專利名稱：：多肽組合物及其在結(jié)核病抗體檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種多肽組合物，尤其涉及一種包含Mtb16.3特異表位抗原肽段的多肽組合物，更具體的是涉及一種應(yīng)用于結(jié)核抗體檢測(cè)的Mtbl6.3特異表位抗原肽段的的多肽組合物。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，結(jié)核病(Tuberculosis,TB)成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球有肺結(jié)核病人2，000萬(wàn)，新發(fā)病人1，000萬(wàn)，每年死亡人數(shù)300萬(wàn)，超過(guò)了其它傳染病的總和。肺結(jié)核(Pulmonarytuberculosis)顯示出全球性流行病的所有主要特征，并在全世界范圍內(nèi)蔓延。地球上大約有1/3的人感染結(jié)核桿菌，導(dǎo)致每年800萬(wàn)例活動(dòng)性肺結(jié)核和300萬(wàn)人死亡。結(jié)核桿菌多重藥耐藥株的出現(xiàn)以及合并HIV感染使得形勢(shì)變得更為嚴(yán)峻。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WorldHealthOrganization,WHO)的信息，如果不能有效控制，在未來(lái)十年中將有3，000萬(wàn)人死于結(jié)核病，還有9，000萬(wàn)活動(dòng)性結(jié)核新發(fā)病例，結(jié)核病正在成為成人的頭號(hào)殺手。結(jié)核如此強(qiáng)大的流行性和傳染性對(duì)公眾健康來(lái)說(shuō)是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，人們迫切需要解決這些問(wèn)題的方法，然而現(xiàn)存的一些對(duì)抗結(jié)核的策略是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，尤其在診斷方法中存在著較多問(wèn)題。目前結(jié)核病的診斷雖然有多種方法，但都存在這樣或那樣的問(wèn)題。影像學(xué)診斷雖然仍是主體，但是它需要其它輔助診斷方法；痰涂片簡(jiǎn)單易行，但陽(yáng)性率低；痰培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)，但周期太長(zhǎng)，不能滿足臨床上快速診斷的需要；PCR分子生物學(xué)法敏感性高、診斷速度快，但存在檢測(cè)不穩(wěn)定的缺陷；噬菌體裂解法可以檢測(cè)活結(jié)核桿菌，不能檢測(cè)非結(jié)核桿菌感染，更加適用于結(jié)核菌抗藥性實(shí)驗(yàn)研究；而血清學(xué)診斷技術(shù)有其固有的優(yōu)勢(shì)，如操作簡(jiǎn)便、快速、易判斷結(jié)果、穩(wěn)定性好、便于推廣、無(wú)需特殊精密儀器等。對(duì)于結(jié)核病檢測(cè)的血清學(xué)檢測(cè)，尋找高敏感性(Sensitivity)和高特異性(Speciality)的抗原成分，建立高特異性高敏感性的檢測(cè)方法是解決結(jié)核病早期快速準(zhǔn)確診斷的關(guān)鍵。目前人們對(duì)建立一種特異性和靈敏性都比較可靠的血清學(xué)結(jié)核病診斷方法投入了越來(lái)越多的關(guān)注。在結(jié)核病的診斷領(lǐng)域，雖然通常使用結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purifiedproteinderivative，PPD)用以判斷是否感染結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)，但是結(jié)核菌素試驗(yàn)的陰性結(jié)果并不能排除患有結(jié)核病的可能性(Postgrad.Med.1995，100，201-204)。此外，由于PPD所包含的抗原由于為致病性分支桿菌(Mycobacterium)、環(huán)境分支桿菌及卡介苗(Mycobacterium,bovisbacillusCalmette-Gu6rin，BCG)所共有，所以及時(shí)檢測(cè)的陽(yáng)性結(jié)果也不能明確區(qū)分BCG免疫、環(huán)境分支桿菌感染和致病性結(jié)核桿菌感染(Mol.Immuno.，2002，39，113-119)，從而不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確診斷的目的。商業(yè)化提供的PPD來(lái)源各異，沒(méi)有經(jīng)過(guò)精細(xì)制備，抗原組成也沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化，所以會(huì)產(chǎn)生一些皮試反應(yīng)(skintestresponse)(Karger，Basel,1996，201-211)。比較基因組學(xué)已經(jīng)揭示，有16種區(qū)域出現(xiàn)在致病性的臨床菌株結(jié)核分枝桿4菌和牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)中。這些區(qū)域被命名為RD1-RD16(regiondeleted,RD)的區(qū)域沒(méi)有出現(xiàn)在M.bovisBCG疫苗菌株中(Bacteriology1996,178，1274-1282;Mol.Microbiol.，1999，32，643-655)。這些區(qū)域編碼的蛋白包括早期分泌性抗原革巴蛋白(earlysecretoryantigentarget6kDa，ESAT—6)、MPT64(proteinofMycobacteriumtuberculosis)、培養(yǎng)濾液蛋白10(culturefiltrateproteinIO，CFPIO)、MPB83和KatG等等。有研究表明，將這些蛋白各自或組合使用能對(duì)模型動(dòng)物抵抗結(jié)核分枝桿菌的感染起到作用(Leukoc.Biol.，1995，57，221-225;Gen.Microbiol.，1987,133，1431-1435)。這些蛋白中，如ESAT-6、CFP10和MPT64等，正是目前診斷結(jié)核病領(lǐng)域研究得最多、最重要的抗原。此外，包括38kD抗原在內(nèi)都作為血清學(xué)檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核的標(biāo)志物。38kD抗原是一種脂蛋白和主要免疫原，是目前最為常用的結(jié)核病診斷抗原之一。38kD抗原是結(jié)核桿菌種特異性蛋白質(zhì)抗原且含量高出BCG10倍。當(dāng)用于結(jié)核血清學(xué)檢測(cè)時(shí)，該蛋白的敏感性和特異性優(yōu)于其它單一抗原。有研究證實(shí)，用38kD抗原檢測(cè)肺結(jié)核病人血清，靈敏度與特異性分別為65.6%和95.8%(J.Clin.Microbiol.，1997,35，553-557)。ESAT-6和CFP10具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性，在抗結(jié)核感染的免疫應(yīng)答中起重要作用，是兩種在結(jié)核病免疫診斷中很有應(yīng)用前景的抗原。根據(jù)基因開放閱讀框(openreadingframes,0RF)而設(shè)計(jì)的計(jì)算機(jī)程序預(yù)測(cè)了M.tuberculosis的RD1區(qū)能編碼14種長(zhǎng)度在99-666個(gè)氨基酸范圍的特殊蛋白。其中就包括由100個(gè)氨基酸構(gòu)成的CFP10(Rv3874)和由95個(gè)氨基酸構(gòu)成的ESAT-6(Rv3875)這兩個(gè)抗原(Mol.Immuno.，2002，39,113-119)。RD1區(qū)只存在于致病性結(jié)核桿菌基因組中，所有BCG菌株基因組中均沒(méi)有該區(qū)域(J.Bacteriol.，1996，178，1274-1282)。通過(guò)對(duì)抗原PPD-M，PPD-A，ESAT-6,Ag85，38kD，MPB64，MPB70，MPB83，hspl6.1，hsp65，andhsp70的T細(xì)胞反應(yīng)全面而綜合的研究發(fā)現(xiàn)，ESAT-6是結(jié)核分子桿菌感染早期的主要抗原(Infect.Immun.，2000，68，2573-2578)。RD1是第一個(gè)未在BCG巴斯德菌株衍生的BCG亞菌株中發(fā)現(xiàn)的區(qū)域，由該區(qū)編碼的ESAT-6蛋白在人體結(jié)核分枝桿菌免疫反應(yīng)中具有驚人的免疫優(yōu)勢(shì)(Nature1997，389，133-134)。ESAT-6和CFP10對(duì)y干擾素(interferongamma，IFN-y)都表現(xiàn)出很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。相比較而言，CFP10的誘導(dǎo)作用顯得較弱一些，但是當(dāng)其與ESAT-6相組合后能使反應(yīng)能力得到改善。ESAT-6和CFP10可形成異二聚體結(jié)構(gòu)，聯(lián)合應(yīng)用ESAT-6和CFP10診斷結(jié)核病發(fā)現(xiàn)混合抗原敏感性較單抗原增加，而不降低其特異性(Clin.Diagn.Lab.Immunol.，2000,7，155-160)。所以，ESAT-6和CFP10有望成為診斷動(dòng)物和人致病性結(jié)核桿菌感染的特異性抗原。38kD和MPT64不僅作為診斷抗原，也是組成疫苗的一部分。MPT64是一種分泌型結(jié)核桿菌抗原，也是一種對(duì)肺外結(jié)核(Extra-pulmonarytuberculosis,EPTB)具有特異性和靈敏度的診斷抗原(DiagnosticPathology2007,2，36-34)。MPT64是結(jié)核桿菌生長(zhǎng)最早分泌的主要蛋白，由未在BCG巴斯德菌株中發(fā)現(xiàn)的RD2區(qū)域編碼。該抗原可以從結(jié)核分枝桿菌免疫過(guò)的豚鼠體內(nèi)分離得到(Infect.Imm皿.2002，70,672-678;InfectImmun.2000，68，214-220)。ESAT-6和MPT64都由結(jié)核分枝桿菌基因編碼，而在BCG疫苗中則未曾發(fā)現(xiàn)。天然的MPT64和重組的MPT64均可使結(jié)核病人或結(jié)核菌素陽(yáng)性者產(chǎn)生T細(xì)胞反應(yīng)和皮膚延遲型超敏反應(yīng)(delayed-typehypersensitivity,DTH)。但由于MPT64只存在于結(jié)核桿菌復(fù)合群中，大多數(shù)BCG菌株缺乏MPT64基因，BCG接種者或環(huán)境分支桿菌感染者(如鳥分支桿菌)對(duì)MPT64皮膚試驗(yàn)不反應(yīng)。有研究結(jié)果表明，雖然以MPT64蛋白作為抗原檢測(cè)抗結(jié)核抗體的陽(yáng)性率在各種結(jié)核桿菌分泌性蛋白中是較低的，但如果與其它蛋白形成融合蛋白則有可能具有較好的穩(wěn)定性(Clin.Diagn.Lab.Immunol.，2000，7，155-160)，因此MPT64蛋白有希望成為結(jié)核病血清學(xué)診斷的組合抗原的候選者之研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于個(gè)體因結(jié)核病引起的免疫反應(yīng)具有復(fù)雜性，以及主要組織相容性復(fù)合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)所導(dǎo)致的遺傳局限，所以一種有效的亞基疫苗或診斷試劑有必要包含多種抗原表位，以保證其能適用于遺傳上表現(xiàn)各異的人群(Infect.Immun.1999,67，1702-1707;Eur.Respir.J.2001，17,537-557)。Tavares等人對(duì)38kD/CFP10、38kD/MPT64、ESAT_6/MPT64、ESAT-6/CFP10四種融合蛋白抗原用于結(jié)核病感染的診斷的研究表明，38kD/CFP10和ESAT-6/CFP10的檢測(cè)靈敏度基本一致，但結(jié)核菌素皮i式(tuberculinskintest,TST)呈陽(yáng)性的患者有更高的反應(yīng)選擇性(Microbiol.Immunol.，2007，51，289-296)。和經(jīng)過(guò)本發(fā)明的工作，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了Mtbl6.3特異表位抗原肽段在檢測(cè)結(jié)核病方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其與選自38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一種特異表位抗原肽段相組合可以使結(jié)核病的檢測(cè)敏感性和特異性均提高。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，與單一的MPT64相比，ESAT-6/MPT64融合蛋白表現(xiàn)出更強(qiáng)的人體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)中的結(jié)核病模型小鼠具有一定的保護(hù)作用。研究者認(rèn)為這一結(jié)果表明ESAT-6/MPT64融合蛋白是一種潛在的疫苗(ProteinExpr.Purif.，2008，59，189-196)。Mtb8.4(Rvll74c)、Mtb8(Rv0379)和Mtbl6.3(Rv2185c)廣泛雖然存在于結(jié)核桿菌(包括BCG)中，其在結(jié)核病診斷方面的意義仍然不清楚。Mtb8.4是最近從結(jié)核桿菌培養(yǎng)物濾液中純化分離得到的一種的低分子量蛋白抗原，Coler等學(xué)者(JImmunol.，1998,161，2356-2364)的研究更進(jìn)一步揭示Mtb8.4是患有潛伏結(jié)核桿菌感染的個(gè)體中重要的免疫活性T細(xì)胞抗原，在確定致病性結(jié)核桿菌感染中具有重要作用。Mtb8可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，僅在Houghton等(Clin.Diagno.Lab.Immun.，2002，9，883-891)的研究中將Mtb8與其它幾種抗原(Mtbll、Mtb48、38kD等)組成融合抗原用于檢測(cè)結(jié)核病，表明Mtb8與其它幾種抗原一起有可能增強(qiáng)38kD抗原的反應(yīng)活性。Mtbl6.3是一種未知功能蛋白質(zhì)，有研究表明Mtbl6.3與Mtb9.7組合有助于提高對(duì)與HIV共感染的結(jié)核病患者的檢出率。雖然學(xué)者們?cè)谘鍖W(xué)檢測(cè)結(jié)核病的領(lǐng)域中進(jìn)行了大量的研究，目前尚沒(méi)有找到靈敏度和特異性均令人滿意的單一抗原、融合抗原或其組合抗原。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種多肽組合物，該多肽組合物由Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原相組合。Mtbl6.3能與其它幾種多肽在檢測(cè)結(jié)合抗體方面相互補(bǔ)，從而提高血清學(xué)檢測(cè)結(jié)核病的靈敏度和特異性。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種多肽組合物，該多肽組合物是Mtb16.3與38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原形成融合蛋白的混合。在檢測(cè)結(jié)核抗體方面，Mtbl6.3不僅能與其它幾種單獨(dú)抗原相互補(bǔ)，而且還能與多種抗原相互補(bǔ)，從而進(jìn)一步提高血清學(xué)檢測(cè)結(jié)核病的靈敏度和特異性。本發(fā)明的又一個(gè)目的在于提供一種多肽組合物，由Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等抗原相組合或構(gòu)成融合抗原再混合組成。其用于檢測(cè)應(yīng)答結(jié)核菌抗原而產(chǎn)生的抗體，以及在結(jié)核病抗體檢測(cè)中的應(yīng)用?？乖璏tbl6.3、38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8或Mtb8.4，還包括使用蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件，如BIOSUN(北京基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所計(jì)算生物學(xué)中心)，然后選取抗原中具有一個(gè)或多個(gè)表位、尤其是優(yōu)勢(shì)表位(能夠激發(fā)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)的表位)的相應(yīng)肽段；通過(guò)常規(guī)的分子生物學(xué)方法釣取其編碼序列并表達(dá)出該抗原多肽。通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得Mtbl6.3特異表位抗原的氨基酸序列為SEQIDNol，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo10。通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得38kD特異表位抗原的氨基酸序列為SEQIDNo2，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo11。通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得ESAT-6特異表位抗原的氨基酸序列為SEQIDNo3，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo12。通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得CFP10特異表位抗原的氨基酸序列為SEQIDNo4，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo13。通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得MPT64特異表位抗原的氨基酸序列為SEQIDNo5，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo14。通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得Mtb8特異表位抗原的氨基酸序列為SEQIDNo6，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo15。通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得Mtb8.4特異表位抗原的氨基酸序列為SEQIDNo7，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo16。根據(jù)計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)而選擇的Mtbl6.3、38kD、ESAT_6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4特異表位抗原肽段進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎椚匀痪哂袡z測(cè)效果。例如對(duì)其中個(gè)別氨基酸進(jìn)行保守替換、增加或缺失，個(gè)別氨基酸指少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個(gè)氨基酸。保守氨基酸替換的具體方式為Ala、Val、Leu和lie間的互相替換;Ser和Thr間的互相替換；酸性殘基Asp和Glu間的互相替換；Asn和Gin間的互相替換；和堿性殘基Lys和Arg間的互相替換；或者芳香族殘基Phe和Tyr間的互相替換。這些互相替換的氨基酸具有相同/相近似的生物化學(xué)性質(zhì)，如親水性、電荷性、等電點(diǎn)等(《生物化學(xué)》，北京高等教育出版社，1990)，應(yīng)當(dāng)視為等同替換。個(gè)別氨基酸進(jìn)行保守替換、增加或缺失的抗原，其空間折疊結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生改變，抗原表位也不發(fā)生改變。ESAT-6特異表位抗原肽段(SEQIDNo3)5位和34位Asp可以單獨(dú)或同時(shí)替換為Glu;6位、24位和39位Glu可以單獨(dú)、任意兩個(gè)或同時(shí)替換為Asp;26位Tyr可以替換為Phe;2位、10位和21位Ser可以單獨(dú)、任意兩個(gè)或同時(shí)替換為Thr;8位、13位和32位Lys可以單獨(dú)、任意兩個(gè)或同時(shí)替換為Arg;9位、27位、30位和31位Gin可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)或同時(shí)替換為Asn;3位、4位、11位、14位和40位Leu可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)、任意四個(gè)或同時(shí)替換為lie或Ala或Val;15_17位、25位、35位和37位Ala可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)、任意四個(gè)、任意五個(gè)或同時(shí)替換為Ile或Leu或Val。這些替換類型可以單獨(dú)進(jìn)行，也可以以任意替換類型的組合進(jìn)行。CFP10特異表位抗原肽段(SEQIDNo4)11位和28位Asp可以單獨(dú)或同時(shí)替換為Glu;1位、9位、12位、29位和30位Glu可以單獨(dú)、、任意兩個(gè)、任意三個(gè)、任意四個(gè)或同時(shí)替換為Asp;24位Tyr可以替換為Phe;14位、25位、36位和37位Ser可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)或同時(shí)替換為Thr;5位和7位Lys可以單獨(dú)或同時(shí)替換為Arg;18位和26位Arg可以單獨(dú)或同時(shí)替換為L(zhǎng)ys;9位、6位、8位、19位、23位和31-33位Gin可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)、任意四個(gè)、任意五個(gè)、任意六個(gè)或同時(shí)替換為Asn;10位和35位Leu可以單獨(dú)或同時(shí)替換為lie或Ala或Val;20位、27位和34位Ala可以單獨(dú)、任意兩個(gè)或同時(shí)替換為Ile或Leu或Val。這些替換類型可以單獨(dú)進(jìn)行，也可以以任意替換類型的組合進(jìn)行。Mtb8特異表位抗原肽段(SEQIDNo6)19位、22位和23位Asp可以單獨(dú)、任意兩個(gè)或同時(shí)替換為Glu;17位和22位Glu可以單獨(dú)或同時(shí)替換為Asp;5位和20位Ser可以單獨(dú)或同時(shí)替換為Thr;16位、18位、26位和28位Arg可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)或同時(shí)替換為L(zhǎng)ys;8位和15位Gin可以單獨(dú)或同時(shí)替換為Asn;14位、21位、26位、和29位Val可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)或同時(shí)替換為lie或Ala或Leu;9-10位、11位、13位、17位和27位Ala可以單獨(dú)、任意兩個(gè)、任意三個(gè)、任意四個(gè)、任意五個(gè)或同時(shí)替換為Ile或Leu或Val。這些替換類型可以單獨(dú)進(jìn)行，也可以以任意替換類型的組合進(jìn)行。這些經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測(cè)并確定的源自于生物自身抗原(母抗原)的特異表位抗原可以替代其相應(yīng)的母抗原與其它抗原相組合，或以替代母抗原的形式各自互相組合?？乖M合指Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原各自獨(dú)立地相互混合或形成融合蛋白抗原。Mtbl6.3抗原與38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原之一相組合，或與38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原任意幾種相組合。具體的，Mtbl6.3抗原分別與38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原任意摩爾比比例相混合；Mtbl6.3抗原與38kD和ESAT-6任意摩爾比比例相混合；Mtbl6.3抗原與38kD和MPT64任意摩爾比比例相混合；Mtbl6.3抗原與38kD、ESAT-6和CFP10任意摩爾比比例相混合；Mtbl6.3抗原與38kD、ESAT-6、MPT64和CFP10任意摩爾比比例相混合。具體的，Mtbl6.3抗原分別與38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原以任意摩爾比比例構(gòu)成融合蛋白；Mtbl6.3抗原與38kD和ESAT-6以任意摩爾比比例相融合；Mtbl6.3抗原與38kD和MPT64以任意摩爾比比例相融合；Mtbl6.3抗原與38kD、ESAT-6和CFP10以任意摩爾比比例相融合；Mtbl6.3抗原與38kD、ESAT-6、MPT64和CFP10以任意摩爾比比例相融合。進(jìn)一步的，Mtbl6.3抗原與Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所構(gòu)成融合蛋白從N末端至C末端的順序依次為Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8。這些融合蛋白包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合蛋白。連接各抗原之間的多肽氨基酸序列優(yōu)先選擇SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。本發(fā)明所述的融合蛋白的混合為Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原中一種或幾種形成融合抗原再與Mtbl6.3、38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意兩種以上抗原形成的融合抗原以任意摩爾比比例相混合。所述的融合抗原包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合抗原。這種組合可以選擇性地為Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4抗原中一種或幾種形成融合抗原再與38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意兩種以上抗原形成的融合抗原以任意摩爾比比例相混合。具體的，Mtbl6.3抗原與Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原融合后，與38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原以任意摩爾比比例相混合。進(jìn)一步的，Mtbl6.3抗原與Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所構(gòu)成融合蛋白從N末端至C末端的順序依次為Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3_Mtb8;38kD、ESAT-6和CFPIO融合抗原從N末端至C末端的順序依次為38kD-ESAT-6_CFP10。這些融合抗原包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合抗原。融合蛋白抗原可以通過(guò)基因工程方式制得，即通過(guò)目標(biāo)融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)/轉(zhuǎn)化至基因工程菌株，如大腸桿菌(E.coli)、酵母菌(Saccharomycescerevisiae)中表達(dá)并純化，或在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、小倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞、小鼠NSO胸腺瘤細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)并純化后，得到將其中一種抗原C末端，經(jīng)由酰胺鍵(amidebond)和另一種抗原N末端首尾相連的融合蛋白產(chǎn)物(ProteinE鄧r.Purif.，2008,59，189-196)?；蚬こ谭椒ㄖ苽涞鞍踪|(zhì)抗原的克隆、表達(dá)以及純化可通過(guò)多種方法進(jìn)行。具體方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002，第1217-1270頁(yè)。適宜的原核表達(dá)載體如pEGX系列原核表達(dá)載體(AmershamPharmacia)、pET系列原核表達(dá)載體(Novagen)等。特別優(yōu)選pGEX_4T_2載體?？乖€可以通過(guò)化學(xué)合成的方式完成?；瘜W(xué)合成采用Fmoc方法，通過(guò)固相合成技術(shù)合成。該方法的具體步驟參見Eur.J.Immunol.1994，24，3188-3193;J.Org.Chem.1972，37,3404-3409;黃惟德，陳常慶多肽合成，北京科學(xué)出版社，1985。對(duì)于不同肽段融合的抗原，本領(lǐng)域眾所周知其構(gòu)建原則和方法。具體而言，為了不影響待融合肽段的各自的功能需要在不同肽段之間添加一個(gè)接頭。關(guān)于接頭的選擇具體可參見ProteinEng.，2001，14，529-532。具體的，選擇多肽或蛋白質(zhì)將各抗原之間相連接形成融合蛋白，所述多肽或蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度為1-100個(gè)氨基酸，通常選擇長(zhǎng)度為4-30個(gè)氨基酸的多肽，優(yōu)先選擇長(zhǎng)度為4-15個(gè)氨基酸的多肽。組成這些多肽和蛋白質(zhì)的氨基酸指具有既共價(jià)連接氨基又共價(jià)連接羧基的不對(duì)稱中心碳原子的有機(jī)分子?！N具體的融合方式為，通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得38kD-ESAT-6-CFP10抗原的單元結(jié)構(gòu)氨基酸序列為SEQIDNo8，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo17。連接各抗原的多肽的氨基酸長(zhǎng)度為IO，序列為SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。另一種具體的融合方式為，通過(guò)蛋白質(zhì)表位預(yù)測(cè)軟件所得Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3-Mtb8抗原的單元結(jié)構(gòu)氨基酸序列為SEQIDNo9，其相應(yīng)的DNA編碼序列為SEQIDNo18。連接各抗原的多肽的氨基酸長(zhǎng)度為10，序列為SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。多種抗原的連接還可以采用連接子(spacelinker)，以化學(xué)連接的方式進(jìn)行。這種連接子選自于氨基酸長(zhǎng)度1-500的多肽或蛋白質(zhì)、有機(jī)高分子聚合物(Polymer)，分子量在100-2，OOODa的有機(jī)小分子。如使用兩端活化的分子量為2，000-50，OOODa聚乙二醇(NOFCorporation)、兩端活化的C1-C30的脂肪酸(J.Gene.Med.，2005，7，604-612)。化學(xué)連接可以是抗原C末端與另一抗原N末端首尾順序連接，也可以由連接子將組成抗原的某一個(gè)氨基酸側(cè)鏈與另一抗原相連接。連接子與抗原之間形成酰胺鍵(amidebond)或尿鍵(urinebond)。高分子聚合物是指具有分子量大于2，OOODa的化合物，分子間由結(jié)構(gòu)單位(structuralunit)、或單體經(jīng)由共價(jià)鍵相互連接在一起。所述聚合物具體選自于聚乙二醇、聚氨基酸、聚核苷酸、聚乳酸、聚賴氨酸、聚亞胺和10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵形成的多聚糖(polysaccharide)，如淀粉及其水解產(chǎn)物、纖維素、甲殼素或葡聚糖。有機(jī)小分子具體選自于各類氨基酸、各類單糖、各類維生素(Vitamin)、由兩個(gè)單糖單元通過(guò)糖苷鍵形成的二糖(disaccharide)(如蔗糖、乳糖或麥芽糖)、由2_10單糖通過(guò)糖苷鍵形成的寡聚糖(oligosaccharide)(如低聚異麥芽糖、低聚木糖或低聚半乳糖)和分子量在20-2000Da的聚合物?？乖M合或融合抗原還包括在其氨基酸序列骨架上進(jìn)行化學(xué)修飾或生物修飾后所得的產(chǎn)物。所述的修飾包括聚乙二醇化(PEGylation)(Adv.Drugdeliv.Rev.，28，275-299;Adv.Drugdeliv.Rev.，54，453-609;Adv.Drugdeliv.Rev.，60，1-88)、酰基化(Acylation)(J.Pharma.Sci.，86,768-773;J.Pharma.Sci.，86，1365-1368)、糖基化(Glycosylation)(J.Pharma.Sci.87，326-332;Adv.Drugdeliv.Rev.，6，103-131;Adv.Drugdeliv.Rev.，13,251-267)和有機(jī)小分子修飾等。聚乙二醇化修飾所用的聚乙二醇為一端封閉的聚乙二醇，封閉基團(tuán)可以為C1-C30的烷基，C1-C30的脂肪酸或糖基。聚乙二醇為分子量2，000-100，OOODa，可以選擇2，000-50，000Da，一般選擇5，000-50，000Da。烷基與聚乙二醇一端通常形成醚鍵，也可以以酯鍵相連接。鏈長(zhǎng)可以選擇C1-C10的烷基，優(yōu)先選擇甲基、乙基或丙基。脂肪酸與聚乙二醇一端通常形成酯鍵，脂肪酸鏈長(zhǎng)一般選擇C1-C18的脂肪酸，優(yōu)先選擇鏈長(zhǎng)為C10、C12、C16和C18的脂肪酸。酰基化使用C1-C30的脂肪酸，進(jìn)一步選擇C1-C18的脂肪酸。有機(jī)小分子指具有C、H、0或C、H、0、N、P、S等幾種元素組成的分子量小于2，OOODa的有機(jī)小分子。具體地指各類氨基酸、各類單糖或多糖、各類維生素(Vitamin)、生物素和分子量在20-2000Da的聚合物，如聚乙二醇、多肽、寡聚糖和多聚糖(葡聚糖、淀粉和甲殼素等)和核苷等。抗原Mtbl6.3與抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意一種的混合比例范圍為ioo:ii:ioo，摩爾比。所述混合比例范圍具體選自于50:ii:50、30:ii:30、20:ii:20、io:ii:io、5:ii:5、3:ii:3、2:ii:2或i:i?？乖璏tbl6.3與抗原38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意幾種(二種、三種、四種、五種、六種)混合，其占總抗原的摩爾比比值范圍為0.01-0.99?？梢赃x擇摩爾比比值范圍為0.05-0.95、0.10-0.90、0.20-0.80、0.30-0.70、0.35-0.65、0.40-0.60、0.45-0.55、0.60-0.40、0.70-0.30、0.80-0.20或0.90-0.10。摩爾比比值具體選自于O.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90?？乖璏tbl6.3與抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意一種的融合的比例為ioo:ii:ioo，摩爾比?？梢赃x擇混合比例為50:ii:50、30:ii:30、20:ii:20、io:ii:io、5:ii:5、3:ii:3、2:ii:2或i:i。融合抗原包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合抗原?？乖璏tbl6.3與抗原38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意幾種(二種、三種、四種、五種、六種)融合，其占總抗原的摩爾比比值范圍為0.01-0.99。可以選擇摩爾比比值范圍為0.05-0.95、0.10-0.90、0.20-0.80、0.30-0.70、0.35-0.65、0.40-0.60、0.45-0.55、0.60-0.40、0.70-0.30、0.80-0.20或0.90-0.10。具體選擇摩爾比比值為O.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。融合抗原包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合抗原。—種具體的融合方式為，Mtb16.3與抗原MPT64或Mtb8或Mtb8.4單獨(dú)融合，各種抗原可以為其氨基酸序列的單拷貝，也可以為其氨基酸序列的多拷貝。Mtb16.3占總抗原的摩爾比比值為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80。另一種具體的融合方式為，Mtbl6.3與抗原MPT64和Mtb8融合，各種抗原可以為其氨基酸序列的單拷貝，也可以為其氨基酸序列的多拷貝，通式分別表示為[Mtbl6.3]m、[MPT64L和[Mtb8]p，n、m或p為^1且《100的正整數(shù)，取值各自獨(dú)立。Mtbl6.3占總抗原的摩爾比比值為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80。當(dāng)m、n或p同時(shí)取值為1時(shí)，其單元結(jié)構(gòu)融合順序選自于Mtbl6.3_MPT64_Mtb8、Mtbl6.3-Mtb8-MPT64、Mtb8-Mtb16.3-MPT64、Mtb8-MPT64-Mtb16.3、MPT64_Mtb8_Mtbl6.3或MPT64-Mtb16.3-Mtb8。又一種具體的融合方式為，Mtbl6.3與抗原MPT64、Mtb8和Mtb8.4融合，各種抗原可以為其氨基酸序列的單拷貝，也可以為其氨基酸序列的多拷貝，通式分另U表示為[Mtbl6.3]m、[MPT64]n、[Mtb8]p禾P[Mtb8.4]q，m、n、p或q為>l且《100的正整數(shù)，取值各自獨(dú)立。Mtbl6.3占總抗原的摩爾比比值為0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75或0.80。當(dāng)m、n、p或q同時(shí)取值為l時(shí)，其單元結(jié)構(gòu)融合順序選自于Mtbl6.3-MPT64-Mtb8-Mtb8.4、Mtbl6.3-Mtb8-MPT64-Mtb8.4、Mtb8-Mtb16.3-MPT64-Mtb8.4、Mtb8-Mtb8.4-Mtbl6.3_MPT64、MPT64-Mtb8.4-Mtbl6.3-Mtb8、MPT64-Mtb16.3_Mtb8_Mtb8.4或Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8。Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原中一種或幾種形成的融合抗原再與Mtbl6.3、38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意兩種以上抗原形成的融合抗原相混合。融合抗原之間的混合比例為ioo:ii:100，摩爾比?？梢赃x擇混合比例為50:ii:50、30:ii:30、20:ii:20、10:ii:10、5:ii:5、3:ii:3、2:ii:2或1:i，摩爾比。Mtb16.3抗原與Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原相融合，其占總抗原的摩爾比比值為0.01-0.99?？梢赃x擇摩爾比比值為0.05-0.95、0.10-0.90、0.20-0.80、0.30-0.70、0.35-0.65、0.40-0.60、0.45-0.55、0.60-0.40、0.70-0.30、0.80-0.20或0.90-0.10。具體選擇摩爾比比值為0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。融合抗原包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合抗原。38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原相組合，摩爾比為1:1:1?！N具體的實(shí)施方式為，Mtbl6.3抗原與Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所構(gòu)成融合蛋白從N末端至C末端的順序依次為Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8;38kD、ESAT-6和CFP10融合抗原從N末端至C末端的順序依次為38kD-ESAT-6-CFP10。這些融合抗原包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合抗原，通式分別為[Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3_Mtb8]x和[38kD-ESAT-6-CFP10]y，x或y為>1且《1000的正整數(shù)，取值各自獨(dú)立。兩種抗原單元結(jié)構(gòu)Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3-Mtb8與38kD-ESAT-6-CFP10的混合比例為1:3、1:2、1:1、2:1或3:1。另一種具體的實(shí)施方式為，各種抗原以其各自氨基酸序列的多拷貝方式融合，通式分別表示為[Mtbl6.3]m、[MPT64]n、[Mtb8]。和[Mtb8.4]q，m、n、p或q為>1且《100的正整數(shù)，取值各自獨(dú)立。Mtbl6.3抗原與Mtb8.4、Mtb8和MPT64抗原所構(gòu)成融合蛋白從N末端至C末端的順序依次為[Mtb8.4]q-[MPT64]n-[Mtbl6.3]m-[Mtb8]p;38kD、ESAT-6和CFPIO融合抗原從N末端至C末端的順序依次為38kD-ESAT-6-CFP10，通式分別表示為[38kD]u、[ESAT-6L和[CFP10L，u、v或w為^l且《100的正整數(shù)，取值各自獨(dú)立。這些融合抗原包括含有相同組成的單元結(jié)構(gòu)的多拷貝融合抗原，通式分別為[Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3_Mtb8]x和[38kD-ESAT-6-CFP10]y，x或y為>1且《1000的正整數(shù)，取值各自獨(dú)立。兩種抗原單元結(jié)構(gòu)Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8與38kD-ESAT-6-CFP10的混合比例為1:3、1:2、i:i、2:i或3:i。由Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等抗原相組合或構(gòu)成融合抗原再混合方式得到的多肽組合物用于檢測(cè)應(yīng)答結(jié)核菌抗原而產(chǎn)生的抗體。具體而言，該組合在結(jié)核病抗體檢測(cè)中的應(yīng)用。檢測(cè)方法可以有多種，例如間接酶聯(lián)免疫測(cè)定技術(shù)、雙抗原夾心酶免疫測(cè)定技術(shù)、金標(biāo)快速檢測(cè)技術(shù)、免疫滲濾檢測(cè)技術(shù)、蛋白芯片檢測(cè)技術(shù)等。具體選擇間接酶聯(lián)免疫測(cè)定，即間接ELISA方法。間接ELISA方法基本原理是多肽(抗原)包被在酶標(biāo)板表面，將稀釋后的待檢血清/血漿和對(duì)照物加入反應(yīng)板孔中，如果被檢血清/血漿中存在抗體，經(jīng)溫育后，則血清/血漿中特異性抗體與反應(yīng)板孔中的抗原多肽結(jié)合，形成固相抗原_抗體復(fù)合物，洗去未結(jié)合的血清/血漿中其它成分，加入酶標(biāo)記的抗人IgG抗體，溫育，固相抗原(多肽)結(jié)合的抗體再與酶標(biāo)記的抗人IgG抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)記抗體成分，加入酶底物，并被催化成為有色產(chǎn)物，最后加入終止液終止反應(yīng)。根據(jù)對(duì)照物，可對(duì)抗體進(jìn)行定量或定性測(cè)定。其具體方法可以參見Infect.Immun.1998，66，3936-3940和ProteinExpr.Purif.，2008，59，189-196。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的有益效果Mtbl6.3抗原在檢測(cè)結(jié)核桿菌中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Mtbl6.3抗原與38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等四種抗原在血清學(xué)檢測(cè)方面具有良好的互補(bǔ)性。Mtbl6.3抗原與選擇38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一種抗原的組合能顯著提高結(jié)核病診斷的靈敏度。Mtbl6.3特異表位抗原肽段(SEQIDNo1)在檢測(cè)結(jié)核桿菌中具有更獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)四種特異表位抗原，即38kD(SEQIDNo2)、ESAT-6(SEQIDNo3)、CFP10(SEQIDNo4)和MPT64(SEQIDNo5)，全部反應(yīng)性為陰性時(shí)，Mtb16.3抗原肽段則對(duì)該血清的反應(yīng)性呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性(BP19)。由此可見，Mtbl6.3特異表位抗原肽段與38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等四種特異表位抗原肽段在血清學(xué)檢測(cè)方面具有良好的互補(bǔ)性。Mtbl6.3特異表位抗原肽段與選擇38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一種特異表位抗原肽段的組合能顯著提高結(jié)核病診斷的靈敏度。間接ELISA方法進(jìn)行檢領(lǐng)lj，組合應(yīng)用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3_Mtb8融合抗原或其各自相應(yīng)的特異表位多肽融合抗原對(duì)結(jié)核病的檢測(cè)靈敏度和特異性分別為95%和100%，表現(xiàn)出更佳的檢測(cè)效果。圖1表示結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)38kD的表位分析；圖2表示結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)ESAT-6的表位分析；圖3表示結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)CFP10的表位分析；圖4表示結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)MPT64的表位分析；圖5表示結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)Mtb8的表位分析；圖6表示結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)Mtb8.4的表位分析；圖7表示結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)Mtb16.3的表位分析。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，本發(fā)明所述的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未明確指明，則均購(gòu)自西格瑪_奧德里奇(Sigma-Aldrich)。實(shí)施例17種結(jié)核桿菌特異表位抗原肽段的確定利用BIOSUN生物學(xué)分析軟件分別分析了7種結(jié)核桿菌抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3的表位分布情況，首先輸入其氨基酸序列，然后尋找B細(xì)胞表位，所得表位分布圖示于圖1-7。根據(jù)表位分布圖，最終確定特異表位抗原肽段。其中結(jié)核桿菌抗原38kD的特異表位抗原肽段的氨基酸序列和編碼DNA序列分別為SEQIDNO2和SEQIDNO11;結(jié)核桿菌抗原ESAT-6的特異表位抗原肽段的氨基酸序列和編碼DNA序列分別為SEQIDNO3和SEQIDNO12;結(jié)核桿菌抗原CFP10的特異表位抗原肽段的氨基酸序列和編碼DNA序列分別為SEQIDNO4和SEQIDNO13;結(jié)核桿菌抗原MPT64的特異表位抗原肽段的氨基酸序列和編碼DNA序列分別為SEQIDNO5和SEQIDN014;結(jié)核桿菌抗原Mtb8的特異表位抗原肽段的氨基酸序列和編碼DNA序列分別為SEQIDNO6和SEQIDNO15;結(jié)核桿菌抗原Mtb8.4的特異表位抗原肽段的氨基酸序列和編碼DNA序列分別為SEQIDNO7和SEQIDNO16;結(jié)核桿菌抗原Mtbl6.3的特異表位抗原肽段的氨基酸序列和編碼DNA序列分別為SEQIDNO1和SEQIDNO10。實(shí)施例2單獨(dú)的7種結(jié)核桿菌特異表位抗原肽段的制備1、特異表位抗原肽段基因的克隆根據(jù)特異表位抗原肽段的核苷酸序列設(shè)計(jì)并合成了上下游引物，所使用的限制性內(nèi)切酶分別為BamHI和XhoI。用于擴(kuò)增特異表位抗原肽段38kD的引物序列如下38kD-F:5'-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA—3，38kD-R:5'-GCTCGAGGCTGGAAATCGTCGCGA-3'用于擴(kuò)增特異表位抗原肽段ESAT6的引物序列如下ESAT6-F:5'-GGGATCCCATTCCCTCCTTGACGA—3，ESAT6-R:5'-GCTCGAGGTTCAGCTCGGTAGCCGT-3'用于擴(kuò)增特異表位抗原肽段CFP10的引物序列如下CFP10-F:5'-CGGATCCGAAGCAGCCAATAAGCAG-3'CFP10-R:5'-GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG—3'用于擴(kuò)增特異表位抗原肽段MPT64的引物序列如下MPT64-F:5'-GGGATCCCCCAAGACCTACTGCGA-3'MPT64-R:5'-GCTCGAGCGGCGCTATCGATACCT-3'用于擴(kuò)增特異表位抗原肽段Mtb8的引物序列如下Mtb8-F:5'-GGGATCCACCAGCCCCACATCCT-3'Mtb8-R:5'-GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA—3'用于擴(kuò)增特異表位抗原肽段Mtb8.4的引物序列如下Mtb8.4-F:5'-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA-3'Mtb8.4-R:5'GCTCGAGTTGCGCGGCCATGGCA-3'用于擴(kuò)增特異表位抗原肽段Mtb16.3的引物序列如下Mtb16.3-F:5'-GGGATCCCGGACAAGACGACACAGA-3'Mtb16.3-R:5'-GCTCGAGGCCCTCGACTCGTTTCTT-3'以結(jié)核桿菌菌株H37Rv(中國(guó)結(jié)核病防治臨床中心國(guó)家參比實(shí)驗(yàn)室提供)基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增了38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特異表位抗原肽段的基因片段。PCR擴(kuò)增條件如下預(yù)變性95°C2分鐘，變性94°C30秒；復(fù)性58°C30秒；延伸72°C30-90秒(隨基因長(zhǎng)度不同而不同)，擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，再72。C延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增所得的片段通過(guò)電泳鑒定，表明均得到相應(yīng)大小的基因片段。2、表達(dá)載體的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切并連接入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的pGEX-4T-2載體，測(cè)序由利嘉富誠(chéng)生物技術(shù)有限公司完成。3、特異表位抗原肽段在大腸桿菌DH5a中的表達(dá)與純化用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a，對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性克隆進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，將上清液與適量50%谷胱甘肽_瓊脂糖樹脂勻漿混合，室溫輕搖30分鐘?；旌衔镉?°C以500g離心5分鐘，小心去掉上清，在沉淀中加入10倍柱體積的PBS，顛倒離心管數(shù)次，洗去未與樹脂結(jié)合的蛋白。于4t:以500g離心5分鐘。重復(fù)洗滌過(guò)程2次。在每毫升樹脂加入50單位溶于lmlPBS的凝血酶，顛倒離心管數(shù)次混勻，室溫下振蕩1016小時(shí)。于4t:以500g離心5分鐘，將上清小心轉(zhuǎn)移至新管中。進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果表明獲得了純度較高的特異表位抗原肽段。實(shí)施例338kD-ESAT6-CFP10融合抗原的制備1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)三個(gè)抗原基因及接頭的序列設(shè)計(jì)了上下游引物，使用的限制性內(nèi)切酶分別為BamHI和XhoI，所有引物均由上海英俊生物技術(shù)公司合成，其序列如下38kD-F:5'-GGGATCCGCGGCGGGCTGTGGCTCGA-3'38kD-RL:5'-ACTACCGCCACCAGAGCTGGAAATCGTCGC-3'ESAT6-FL:5'-AGCGGCGGCGGTAGCCATTCCCTCCTTGAC-3'ESAT6-RL:5'-AGAGCCACCGCCACTGTTCAGCTCGGTAGC-3'CFP10-FL:5'-CTTCCGGTGGTGGCTCTGAAGCAGCCAATAA-3'CFP10-R:5'-GCTCGAGCGAGGACAGCGCCTGCTG-3'[OUO]2、載體構(gòu)建以結(jié)核桿菌菌株H37Rv基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增了38kD、ESAT-6和CFP10特異表位抗原肽段的基因片段。PCR擴(kuò)增條件如下預(yù)變性95t:2分鐘，變性94t:30秒；復(fù)性58°C30秒；延伸72°C30-90秒(隨基因長(zhǎng)度不同而不同)，擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，再72。C延伸7分鐘。通過(guò)電泳鑒定，表明均得到相應(yīng)大小的基因片段。然后以具有互補(bǔ)接頭的基因片段互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，將38kD、ESAT-6和CFP10抗原基因片段連接到一起，構(gòu)建融合抗原基因。將融合抗原基因片段用限制性內(nèi)切酶酶切后連接入經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切的pGEX-4T-2載體，測(cè)序由利嘉富誠(chéng)生物技術(shù)有限公司完成。0122]3、抗原制備0123]參見實(shí)施例2。0124]實(shí)施例4MPT64-Mtb8-Mtb8.4-Mtbl6.3融合抗原的制備0125]根據(jù)4個(gè)抗原基因的序列設(shè)計(jì)了上下游引物，使用的限制性內(nèi)切酶分別為BamHI和XhoI，所有引物均由上海英俊生物技術(shù)公司合成，其序列如下0126]Mtb8.4-F:5'-GGGATCCCCGGGGTCGCCTCCGCA-3'0127]Mtb8.4-RL:5'-GCTACCACCGCCGGATTGCGCGGCCATGGCA-3'0128]MPT64-FL:5'-GGTGGCGGCTCCCCCAAGACCTACT—3'0129]MPT64-RL:5'-CTACCGCCACCAGACGGCGCTATCGATA-3'0130]Mtb16.3-FL:5'-GCGGCGGCGGTAGCGCGGACAAGACGACAC-3'0131]Mtbl6.3-RL:5'-GAGCCACCGCCACTGCCCTCGACTCGTTTCT-3'0132]Mtb8-FL:5'-CCGGTGGTGGCTCTGCCGGGGTCGCCTCCG—3'0133]Mtb8-R:5'-GCTCGAGAATGACCCGAGCGACGCGGA-3'0134]載體構(gòu)建以及抗原制備參見實(shí)施例3。0135]實(shí)施例5間接ELISA方法評(píng)價(jià)7種單獨(dú)特異表位抗原肽段的抗原性0136]分別以所選擇的38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3特異表位抗原肽段為抗原，應(yīng)用間接ELISA方法初步檢測(cè)了30例結(jié)核陰性血清樣本，以其OD值的平均值+2SD為cutoff值，計(jì)算出38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtbl6.3的cutoff值分別為0.55、0.2、0.15、0.29、0.17、0.18和0.30。然后，再用這七種抗原分別檢測(cè)了20例結(jié)核病人血清和10例正常人血清的抗結(jié)核抗體，表1中顯示了所檢測(cè)樣品的OD值與cutoff值的比值(S/co=樣品0D值/cutoff值)，比值大于1判定為陽(yáng)性，比值大于2判定為強(qiáng)陽(yáng)性，比值小于1判定為陰性。在初步檢測(cè)中38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8、Mtb8.4和Mtb16.3七種抗原的敏感性和特異性分別如下:38kD為75%和90%、ESAT-6為45%禾口90%、CFP10為80%禾口100%、MPT64為50%禾口90%、Mtb8分別為55%禾口90%，Mtb8.4分別為40%和90%，Mtbl6.3分別為55%和80%。表1間接ELISA方法檢測(cè)七種特異表位抗原肽段對(duì)結(jié)核病人和正常人血液樣本的反應(yīng)性(S/co)編號(hào)狀態(tài)38kDESAT6CFP10MPT64Mtb8M獻(xiàn)4Mtbl6.3BP1TB0.230.581.122.750.660.200.47BP2TB1.121.661.210.891.510.181.28BP3TB1.133.838.122.343.040.222.55BP4TB1.390.540.420.430.570.180.56BP5TB0.441.211.431.181.270.181.36BP6TB1.551.659.131.630.870.190.78BP7TB1.440.89].040.680.810.531.32BP8TB1.511.211.710.721.241.061.53BP9TB2.310.281.010.946.241.121.26BP10TB1.710.690.610.610.820.390.75BP11TB2.110.591.450.881.741.251.18BP12TB0.390.580.633.960.820.360.83BP13TB1.081.071.010.891.75i.290.71BP14TB0.830.722.171.512.001.371.05BP15TB1.860.985.291.182.167.161.23BP16TB1.031.129.461.210.710.460.41BP17TB2.331.164.651.632.035.262.11BP18TB1.670.361.570.711.152,010.36BP19TB0.870.390.680.410.510.242.96BP20TB1.891.471.311.220.320.180.61N-lDonor0.180.630.490.390.640.400.49N-2Donor0.490.860.680.740.980.411.05N-3Donor0.590.980.450.380.640.30.62N-4Donor1.451.310.990,624.801.240.92N-5Donor0.240.590.560.970.840.581.03N-6Donor0.970.720.470.490.650.390.93N-7Donor0.420.780.771.280.830.710.65N-8Donor0.580.860.350.740.710.760.81N-9Donor0.330.550.960.960.930.870.61N-10Dcmor0.250.760.850.930.650.740.78靈敏度75%45%80%50%55%40%55%特異性卯％90%100%90%90%90%80%由表1數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在這七種抗原中沒(méi)有任何一種能夠檢出全部結(jié)核病患者，但令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，Mtbl6.3特異表位抗原肽段在檢測(cè)結(jié)核桿菌中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)常用的四種抗原，即38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64，全部反應(yīng)性為陰性時(shí)，Mtbl6.3特異表位抗原肽段則對(duì)該血清的反應(yīng)性呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性(BP19)。由此可見，Mtbl6.3特異表位抗原肽段與38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64四種特異表位抗原肽段在血清學(xué)檢測(cè)方面具有良好的互補(bǔ)性。Mtbl6.3特異表位抗原肽段與選擇38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64的至少一種特異表位抗原肽段的組合有可能提高結(jié)核病診斷的靈敏度。此外，雖然這七種抗原中沒(méi)有任何一種能夠檢出全部結(jié)核病患者，但是七種抗原的聯(lián)合檢出率可以達(dá)到100%，抗原之間的這種互補(bǔ)性對(duì)于結(jié)核病患者的臨床診斷是非常重要的。用不同抗原檢測(cè)同一病人血清，其反應(yīng)性有所不同，并且各抗原之間存在一定的互補(bǔ)性。這可能是由于結(jié)核桿菌抗原多而復(fù)雜，在宿主體內(nèi)表現(xiàn)出不同的抗體譜。因此，聯(lián)合應(yīng)用多種抗原進(jìn)行檢測(cè)能在保證特異性的基礎(chǔ)上有效提高檢測(cè)靈敏度，并開發(fā)出高特異性和高靈敏度的檢測(cè)結(jié)核病抗體試劑。實(shí)施例6間接ELISA方法評(píng)價(jià)Mtbl6.3特異表位抗原肽段與其余特異表位抗原肽段相組合在檢出結(jié)核病患者中的效果如實(shí)施例5所述，由于Mtbl6.3特異表位抗原肽段具有其它抗原肽段所不具有的優(yōu)點(diǎn)，因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其與四種常用抗原，即38kD、ESAT-6、CFPIO、MPT64，特異表位抗原肽段的一種或多種抗原肽段相組合在檢出結(jié)核病患者中的效果。各種組合中的抗原摩爾比比值為l。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表2間接ELISA方法檢測(cè)Mtbl6.3特異表位抗原肽段與其它特異表位抗原肽段混合血液樣本的反應(yīng)性(S/co)傳太38kD+ESAT-6~CFP10+~~MPT64~"38kD+38kD+38kD+~-顛5狀心、Mbt16.3+Mbt16.3十ESAT-6MPT64ESAT-6ESAT-6Mbtl6.3Mbtl6.3十Mtbl6++CFP10+CFP10.3Mtbl6.3+Mtbl6MPT64.3+Mtbl6BP1TB0.370.651.152.230.661.670.771.31BP2TB2.041.791.381.191.811.321.281.29BP3TB2.613.967.363.043.323.923.554.62BP4TB1.200.470.570.651.160.96].030.98BP5TB1.181.261.491.211.191.201.301.27BP6TB1.331.618.971.131.251.193.184.7318<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>由表2可見，Mtbl6.3特異表位抗原肽段與其余一種或多種抗原肽段相組合在檢出結(jié)核病患者中效果更好，檢出率明顯提高，特異性卻沒(méi)有降低。這表明Mtbl6.3特異表位抗原肽段確實(shí)與其它特異表位抗原肽段在檢出結(jié)核病患者方面存在互補(bǔ)性。聯(lián)合應(yīng)用多種抗原可以提高檢出率，避免漏檢。實(shí)施例7間接ELISA方法評(píng)價(jià)融合抗原在檢出結(jié)核病患者中的效果單獨(dú)或組合應(yīng)用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4_MPT64-Mtbl6.3_Mtb8融合抗原包被酶聯(lián)板，應(yīng)用間接ELISA方法初歩評(píng)價(jià)了融合抗原在檢出結(jié)核病患者中的效果。融合抗原中的各組分的摩爾比比值為l，抗原組合的摩爾比比值為1。在初步檢測(cè)中，組合應(yīng)用38kD-ESAT6-CFP10和Mtb8.4_MPT64_Mtbl6.3_Mtb8融合抗原時(shí)，20例結(jié)核病患者的血清僅1例檢測(cè)結(jié)果為陰性，其它19例均為陽(yáng)性，其中9例為強(qiáng)陽(yáng)性(S/co>2.0)，與臨床結(jié)果的符合性達(dá)到95%。初步檢測(cè)中10例健康獻(xiàn)血員血清均為陰性。確定應(yīng)用間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)融合抗原的靈敏度和特異性分別為95%和100%(見表3)。以上結(jié)果顯示7個(gè)抗原全部融合(3個(gè)融合在一起，另4個(gè)融合在一起)的效果更佳。表3間接ELISA方法檢測(cè)融合抗原對(duì)結(jié)核病人和正常人血液樣本的反應(yīng)性(S/co)編號(hào)狀態(tài)38kD-ESAT-6-CFP10Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3-38kD曙ESAT陽(yáng)6-CFP1()+Mtb8Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3-Mtb8BP1TB0.711.682.43BP2TB1.580.961.39BP3TB6.152.343.97BP4TB1.220.57.06BP5TB1.301.161.21BP6TB5.411.217.62BP7TB1.190.850.89BP8TB1.511.141.21BP9TB2.031.972.28BP10TB1.420.821.25BP11TB1.751.252.33BP12TB0.492.041.86BP13TB1.071.111.07BP14TB1.681.361.70BP15TB3.253.375.71BP16TB6.120.866.03BP17TB2.332.872.16BP18TB.241.221.20BP19TB0.661.672.11BP20TB1.490.701.27N-lDonor0.850.630.35N-2Donor0.620.80.37N-3Donor0.550.420.40N-4Donor1.321.690.97N-5Donor0.640.550.55N-6Donor0.950.370.47N-7Donor0.520.710.56N-8Donor0.710.440.38N-9Donor0.680.820.46N-10Donor0.530610.52靈敏度85%75%95%特異性卯％90%100%序列表〈110〉上海榮盛生物藥業(yè)有限公司〈120〉多肽組合物及其在結(jié)核病抗體檢測(cè)中的應(yīng)用〈130>0811571〈160>18〈170>PatentInversion3.3〈210>SEQIDNo1〈211>143<212>PRT〈213>Mtbl6.3特異表位抗原肽段的氨基酸序列〈400〉1AlaAspLysThrThrGinThrlieTyrlieAspAlaAspProGlyGluValMetLysAlalieAla15101521AsplieGluAlaTyrProGinTrplieSerGluTyrLysGluValGlulieLeuGluAlaAspAspGlu2530354045GlyTyrProLysArgAlaArgMetLeuMetAspAlaAlaliePheLysAspThrLeulieMetSer50556065TyrGluTrpProGluAspArgGinSerLeuSerTrpThrLeuGluSerSerSerLeuLeuLysSerLeu7075808590GluGlyThrTyrArgLeuAlaProLysGlySerGlyThrGluValThrTyrGluLeuAlaValAsp95100105110LeuAlaValProMetlieGlyMetLeuLysArgLysAlaGluArgArgLeulieAspGlyAlaLeuLys115120125130135AspLeuLysLysArgValGluGly140〈210>SEQIDNo2〈211>354〈212>PRT〈213>38kD特異表位抗原肽段的氨基酸序列〈400>2AlaAlaGlyCysGlySerLysProProSerGlySerProGluThrGlyAlaGlyAlaGlyThrVal15101520AlaThrThrProAlaSerSerProValThrLeuAlaGluThrGlySerThrLeuLeuTyrProLeuPhe2530354045AsnLeuTrpGlyProAlaPheHisGluArgTyrProAsnValThrlieThrAlaGinGlyThrGly5055602265AspAla85AlaGin110AlaAla130AsnLeu155ThrGin175PhePro200ThrPro220AlaGin245AlaGly265TyrProSerTyrGluGinAsnMetGlyProThrTyrLysAlaProGlyAlaLeuAsnPheLyslieGlyLeuGlyValTyrTyrAlaGlylieAlaGinAlaAlaAlaGlyThrValAsnlieGlyAlaSerSer7580Asp7090MetAlaAlaHisLysGlyLeuMetAsnlieAlaLeuAlalieSer95100105AsnLeuProGlyValSerGluHisLeuLysLeuAsnGlyLysValLeuGinThrGlyAlaLeuGinValGlyCysTyrGlySerAlalie115135LysThr120125ValSerAspTrpAspAspProGinlieAlaAlaLeuAsnProGlyVal140145150ValProLeuHisArgSerAspGlySerGlyAspThrPheLeuPhe165170160180ProGluGlyTrpGlyLysSerProGlyPheGlyThrThrValAsp185190195AlaLeuGlyGluAsnGlyAsnGlyGlyMetValThrGlyCysAlaGluVallie205225Glylie210215SerPheLeuAspGinAlaSerGinArgGlyLeuGlyGlu230235240SerGlyAsnPheLeuLeuProAspAlaGinSerlieGinAlaAlaAlaSer250270255260ThrProAlaAsnGinAlalieSerMetlieAspGlyProAlaProAspGlylie290ThrLeu310PheGin335GlyGly20GluLeu40GinAla20AsnGinLeuPro275280285TyrGluTyrAlalieValAsnAsnArgGinLysAspAlaAlaThrAlaGinAlaPhe295300305315HisTrpAlalieThrAspGlyAsnLysAlaSerPheLeuAspGinValHisLeu320325330ProProAlaValValLysLeuSerAspAlaLeulieAlaThrlieSerSer340345350〈210>SEQIDNo3〈211>41〈212>PRT〈213>ESAT-6特異表位抗原肽段的氨基酸序列〈400>3HisSerLeuLeuAspGluGlyLysGinSerLeuThrLysLeuAlaAlaAlaTrp151015SerGlySerGluAlaTyrGinGlyValGinGinLysTrpAspAlaThrAlaThrAsn253035〈210>SEQIDNo4〈211>37〈212>PRT〈213>CFP10特異表位抗原肽段的氨基酸序列〈400>4GluAlaAlaAsnLysGinLysGinGluLeuAspGlulieSerThrAsnlieArg151015GlyValGinTyrSerArgAlaAspGluGluGinGinGinAlaLeuSerSer253035〈210>SEQIDNo5〈211>154〈212>PRT24〈213>MPT64特異表位抗原肽段的氨基酸序列〈400>5ProLysThrTyrCysGluGluLeuLysGlyThrAspThrGlyGinAlaCysLeulieGinMetSer15101520AspProAlaTyrAsnThrAsnlieSerLeuProSerTyrTyrProAspGinLysSerLeuGluAsnTyr2530354045lieAlaGinThrArgAspLysPheLeuSerAlaAlaThrSerSerThrProArgGluAlaProTyr50556065GluLeuAsnlieThrSerAlaThrTyrGinSerAlalieProProArgGlyThrGinAlaValValLeu7075808590LysValTyrGinAsnAlaGlyGlyThrHisProThrThrThrTyrLysAlaPheAspTrpAspGin95100105110AlaTyrArgLysProlieThrTyrAspThrLeuTrpGinAlaAspThrAspProLeuProValValPhe115120125130135ProlieValGinGlyGluLeuSerLysGinThrGlyGinGinValSerlieAlaPro140145150〈210>SEQIDNo6〈211>30〈212>PRT〈213>Mtb8特異表位抗原肽段的氨基酸序列〈400>6ThrSerProThrSerTrpGluGinAlaAlaAlaGluAlaValGinArgAlaArgAspSer15101520ValAspAsplieArgValAlaArgVallieTyrGly20ProVal45GinAlaGly20LeuTyr40GinGly65AspAla852530〈210>SEQIDNo7〈211>64〈212>PRT〈213>Mtb8.4特異表位抗原肽段的氨基酸序列〈400>7AlaGlyValAlaSerAlaAspProValAspAlaVallieAsnThrThrCysAsnGinVal151015ValAlaAlaLeuAsnAlaThrAspProGlyAlaAlaAlaGinPheAsnAlaSerAlaGinSer25303540TyrLeuArgAsnPheLeuAlaAlaProProProGinArgAlaAlaMetAlaAla505560〈210>SEQIDNo8〈211>452〈212>PRT〈213>38kD-ESAT6-CFP10融合抗原的氨基酸序列〈400>8GlyCysGlySerLysProProSerGlySerProGluThrGlyAlaGlyAlaThr1AlaProAsnThrSerTyrAlaValThrLeuLeuGlyGlyLeuThrProPhe2545TrpGlyGluGly51015AlaSerSerProValThrLeuAlaGluThrGlySerThrLeu3035ProAlaPheHisGluArgTyrProAsnValThrlieThrAla505560AlaGlylieAlaGinAlaAlaAlaGlyThrValAsnlieGlyAlaSerSer70758090AspMetAlaAlaHisLysGlyLeuMetAsnlieAlaLeuAlalieSerAlaGin110AlaAla130AsnLeu155ThrGin175PhePro200ThrPro220AlaGin245AlaGly265TyrPro290ThrLeu310GinVal95100105AsnMetGlyProThrTyrLysAlaProGlyAlaLeuAsnPheLyslieAsnGinTyrTyrThrGlyAlaLeuGinValGlyCysTyrGlySerAlaThrlieTyrAlaAsnLeuProGlyValSerGluHisLeuLysLeuAsnGlyLysValLeuGin115120125135lieLysThrTrpAspAspPro140GinlieAlaAlaLeuAsnProGlyVal145150ValValProLeuHisArgSerAspGlySerGlyAspThrPheLeuPheSer160165170180AspProGluGlyTrpGlyLysSerProGlyPheGlyThrThrValAsp185190195AlaLeuGlyGluAsnGlyAsnGlyGlyMetValThrGlyCysAlaGluVal205210215225lieGlylieSerPheLeuAspGinAlaSerGinArgGlyLeuGlyGlu230SerGlyAsnPheLeuLeuProSer250270ProAlaAsnGinAlalieSer275GluTyrAlalieValAsnAsnPhe295315235240AspAlaGinSerlieGinAlaAlaAla255260MetlieAspGlyProAlaProAspGly280285ArgGinLysAspAlaAlaThrAlaGin300305PheGin335GlyGly355AlaAla380AlaThr400GluLeu425GinGin445TyrGly20ProVal40LeuHisTrpAlalieThrAspGlyAsnLysAlaSerPheLeuAspGinValHisProLeu320325330ProProAlaValValLysLeuSerAspAlaLeulieAlaThrlieSerSerSerGlySerSer340345350360GlyGlyGlySerHisSerLeuLeuAspGluGlyLysGinSerLeuThrLysLeuAlaTrp365370375GlyGlySerGlySerGluAlaTyrGinGlyValGinGinLysTrpAspAlaThrGluLeuAsn385390395405SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySerGluAlaAlaAsnLysGinLysGinAspGlu410415420lieSerThrAsnlieArgGinAlaGlyValGinTyrSerArgAlaAspGluGluGinAlaLeu430435440450SerSer〈210>SEQIDNo9〈211>421〈212>PRT〈213>Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3_Mtb8融合抗原的氨基酸序列〈400>9AlaGlyValAlaSerAlaAspProValAspAlaVallieAsnThrThrCysAsnGinVal151015ValAlaAlaLeuAsnAlaThrAspProGlyAlaAlaAlaGinPheAsnAlaSerAlaGinSer25303545TyrLeuArgAsnPheLeuAlaAlaProProProGinArgAlaAlaMetAlaAla28GinSerGlyGly50556065GlySerSerGlyGlyGlySerProLysThrTyrCysGluGluLeuLysGlyThrAspThrGlyGinAla7075808590CysLeulieGinMetSerAspProAlaTyrAsnThrAsnlieSerLeuProSerTyrTyrProAsp95100105110GinLysSerLeuGluAsnTyrlieAlaGinThrArgAspLysPheLeuSerAlaAlaThrSerSerThr115120125130135ProArgGluAlaProTyrGluLeuAsnlieThrSerAlaThrTyrGinSerAlalieProProArg140145150155GlyThrGinAlaValValLeuLysValTyrGinAsnAlaGlyGlyThrHisProThrThrThrTyrLys160165170175180AlaPheAspTrpAspGinAlaTyrArgLysProlieThrTyrAspThrLeuTrpGinAlaAspThr185190195200AspProLeuProValValPheProlieValGinGlyGluLeuSerLysGinThrGlyGinGinValSer205210215220225lieAlaProSerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySerAlaAspLysThrThrGinThrlieTyr225230235240lieAspAlaAspProGlyGluValMetLysAlalieAlaAsplieGluAlaTyrProGinTrplieSer250255260265270AlaArg290AspArg310LeuAla335lieGly355ValGlu380AlaAla40060120180240MetGinSerProGlyMetArgGlyGlyGluGinTyrLysGluValGlulieLeuGluAlaAspAspGluGlyTyrProLeu275280AspAlaAlaliePheLysAspThrLeulieMetSerTyrGluTrpSerLeu295300315TrpThrLeuGluSerSerSerLeuLeuLysSerLeuGluGlyThrLys320325SerGlyThrGluValThrTyrGluLeuAlaValAspLeuAlaValLeuLys340345360LysAlaGluArgArgLeulieAspGlyAlaLeuLysAspLeuLysSer365370GluTyrLysGluValGlulieLeuGluAlaAspAspGluGlyTyrProLysArgMet285ProGlu305TyrArg330ProMet350LysArg375GlyGlySerSerGlyGlyGlySerThrSerProThrSerTrpGluGinAlaAlaVal385390395405ArgAlaArgAspSerValAspAsplieArgValAlaArgVallie410415420〈210>SEQIDNo10〈211>429〈212>DNA〈213>Mtbl6.3特異表位抗原肽段的編碼DNA序列〈400>10gcggacaagacgacacagacgatttacatcgacgcggatccaggcgaggtgatgaaggcgatcgccgacatcg肌gcctacccgc肌tggatttcggagtat肌gg肌gtcgagatcctagaggccgacgacgagggctacccgaaacgagcgcgaatgttgatggacgcagccatcttc3肌g3caccttgatcatgtcctacgagtggccgg肌gaccgcc肌tcgcttagctggact3030036042060120180240300360420■540600660720780ctcgaatccagctcgctgctaaagtccctcgaaggcacgtatcgcttggcgcccaagggttctggcactgaggtcacctacgagcttgccgtcgaccttgctgtccccatgatcgggatgctcaagcgtaaggcggaacgcaggttgatagacggcgcgttgaaggatctgaagaaacgagtcgagggc〈210>SEQIDNo11〈211>1062〈212>DNA〈213>38kD特異表位抗原肽段的編碼DNA序列〈400>11gcggcgggctgtggctcgaaaccaccgagcggttcgcctgaaacgggcgccggcgccggtactgtcgcgactacccccgcgtcgtcgccggtgacgttggcggagaccggtagcacgctgctctacccgctgttcaacctgtggggtccggcctttcacgagaggtatccgaacgtcacgatcaccgctcagggcaccggttctggtgccgggatcgcgcaggccgccgccgggacggtcaacattggggcctccgacgcctatctgtcggaaggtgatatggccgcgcacaaggggctgatgaacatcgcgctagccatctccgctcagcaggtcaactacaacctgcccggagtgagcg3gC3CCtC33gCtg肌Cgg肌肌gtCCtggCggCC3tgt3CC3gggC3Ccatc肌肌cctgggacgacccgcagatcgctgcgctcaaccccggcgtgaacctgcccggcaccgcggtagttccgctgcaccgctccgacgggtccggtgacaccttcttgttcacccagtacctgtccaagcaagatcccgagggctggggcaagtcgcccggcttcggcaccaccgtcgacttcccggcggtgccgggtgcgctgggtgag肌cggc肌cggcggcatggtgaccggttgcgccgagacaccgggctgcgtggcctatatcggcatcagcttcctcgaccaggccagtcaacggggactcggcgaggcccaactaggcaatagctctggcaatttcttgttgcccgacgcgcaaagcattcaggccgcggcggctggcttcgcatcgaaaaccccggcgaaccaggcgatttcgatg3184090096010201062601206011160120180atcgacgggcccgccccggacggctacccgatcatcaactacgagtacgccatcgtcaacaaccggcaaaaggacgccgccaccgcgcagaccttgcaggcatttctgcactgggcgatcaccgacggcaacaaggcctcgttcctcgaccaggttcatttccagccgctgccgcccgcggtggtgaagttgtctgacgcgttgatcgcgacgatttccagc〈210>SEQIDNo12〈211>123〈212>DNA〈213>ESAT-6特異表位抗原肽段的編碼DNA序列〈400>12cattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctg朋c〈210>SEQIDNo13〈211>111〈212>DNA〈213>CFP10特異表位抗原肽段的編碼DNA序列〈400>13g肌gcagccaat肌gcag肌gcagg肌ctcgacgagatctcgacg肌tattcgtcaggccggcgtccaatactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcg〈210>SEQIDNo14〈211>462〈212>DNA〈213>MPT64特異表位抗原肽段的編碼DNA序列〈400>14cccaagacctactgcgaggagttgaaaggcaccgataccggccaggcgtgcctgattcaaatgtccgacccggcctacaacaccaacatcagcctgcccagttactaccccgaccagaagtcgctggaaaattacatcgcccagacgcgcgacaagttcctcagcgcggcaacatcgtcc24030036042046260906012018019260actccacgcgaagccccctacgaattgaatatcacctcggccacataccagtccgcgataccaccgcgtggtacgcaggccgtggtgctcaaggtctaccagaatgccggcggcacgcacccaacgaccacgtacaaggccttcgattgggaccaggcttatcgcaagccaatcacctatgacacgctgtggcaggctgacaccgatccgctgccagtcgtcttccccattgtgcaaggtg33ctgagca3gc3gaccgg3C33C3ggtatcgatagcgceg〈210>SEQIDNo15〈211>90〈212>DNA〈213>Mtb8特異表位抗原肽段的編碼DNA序列〈400>15accagccccacatcctgggaacaggeggeggeggaggeggtccagcgggcgegggatagegtcgatgacatccgcgtcgctegggtcatt〈210>SEQIDNo16〈211>192〈212>DNA〈213>Mtb8.4特異表位抗原肽段的編碼DNA序列〈400>16geeggggtegcctccgcagatcccgtggacgeggtcattaacaccacctgcaattaegggcaggtagtagctgcgctcaacgegaeggatccgggggctgccgcacagttcaacgcctcaccggtggcgcagtcctatttgegcaatttectcgccgcaccgccacctcagcgcgctgccatggccgcgc〈210>SEQIDNo17〈211>1356〈212>DNA〈213>38kD-ESAT6-CFP10融合抗原的編碼DNA序列〈400>17geggegggetgtggctcgaaaccaccgagcggttcgcctgaaaegggegecggcgccggt120180240300360420■5406006607207808409009601020108011401200actgtcgcgactacccccgcgtcgtcgccggtgacgttggcggagaccggtagcacgctgctctacccgctgttcaacctgtggggtccggcctttcacgagaggtatccgaacgtcacgatcaccgctcagggcaccggttctggtgccgggatcgcgcaggccgccgccgggacggtcaacattggggcctccgacgcctatctgtcggaaggtgatatggccgcgcacaaggggctgatgaacatcgcgctagccatctccgctcagcaggtcaactacaacctgcccggagtgagcg3gC3CCtC33gCtg肌Cgg肌肌gtCCtggCggCC3tgt3CC3gggC3Ccatc肌肌cctgggacgacccgcagatcgctgcgctcaaccccggcgtgaacctgcccggcaccgcggtagttccgctgcaccgctccgacgggtccggtgacaccttcttgttcacccagtacctgtccaagcaagatcccgagggctggggcaagtcgcccggcttcggcaccaccgtagacttcccggcggtgccgggtgcgctgggtgag肌cggc肌cggcggcatggtgaccggttgcgccgagacaccgggctgcgtggcctatatcggcatcagcttcctcgaccaggccagtcaacggggactcggcgaggcccaactaggcaatagctctggcaatttcttgttgcccgacgcgcaaagcattcaggccgcggcggctggcttcgcatcgaaaaccccggcgaaccaggcgatttcgatgatcgacgggcccgccccggacggctacccgatcatcaactacgagtacgccatcgtcaacaaccggcaaaaggacgccgccaccgcgcagaccttgcaggcatttctgcactgggcgatcaccgacggcaacaaggcctcgttcctcgaccaggttcatttccagccgctgccgcccgcggtggtgaagttgtctgacgcgttgatcgcgacgatttccagctctggtggcggtagtagcggcggcggtagccattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctgaacagtggcggtggctcttccggtggtggctctgaagcagccaataag3412601320135660120180240300360420■540600660720780840C3g肌gcagg肌ctcgacg3gatctcgacg肌tattcgtcaggccggcgtcc肌tactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcg〈210>SEQIDNo18〈211>1263〈212>DNA〈213>Mtb8.4-MPT64-Mtbl6.3_Mtb8融合抗原的編碼DNA序列〈400>18ccggggtcgcctccgcagatcccgtggacgcggtcattaacaccacctgcaattacgggcaggtagtagctgcgctcaacgcgacggatccgggggctgccgcacagttcaacgcctcaccggtggcgcagtcctatttgcgcaatttcctcgccgcaccgccacctcagcgcgctgccatggccgcgcaatccggcggtggtagctctggtggcggctcccccaagacctactgcgaggagttgaaaggcaccgataccggccaggcgtgcctgattcaaatgtccgacccggcctacaacaccaacatcagcctgcccagttactaccccgaccagaagtcgctggaaaattacatcgcccagacgcgcgacaagttcctcagcgcggcaacatcgtccactccacgcgaagccccctacgaattgaatatcacctcggccacataccagtccgcgataccaccgcgtggtacgcaggccgtggtgctcaaggtctaccagaatgccggcggcacgcacccaacgaccacgtacaaggccttcgattgggaccaggcttatcgcaagccaatcacctatgacacgctgtggcaggctgacaccgatccgctgccagtcgtcttccccattgtgcaaggtgaactgagcaagcagaccggacaacaggtatcgatagcgccgtctggtggcggtagtagcggcggcggtagcgcggacaagacgacacagacgatttacatcgacgcggatccaggcgaggtgatgaaggcgatcgccgacatcg肌gcctacccgc肌tggatttcgg3gtat肌ggaagtcgagatcctagaggccg3Cg3Cg3gggCt3CCCg肌3Cg3gCgCg肌tgttg3tgg3CgC3gCC3tCttC肌3g3C3900ccttgatcatgtcctacgagtggccggaag960ccagctcgctgctaaagtccctcgaaggca1020ctgaggtcacctacgagcttgccgtcgacc1080gtaaggcggaacgcaggttgatagacggcg1140gcagtggcggtggctcttccggtggtggct1200gcggcggaggcggtccagcgggcgcgggat1260attaccgccaatcgcttagctggactctcgaatcgtatcgcttggcgcccaagggttctggcattgctgtccccatgatcgggatgctcaagccgttgaaggatctgaagaaacgagtcgaggctgaccagccccacatcctgggaacaggcgagcgtcgatgacatccgcgtcgctcgggtc權(quán)利要求一種多肽組合物，由抗原Mtb16.3與抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4相組合。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原Mtbl6.3的氨基酸序列為SEQIDNo1。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原38kD的氨基酸序列為SEQIDNo2。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原ESAT-6的氨基酸序列為SEQIDNo3。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原CFP10的氨基酸序列為SEQIDNo4。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原MPT64的氨基酸序列為SEQIDNo5。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原Mtb8的氨基酸序列為SEQIDNo6。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原Mtb8.4的氨基酸序列為SEQIDNo7。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于抗原Mtb16.3與抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4中的一種相組合。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽組合物，其特征在于所述的組合比例為100:1i:ioo，摩爾比。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的多肽組合物，其特征在于所述的組合比例為50:ii:50、30:ii:30、20:ii:20、10:ii:io、5:ii:5、3:ii:3、2:ii:2或i:i，摩爾比。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽組合物，其特征在于抗原Mtbl6.3與抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4中的任意幾種相組合。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多肽組合物，其特征在于Mtb16.3占所述組合總抗原的摩爾比比值為0.01-0.99。14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多肽組合物，其特征在于所述的摩爾比比值為0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。15.—種多肽組合物，其特征在于Mtbl6.3與38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4等抗原中一種或幾種形成融合抗原再與Mtbl6.3、38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4任意兩種以上抗原形成的融合抗原相混合。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多肽組合物，其特征在于所述的融合抗原相混合，其混合比例為ioo:ii:ioo，摩爾比。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多肽組合物，其特征在于所述的混合比例為50:li:50、30:ii:30、20:ii:20、10:ii:io、5:ii:5、3:ii:3、2:ii:2或i:i，摩爾比。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的多肽組合物，其特征在于Mtbl6.3抗原與抗原Mtb8.4、Mtb8和MPT64融合后，再與38kD、ESAT-6和CFPIO融合抗原相混合。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽組合物，其特征在于所述的Mtbl6.3占所述組合總抗原的摩爾比比值為0.01-0.99。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽組合物，其特征在于所述的Mtb16.3占所述組合總抗原的摩爾比比值為0.05、0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85或0.90。21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽組合物，其特征在于所述的38kD、ESAT-6和CFP10抗原融合摩爾比為i:i:i。22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的多肽組合物，其特征在于所述的多肽組合物由從N末端至C末端的順序依次為Mtb8.4-MPT64-Mtb16.3-Mtb8融合抗原與從N末端至C末端的順序依次為38kD-ESAT-6-CFP10相混合。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的多肽組合物，其特征在于連接所述的融合抗原的多肽氨基酸序列為SerGlyGlyGlySerSerGlyGlyGlySer。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的多肽組合物，其特征在于所述的抗原混合比例為1:3、i:2、i:1、2:i或3:i。25.根據(jù)權(quán)利要求l-24之一所述的多肽組合物，用于檢測(cè)應(yīng)答結(jié)核菌抗原而產(chǎn)生的抗體。26.根據(jù)權(quán)利要求l-24之一所述的多肽組合物，在間接酶聯(lián)免疫測(cè)定結(jié)核病抗體中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種多肽組合物，由抗原Mtb16.3與抗原38kD、ESAT-6、CFP10、MPT64、Mtb8和Mtb8.4相組合。Mtb16.3抗原與38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64等四種抗原在血清學(xué)檢測(cè)方面具有良好的互補(bǔ)性。Mtb16.3抗原與選擇38kD、ESAT-6、CFP10和MPT64的至少一種抗原的組合能顯著提高結(jié)核病診斷的靈敏度。文檔編號(hào)G01N33/569GK101735321SQ20081020353公開日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日發(fā)明者張賀秋,朱紹榮申請(qǐng)人:上海榮盛生物藥業(yè)有限公司;中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所