一種促凝血黑莓籽有效成分及其提取分離方法、應(yīng)用
【專利說明】
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促凝血黑莓籽有效成分及其提取分離方 法、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 黑莓沿//wsspp.Blackberry為薔薇科懸鉤子屬聚合果類植物，未作藥用，是世界上新 興的4種小果類果樹之一。原產(chǎn)北美，其果實(shí)酸甜可口，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值， 除鮮食外還大部分制成速凍果、果汁、果酒和果醬等食品。文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)對黑莓研究主要集 中在果實(shí)揮發(fā)油、黑莓籽油脂肪酸成分和黑莓葉、種子中黃酮、花色苷及維生素E含量分析 方面。
[0003] 黑莓籽是黑莓果酒、黑莓汁等加工產(chǎn)品的副產(chǎn)物，含有約27. 14%的功能性油脂， 其中不飽和脂肪酸總量高達(dá)93. 55%，此外還有人體必需的氨基酸，在對抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗 糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)生長和智力發(fā)育等方面具有重要的作用。
[0004] 血液凝固簡稱凝血，是在內(nèi)源性或（和）外源性凝血途徑下產(chǎn)生凝血酶原激活物， 凝血酶原激活物在凝血因子的作用下產(chǎn)生凝血酶，最后凝血酶使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋 白，血液由溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。凝血過程通常分為：①內(nèi)源性凝血途徑；②外源性凝 血途徑；③共同凝血途徑。外源性凝血途徑是從組織因子暴露于血液而啟動(dòng)，到因子X被激 活的過程；臨床上以凝血酶原時(shí)間（PT)測定來反映外源性凝血途徑的狀況。內(nèi)源性凝血途 徑是指從因子XII激活，到因子X激活的過程；臨床上以活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT)來 反映體內(nèi)內(nèi)源性凝血途徑的狀況。從因子X被激活至纖維蛋白形成，是內(nèi)、外源共同凝血途 徑；主要包括凝血酶生成和纖維蛋白形成兩個(gè)階段。
[0005] 機(jī)體凝血系統(tǒng)包括凝血和抗凝兩個(gè)方面，兩者間的動(dòng)態(tài)平衡是正常機(jī)體維持體內(nèi) 血液流動(dòng)狀態(tài)和防止血液丟失的關(guān)鍵。促凝血藥是一些通過加速血液凝固過程或阻止纖維 蛋白溶解作用而起到止血效果的藥物，其主要通過增強(qiáng)體內(nèi)凝血因素或抑制抗凝血因素， 促使凝血，以達(dá)到凝血目的，用于治療各種出血疾病以及創(chuàng)傷性出血等。
[0006]目前尚無薔薇酸對家兔體外血漿凝血四項(xiàng)影響的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種促凝血黑莓籽有效成分，同時(shí)提供一種促凝血黑莓籽有效 成分的提取分離方法和應(yīng)用。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種促凝血黑莓籽有效成分的提取分離方法，包括以下步驟：1)以黑莓籽為原料，黑莓 籽破碎后，用石油醚浸提(浸提3-4次，每次3d)，石油醚浸提液合并揮干石油醚后，加入70%乙醇浸提(浸提3次，每次3d)，乙醇浸提液合并、過濾、濃縮得乙醇總浸膏，依次用溶劑石 油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位； 2)乙酸乙酯部位進(jìn)行200~300目硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，體積比例為100:0~1:1，以TLC薄層色譜檢測合并，得到6個(gè)組分，按照所得組分極性由小到大依次標(biāo) 記為組分1-6(極性判斷時(shí)所用體系為石油醚-乙酸乙酯)，組分1經(jīng)反復(fù)硅膠H、S印hadex LH-20柱色譜得到薔薇酸，薔薇酸即為促凝血黑莓籽有效成分。
[0009] 按照以上提取分離方法得到的促凝血黑莓籽有效成分。
[0010] 促凝血黑莓籽有效成分在制備促凝血藥物方面的應(yīng)用。
[0011] 化合物薔薇酸的結(jié)構(gòu)如下：
[0012] 本發(fā)明采用特殊的方法從黑莓籽的乙酸乙酯部位中分離得到薔薇酸，并對其體外 促凝血效果的考察，結(jié)果表明，薔薇酸具有良好的促凝血效果，可以用于促凝血?jiǎng)?br>【附圖說明】
[0013] 圖1為效果實(shí)驗(yàn)時(shí)的凝血機(jī)制圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1 黑莓籽購于河南省封丘縣黑莓種植基地，為薔薇科懸鉤子屬植物黑莓沿/^wsspp.Blackberry軒。
[0015] 本文中的乙醇濃度均為體積濃度。
[0016] 活性化合物的提取分離方法： (1)黑莓籽破碎后，先用石油醚浸提4次，每次3d，揮干石油醚后，加入70v%乙醇浸 提3次，每次3d，浸提液合并、過濾、濃縮得乙醇總浸膏，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 萃取，回收溶劑，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位； 2)乙酸乙酯部位進(jìn)行200~300目硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫(體積比例為100:0~1:1)，以TLC薄層色譜檢測合并，得到6個(gè)組分，按照所得組分極性由小到大依次標(biāo) 記為組分1-6,組分1經(jīng)反復(fù)硅膠H、SephadexLH-20柱色譜得到薔薇酸，薔薇酸即為促凝 血黑莓籽有效成分。
[0017] 運(yùn)用多種譜學(xué)技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)如下： 薔薇酸：白色粉末，C3QH4S05，EI-MS餘々：488[M]+。iH-NMR(CD30D，400MHZ) 5:0.83, 0.91, 1.03, 1.03, 1.24, 1.39 (3HX6,s,CH3-24, 26, 23, 25, 27), 0.97 (3H,d, ^4.4Hz,H-30), 2.54 (1H,s,H-18),3. 36 (1H,m,H-3), 5.34 (1H,brs,H-12). 13C-NMR(CD30D, 100MHZ) 42.5 (C-l), 67.2 (C-2), 80.1 (C-3), 39.4 (C-4), 49.0 (C-5), 19.3 (C-6), 34.1 (C-7), 41.3 (C-8), 48.2 (C-9), 39.5 (C-10), 24.7 (C-ll), 129.4 (C-12), 140.1 (C-13), 43.1 (C-14), 29.2 (C-15), 27.1 (C-16), 49.3 (C-17), 55.1 (C-18), 73.6 (C-19), 42.7 (C-20), 27.1 (C-21), 39.5 (C-22), 29.2 (C-23), 22.6 (C-24), 16.6 (C-25), 17.6 (C-26), 24.9 (C-27), 182.2 (C-28), 27.1 (C-29), 16.9 (C-30)。
[0018] 薔薇酸的促凝血效果實(shí)驗(yàn)： 方法：家兔體外血漿凝血四項(xiàng)檢測(凝血機(jī)制圖見圖1) 儀器和材料：TGL-16gR高速臺式冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠）；LRH-150生化培 養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；氯化鈉注射液(河北天成藥業(yè)股份有限公司，A14091701); 0.109mol/L枸櫞酸鈉溶液（自制)、維生素&注射液（天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司， 1403112);注射用燈盞花素（湖南恒生制藥有限公司，20110202);凝血酶原時(shí)間（PT)測定 試劑盒（105241);活化部分凝血酶時(shí)間（APTT)測定試劑盒（112175);凝血酶時(shí)間（TT)測定 試劑盒（121132);纖維蛋白原（FIB)含量測定試劑盒（1320701)均由上海太陽生物技術(shù)有 限公司生產(chǎn)。
[0019] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：獺兔，雄性，體重2. 0~2. 5kg，由河南大學(xué)藥學(xué)院中藥研究所提供（醫(yī) 動(dòng)字14-2-6號）。
[0020] 樣品溶液配制：分別取化合物1-6 (1mg)用80yL溶劑溶解制12. 5mg/mL溶 液。取燈盞花素8mg用240yL溶劑溶解制得33. 33mg/mL溶液，維生素&注射液用溶劑 溶解制得維生素I濃度12. 5mg/mL的溶液。溶劑為：DMS0:1，2-丙二醇=3:2 (體積比)。
[0021] 實(shí)驗(yàn)方法： (1)對APTT影響的檢測方法 血漿的制備：家兔耳緣靜脈取血3. 6mL，置于含有0. 109mol/L枸櫞酸鈉400yL的4mL離心管中，輕輕顛倒混勻，3000rpm離心15min，取上層清液備用。
[0022] 在測試杯中加入20yL樣品溶液，再加入100yL血漿和37 °C預(yù)溫的APTT試劑 100 1^，37°(：孵育5 111111后加入37°(：預(yù)溫的 0.025 111〇1/1〇3(：12溶液100 1^，記錄凝固 時(shí)間。
[0023] (2)對PT影響的檢測方法 血漿制備方法同（1)，在測試杯中加入20yL的樣品溶液，再加入100yL的血漿，37 °C孵育3min后加入37 °C預(yù)溫的PT試劑200yL，記錄凝固時(shí)間，即為PT值。
[0024] (3)對TT影響的檢測方法 血漿制備方法同（1)，在測試杯中加入40yL樣品溶液和200yL的血漿，孵育3min后加入TT試劑200yL，記錄凝固時(shí)間，即為TT值。
[0025] (4)對FIB影響的檢測方法 血漿制備方法同（1)，按照試劑說明書定標(biāo)準(zhǔn)曲線，取200yL血漿和100yL樣品，然 后加入700yL緩沖液?；靹蚝?，取稀釋后的血漿200yL，37°C預(yù)溫3min，加入凝血酶溶 液100yL，測定凝固時(shí)間，記錄纖維蛋白原的含量。
[0026] 數(shù)據(jù)處理：結(jié)果采用算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值統(tǒng)計(jì)采用SPSS19. 0軟件單因 素方差分析法（One-WayAN0VA)比較其顯著性差異。測定結(jié)果見表1。
[0027]表1黑莓籽化合物對家兔凝血時(shí)間的影響（靈±3
注：與空白組相比：AAA/"< 0. 001. 與燈盞花素組相比：*乃〇. 05 與維生素I組相比：0? 001〈 ##尸< 0? 01，###尸< 0? 001. 與空白組相比，薔薇酸促凝血效果有極顯著差異（尸<〇.〇〇1)，說明本發(fā)明從黑莓籽中 分離得到的薔薇酸具有良好的促凝血效果，可用于促凝血?jiǎng)?br>【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促凝血黑莓籽有效成分的提取分離方法，其特征在于，包括以下步驟：1)以黑 莓籽為原料，黑莓籽破碎后，用石油醚浸提，石油醚浸提液合并、揮干石油醚后，加入70 %乙 醇浸提，乙醇浸提液合并、過濾、濃縮得乙醇總浸膏，依次用溶劑石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 萃取，回收溶劑，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位； 2)乙酸乙酯部位進(jìn)行200~300目硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，體積比例為 100:0~1:1，以TLC薄層色譜檢測合并，得到6個(gè)組分，按照所得組分極性由小到大依次標(biāo)記 為組分1-6,組分1經(jīng)反復(fù)硅膠H、S印hadex LH-20柱色譜得到薔薇酸，薔薇酸即為促凝血 黑莓籽有效成分。2. 利用權(quán)利要求1提取分離方法得到的促凝血黑莓籽有效成分。3. -種權(quán)利要求2所述的促凝血黑莓籽有效成分在制備促凝血藥物方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種促凝血黑莓籽有效成分及其提取分離方法、應(yīng)用。本發(fā)明采用特殊的方法從黑莓籽的乙酸乙酯部位中分離得到薔薇酸，并對其體外促凝血效果的考察，結(jié)果表明，薔薇酸具有良好的促凝血效果，可以用于制備促凝血?jiǎng)?br>【IPC分類】A61K31/56, A61P7/04, C07J63/00
【公開號】CN105131075
【申請?zhí)枴緾N201510499997
【發(fā)明人】康文藝, 張勇, 謝平耀, 張娟娟, 何楠, 余琦
【申請人】河南大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年8月14日