本發(fā)明屬于藥物
技術(shù)領域：
，具體地，本發(fā)明涉及三七廢渣中三七素的提取方法；還涉及三七廢渣中提取的三七素的應用。
背景技術(shù)：
：三七[panaxnotoginseng(burk.)f.h.chen]是我國珍貴的藥材。具有散瘀止血、消腫止痛的功效。道地產(chǎn)地是云南文山。三七有效成分包括皂苷、三七素、黃酮、聚炔醇、多糖、脂肪酸以及環(huán)肽類等。目前對三七有效成分的研究利用主要集中在皂苷成分。三七主產(chǎn)地云南文山的三七常年種植面積達到了12萬畝左右，產(chǎn)量9000噸，每年用于提取三七皂苷的三七量約為1400噸，皂苷提取后，其他有效成分多被當作廢渣廢液棄去。據(jù)統(tǒng)計，工業(yè)上，每年用于提取三七皂苷的三七約為1400噸，廢渣約為400噸，測定工業(yè)三七廢渣中三七素含量為0.72％，每年棄去的三七素近3噸。公開號為cn1865232a的中國發(fā)明專利申請公開了從三七中提取三七素的方法，包括如下步驟：(1)將三七用5-15倍的體積比為95％的乙醇溶液，醇提10-20h；再用2-10倍的體積比為95％的乙醇，醇提4-10h；(2)合并兩次醇提液，將殘渣晾干，加入10-20倍量的水浸提，提取10-20h，再用2-10倍量的水浸提，提取4-10h，提取溫度為室溫；(3)過濾，濾液濃縮，加入乙醇調(diào)節(jié)醇濃度為50-90％，攪拌，靜置0.5-2h；(4)過濾，濾液再用等體積正丁醇萃取，合并水相；(5)將(4)中合并水溶液直接過以苯乙烯和二乙烯苯為單體聚合的離子交換樹脂柱，先用水沖洗，再用氨水溶液洗脫，氨水溶液濃度為0.05m-0.2m；(6)將過離子交換樹脂柱液減壓濃縮至干，加水溶解，用丙酮沉淀，丙酮量為水溶液體積的10-50倍；(7)將沉淀物過濾，重結(jié)晶，過濾后用丙酮洗至白色，得到純度為99％以上的三七素。以上現(xiàn)有技術(shù)中，采用正丁醇進行萃取，而正丁醇具有特殊氣味，讓人反胃；蒸汽可能引起困倦和眩暈；刺激呼吸系統(tǒng)和皮膚；而且在現(xiàn)有技術(shù)中，工業(yè)三七廢渣并沒有得到充分的利用，而是從三七中95％乙醇一去皂苷后，將廢渣用于提取其中的三七素，而工業(yè)上三七中提取皂苷的方法過程與以上文件不同，產(chǎn)生的三七廢渣也與之不同，采用以上方法不能保證能從工業(yè)三七廢渣中得到三七素。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服以上現(xiàn)有技術(shù)中工業(yè)三七廢渣沒有得到充分利用的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種三七素的提取方法，該方法充分利用了工業(yè)三七廢渣，并且能夠保證最終從工業(yè)三七廢渣中得到的有三七素。為了達到以上目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種三七素的提取方法，包括以下步驟：a、三七素的粗提：取工業(yè)三七廢渣進行兩次水浸提；收集并合并兩次水浸提的濾液，并將合并后的濾液進行離心，取上清液進行濃縮得濃縮液；向濃縮液中加入乙醇，然后靜置、抽濾，得濾液，并回收抽濾得到的濾液中的乙醇，得余下的三七素粗提液；b、三七素粗提液鑒別：采用薄層層析法(thinlayerchromatography，簡稱tlc)對粗提液進行鑒別，判斷所述三七素粗提液中是否含有三七素；c、三七素的純化：步驟b中鑒別結(jié)果顯示所述三七素粗提液中含有三七素時，對三七素粗提液進行純化，得到洗脫液；d、洗脫液鑒別：采用薄層層析法(tlc)對所述洗脫液進行鑒別，判斷所述洗脫液中是否含有三七素；e、結(jié)晶：合并含有與三七素對照品有相同rf值且只有一個斑點的洗脫液，并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加水使其剛好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量晶體沉淀；f、重結(jié)晶：步驟e中得到的晶體沉淀和溶液用0.2μm微孔濾膜過濾，收集晶體沉淀，且向所述晶體沉淀加水使其剛好完全溶解得到水溶液；并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加水使其剛好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量重結(jié)晶晶體沉淀，然后用0.2μm微孔濾膜過濾，收集重結(jié)晶晶體沉淀并加水使其剛好完全溶解，得到三七素水溶液；g、三七素水溶液的鑒別；采用薄層層析法進行檢測；h、步驟g中檢測結(jié)果顯示為所述三七素水溶液僅有一個斑點且與三七素對照品有相同rf值，將所述三七素水溶液進行冷凍干燥，得到三七素供試品。工業(yè)上，從三七中提取皂苷的步驟大概如下：將粉碎后的三七剪口，從投料口投入多功能提取罐內(nèi)，然后關(guān)閉投料口。按產(chǎn)品工藝規(guī)程的要求，加入原料的2.8倍量80％(2％)的乙醇，打開蒸汽閥進行溫浸(60-80℃)提取四次；第一次提取不得低于20小時，第二次提取不得低于12小時，第三、四次不低于8小時。每次放凈提取液；從多功能提取罐底部加熱廢渣，產(chǎn)生酒精蒸汽，冷凝酒精蒸汽，收集酒精溶液至酒精濃度為15-20％；廢渣在太陽下暴曬至水分至9％以下，裝麻袋，當廢料丟棄?？梢姡I(yè)上從三七中提取皂苷的過程與試驗室不同：首先，量不同，試驗室一般量較小，而工業(yè)上用的三七的量要比試驗室大很多；第二，工業(yè)上從三七中提取皂苷所用乙醇的濃度與試驗室不同，試驗室一般用95％的乙醇來提取三七中的皂苷；而工業(yè)上不會用這么高濃度的乙醇來提取三七中的皂苷，一般用的75％-80％的乙醇濃度，乙醇濃度小，溶液中水含量更多，那么三七中的三七素則更容易被提取出去，所以工業(yè)上的三七廢渣中三七素的含量可能比試驗室三七廢渣中的三七素的含量低更多，甚至有可能工業(yè)上的三七廢渣中已經(jīng)沒有三七素；第三，工業(yè)上從三七中提取皂苷的次數(shù)也與試驗室不一樣，工業(yè)上提取皂苷的次數(shù)一般為四次，而試驗室一般僅提取兩次；第四，工業(yè)上提取皂苷的工藝條件也不一樣，如提取的溫度、時間、真空度等，工業(yè)上一般采取60-80℃的溫度提取，有時還會采用真空條件，這種情況下，三七素很容易被破壞，從而導致工業(yè)三七廢渣中可能不存在三七素；第五，工業(yè)上提取皂苷個過程中沒可能還會添加酸或堿來調(diào)節(jié)ph，這樣也可能會破壞三七素，導致三七廢渣中可能沒有三七素的存在。采用本發(fā)明的三七素提取方法，在從工業(yè)三七廢渣中提取三七素的過程中，在多個節(jié)點采用薄層層析法進行鑒別，確定存在三七素后，再繼續(xù)后續(xù)的純化、結(jié)晶、干燥等等，以確保最終得到的供試品中含有三七素；而如果在粗提液的鑒別中就不存在三七素，則放棄所用工業(yè)廢渣，不繼續(xù)進行粗提液的純化、結(jié)晶、干燥等，可最大化保證資源的再利用與不浪費。優(yōu)選的是，步驟a中，所述兩次水浸提為：第一次水浸提是在50℃-80℃恒溫水浴提取8小時，第二次水浸提是在50℃-80℃恒溫水浴提取8小時。上述任一方案優(yōu)選的是，第一次水浸提，工業(yè)廢渣中加入6-10倍量的蒸餾水。上述任一方案優(yōu)選的是，第二次水浸提，第一次水浸提的濾渣中加入3-5倍量的蒸餾水。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，收集兩次水浸提的濾液的操作為：將兩次水浸提溶液采用紗布粗濾，再將紗布粗濾得到的濾渣用離心機分離，傾倒上清液，得兩次水浸提的濾液。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，取上清液濃縮至所述上清液體積的1/5，得濃縮液。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，上清液濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行，溫度為50-80℃。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，濃縮液中加入3倍量的無水乙醇，然后在4℃下靜置24小時。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，所述抽濾采用化學分析濾紙，真空度為0.06-0.08mpa。上述任一方案優(yōu)選的是，回收抽濾得到的濾液中的乙醇時，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，溫度為50℃-80℃。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟b中，判定三七素粗提液中不存在三七素時，更換工業(yè)三七廢渣重新進行步驟a。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟c中，所述對三七素粗提液進行純化時，采用001×7陽離子交換樹脂柱，其尺寸為3cm×20cm(長度)。001×7樹脂是凝膠樹脂，而且001×7樹脂是以苯乙烯—二乙烯苯共聚交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子基體上帶有磺酸基(—so3h)的離子交換樹脂，相比于以苯乙烯—二乙苯為單體聚合的離子交換樹脂，純化效果好。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟c中，用001×7陽離子交換樹脂柱純化時，流速為0.1-0.25ml/min。流速過大，純化效果變差，而流速太慢，在純化效果基本不變的情況下，耗時更長，效率低下。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟c中，用001×7陽離子交換樹脂柱純化時，流速為0.15ml/min。這個流速下，純化效果和效率達到最佳平衡。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟c中，對三七素粗提液進行純化時，先用水洗脫，收集水洗脫液，至無色；再用氨水洗脫，收集氨水洗脫液。上述任一方案優(yōu)選的是，所述氨水洗脫液，用茚三酮顯色，直至洗脫液不顯紫色，結(jié)束沖洗。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟d中，將茚三酮顯色結(jié)果顯紫色的各洗脫液與三七素對照品在硅膠板上進行點樣，展開劑為正丁醇：冰醋酸：乙醇：水＝4:1:1:2，且茚三酮溶液為顯色劑。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟e中，合并含有與三七素對照品有相同rf值且只有一個斑點的洗脫液后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50-80℃下濃縮蒸干，然后加入蒸餾水使其剛好完全溶解，加入此時溶液體積30倍量的丙酮，析出晶體沉淀。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟f中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干時的溫度為50-80℃，且加入的丙酮的量為加入丙酮前溶液體積的30倍量。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟h中，所述冷凍干燥的操作為：(1)、預凍：在-40℃預凍12h；(2)、在真空度為0.05-0.07mbar、溫度為-49℃條件下，凍存38h。本發(fā)明提供的三七素提取方法，得到的三七素供試品，三七素含量50％以上，止血效果好，且合理利用工業(yè)三七廢渣，實現(xiàn)資源的再利用，節(jié)約能源，成本低。本發(fā)明第二方面的目的是提供一種三七氨基酸的提取方法，包括以下步驟：a、三七氨基酸的粗提：取工業(yè)三七廢渣進行兩次水浸提；收集并合并兩次水浸提的濾液，并將合并后的濾液進行離心，取上清液進行濃縮得濃縮液；向濃縮液中加入乙醇，然后靜置、抽濾，得濾液，并回收抽濾得到的濾液中的乙醇，得余下的三七素粗提液；b、三七氨基酸粗提液鑒別：采用薄層層析法(thinlayerchromatography，簡稱tlc)對粗提液進行鑒別，判斷所述三七氨基酸粗提液中是否含有氨基酸；c、三七氨基酸的純化：步驟b中鑒別結(jié)果顯示所述三七氨基酸粗提液中含有氨基酸時，對三七氨基酸粗提液進行純化，得到洗脫液；d、洗脫液鑒別：采用薄層層析法(tlc)對所述洗脫液進行鑒別，判斷所述洗脫液中是否含有氨基酸；e、結(jié)晶：合并含有與三七素對照品水溶液有相同斑點且還有其他斑點的洗脫液，并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加水使其完全溶解，然后加入丙酮，析出大量晶體沉淀；f、重結(jié)晶：步驟e中得到的晶體沉淀和溶液用0.2μm微孔濾膜過濾，收集晶體沉淀，且向晶體沉淀加水使其剛好完全溶解得到水溶液；并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加水使其剛好完全溶解，然后加入丙酮，析出大量重結(jié)晶晶體沉淀，然后用0.2μm微孔濾膜過濾，收集重結(jié)晶晶體沉淀并加水使其剛好完全溶解，得到三七素氨基酸水溶液；g、三七氨基酸水溶液的鑒別；采用薄層層析法進行檢測，判斷該水溶液中是否含有氨基酸；h、步驟g中檢測結(jié)果顯示為所述三七氨基酸水溶液與三七素照品有相同斑點，且還有其他斑點，然后將所述三七氨基酸水溶液進行冷凍干燥，得到三七氨基酸供試品。優(yōu)選的是，步驟a中，所述兩次水浸提為：第一次水浸提和是在50℃-80℃恒溫水浴提取8小時，第二次水浸提是在50℃-80℃恒溫水浴提取8小時。上述任一方案優(yōu)選的是，第一次水浸提，工業(yè)廢渣中加入6-10倍量的蒸餾水。上述任一方案優(yōu)選的是，第二次水浸提，第一次水浸提的濾渣中加入3-5倍量的蒸餾水。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，收集兩次水浸提的濾液的操作為：將兩次水浸提溶液采用紗布粗濾，再將紗布粗濾得到的濾渣用離心機分離，傾倒上清液，得兩次水浸提的濾液。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，取上清液濃縮至所述上清液體積的1/5，得濃縮液。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，上清液濃縮采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行，溫度為50-80℃。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，濃縮液中加入3倍量的無水乙醇，然后在4℃下靜置24小時。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟a中，所述抽濾采用化學分析濾紙，真空度為0.06-0.08mpa。上述任一方案優(yōu)選的是，回收抽濾得到的濾液中的乙醇時，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，溫度為50-80℃。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟b中，判定三七氨基酸粗提液中不存在氨基酸時，更換工業(yè)三七廢渣重新進行步驟a。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟b中，所述對三七氨基酸粗提液進行純化時，采用001×7陽離子交換樹脂柱，其尺寸為3cm×20cm(長度)。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟c中，用001×7陽離子交換樹脂柱純化時，流速為0.15ml/min。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟c中，對三七氨基酸粗提液進行純化時，先用水洗脫，收集水洗脫液，至無色；再用氨水洗脫，收集氨水洗脫液。上述任一方案優(yōu)選的是，所述氨水洗脫液，用茚三酮顯色，直至洗脫液不顯紫色，結(jié)束沖洗。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟d中，將茚三酮顯色結(jié)果顯紫色的各洗脫液與三七素對照品在硅膠板上進行點樣，展開劑為正丁醇：冰醋酸：乙醇：水＝4:1:1:2，且茚三酮溶液為顯色劑。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟e中，合并含有與三七素對照品有相同斑點且還有其他斑點的洗脫液后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50-80℃下濃縮蒸干，然后加入蒸餾水使其剛好完全溶解，加入此時溶液體積30倍量的丙酮，析出晶體沉淀。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟f中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干時的溫度為50-80℃，且加入的丙酮的量為加入丙酮前溶液體積的30倍量。上述任一方案優(yōu)選的是，步驟h中，所述冷凍干燥的操作為：(1)預凍：在-40℃預凍12h；(2)在真空度為0.05-0.07mbar、溫度為-49℃條件下，凍存38h。本發(fā)明提供的三七氨基酸提取方法，得到的三七氨基酸供試品，含有三七素，具有止血效果，且合理利用工業(yè)三七廢渣，實現(xiàn)資源的再利用，節(jié)約能源，成本低。第三方面，本發(fā)明另一目的在于提供通過本發(fā)明第一方面提供的三七素提取方法得到的三七素的應用，得到的三七素用于制備具有止血功能的牙膏。第四方面，本發(fā)明另一目的在于提供通過本發(fā)明第一方面提供的三七素提取方法得到的三七素的應用，得到的三七素用于制備具有止血功能止血產(chǎn)品，如創(chuàng)可貼、止血噴劑、止血凝膠、止血粉、含片、內(nèi)服產(chǎn)品等等。本發(fā)明充分、合理利用了工業(yè)三七廢渣，實現(xiàn)資源再利用，且采用本發(fā)明的方法，保證提取的產(chǎn)品含有三七素，真正實現(xiàn)了資源再利用，變廢為寶。采用本發(fā)明的三七氨基酸提取方法，得到的產(chǎn)品中含有少量三七素，同時還含有其他種類的氨基酸，也可用于輕微出血的止血，同時，其中的氨基酸也得到提取，也可以用于制備其他產(chǎn)品，既能補充氨基酸又能預防出血。附圖說明圖1是按照本發(fā)明的三七素提取方法的一優(yōu)選實施例的工藝流程圖。圖2是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液的tlc結(jié)果圖，其中，a代表三七素對照品溶液，b代表三七素粗提液。圖3-1是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第1-18管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-2是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第19-36管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-3是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第37-54管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-4是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第55-72管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-5是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第73-90管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-6是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第91-108管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-7是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第109-126管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-8是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第127-144管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-9是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第145-162管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖3-10是圖1所示三七素提取方法得到的三七素粗提液純化的氨水洗脫液第163-180管和三七素對照片的tlc結(jié)果圖。圖4是本發(fā)明采用的三七素對照品hplc色譜圖。圖5是是圖1所示三七素提取方法得到的三七素供試品hplc色譜圖。圖6是按照本發(fā)明的三七氨基酸提取方法的一優(yōu)選實施例的工藝流程圖。具體實施方式為了更加清楚、正確地理解本發(fā)明的
發(fā)明內(nèi)容，下面結(jié)合附圖及具體實施例進行進一步詳細的闡述。本發(fā)明采用的三七素對照品購買自上海純優(yōu)生物科技，純度>98％；其他原料均為市售，001×7樹脂柱來自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司樹脂分廠。工業(yè)三七廢渣為昆藥制藥集團股份有限公司所提供，為提取過三七總皂苷后的廢渣，三七總皂苷的提取操作如下：1.1將粉碎后的三七剪口，從投料口投入多功能提取罐內(nèi)，然后關(guān)閉投料口。1.2按產(chǎn)品工藝規(guī)程的要求，加入原料的2.8倍量80％(±2％)的乙醇，打開蒸汽閥進行溫浸(60-80℃)提取四次。1.3第一次提取不得低于20小時，第二次提取不得低于12小時，第三、四次不低于8小時。每次放凈提取液。1.4吹渣：從多功能提取罐底部加熱廢渣，產(chǎn)生酒精蒸汽，冷凝酒精蒸汽，收集酒精溶液至酒精濃度為15-20％。1.5廢渣在太陽下暴曬至水分至9％以下，裝麻袋，當廢料丟棄。實施例1一種三七素的提取方法，包括以下步驟：1、三七素的提取取工業(yè)三七廢渣1kg，加6-10倍量體積的蒸餾水在50-80℃的恒溫水浴鍋中提取8h，收集濾液(紗布粗濾，再用離心機分離，4500r/min，離心10min，傾倒上清液)，濾渣加3-5倍量體積的蒸餾水在50-80℃的恒溫水浴鍋中提取8h，收集濾液，合并兩次濾液。以4500r/min，離心5min，傾倒上清液，將上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，轉(zhuǎn)速40r/min，50-80℃旋轉(zhuǎn)濃縮至原體積的1/5，加入3倍量無水乙醇，4℃下靜置24h，抽濾(采用化學分析濾紙，真空度為0.06-0.08mpa)；將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50-80℃下回收乙醇，得粗提液。2、粗提液經(jīng)薄層層析法(tlc)鑒別含有三七素斑點：分別取三七素對照品儲備液和三七素粗提液1ml在硅膠板上點樣，展開劑為正丁醇：冰醋酸：乙醇：水(4:1:1:2)，加入10μl茚三酮溶液為顯色劑，在110℃下顯色5min，觀察粗提液是否有三七素的斑點，結(jié)果如圖2所示，可判定粗提液中含有三七素。如果在這步鑒別結(jié)果顯示，三七素粗提液中不存在三七素，則，放棄后面的操作并更換所用的工業(yè)廢渣，重新從第1步開始。3、三七素粗提液的純化：取粗提液30ml，用3cm×20cm的001×7陽離子交換樹脂柱純化，流速為0.2ml/min，先用水洗脫，收集洗脫液，每管10ml，直至洗脫液為無色；再用0.1mol/l氨水洗脫，收集洗脫液，每管10ml，茚三酮顯色(每管洗脫液吸取1ml置試管中，加顯色劑10μl，置電爐加熱，觀察是否顯色)，從茚三酮顯色結(jié)果顯示紫色的第一管洗脫液開始編號，編號為1，后面依次編號，直至洗脫液不顯紫色，結(jié)束洗脫。d001樹脂以苯乙烯—二乙苯為單體聚合的離子交換樹脂，孔徑大；001×7樹脂是凝膠樹脂，而且001×7樹脂是以苯乙烯—二乙烯苯共聚交聯(lián)結(jié)構(gòu)的高分子基體上帶有磺酸基(—so3h)的離子交換樹脂，純化效果好。在純化這個步驟，收集洗脫液時，每管的體積并不是固定的，如顯色較重，可一管多收集一些，如果顯色非常淺，可以每管少量收集，根據(jù)實際情況做調(diào)整。4、洗脫液鑒定：取步驟3中茚三酮顯色結(jié)果中顯色的各洗脫液與三七素對照品各1ml在硅膠板上點樣，展開劑為正丁醇：冰醋酸：乙醇：水(4:1:1:2)，茚三酮溶液為顯色劑(110℃顯色5min)，觀察哪些管中有三七素的斑點，結(jié)果如圖3-1至3-10所示。5、結(jié)晶：合并與三七素對照品斑點有相同rf值且只有一個斑點的流份(從圖3-3至圖3-10所對應的的所有管中的氨水洗脫液，即第37-180管中的氨水洗脫液)。合并液于50-80℃下的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干，加適量水使其剛好全部溶解，然后此時溶液體積加入30倍量的丙酮，析出大量沉淀，含有沉淀的溶液過0.2μm微孔濾膜，沉淀用少量水溶解得水溶液。6、重結(jié)晶：步驟5最后所得水溶液繼續(xù)用同樣的方法再次結(jié)晶，即，先旋轉(zhuǎn)濃縮蒸干，然后加適量水使其剛好完全溶解，加入此時溶液體積的30倍量的丙酮，析出大量重結(jié)晶晶體沉淀，并加入適量水使重結(jié)晶晶體沉淀剛好完全溶解，得到三七素水溶液。7、三七素水溶液鑒別：將所得三七素水溶液，進行薄層檢測驗證，驗證結(jié)果顯示三七素水溶液僅有一個斑點且與三七素對照品有相同rf值。8、經(jīng)過步驟7的確定后，將三七素水溶液冷凍干燥，得三七素供試品，備用。其中，冷凍干燥的操作為：首先，預凍：在零下40℃預凍12h；然后在真空度為0.05-0.07mbar、溫度為-49℃條件下，凍存38h。實施例2.1一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在60℃下進行。實施例2.2一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在70℃下進行。實施例2.3一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在80℃下進行。實施例3.1一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，對三七素粗提液進行純化時，流速為0.1ml/min。實施例3.2一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，對三七素粗提液進行純化時，流速為0.25ml/min。實施例3.3一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，對三七素粗提液進行純化時，流速為0.15ml/min。實施例4一種三七氨基酸的提取方法，與實施例1大部分相同，不同的是，步驟5中，不是合并與三七素對照品斑點有相同rf值且只有一個斑點的流份(從圖3-3至圖3-10所對應的的所有管中的氨水洗脫液，即第37-180管中的氨水洗脫液)，而是合并剩余的含有與三七素對照品有相同斑點但還有其他斑點的流份(即圖3-1和圖3-2所對應的所有管中的氨水洗脫液，即第1-36管中的氨水洗脫液)，用同樣的方法接近、重結(jié)晶、驗證、冷凍干燥，得三七氨基酸供試品，備用。實施例2.1-2.3及3.1-3.3中的變量，同樣適用于實施例4。實施例5通過本發(fā)明的三七素提取方法得到的三七素的應用，用于制備具有止血功能的牙膏，該牙膏原料配比：(重量百分比，下同)該牙膏制備方法如下：(1)按組分比例備料。(2)將三七素、糖精鈉、苯甲酸鈉、焦磷酸四鈉加入去離子水中，溶解。(3)取備料中的摩擦劑、表面活性劑、粘合劑、潤濕劑、香精和其他輔料，分別加入到第(2)步驟的溶液中。加入的同時啟動慢速刮板攪拌攪拌至充分混勻，啟動高速攪拌機、抽真空制成均勻膏體。(4)把制膏機內(nèi)的膏體盡量吸入貯存罐再次進行攪拌，滅菌，分裝。其中，所述三七素為實施例1中三七素提取方法得到的三七素供試品。通過本發(fā)明的三七素提取方法得到的三七素的應用，還可以用于制備具有止血功能的生物制品，如如創(chuàng)可貼、止血噴劑、止血凝膠、止血粉等等，而其制備方法可采用其常規(guī)的制備方法，僅僅是在其原料中加入本發(fā)明所得的三七素供試品。對比例1一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，對三七素粗提液進行純化時，流速為0.3ml/min。對比例2一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在40℃下進行。對比例3一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，第一次和第二次水浸提是在90℃下進行。對比例4一種三七素提取方法，與實施例1不同的是，經(jīng)過步驟7的確定后，將三七素水溶液置50℃烘箱干燥，最后發(fā)現(xiàn)三七素被破壞。以上實施例中供試品中三七素含量的測定按照以上實施例的方法，分別準備三批樣品，分別進行含量測定，最終去平均值作為三七素的含量。色譜條件：色譜柱：hypersilods2(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：溶劑a:溶劑b(95:5，v:v)，溶劑a為0.001％的醋酸溶液，溶劑b為乙腈:甲醇:水(45:10:45,v:v:v)的混合溶液；流速1.0ml/min，檢測波長：214nm，柱溫為30℃，進樣量為20μl。三七素對照品溶液的配制：精密稱取三七素對照品2.5mg，置25ml容量瓶中，用流動相(蒸餾水)稀釋至刻度，搖勻，即得三七素對照品儲備液。臨用前用0.2μm微孔濾膜過濾。供試品溶液的配制：精密稱取供試品2.5mg，置25ml容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。臨用前用0.2μm微孔濾膜過濾。標準曲線的制備：精密吸取對照品儲備液適量，用流動相配制成濃度分別為20、40、60、80、100μg/ml的對照品溶液，搖勻，依次進樣20μl，按上述色譜條件測定，以三七素對照品濃度c為橫坐標，峰面積a為縱坐標進行線性回歸?；貧w方程為a＝1864.1c-24596，r＝0.99979，結(jié)果表明三七素對照品濃度在20μg/ml～100μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。精密度試驗：精密吸取濃度為0.1mg/ml的對照品溶液，按照色譜條件進樣20μl，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，計算rsd值。進樣量20μl的三七素對照品峰面積依次為162846、163192、162767、165971、161488、163790，rsd為0.81％。結(jié)果表明，用于本品的檢測儀器精密度良好。重復性試驗：精密稱取同一批號供試品5份，供試品溶液的制備，制備6份供試品溶液，分別測定，記錄峰面積，計算rsd值。三七素供試品進樣6次，峰面積依次為96762、95693、96848、96380、97434、95971，rsd為0.66％。結(jié)果表明，此方法重復性良好。穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一對照品溶液，分別在0、2、4、6、8、10h進樣測定，記錄峰面積，計算rsd值。0、2、4、6、8、10h的峰面積依次為96424、95984、96118、97357、96288、97165，rsd為0.59％。結(jié)果表明，本供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定性良好。加樣回收率試驗：精密量取待測樣品6份，按照3.3.3中“供試品溶液的制備”方法操作，分別加入三七素對照品(對照品濃度為0.1mg/ml)0.4ml，即加入0.04mg三七素，進樣20μl，測定峰面積，計算回收率。將已加入對照品的供試品峰面積與供試品自身峰面積比較，差值代入回歸方程，rsd為0.47％。結(jié)果表明，本方法加樣回收率良好。含量測定：稱取供試品2.5mg，按照供試品溶液的制備方法，每個實施例的方法得到的供試品分別準備供試液3份，進樣20μl，得到供試品的hplc圖(圖4示出三七素對照品的hplc圖，圖5示出實施例1的三七素供試品的hplc圖)，計算峰面積，然后對應標準曲線，計算三七素的含量，見表1，對于三七素粗提液，直接進樣三七素粗提液20μl。表1三七素供試品中三七素的含量測定結(jié)果(n＝3)40℃提取，在相同時間內(nèi)，提取得到的三七素純度小很多，而需要達到相同的量，則需要很長的時間；三七素粗提液中，三七素的含量均可達到8％，如果這個純度可以滿足需要，也可以將粗提液進行結(jié)晶、重結(jié)晶和干燥或直接進行干燥得到供試品，以備使用。凝血藥理實驗(以實施例1為例)1.給藥劑量的選擇實施例1中，經(jīng)001×7陽離子交換樹脂柱純化后的三七素粗品的純度為59.03％，本課題凝血實驗設定的三七素低、中、高濃度分別為9.4mg/kg、18.9mg/kg、37.8mg/kg，分別稱取三七素供試品固體3.2mg、6.4mg、12.8mg，依次加入2ml生理鹽水，配制成濃度為1.6mg/ml、3.2mg/ml、6.4mg/ml的注射液。經(jīng)預實驗測定三七素的凝血時間，發(fā)現(xiàn)中濃度效果最好，所以在后面的凝血時間實驗中，三七素粗提液組(三七素含量：8.07％)和三七氨基酸組(三七素含量：20.0％)中三七素的濃度均設定為18.9mg/kg。2.三七素對小鼠凝血時間的影響取昆明種小鼠35只，隨機分為7組，5只/組，分別用苦味酸標記。組別分別為生理鹽水組(陰性對照組)、酚磺乙胺注射液組(陽性對照組，25mg/ml)、三七素粗提液注射液組(27mg/ml)、三七氨基酸注射液組(9.4mg/ml)、三七素粗品低濃度組(1.6mg/ml)、三七素粗品中濃度組(3.2mg/ml)、三七素粗品高濃度組(6.4mg/ml)。腹腔注射給藥，劑量為10ml/kg。30min后用眼科彎鑷迅速摘去小鼠一側(cè)眼球，即有血液流出。將血滴至干凈的載玻片上，血滴直徑約為5mm，滴血同時用秒表計時，每隔10s用清潔針頭自血滴邊緣向里輕輕挑動1次，觀察有無血絲挑起，記錄凝血時間。從采血開始到挑起血絲止，所歷時間為凝血時間。采用spss統(tǒng)計學軟件中的單變量方差分析法對各組凝血時間進行比較，結(jié)果如表2和表3所示。表2三七素對小鼠凝血時間的影響(n＝5)組別給藥劑量(mg/kg)凝血時間(s)生理鹽水組0163.4±36.74酚磺乙胺注射液組25085.20±21.44**三七素粗提液組27042.00±17.60**三七氨基酸組9450.00±24.40**三七素供試品低濃度組1628.20±11.05**三七素供試品中濃度組3224.60±8.320**三七素供試品高濃度組6438.40±12.00**注：與生理鹽水組相比，*p<0.05,**p<0.01表3三七素對小鼠凝血時間的影響(n＝5)組別給藥劑量(mg/kg)凝血時間(s)酚磺乙胺注射液組25085.20±21.44三七素粗提液組27042.00±17.60**三七氨基酸組9450.00±24.40*三七素供試品低濃度組1628.20±11.05**三七素供試品中濃度組3224.60±8.320**三七素供試品高濃度組6438.40±12.00**注：與酚磺乙胺組相比，*p<0.05,**p<0.01從表2和表3可以看出，含有三七素的各組與生理鹽水組比較，能縮短凝血時間(p<0.01)。含有三七素的各組與酚磺乙胺注射液組比較，凝血時間縮短。含有三七素的各組間相互比較，p>0.05，差異沒有統(tǒng)計學意義。酚磺乙胺注射液是一個公認的止血藥，而本發(fā)明的三七素提取方法得到的三七素的凝血時間好更短，說明止血效果更好，也就是說，在能達到的效果沒有變差(實際上是更好)的情況下，還充分利用了工業(yè)廢棄物，變廢為寶，實現(xiàn)資源再利用。需要說明的是，以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術(shù)人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍。當前第1頁12