一種五肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥與化妝品等領(lǐng)域，具體涉及一種五肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型是評價樣品是否具有抗氧化能力的常用方法，而紅細(xì)胞來 源豐富、取材方便，是體外生物實(shí)驗(yàn)中的常用材料。自由基首先攻擊紅細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋 白質(zhì)，使細(xì)胞膜破損，釋放出紅細(xì)胞中的血紅蛋白，稱為紅細(xì)胞溶血。AAPH、H202和Hemin為 常用的誘導(dǎo)紅細(xì)胞溶血的物質(zhì)?；钚詷悠返念A(yù)處理，可以起到抑制紅細(xì)胞溶血的作用，從而 該模型通過測定紅細(xì)胞溶血抑制率和細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶S0D的活性來評價樣品的細(xì)胞內(nèi)抗 氧化效果。原子力顯微鏡（AFM)是一種高分辨率的新型成像工具，在生物醫(yī)學(xué)界已被廣泛 用于細(xì)胞形貌及其超微結(jié)構(gòu)的表征，其原理是通過檢測探針掃描樣品時所產(chǎn)生的原子間相 互作用力來獲得樣品形貌結(jié)構(gòu)信息，經(jīng)計算機(jī)軟件處理成像。自由基攻擊細(xì)胞膜使之結(jié)構(gòu) 和功能喪失，發(fā)生細(xì)胞溶血。這一結(jié)論通過用原子力顯微鏡（AFM)觀察對照組、損傷組和保 護(hù)組紅細(xì)胞形貌得到進(jìn)一步驗(yàn)證。
[0003] 光老化是外界環(huán)境對皮膚的生物學(xué)應(yīng)答的效果。皮膚對光老化的應(yīng)答通常與正常 的水合作用的缺乏、皮膚下垂以及線條和皺紋外觀有關(guān)。UVB照射可使成纖維細(xì)胞內(nèi)活性 氧（reactiveoxygenspecies，R0S)堆積，超過了其清除能力，打破氧化與抗氧化平衡，發(fā) 生氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)一系列程序化的細(xì)胞反應(yīng)，甚至調(diào)控衰老相關(guān)的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞 衰老的發(fā)生。大量研究表明R0S在細(xì)胞內(nèi)的堆積是皮膚光老化發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán) 節(jié)。人皮膚成纖維細(xì)胞是人皮膚產(chǎn)膠原蛋白的主要場所，其數(shù)量的多少和細(xì)胞膠原蛋白的 產(chǎn)率與皮膚衰老狀態(tài)息息相關(guān)。因此，人皮膚成纖維細(xì)胞的存活率和膠原蛋白的產(chǎn)率是被 廣泛應(yīng)用認(rèn)可的一種評價皮膚衰老狀態(tài)的模型。
[0004] 生物活性肽具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，易消化吸收，有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗 菌、降血壓、抗癌、抗氧化等功效，是由25個天然氨基酸通過肽鍵以不同組成和排列方式構(gòu) 成的二肽到復(fù)雜的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱?；钚噪陌踩詷O高，是當(dāng)前國際食品 界最熱門的研究課題和極具發(fā)展前景的功能因子?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶作 用后并不完全以游離氨基酸的形式吸收，大多以低肽的形式吸收，并且低肽比游離氨基酸 具有更高的營養(yǎng)價值和生物效價。雖然，活性肽被廣泛應(yīng)用在化妝品中，但是，本發(fā)明中的 序列是首次發(fā)現(xiàn)，并具備該功效的多肽。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種具有保護(hù)紅細(xì)胞溶血以及促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞的增 殖和膠原蛋白產(chǎn)生的合成五肽，可應(yīng)用于生物制藥與化妝品等領(lǐng)域。本發(fā)明以APPH誘導(dǎo)的 紅細(xì)胞溶血實(shí)驗(yàn)以及紫外損傷人皮膚成纖維細(xì)胞來評價多肽的抗氧化及抗皮膚衰老活性。
[0006] 本發(fā)明所述的合成五肽縮寫為FFEFF，分子量735. 32。序列為： Phe-Phe-Glu-Phe-Phe。其中， Phe表示英文名稱為phenylalanine，中文名稱為苯丙氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基； Glu表示英文名稱為Glutamicacid，中文名稱為谷氨酸的氨基酸的相應(yīng)殘基。
[0007] 本發(fā)明所述的氨基酸序列采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合成 方法。將目標(biāo)多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個 氨基酸的氨基作為起點(diǎn)，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復(fù)這一過程，即可 以得到目標(biāo)多肽產(chǎn)物。合成反應(yīng)完成后，去除保護(hù)基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標(biāo)產(chǎn)物。 多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N端合成。采用高效液相 色譜進(jìn)行純化，液氮速凍，冷凍干燥，得到成品合成五肽。
[0008] 本發(fā)明將終濃度為1-100Pg/mL的合成五肽與正常人血紅細(xì)胞混勻，孵育，經(jīng) AAPH損傷2h后，使得細(xì)胞溶血抑制率最高可達(dá)到82.0 ±1.03%。用100噸/mL的合成五 肽處理組與僅用AAPH損傷的紅細(xì)胞組相比，其形貌比單純AAPH處理組光滑，有序。用5 呢/111]^合成五肽處理，紅細(xì)胞300活力由 2.5976 11^。1'〇1:/111]^上升到 5.6877 11^。1'〇1:/1111， 結(jié)果表明，合成五肽處理后紅細(xì)胞的S0D活性有較大提高，可在生物醫(yī)藥與化妝品等領(lǐng)域 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明將濃度為1-10Pg/mL的合成五肽加入人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育，經(jīng) 中波紫外（UVB) 80mJ/cm2損傷后，與模型組相比，樣品組細(xì)胞存活率提高了 0-18. 62%。同 時，膠原蛋白得率提高了 4. 69-9. 8%。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果： 本發(fā)明首次合成了該肽，并且應(yīng)用于AAPH損傷的正常人紅細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，使得紅細(xì)胞 溶血率顯著降低，S0D活性有較大的提高，同時，合成五肽對紫外損傷的人皮膚成纖維細(xì)胞 的生長具有促進(jìn)作用，同時能促進(jìn)其膠原蛋白的產(chǎn)生。
【附圖說明】
[0011] 圖 1 為合成五肽Phe-Phe-Glu-Phe-Phe的T0F圖譜。
[0012] 圖2為添加合成五肽進(jìn)行預(yù)保護(hù)后進(jìn)行AAPH損傷的正常人紅細(xì)胞溶血抑制率變 化曲線，其中橫坐標(biāo)為Concentration(濃度）、縱坐標(biāo)為Hemolysisinhibition(溶血抑制 率
[0013] 圖3為不同處理組紅細(xì)胞的原子力顯微鏡（AFM)成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下結(jié)合具體實(shí)例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施和保護(hù)范圍不限于 此。對于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0015] 合成五肽固相合成 選用高分子樹脂（中肽生化有限公司)，按照氨基酸序列Phe-Phe-Glu-Phe-Phe的特征， 先將Phe的羧基以共價鍵的形式與一個樹脂相連，然后Phe的氨基和Phe的羧基縮水反應(yīng)， 處理后，再添加Glu，Phe的氨基和Glu的羧基反應(yīng)，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一 個Phe氨基酸后，再切除樹脂即得到目標(biāo)合成五肽。高效液相色譜純化得到最后的產(chǎn)品，純 化過程使用PhenomenexC1S (4. 6*250mm)色譜柱，流速為1.0mL/min。采用兩個通道進(jìn)行 洗脫，溶劑A:含有0. 1%三氟乙酸的水；溶劑B:含有0. 09%三氟乙酸的溶液（80%乙腈 +20%水）；洗脫梯度過程中B初始比例為39%，在20min內(nèi)，B的比例上升到49%，檢測波長 220nm。收集合成五肽溶液，液氮速冷，然后凍干。得到純度為95%以上的產(chǎn)品，并經(jīng)ESI-MS 鑒定結(jié)構(gòu)(如圖1所示)。
[0016] 合成五肽對人皮膚成纖維細(xì)胞UVB損傷的保護(hù)應(yīng)用 人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中，完全培養(yǎng)基主要由基礎(chǔ)培養(yǎng)基高糖DMEM， 10%胎牛血清（v/v)，以及1%雙抗（由青霉素和鏈霉素組成，v/v)組成。置于37 °C、C02 體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度培養(yǎng)箱中。每隔2d換液1次。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)平的90%左右， 取其接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔lOOyL，濃度為5X104cells/mL。細(xì)胞生長24h后， 吸棄培養(yǎng)液，用200yLPBS洗1次，加入200yLPBS，用80mj/cm2UVB照射，吸棄PBS，每 孔加入200yL10yg/mL樣品（零濃度用完全培養(yǎng)基取代，即為正常對照)，繼續(xù)培養(yǎng)72h， 吸棄培養(yǎng)液，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果見表1。
[0017] 表 1
合成五肽促進(jìn)UVB損傷人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白產(chǎn)生的應(yīng)用 取上述處理組的細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)液，用無菌水洗細(xì)胞表面兩次，加入冰冷70%乙醇 200yL進(jìn)行固定，在-80 °C冰箱放置至少lOmin，取出后，用無菌水洗細(xì)胞表面兩次，風(fēng)干 水分后，每孔加入200yL1%飽和苦味酸-猩紅染液（m/v)，于4°C條件下輕晃24h，吸棄 染液，用無菌水洗3次，直至沒有染色液洗出為止，加入150yL1MNaOH溶液，150r/min， 震蕩15min，每孔取出100yL置于96孔板中，測定492nm處的吸光度值，