘油中低活性醛水平之間的相關(guān)關(guān)系。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方法是使用非動(dòng)物來(lái)源的甘油作為包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物中的甘油成分，以改善所述組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。更優(yōu)選的實(shí)施方案是使用丙烯或植物來(lái)源甘油作為包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物中的甘油成分，以改善所述組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。最優(yōu)選的實(shí)施方案是使用丙烯來(lái)源的甘油作為包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物中的甘油成分，以改善所述組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。實(shí)施例9-26和28-34描述了摻入非動(dòng)物來(lái)源甘油的多肽組合物的制備。
本發(fā)明多肽組合物的化學(xué)穩(wěn)定性改善是指所述組合物中高分子量多肽二聚體和多聚體在一段時(shí)間后增加的水平低于相似處理的比較組合物水平。根據(jù)在多種條件、時(shí)間和溫度下進(jìn)行的測(cè)試，可以定量形成的共價(jià)二聚體和多聚體。本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例4-8提供了測(cè)試結(jié)果，其中在經(jīng)過(guò)特定時(shí)間和溫度后，本發(fā)明多肽組合物中高分子量二聚體和多聚體增加的水平明顯更低。本發(fā)明多肽組合物化學(xué)穩(wěn)定性的改善最好導(dǎo)致高分子量二聚體和多聚體增加的水平比以前已知相當(dāng)組合物的水平低至少3％。更優(yōu)選二聚體和多聚體形成增加的水平至少低10％。更優(yōu)選二聚體和多聚體形成增加的水平至少低30％。最優(yōu)選本發(fā)明組合物中高分子量二聚體和多聚體增加的水平比以前所知組合物中的水平低至少60％。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案是包含多肽和甘油的水性胃腸外組合物，其中所述甘油源于非動(dòng)物來(lái)源。更優(yōu)選的實(shí)施方案是包含甘油的多肽組合物，其中所述甘油源于植物來(lái)源或丙烯來(lái)源。最優(yōu)選的實(shí)施方案是包含甘油的多肽組合物，其中所述甘油源于丙烯來(lái)源。
由表2數(shù)據(jù)可知，選擇非動(dòng)物來(lái)源的各批商品甘油并不保證可以獲得極低的活性醛水平，如3ppm或更低。對(duì)于要制備的任何藥用多肽組合物，購(gòu)買動(dòng)物來(lái)源或非動(dòng)物來(lái)源的各批商品甘油可能不具有滿足所需技術(shù)要求限制的足夠低的活性醛水平。
因此，本發(fā)明的再一方面是降低甘油活性醛含量的方法。具體地說(shuō)，如實(shí)施例8所述，所述方法包括使甘油接觸固體干燥劑以及包含自由氨基基團(tuán)的聚合物樹(shù)脂。
據(jù)認(rèn)為含胺樹(shù)脂的類型、干燥劑的性質(zhì)以及甘油、聚合物和干燥劑之間接觸的物理形式對(duì)于去除活性醛不是關(guān)鍵的。
在本發(fā)明的這一方面中可以利用的含胺聚合物樹(shù)脂包括聚苯乙烯型樹(shù)脂如Tris(2-氨基乙基)胺聚苯乙烯樹(shù)脂、TantaGelS NH2樹(shù)脂和氨基甲基聚苯乙烯樹(shù)脂。優(yōu)選樹(shù)脂為氨基甲基聚苯乙烯樹(shù)脂。
在所述降低醛的方法中可以利用廣泛范圍數(shù)量的含胺聚合物樹(shù)脂。優(yōu)選使用顯著過(guò)量摩爾量(與甘油中的醛相比)的含胺聚合物樹(shù)脂，以加速所述過(guò)程并最大化降低活性醛的效應(yīng)。
可以使甘油通過(guò)包含固體干燥劑和聚合物樹(shù)脂的固定化固體聚集體使甘油、樹(shù)脂和干燥劑接觸?？梢詫⒐潭ɑ墓腆w聚集體本身裝載在圓柱形柱中。這種類型的物理構(gòu)型可以便利甘油通過(guò)所述固定化固體聚集體，以便可以快速有效地獲得大量低活性醛水平的甘油。
或者，可以以分批方法實(shí)現(xiàn)所述接觸，其中在甘油中加入干燥劑和聚合物樹(shù)脂以形成懸浮液。在所述批方法中，優(yōu)選的隨后步驟包括加熱所述懸浮液到約40℃和約100℃之間，攪拌加熱的懸浮液約1分鐘到約100小時(shí)，將所述懸浮液通過(guò)截留固體干燥劑和聚合物樹(shù)脂的濾器，然后收集通過(guò)所述濾器的甘油。用所述分批方法處理的甘油的活性醛含量將降低。也可以使用該分批方法非常快速有效地降低非常大量甘油中的活性醛水平。
許多分離純化甘油與聚合物和干燥劑的技術(shù)也是切實(shí)可行的。可以用于本發(fā)明這一方面的相分離技術(shù)包括離心和過(guò)濾。過(guò)濾是優(yōu)選的方法。多種過(guò)濾設(shè)備和程序適于用于相分離，包括由纖維素或玻璃纖維組成的濾膜。優(yōu)選玻璃纖維濾膜。更優(yōu)選的濾膜是Corning 5微米玻璃纖維膜，目錄號(hào)#25981-PF(Corning Inc.，Corning，NY，美國(guó))。
在所述分批方法中，優(yōu)選盡量保持正在進(jìn)行純化的甘油周圍的非氧化性環(huán)境，尤其是在加熱和攪拌步驟時(shí)，盡管這并不是必要的。可以通過(guò)在甘油上方提供惰性氣體環(huán)境而獲得這種非氧化性環(huán)境，例如使用套袋、或向甘油中通入氬氣或氮?dú)?、或通過(guò)提供還原性氣體環(huán)境或部分真空。更優(yōu)選在甘油加熱和攪拌步驟中提供氮?dú)猸h(huán)境。
雖然據(jù)信所述干燥劑的性質(zhì)對(duì)于所述降低醛的方法的成功不是關(guān)鍵的，但在本發(fā)明該方面優(yōu)選使用的干燥劑包括硫酸鎂(MgSO4)和氯化鈣(CaCl2)。更優(yōu)選的干燥劑是硫酸鎂。
在本發(fā)明降低醛的方法中使用的干燥劑的數(shù)量取決于許多因素，包括所使用的干燥劑、甘油中存在的醛和水的水平、所使用的含胺聚合物樹(shù)脂的水平和性質(zhì)、加熱甘油的溫度以及加熱甘油攪拌的時(shí)間長(zhǎng)度。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員知道這些因素中的每一個(gè)因素如何影響所述降低甘油中活性醛水平的反應(yīng)，并可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或通過(guò)計(jì)算確定在該方法中需要使用的干燥劑適當(dāng)數(shù)量。優(yōu)選在該方法中使用過(guò)量干燥劑。
雖然本文所述的降低活性醛的方法對(duì)于任何來(lái)源的甘油都有利，但優(yōu)選動(dòng)物來(lái)源、丙烯來(lái)源或植物來(lái)源的甘油。更優(yōu)選丙烯來(lái)源或植物來(lái)源的甘油。最優(yōu)選丙烯來(lái)源的甘油。
因此，在選定一批非動(dòng)物來(lái)源的商品甘油、最好是植物來(lái)源或丙烯來(lái)源、更優(yōu)選是丙烯來(lái)源的新鮮生產(chǎn)的甘油后，就可以通過(guò)合適的測(cè)定確定活性醛含量。如果活性醛含量低于針對(duì)特定藥用多肽組合物設(shè)定的技術(shù)要求限制，那么可以將所述甘油直接摻入所述組合物，同時(shí)保證將會(huì)獲得所需的化學(xué)穩(wěn)定性水平。
假如活性醛含量高于針對(duì)特定藥用多肽組合物設(shè)定的技術(shù)要求限制，那么可以通過(guò)用本文所述的方法處理，降低所述甘油的活性醛含量。這樣可以在摻入多肽組合物前，將活性醛含量例如為45ppm或更高的一批非動(dòng)物來(lái)源甘油的活性醛含量降到33ppm以下。
或者，可以選定一個(gè)工業(yè)批號(hào)的動(dòng)物來(lái)源甘油，在將其用于制備多肽組合物前測(cè)定其活性醛含量。如果進(jìn)行測(cè)量，則最好通過(guò)使用甘油醛標(biāo)準(zhǔn)品的測(cè)定方法來(lái)確定甘油中的活性醛含量，更優(yōu)選所述測(cè)定是本文所述的MBTH測(cè)試。如果活性醛含量低于8ppm，那么可以直接將所述甘油摻入所述組合物，同時(shí)可以保證將獲得所需的化學(xué)穩(wěn)定性水平。如果活性醛水平是8ppm或更高，那么可以通過(guò)本文所述的方法進(jìn)行處理，降低所述甘油的活性醛水平。這樣可以在將活性醛含量例如為24ppm的一批動(dòng)物來(lái)源甘油摻入多肽組合物前，對(duì)其進(jìn)行處理，將其活性醛含量降到例如2ppm。
本發(fā)明的水性胃腸外藥用組合物可以包含非動(dòng)物來(lái)源的甘油以改善其化學(xué)穩(wěn)定性。本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例5-7清楚顯示與包含動(dòng)物來(lái)源甘油的類似多肽組合物相比，包含非動(dòng)物來(lái)源甘油的藥用多肽溶液和懸浮液組合物的化學(xué)穩(wěn)定性得到改善。
本發(fā)明的水性胃腸外藥用組合物可以包含非動(dòng)物來(lái)源的甘油。如果測(cè)量甘油的活性醛含量，所述甘油的活性醛含量最好低于33ppm，以進(jìn)一步改善所述多肽組合物的化學(xué)穩(wěn)定性。本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例4和8清楚地顯示與包含活性醛含量高于33ppm的非動(dòng)物來(lái)源甘油的相似多肽組合物相比，包含活性醛含量低于33ppm的非動(dòng)物來(lái)源甘油的藥用多肽溶液和懸浮液組合物的化學(xué)穩(wěn)定性提高。
為了改善化學(xué)穩(wěn)定性，本發(fā)明的水性胃腸外藥用組合物或者可以包含活性醛含量低于8ppm的任何來(lái)源甘油，包括丙烯來(lái)源甘油、植物來(lái)源甘油或動(dòng)物來(lái)源甘油。本說(shuō)明書(shū)的實(shí)施例4、5和8清楚地顯示與包含活性醛含量為8ppm或更高的甘油的相似多肽組合物相比，包含活性醛含量低于8ppm的甘油的藥用多肽溶液和懸浮液組合物的化學(xué)穩(wěn)定性提高。
據(jù)信本發(fā)明可以應(yīng)用于任何包含甘油的水性多肽組合物。這樣的多肽組合物常常包含其它成分和賦形劑，并且以通常用于制備所述組合物的方法制備。在不限制本發(fā)明的普遍性的同時(shí)，公開(kāi)下面的組合物、賦形劑和制備它們的方法，以更好地指導(dǎo)讀者。
本發(fā)明提供包含水、多肽和活性醛水平低于8ppm的非動(dòng)物來(lái)源甘油或任何來(lái)源甘油的組合物。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供包含至少一種多肽或其藥學(xué)上可接受的鹽形式的組合物。本發(fā)明中可以使用的多肽濃度范圍根據(jù)給予途徑從約1.0μg/mL到約100mg/mL，盡管更低或更高的濃度也是可操作的。多肽濃度最好約5.0μg/mL到約20mg/mL，最優(yōu)選約20μg/mL到約10mg/mL。根據(jù)所需劑量、多肽的效力以及所述多肽在所述多肽中的穩(wěn)定性，技術(shù)人員將知道要摻入本發(fā)明組合物中的適當(dāng)多肽濃度。
根據(jù)常規(guī)多肽制劑，在本發(fā)明的組合物中可以使用其它賦形劑，例如除甘油以外的等滲劑、防腐劑、魚(yú)精蛋白、緩沖劑、增溶劑、去污劑、抗氧化劑、溶液穩(wěn)定劑和金屬陽(yáng)離子。但在本發(fā)明的多肽組合物中也可以使用其它賦形劑。
本發(fā)明組合物的水含量是500mg/mL或更高。本發(fā)明多肽組合物的甘油濃度低于500mg/mL。
可以用多種本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的程序制備本發(fā)明的藥用組合物。本發(fā)明并不要求按規(guī)定順序加入所述組合物的各成分。根據(jù)所述多肽的性質(zhì)、治療應(yīng)用和所需制劑，技術(shù)人員將知道制備本發(fā)明組合物的合適程序和加入順序。
根據(jù)本發(fā)明，如果植物來(lái)源或丙烯來(lái)源的甘油足夠新鮮，那么可以放心地將其直接用于改善多肽組合物的化學(xué)穩(wěn)定性，這與動(dòng)物來(lái)源甘油在同樣組合物中的已知應(yīng)用相比有優(yōu)勢(shì)。然而，如果首先測(cè)量要在多肽組合物中使用的甘油的活性醛含量，那么可以最大限度地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。最好在將甘油摻入多肽組合物前兩周內(nèi)測(cè)定甘油中的活性醛含量。更優(yōu)選在將甘油摻入多肽組合物前三天內(nèi)測(cè)定甘油中的活性醛含量。如果在將非動(dòng)物來(lái)源甘油用于制備多肽組合物前測(cè)量其活性醛含量，則該含量最好低于33ppm。更優(yōu)選所述甘油的活性醛含量低于24ppm。更優(yōu)選所述甘油的活性醛含量低于15ppm。更優(yōu)選所述甘油的活性醛含量低于8ppm。最優(yōu)選所述甘油的活性醛含量為3ppm或更低。用于測(cè)量甘油活性醛含量的測(cè)定方法最好使用甘油醛作為標(biāo)準(zhǔn)品。更優(yōu)選用于測(cè)量甘油活性醛含量的測(cè)定方法是本文所述的MBTH測(cè)試。
或者，假如按照上文所述方法和期限測(cè)試的動(dòng)物來(lái)源甘油活性醛含量低于8ppm，那么就可以在本發(fā)明的多肽組合物中使用它們，同時(shí)保證化學(xué)穩(wěn)定性得到改善。
因此，本發(fā)明的一方面提供包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物，其中所述甘油來(lái)自任何來(lái)源，包括丙烯來(lái)源、植物來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源甘油，并且所述甘油的活性醛含量低于8ppm。所述甘油的活性醛含量最好是3ppm或更低。用于測(cè)量甘油活性醛含量的測(cè)定方法最好使用甘油醛作為標(biāo)準(zhǔn)品。更優(yōu)選用于測(cè)量甘油活性醛含量的測(cè)定方法是本文所述的MBTH測(cè)試。
本發(fā)明的水性藥用多肽組合物用作藥物，或用于制備治療哺乳動(dòng)物疾病的藥物。更具體地說(shuō)，當(dāng)所述多肽是胰島素或胰島素的類似物或衍生物、或GLP-1或GLP-1的類似物或衍生物時(shí)，就可以使用所述藥物治療糖尿病或高血糖癥。
可以將要求保護(hù)的多肽組合物以澄清溶液、懸浮液混合物或雙瓶包裝提供給患者，其中所述雙瓶包裝包含一瓶?jī)龈苫蚋稍锏亩嚯?，該瓶多肽用另一瓶溶劑重建。?yōu)選的多肽組合物是澄清溶液和懸浮液混合物。
可以通過(guò)多種技術(shù)人員了解的各種胃腸外傳遞途徑將所要求保護(hù)的組合物給予需要它們的患者。優(yōu)選的方法包括皮下注射、肌肉內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射或輸注、肺給予、頰傳遞、鼻傳遞、眼內(nèi)傳遞或經(jīng)皮傳遞、以及內(nèi)部或外部泵給予。更優(yōu)選的傳遞途徑是皮下注射和肌肉內(nèi)注射。
在保存時(shí)，所要求保護(hù)的組合物比以前所知的組合物在化學(xué)上更加穩(wěn)定。
方法1MBTH測(cè)試在總體積100ml的水中，溶解約250mg約20-25％(重量)的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽(MBTH)及約75-80％(重量)氯化鈉的混合物，制備“MBTH溶液”。
取約5.4g在丙二醇中含約20-35％(重量)氯化鐵(FeCl3)和約5％(重量)鹽酸的溶液，加入約1.5g氨基磺酸，制備“氯化鐵溶液”。用水將該混合物稀釋到100ml總體積。
用15ml試管準(zhǔn)確稱取約50mg到約400mg要測(cè)定的各批甘油樣品。加入1.0mL水。然后加入4.0mL MBTH溶液并充分混合所述制品。在沸水浴中加熱所述溶液60±5秒鐘。在室溫下冷卻5分鐘后，加入5.0mL氯化鐵溶液并充分混合。
在室溫下冷卻30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間后，在分光光度計(jì)上測(cè)量所述溶液在624nm處的吸光度。
如上文所述制備空白測(cè)試溶液，只是不加入甘油。用水稀釋100μg/mL甘油醛水溶液，制備約0.5μg/ml到約10μg/ml的甘油醛標(biāo)準(zhǔn)品，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后用測(cè)試試劑處理所述標(biāo)準(zhǔn)溶液。
從標(biāo)準(zhǔn)溶液和測(cè)試溶液的吸光度減去空白的吸光度后，根據(jù)甘油醛標(biāo)準(zhǔn)曲線定量所述甘油樣品中的活性醛水平。對(duì)于其中活性醛水平低于0.5μg/ml甘油醛標(biāo)準(zhǔn)的甘油樣品，通過(guò)外推用甘油醛標(biāo)準(zhǔn)品獲得的最優(yōu)擬合線，確定其活性醛含量。所述樣品一般一式三份進(jìn)行檢測(cè)。在該測(cè)試中使用的所有水最好都是無(wú)醛的。
方法210X甘油應(yīng)激測(cè)試(10X GST)10X甘油應(yīng)激測(cè)試(10X GST)測(cè)量胰島素組合物中形成的共價(jià)二聚體和多聚體。將要測(cè)試的甘油加入HumulinR(U40，Eli Lilly & Co.，Indianapolis IN，美國(guó))達(dá)到160mg/mL甘油終濃度，即10倍于該制劑中的通常使用的甘油水平。將1等份所獲得的制劑在30℃溫育7天，第二等份在同樣時(shí)間內(nèi)冰凍保存。然后在變性條件下通過(guò)尺寸排阻HPLC層析(如Zorbax GF 250 Special柱；流動(dòng)相為65份0.1M磷酸銨緩沖液pH7.5和35份乙腈；在214nm處檢測(cè))測(cè)量所述兩個(gè)等份中的高分子量蛋白(HMWP)水平。測(cè)試制劑中HMWP的增加水平是30℃樣品HMWP的濃度減去冰凍對(duì)照HMWP的濃度。
方法3改良10X甘油應(yīng)激測(cè)試(Mod.10X-GST)一毫升HumulinN(U40，Eli Lilly & Co.，Indianapolis IN，美國(guó))與約160mg(約128μl)需測(cè)試的甘油摻合。該甘油水平是商業(yè)化產(chǎn)品中正常水平的約10倍。將另一毫升HumulinU40與128μL水摻合。兩種樣品都在30℃保存7天。然后在變性條件下通過(guò)尺寸排阻HPLC層析[如標(biāo)識(shí)為“合格Protein-Pak 125胰島素測(cè)定”的Waters柱，Waters Corporation(Milford，MA，美國(guó))目錄號(hào)20574；流動(dòng)相為65份的1mg/mL L-精氨酸溶液、20份的乙腈和15份的冰乙酸]測(cè)量?jī)煞N樣品中的高分子量蛋白(HMWP)水平。分析前用少量9.6N HCl酸化，溶解測(cè)試樣品。
測(cè)試制劑中HMWP增加水平計(jì)算方法是所述30℃測(cè)試樣品中的HMWP水平減去所述摻水對(duì)照中的HMWP水平。報(bào)告的增加百分率為7天的增加百分率。
方法4HPLC分析甘油中的衍生醛在3.5mL玻璃小瓶中的乙腈中，用1mL 0.5mg/ml 2-二苯乙?；?1，3-(2，3-二氫-1，3-茚二酮)-1-腙[(DPIH)，見(jiàn)Rideout，J.M.等，Clin.Chim.Acta 16129-35(1986)和Swarin，S.等，J.Liquid Chromatography6425-444(1983)]衍化160mg要測(cè)試的一批甘油樣品。加入10μL三氟乙酸，蓋緊小瓶，室溫下在20rpm離心3小時(shí)。甘油與乙腈-DPIH試劑溶液不能混溶，但離心該管使甘油分布到小管表面的薄層中，最大化了兩層表面的接觸。甘油中的醛和酮與DPIH反應(yīng)，形成吖嗪，吖嗪被提取到乙腈-DPIH試劑溶液中。
然后將該溶液注射入Zorbax Rx C8 HPLC柱(Mac-Mod AnalyticalInc.，Chadds Ford，PA，美國(guó))。用溶液A(0.1％ TFA水溶液)和溶液B(0.1％TFA乙腈溶液)從48％B混合物步進(jìn)到66％B混合物的步進(jìn)梯度運(yùn)行30分鐘，分離吖嗪。使用分光光度計(jì)在290nm處檢測(cè)衍生物，或使用分光熒光計(jì)在425nm激發(fā)和525nm發(fā)射檢測(cè)衍生物。分離醛標(biāo)準(zhǔn)品，它們的洗脫順序是甘油醛、乙醇醛、羥基丙醛、甲醛、乙醛和丙醛。
僅為說(shuō)明本發(fā)明的目的提供下面的實(shí)施例。不應(yīng)當(dāng)解釋為本發(fā)明的范圍僅包括下面的實(shí)施例。
實(shí)施例1醛測(cè)試的選擇性將植物來(lái)源甘油的樣品與表1所示的確定醛水平摻合。然后通過(guò)本文所述的MBTH測(cè)試(方法1)和其它三種測(cè)試測(cè)定摻合的甘油樣品。
對(duì)于“Nash”測(cè)試，用pH7.5磷酸緩沖液提取甘油中的醛，然后在過(guò)量乙酸銨存在下用乙酰丙酮衍化[du Chatinier等，AnalyticalLetters 22875-883(1989)]。使用分光光度計(jì)在415nm處定量顏色反應(yīng)產(chǎn)物。
對(duì)于“Purpald”測(cè)試，將試劑4-氨基-3-肼基-5-巰基-1，2，4-三唑[Aldrich Chemical Company]溶解于1N NaOH中。然后將該溶液加入用水稀釋的甘油溶液。通氣后，用分光光度計(jì)在401nm處測(cè)定溶液的吸光度。
對(duì)于歐洲藥典(Ph.Eur.)測(cè)試，將甘油溶液與鹽酸副品紅鹽酸鹽溶液[歐洲藥典1997，第906-907頁(yè)，歐洲委員會(huì)，Strasbourg]混合。一小時(shí)后，用分光光度計(jì)測(cè)量550nm處的吸光度。
對(duì)加入的每種化合物，從摻入甘油的反應(yīng)中減去未摻入甘油樣品的反應(yīng)，計(jì)算每個(gè)測(cè)試的吸光度值。在摩爾基礎(chǔ)上計(jì)算每種醛的吸光度值并顯示于表1。負(fù)值表示加入醛實(shí)際上降低了吸光度讀數(shù)。
表1加入甘油的醛的摩爾吸光度
nd＝未測(cè)定Nash測(cè)試對(duì)于任何一種醛都沒(méi)有產(chǎn)生高吸光度。Purpald方法對(duì)于乙醇醛高度敏感，但對(duì)甘油醛沒(méi)有產(chǎn)生吸光度。歐洲藥典方法對(duì)甲醛產(chǎn)生了中等吸光度，但對(duì)于測(cè)量甘油醛相對(duì)不靈敏。
該實(shí)驗(yàn)清楚地顯示在所比較的四種測(cè)試中，用MBTH測(cè)試獲得最高的每摩爾甘油醛吸光度信號(hào)。HPLC分析(方法4)顯示甘油醛是各批商品甘油中發(fā)現(xiàn)的主要醛。在MBTH測(cè)試中，對(duì)甲醛和乙醇醛也獲得了高吸光度值，而HPLC分析(方法4)顯示這兩種醛在各批商品甘油中以低水平存在。因此，MBTH測(cè)試是測(cè)定甘油中活性醛水平的靈敏方法。
實(shí)施例2MBTH測(cè)試與改良10X-GST測(cè)試之間的相關(guān)關(guān)系用上文所述的MBTH測(cè)試測(cè)量新鮮和陳化的各批商品甘油中活性醛的含量。也使用10X-GST測(cè)試(方法3)評(píng)估每種甘油樣品。對(duì)于丙烯來(lái)源和植物來(lái)源的組合的甘油樣品(分別是n＝39和n＝25)，圖1的結(jié)果顯示MBTH測(cè)試測(cè)量的活性醛含量(＜100ppm)與改良10X-GST測(cè)試測(cè)量的HumulinN胰島素制劑中共價(jià)HMWP峰增加之間呈強(qiáng)線性相關(guān)關(guān)系(對(duì)于通過(guò)原點(diǎn)的最優(yōu)擬合直線，R2＝0.90)。動(dòng)物來(lái)源甘油的樣品(n＝19)在這兩種測(cè)試間也顯示了強(qiáng)線性相關(guān)關(guān)系(R2＝0.93，數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例3多批陳化商品甘油中的活性醛含量將生產(chǎn)日期已知的各批商品甘油從生產(chǎn)日期開(kāi)始在室溫下保存1到48月。對(duì)于每一批甘油，用本文所述的MBTH測(cè)試測(cè)量活性醛含量。各批甘油的數(shù)據(jù)顯示于下面表2。
表2三種來(lái)源各批甘油中活性醛的分析
SEM＝平均值標(biāo)準(zhǔn)差*＝根據(jù)Wilcoxon Rank-Sum檢驗(yàn)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p＝0.003這些數(shù)據(jù)清楚地顯示丙烯來(lái)源和植物來(lái)源的各批陳化甘油比動(dòng)物來(lái)源的各批陳化甘油有更低的活性醛水平范圍。這些數(shù)據(jù)還顯示在平均陳化時(shí)間內(nèi)，植物來(lái)源和丙烯來(lái)源的各批甘油比動(dòng)物來(lái)源的各批甘油具有低得多的平均活性醛含量。
用每批甘油的活性醛含量除以其自生產(chǎn)日期起始的陳化時(shí)間，得到表2中最后一行的數(shù)據(jù)。這些計(jì)算顯示每陳化月內(nèi)非動(dòng)物來(lái)源的甘油比動(dòng)物來(lái)源的甘油具有在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著更低的活性醛水平。這些數(shù)據(jù)的合理解釋是動(dòng)物來(lái)源甘油活性醛含量隨時(shí)間的增加比植物或丙烯來(lái)源甘油活性醛含量隨時(shí)間的增加更快。
根據(jù)這項(xiàng)研究，我們相信假如在同等條件下保存具有同等活性醛含量的植物來(lái)源、丙烯來(lái)源和動(dòng)物來(lái)源甘油，那么動(dòng)物來(lái)源甘油活性醛含量隨時(shí)間的增加將比植物或丙烯來(lái)源甘油活性醛含量隨時(shí)間的增加更快。
實(shí)施例4苗條蛋白制劑的穩(wěn)定性用人苗條蛋白類似物Asp(72)、Asp(100)-Ob，[1998年6月24日公布的Beals，J.M.等，WO 98/28335中的SEQ.ID.6]制備含甘油濃度為220mg/ml的制劑。甘油樣品1(根據(jù)MBTH測(cè)試，活性醛＝1ppm)來(lái)自丙烯，甘油樣品2(根據(jù)MBTH測(cè)試，活性醛＝85ppm)來(lái)自植物來(lái)源。每種制劑在調(diào)整到pH7.8的10mM磷酸緩沖液中含有15.2mg/mL苗條蛋白。
同時(shí)制備每種樣品制劑50mL體積，并無(wú)菌過(guò)濾。無(wú)菌操作，將等份(3mL)加入無(wú)菌5mL玻璃管，加塞、密封，保存在5℃和25℃下3、7、10和24天。使用TosoHaas TSK-GEL G3000SW-XL柱(TosoHaas，Montgomeryville，PA，美國(guó))，流動(dòng)相為pH 8.5的0.1M磷酸鈉，0.1M硫酸鈉和0.6％十二烷基硫酸鈉，通過(guò)尺寸排阻層析HPLC在離解條件下分析所述溶液。根據(jù)在214nm處的紫外吸光度檢測(cè)洗脫多肽峰。
除主要蛋白峰外，還觀察到兩個(gè)更早的洗脫峰(即更大分子量)。其中一個(gè)是共價(jià)二聚體，代表多于90％的早期洗脫峰面積。另一個(gè)早期洗脫峰包含比二聚體更大的共價(jià)蛋白多聚體。在樣品制備的那一天，合并的早期洗脫峰代表樣品總色譜峰面積的0.31％到0.33％，而二聚體峰代表樣品總色譜峰面積的0.30％到0.32％。
在整個(gè)研究過(guò)程中所有樣品保持澄清和無(wú)色。下面表3顯示了高分子量蛋白峰(合并的二聚體和更大分子量峰)占總蛋白百分率的增加。至于初始蛋白質(zhì)溶液，在所有樣品中的早期洗脫峰主要是二聚體。
表3高分子量蛋白峰的增加(相對(duì)于總蛋白的％)
該實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)于人苗條蛋白類似物Asp(72)Asp(100)-Ob，包含活性醛含量更低的甘油(樣品1)的制劑與包含活性醛含量更高的甘油(樣品2)的類似制劑相比，在5℃和25℃保存時(shí)高分子量蛋白雜質(zhì)的形成更少。在5℃下24天后，用活性醛含量為1ppm的甘油(樣品1)制備的組合物中高分子量蛋白增加的水平比用活性醛含量為85ppm的甘油(樣品2)制備的組合物低約50％。在25℃下24天后，用甘油樣品1制備的組合物中高分子量蛋白增加的水平比用甘油樣品2制備的組合物中該水平低約67％。
實(shí)施例5胰島素和胰島素類似物制劑的穩(wěn)定性通過(guò)MBTH測(cè)試定量三批不同商品甘油中的活性醛含量。甘油樣品3是來(lái)自丙烯(1ppm活性醛)，甘油樣品4和5是動(dòng)物來(lái)源甘油(活性醛含量分別是45ppm和156ppm)。
將兩種人胰島素制造制劑(可溶的HumulinR和結(jié)晶懸浮液HumulinN)、四種Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素制造制劑[可溶的Humalog、結(jié)晶懸浮液HumalogNPL和它們名為L(zhǎng)isPro Low Mix(25∶75，Humalog∶HumalogNPL，見(jiàn)Roach，P.等，Diabetes Care 221258-1261(1999))和LisPro Mid Mix(50∶50，Humalog∶HumalogNPL))的固定混合物]各以100單位每mL的強(qiáng)度與甘油樣品3、4和5摻合，使最終甘油濃度為160mg/ml。
在30℃下7天后，如方法3測(cè)定每種制劑中高分子量蛋白(HMWP)增加的百分率。下面的表4顯示了HMWP水平的增加。
表4在30℃下7天后高分子量蛋白峰的增加(總蛋白的％)
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚地顯示與用動(dòng)物來(lái)源甘油制備的相似組合物相比，使用非動(dòng)物來(lái)源的甘油提供了化學(xué)穩(wěn)定性改善的多肽溶液、懸浮液和混合溶液/懸浮液。在30℃下7天后，用丙烯來(lái)源甘油(樣品3)制備的組合物中高分子量蛋白增加的水平從LisPro Low Mix降低約87％(與動(dòng)物來(lái)源甘油樣品4相比)到HumulinN降低約99％(與動(dòng)物來(lái)源甘油樣品5相比)。
實(shí)施例6制備Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液使用四批沒(méi)有進(jìn)一步純化的商品甘油制備相當(dāng)于U100規(guī)格的Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素類似物懸浮液的組合物(HumalogNPL，Eli Lilly & Co.，Indianapolis，IN，美國(guó))。
首先，如方法1所述通過(guò)MBTH測(cè)試測(cè)定三批甘油中的活性醛含量。同時(shí)使用10X甘油應(yīng)激測(cè)試(方法2)和改良10X甘油應(yīng)激測(cè)試(方法3)評(píng)估所述各批甘油。下面的表5報(bào)道了這些分析的結(jié)果。
表5對(duì)用于制備Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液的各批甘油的分析
nd＝未測(cè)定為制備Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素制劑，制備幾種中間體溶液。
“防腐劑貯液”用去離子水制備，含有3.52mg/mL間甲酚和1.43mg/mL苯酚(計(jì)算值為89％(重量))。
用水制備每種甘油樣品的160mg/mL“甘油貯液”。
用10％HCl酸化氧化鋅溶液，制備“鋅貯液”。
將合適體積的“防腐劑貯液”、“甘油貯液”和“鋅貯液”混合，制備“防腐劑-甘油-鋅溶液”，該溶液含有1.76mg/mL間甲酚、0.715mg/mL苯酚、16mg/mL甘油，并且當(dāng)該溶液的鋅濃度與主要成分Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素物質(zhì)中存在的鋅合并時(shí)，總濃度達(dá)到25μg/mL。此時(shí)所述“防腐劑-甘油-鋅”溶液約是pH4.7。
然后將一定量Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素(大量鋅結(jié)晶)加入所述防腐劑-甘油-鋅溶液，所述加入量足以在下文所述的“U200Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液中達(dá)到濃度200單位(U)/mL或約7.0mg/mL在室溫下加入小份等量的10％HCl，將pH降到約2.8，溶解Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素。在使所述溶液澄清后，加入小量等份10％NaOH，將所述溶液的pH調(diào)到約7.3。加入一定量用去離子水配制的75.6mg/mL七水合磷酸氫二鈉溶液，所述加入量足以在該溶液中達(dá)到3.78mg/mL七水合磷酸氫二鈉的濃度。攪拌使該溶液中的所有物質(zhì)完全溶解后，加入10％NaOH，將四種Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液中每一種調(diào)整到約pH74。加入去離子水得到200U/mLLys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液，然后將該溶液通過(guò)0.22微米SterivexGV濾膜(Millipore Products Division，Bedford，MA，美國(guó))過(guò)濾。這四種溶液名為“U200 Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液”。
將固體硫酸魚(yú)精蛋白(大麻哈魚(yú)(Chum salmon))溶解于“防腐劑貯液”中，達(dá)到等同于在下文所述的最終“魚(yú)精蛋白-防腐劑-甘油溶液”中0.6mg/mL魚(yú)精蛋白游離堿的濃度，獲得“魚(yú)精蛋白貯液”。攪拌45分鐘后，加入一定體積75.6mg/mL七水合磷酸氫二鈉去離子水溶液，使最終“魚(yú)精蛋白-防腐劑-甘油溶液”中七水合磷酸氫二鈉濃度為3.78mg/mL。加入小量等份10％鹽酸，將該溶液調(diào)整到pH7.4。然后加入一定體積160mg/mL“甘油貯液”，獲得在每種溶液中含16mg/mL甘油的溶液。加入去離子水調(diào)整最終體積，并將四種“魚(yú)精蛋白-防腐劑-甘油”溶液通過(guò)0.22微米Sterivex GV濾膜過(guò)濾。
在15℃平衡四種U200 Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液和四種魚(yú)精蛋白-防腐劑-甘油溶液后，混合等體積的每種溶液并在15℃溫育61小時(shí)。
在該實(shí)驗(yàn)中制備的最終四種懸浮液制劑中每mL大致含有3.5mg Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素、3.78mg七水合磷酸氫二鈉、16mg甘油、1.76mg間甲酚、0.715mg苯酚、25μg鋅和0.3mg魚(yú)精蛋白。
實(shí)施例7Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液的穩(wěn)定性如實(shí)施例6所述，用不同批甘油制備的Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素四種懸浮液制劑在30℃溫育直到12周。在不同時(shí)間，通過(guò)改良10X-GST測(cè)試(方法3)中所述的尺寸排阻HPLC層析，測(cè)量樣品中高分子量蛋白(HMWP)水平，即占總蛋白的百分率。該穩(wěn)定性測(cè)試的結(jié)果顯示于下面的表6。
表6用不同批甘油制備的Lys(B28)Pro(B29)人胰島素懸浮液中的HMWP水平
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果清楚地顯示與用動(dòng)物來(lái)源甘油制備的Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液制劑相比，丙烯來(lái)源的甘油改善所述懸浮液制劑的化學(xué)穩(wěn)定性。在30℃下12周后，在用丙烯來(lái)源甘油(樣品6到8)制備的懸浮液制劑中高分子量蛋白增加的水平平均比用動(dòng)物來(lái)源甘油(樣品9)制備的所述制劑中HMWP增加的水平低約39％。
實(shí)施例8降低甘油中活性醛水平將一批丙烯來(lái)源甘油(3.0ml)放入裝有攪拌棒的五個(gè)燒杯中。用一批植物來(lái)源甘油相似地準(zhǔn)備五個(gè)燒杯。將約50mg固體無(wú)水硫酸鎂(MgSO4)加入每一組的四個(gè)燒杯中。在每一組加入了硫酸鎂的三個(gè)燒杯中，加入稱好重量的下列Advanced Chem Tech Inc.(Louisville，KY，美國(guó))聚合物樹(shù)脂中的一種樹(shù)脂A，0.1g Tris(2-氨基乙基)胺樹(shù)脂(0.7mmol/g，100-200目；樹(shù)脂B，0.2g TantaGelS NH2樹(shù)脂(0.3mmol/g，90um)；樹(shù)脂C，0.1g氨基甲基聚苯乙烯樹(shù)脂(0.7mmol/g，100-200目)。
所有十個(gè)燒杯置于手套袋內(nèi)氮環(huán)境下的攪拌器上，加熱到約60℃。攪拌24小時(shí)后，將樣品活塞過(guò)濾(plug-filter)通過(guò)纖維素膜，并通過(guò)如方法1中所述的MBTH測(cè)試分析它們的活性醛含量(ppm)。也通過(guò)改良10X-GST測(cè)試(方法3)評(píng)估幾個(gè)甘油樣品。下面的表7報(bào)道了本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
表7用聚合物胺樹(shù)脂處理甘油樣品的結(jié)果
nd＝未測(cè)定這些數(shù)據(jù)清楚地顯示所使用的純化方法大大降低各批商品甘油中的活性醛濃度。在用改良10X-GST測(cè)試測(cè)定的胰島素懸浮液中，用氨基甲基聚苯乙烯(樹(shù)脂C)純化的各批甘油不導(dǎo)致HMWP峰增加，而未純化各批甘油導(dǎo)致HMWP峰水平顯著增加。
實(shí)施例9人胰島素溶液將重組人胰島素(35mg)溶于約5m l0.01N HCl。加入氧化鋅溶液(1mL，0.17mg/mL鋅，氧化鋅溶解于0.1N HCl中)，然后加入25mg間甲酚。然后加入160mg新鮮生產(chǎn)的丙烯來(lái)源甘油。將該溶液用1NNaOH調(diào)整到約pH7.4，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.5mg人胰島素、約16mg甘油、約2.5mg間甲酚和約0.017mg鋅。
實(shí)施例10人胰島素溶液將重組人胰島素(35mg)溶于約5ml 0.01N HCl。加入氧化鋅溶液(1mL，0.17mg/mL鋅，氧化鋅溶解于0.1N HCl中)，然后加入16mg間甲酚、6.5mg苯酚和1mL 140mM磷酸鈉緩沖水溶液。然后加入160mg新鮮生產(chǎn)的丙烯來(lái)源甘油。該溶液用1N NaOH調(diào)整到約pH7.4，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.5mg人胰島素、約16mg甘油、14mM磷酸鈉、約1.6mg間甲酚、約0.65mg苯酚和約0.017mg鋅。
實(shí)施例11人胰島素懸浮液首先將35mg重組人胰島素溶解于5ml 0.01N HCl，然后加入16mg間甲酚和6.5mg苯酚，制備人胰島素-魚(yú)精蛋白結(jié)晶懸浮液。加入1ml 160mg/mL丙烯來(lái)源甘油的水溶液、1mL在0.1N HCl中的氧化鋅(0.25mg/ml鋅)溶液和2.7mg魚(yú)精蛋白(以游離堿計(jì))，然后用水稀釋到約9mL總體積。然后加入38mg/mL七水合磷酸氫二鈉溶液(1ml)，導(dǎo)致pH約8。將得到的溶液調(diào)整到pH7.4，并在約19℃結(jié)晶約24小時(shí)。每一mL該懸浮液含約3.5mg人胰島素、約16mg甘油、約0.27mg魚(yú)精蛋白(以游離堿計(jì))、約0.025mg鋅、約1.6mg間甲酚、約0.65mg苯酚和約3.8mg磷酸二氫鈉。
實(shí)施例12人胰島素70/30混合物一種包含70份實(shí)施例11所述懸浮液和30份實(shí)施例10所述人胰島素溶液的組合的混合物。這兩種制劑都使用丙烯來(lái)源的甘油。
實(shí)施例13人胰島素50/50混合物一種包含50份實(shí)施例11所述懸浮液和50份實(shí)施例10所述人胰島素溶液的組合的混合物。這兩種制劑都使用丙烯來(lái)源的甘油。
實(shí)施例14人胰島素30/70混合物一種包含30份實(shí)施例11所述懸浮液和70份實(shí)施例10所述人胰島素溶液的組合的混合物。這兩種制劑都使用丙烯來(lái)源的甘油。
實(shí)施例15Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液將重組Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素(35mg)溶于約5ml 0.01NHCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.2mg/mL鋅)，然后加入31.5mg間甲酚和1mL 70mM磷酸緩沖水溶液。然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油。該溶液用1N NaOH調(diào)整到約pH7.4，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.5mgLys(B28)Pro(B29)-人胰島素、約16mg甘油、7mM磷酸鈉、約3.15mg間甲酚和約0.02mg鋅。
實(shí)施例16Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液將重組Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素(35mg)溶于約5ml 0.01NHCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.2mg/mL鋅)，然后加入16mg間甲酚、6.5mg苯酚和1mL 140mM磷酸緩沖水溶液。然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油。該溶液用1N NaOH調(diào)整到約pH7.4，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.5mg Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素、約16mg甘油、14mM磷酸鈉、約1.6mg間甲酚、約0.65mg苯酚和約0.02mg鋅。
實(shí)施例17Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液使用如實(shí)施例6所述程序，用丙烯來(lái)源甘油制備Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素NPH樣結(jié)晶的懸浮液。
實(shí)施例18Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素75/25混合物一種包含75份實(shí)施例17所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液和25份實(shí)施例16所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液的組合的混合物。這些制劑的每一種都使用丙烯來(lái)源的甘油。
實(shí)施例19Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素50/50混合物一種包含50份實(shí)施例17所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液和50份實(shí)施例16所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液的組合的混合物。這些制劑的每一種都使用丙烯來(lái)源的甘油。
實(shí)施例20Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素25/75混合物一種包含25份實(shí)施例17所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素懸浮液和75份實(shí)施例16所述Lys(B28)Pro(B29)-人胰島素溶液的組合的混合物。這些制劑的每一種都使用丙烯來(lái)源的甘油。
實(shí)施例21Asp(B28)-人胰島素溶液將重組Asp(B28)-人胰島素(35mg)溶于約5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.2mg/mL鋅)，然后加入17mg間甲酚和15mg苯酚。然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油，并加入1mL70mM磷酸緩沖水溶液。該溶液用1N NaOH調(diào)整到約pH7.4，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.5mgAsp(B28)-人胰島素、約16mg甘油、約7mM磷酸、約1.7mg間甲酚、約1.5mg苯酚和約0.02mg鋅。
實(shí)施例22Asp(B28)-人胰島素70/30混合物將76.5mg Asp(B28)-人胰島素溶解于含約0.32mL 0.2N HCl的水中，加入約0.16mL 0.4mg/mL氯化鋅溶液，制備Asp(B28)-人胰島素溶液。加入硫酸魚(yú)精蛋白(相當(dāng)于約4.5mg魚(yú)精蛋白游離堿)水溶液，隨后加入溶解于水中的17.2mg間甲酚、15mg苯酚和160mg丙烯來(lái)源甘油的混合物。得到的溶液約pH2.7，用水稀釋到10mL，并平衡到約30℃。在該溶液中加入10mL含17.2mg間甲酚、15mg苯酚、25mg二水合磷酸氫二鈉和160mg丙烯來(lái)源的甘油、pH9的溶液，并平衡到約30℃。在約30℃2天后，完成結(jié)晶化，獲得懸浮液混合物，該混合物中約70％Asp(B28)-人胰島素存在于不可溶的NPH樣結(jié)晶中，而30％Asp(B28)-人胰島素存在于溶液中。
實(shí)施例23Asp(B28)-人胰島素50/50混合物將76.5mg Asp(B28)-人胰島素溶解于含約0.32mL0.2N HCl的水中，并加入約0.16mL 0.4mg/mL氯化鋅溶液，制備Asp(B28)-人胰島素溶液。加入硫酸魚(yú)精蛋白(相當(dāng)于約3.2mg魚(yú)精蛋白游離堿)水溶液，隨后加入溶解于水中的17.2mg間甲酚、15mg苯酚和160mg丙烯來(lái)源甘油的混合物。得到的溶液約pH2.7，用水稀釋到10mL，并平衡到約30℃。在該溶液中加入10mL含17.2 mg間甲酚、15mg苯酚、25mg二水合磷酸氫二鈉和160mg丙烯來(lái)源的甘油、pH9的溶液，并平衡到約30℃。在約30℃2天后，完成結(jié)晶化，獲得懸浮液混合物，該混合物中約50％Asp(B28)-人胰島素存在于不可溶的NPH樣結(jié)晶中，而50％Asp(B28)-人胰島素存在于溶液中。
實(shí)施例24Asp(B28)-人胰島素30/70混合物將76.5mg Asp(B28)-人胰島素溶解于含約0.32mL 0.2N HCl的水中，并加入約0.16mL 0.4mg/mL氯化鋅溶液，制備Asp(B28)-人胰島素溶液。加入硫酸魚(yú)精蛋白(相當(dāng)于約2.0mg魚(yú)精蛋白游離堿)水溶液，隨后加入溶解于水中的17.2mg間甲酚、15mg苯酚和160mg丙烯來(lái)源甘油的混合物。得到的溶液約pH2.7，用水稀釋到10mL，并平衡到約30℃。在該溶液中加入10mL含17.2mg間甲酚、15mg苯酚、25mg二水合磷酸氫二鈉和160mg丙烯來(lái)源的甘油、pH9的溶液，并平衡到約30℃。在約30℃2天后，完成結(jié)晶化，獲得懸浮液混合物，該混合物中約30％Asp(B28)-人胰島素存在于不可溶的NPH樣結(jié)晶中，而70％Asp(B28)-人胰島素存在于溶液中。
實(shí)施例25肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰島素溶液將胰島素類似物衍生物肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰島素(37mg)溶解于約5ml 0.01N HCl中，加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.17mg/ml鋅)，然后加入32mg間甲酚、1ml 70mM磷酸緩沖水溶液，然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油。將所述溶液調(diào)整到約pH7.9，并用水稀釋到約10ml總體積。每一mL該多肽組合物含有約3.7mg肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰島素、約16mg甘油、7mM磷酸鈉、約3.2mg間甲酚和約0.017mg鋅。
實(shí)施例26Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰島素溶液將胰島素類似物Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰島素(37mg)溶解于約5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.80mg/ml鋅)。加入芐醇(100mg)，然后加入188mg植物來(lái)源的甘油。將該溶液調(diào)整到約pH4.0，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.7mg Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰島素、約16mg甘油、約0.08mg鋅和10mg芐醇。
實(shí)施例27Gly(8)-GLP-1溶液將Gly(8)-GLP-1(10mg)溶解于約5.0ml 0.01N NaOH。然后加入間甲酚(20mg)，然后加入160mg根據(jù)本文所述MBTH測(cè)試測(cè)量活性醛含量為2ppm的動(dòng)物來(lái)源甘油。將該溶液調(diào)整到pH8.0，并用水稀釋到10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約1mg Gly(8)-GLP-1、約16mg甘油和2mg間甲酚。
實(shí)施例28人苗條蛋白溶液將重組人苗條蛋白(10mg)溶解于約5ml 0.01N NaOH。加入間甲酚(30mg)，隨后加入160mg植物來(lái)源甘油和1mL 70mM磷酸緩沖水溶液。將該溶液調(diào)整到pH8.0，并用水稀釋到10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約1mg人苗條蛋白、約16mg甘油、7mM磷酸鈉和3mg間甲酚。
實(shí)施例29人FSH溶液將重組人FSH(5mg)溶解于10mM磷酸鈉pH7.4溶液中。加入30mg間甲酚，然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油。用10mM磷酸鈉pH7.4溶液將該溶液稀釋到10mL總體積。每一mL該多肽組合物含0.5mgFSH、約10mM磷酸鈉、3mg間甲酚和16mg甘油。
實(shí)施例30Gly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰島素溶液將胰島素類似物Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰島素(36mg)溶解于約5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.30mg/ml鋅)。加入間甲酚，然后加入200mg 85％甘油-15％水溶液，其中所述甘油是丙烯來(lái)源。將該溶液調(diào)整到約pH4.0，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物水溶液含約3.6mgGly(A21)Arg(B21)Arg(B32)-人胰島素、約17mg丙烯來(lái)源甘油、約0.03mg鋅和2.7mg間甲酚。
實(shí)施例31Asp(B28)-人胰島素溶液將重組Asp(B28)-人胰島素(35mg)溶于約5ml 0.01N HCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.2mg/mL鋅)，然后加入17mg間甲酚和15mg苯酚。然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油，并加入1mL含5.8mg/ml氯化鈉(NaCl)的70mM磷酸緩沖水溶液。該溶液用1NNaOH調(diào)整到約pH7.4，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.5mg Asp(B28)-人胰島素、約16mg甘油、約7mM磷酸鹽、約1.7mg間甲酚、約1.5mg苯酚、約0.58mg NaCl和約0.02mg鋅。
實(shí)施例32Arg(34)，N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH溶液將Arg(34)，N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH(10mg)溶解于約5ml 0.01N NaOH。加入間甲酚(20mg)，然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油。將該溶液調(diào)整到pH8.0，并用水稀釋到10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約1mgArg(34)，N-ε-(γ-Glu(N-α-十六烷酰))-Lys(26)-GLP-1(7-37)OH、約16mg甘油和約2mg間甲酚。
實(shí)施例33Exendin-4組合物將Exendin-4(1mg)加入5ml含5mg/ml乙酸鈉的pH4.5溶液。加入間甲酚(27mg)，然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油。如果需要，將該溶液調(diào)整到pH4.5，并用水稀釋到10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約0.1mg exendin-4、約2.5mg乙酸鈉、約16mg甘油和約2.7mg間甲酚。
實(shí)施例34Lys(B3)Ile(B28)-人胰島素溶液將重組Lys(B3)Ile(B28)-人胰島素(35mg)溶于約5ml 0.01NHCl。加入1mL溶解于0.1N HCl中的氧化鋅溶液(0.2mg/mL鋅)，然后加入31.5mg間甲酚和1mL 70mM磷酸緩沖水溶液。然后加入160mg丙烯來(lái)源甘油。將該溶液用1N NaOH調(diào)整到約pH7.8，并用水稀釋到約10mL總體積。每一mL該多肽組合物含約3.5mgLys(B3)Ile(B28)-人胰島素、約16mg甘油、約7mM磷酸鈉、約3.15mg間甲酚和約0.02mg鋅。
已經(jīng)在上面的說(shuō)明書(shū)中描述了本發(fā)明的原理、優(yōu)選實(shí)施方案和操作模式。然而，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本文所要求保護(hù)的本發(fā)明限于所公開(kāi)的具體形式，因?yàn)樗_(kāi)的具體形式應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是說(shuō)明性的，而不是限制性的。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員可以作出變更和改變，而不偏離本發(fā)明的精神。
權(quán)利要求
1.一種包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物，其中所述甘油來(lái)自非動(dòng)物來(lái)源。
2.依照權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為溶液。
3.依照權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物為懸浮液。
4.依照權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的組合物，其中所述藥用組合物中的甘油濃度約1mg/mL到約300mg/mL。
5.依照權(quán)利要求4的組合物，其中所述甘油濃度約3mg/mL到約100mg/mL。
6.依照權(quán)利要求5的組合物，其中所述甘油濃度約10mg/mL到約30mg/mL。
7.依照權(quán)利要求6的組合物，其中所述甘油濃度約15mg/mL到約18mg/mL。
8.依照權(quán)利要求1到7中任一項(xiàng)的組合物，其中所述甘油來(lái)自植物來(lái)源或丙烯來(lái)源。
9.依照權(quán)利要求8的組合物，其中所述甘油來(lái)自丙烯來(lái)源。
10.依照權(quán)利要求1到9中任一項(xiàng)的組合物，其中所述多肽通過(guò)生物合成制得。
11.依照權(quán)利要求10的組合物，其中所述多肽在細(xì)菌或酵母中合成。
12.依照權(quán)利要求11的組合物，其中所述多肽在大腸桿菌(E.coli)中合成。
13.依照權(quán)利要求1到12中任一項(xiàng)的組合物，其中所述多肽是FSH或其類似物或衍生物、PTH或其片段或類似物、HGH或其類似物、人苗條蛋白或其類似物或衍生物、GLP-1或其類似物或衍生物、人胰島素或其類似物或衍生物、或人胰島素類似物的衍生物。
14.依照權(quán)利要求13的組合物，其中所述多肽是人胰島素或其類似物或衍生物、或人胰島素類似物的衍生物。
15.依照權(quán)利要求14的組合物，其中所述多肽是人胰島素。
16.依照權(quán)利要求14的組合物，其中所述多肽是人胰島素類似物。
17.依照權(quán)利要求16的組合物，其中所述類似物是Lys(B28)-Pro(B29)-人胰島素。
18.依照權(quán)利要求16的組合物，其中所述類似物是Asp(B28)-人胰島素。
19.依照權(quán)利要求16的組合物，其中所述類似物是Gly(A21)Arg(B31)Arg(B32)-人胰島素。
20.依照權(quán)利要求14的組合物，其中所述多肽是人胰島素衍生物或人胰島素類似物的衍生物。
21.依照權(quán)利要求20的組合物，其中所述人胰島素類似物的衍生物是肉豆蔻酰-ε-Lys(B29)-des(B30)-人胰島素。
22.依照權(quán)利要求20的組合物，其中所述人胰島素衍生物是棕櫚酰-ε-Lys(B29)-人胰島素。
23.依照權(quán)利要求1到22中任一項(xiàng)的組合物，其中所述甘油的活性醛含量低于33ppm。
24.依照權(quán)利要求23的組合物，其中所述甘油的活性醛含量低于24ppm。
25.依照權(quán)利要求24的組合物，其中所述甘油的活性醛含量低于15ppm。
26.依照權(quán)利要求25的組合物，其中所述甘油的活性醛含量低于8ppm。
27.依照權(quán)利要求26的組合物，其中所述甘油的活性醛含量為3ppm或3ppm以下。
28.一種包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物，其中所述甘油的活性醛含量低于8ppm。
29.依照權(quán)利要求28的組合物，其中所述甘油的活性醛含量為3ppm或3ppm以下。
30.依照權(quán)利要求28或29中任一項(xiàng)的組合物，其中所述甘油來(lái)自動(dòng)物來(lái)源。
31.非動(dòng)物來(lái)源甘油用作依照權(quán)利要求1到27中任一項(xiàng)的水性胃腸外藥用組合物中的甘油成分的應(yīng)用，所述甘油的應(yīng)用使所述組合物的化學(xué)穩(wěn)定性提高。
32.甘油在依照權(quán)利要求28到30中任一項(xiàng)的水性胃腸外藥用組合物中的應(yīng)用，所述甘油的應(yīng)用使所述組合物的化學(xué)穩(wěn)定性提高。
33.一種制備權(quán)利要求1到27中任一項(xiàng)的水性胃腸外藥用組合物的方法，所述方法包含將水、所述多肽和所述非動(dòng)物來(lái)源甘油組合在一起。
34.一種制備權(quán)利要求28到30中任一項(xiàng)的水性胃腸外藥用組合物的方法，所述方法包含將水、所述多肽和所述甘油組合在一起。
35.一種降低甘油中活性醛水平的方法，所述方法包括使甘油與固體干燥劑和包含游離氨基基團(tuán)的聚合物樹(shù)脂接觸。
36.依照權(quán)利要求35的方法，其中使所述甘油通過(guò)包含所述固體干燥劑和所述聚合物樹(shù)脂的固定化固體聚集體，從而實(shí)現(xiàn)所述接觸。
37.依照權(quán)利要求36的方法，其中所述固定化固體聚集體盛裝在圓柱體柱中。
38.依照權(quán)利要求35的方法，其中通過(guò)將所述固體干燥劑和所述聚合物樹(shù)脂加入所述甘油中形成懸浮液，從而實(shí)現(xiàn)所述接觸。
39.依照權(quán)利要求38的方法，所述方法還包含下列步驟a)加熱權(quán)利要求38的所述懸浮液到約40℃和約100℃之間；b)攪拌步驟(a)的所述加熱懸浮液約1分鐘到約100小時(shí)；c)將步驟(b)的懸浮液通過(guò)截留所述固體干燥劑和所述聚合物樹(shù)脂的濾膜；d)收集通過(guò)步驟(c)的濾膜的甘油。
40.依照權(quán)利要求35到39中任一項(xiàng)的方法，其中所述聚合物樹(shù)脂是包含游離氨基基團(tuán)的聚苯乙烯樹(shù)脂。
41.依照權(quán)利要求40的方法，其中所述聚苯乙烯樹(shù)脂選自Tris(2-氨基乙基)胺聚苯乙烯樹(shù)脂、TantaGel S NH2樹(shù)脂和氨基甲基聚苯乙烯樹(shù)脂。
42.依照權(quán)利要求41的方法，其中所述聚苯乙烯樹(shù)脂是氨基甲基聚苯乙烯樹(shù)脂。
43.依照權(quán)利要求35到42中任一項(xiàng)的方法，其中所述固體干燥劑是硫酸鎂或氯化鈣。
44.依照權(quán)利要求43的方法，其中所述固體干燥劑是硫酸鎂。
45.依照權(quán)利要求35到44中任一項(xiàng)的方法，其中所述甘油來(lái)自丙烯來(lái)源、植物來(lái)源或動(dòng)物來(lái)源。
46.依照權(quán)利要求45的方法，其中所述甘油來(lái)自丙烯來(lái)源或植物來(lái)源。
47.依照權(quán)利要求45的方法，其中所述甘油來(lái)自動(dòng)物來(lái)源。
48.一種制備水性胃腸外藥用組合物的方法，所述方法包括將水、多肽和甘油組合在一起，其中在將所述甘油用于制備所述組合物前，應(yīng)用依照權(quán)利要求35到47中任一項(xiàng)的方法降低所述甘油的活性醛含量。
全文摘要
本發(fā)明提供改善包含多肽和甘油的水性胃腸外藥用組合物化學(xué)穩(wěn)定性的方法。鑒定商品甘油中的活性醛，提供降低甘油中活性醛的方法。提供測(cè)定甘油中活性醛的簡(jiǎn)便方法，并且證實(shí)甘油中的活性醛水平與包含多肽和甘油的組合物的化學(xué)穩(wěn)定性呈密切的線性關(guān)系。本發(fā)明包括化學(xué)穩(wěn)定性提高(與以前的已知組合物相比)的包含多肽和甘油的組合物。
文檔編號(hào)C07C31/00GK1409640SQ00817025
公開(kāi)日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2000年12月5日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月16日
發(fā)明者M·R·德菲利皮斯, M·A·多賓斯, A·D·沙克納斯, A·M·普羅凱, J·V·J·里尼拉 申請(qǐng)人:伊萊利利公司