D-氨基酸抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌生物膜及其培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域，公開了一種D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌細(xì)菌生物膜中的應(yīng)用及其培養(yǎng)基。本發(fā)明篩選的D-氨基酸可顯著有效抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的細(xì)菌生物膜的生長。本發(fā)明篩選獲得4種可顯著抑制細(xì)菌性軟腐病菌的細(xì)菌生物膜生長的D-氨基酸，D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸；并獲得其最低抑制濃度。本發(fā)明還提供了上述4種D-氨基酸的混配配方，大大降低了各種D-氨基酸的使用濃度。本發(fā)明還提供了一種用于上述應(yīng)用的D-氨基酸培養(yǎng)基?；诒景l(fā)明的內(nèi)容可為開發(fā)細(xì)菌性軟腐病菌的防治新技術(shù)提供新的方法及思路；結(jié)合D-氨基酸使用，提高化學(xué)農(nóng)藥、生物農(nóng)藥等防治方法的使用效果。
【專利說明】D-氨基酸抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌生物膜及其培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害防治領(lǐng)域，特別涉及一種D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟 腐病菌細(xì)菌生物膜中的應(yīng)用及其培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002] 香蕉主要生長在熱帶、亞熱帶地區(qū)，已至少有107個(gè)國家生產(chǎn)香蕉；2013年，香 蕉是產(chǎn)值全球第四大的食用植物，僅次于米、麥及玉米，近10年全世界香蕉種植面積呈增 長的趨勢。然而，該作物現(xiàn)已受到香蕉細(xì)菌性軟腐病的嚴(yán)重危害；從本研宄組首次報(bào)道的 Dickeya sp.引起的香蕉細(xì)菌性軟腐病在中國大陸的發(fā)生（Lin et al，2010)起，細(xì)菌性軟 腐病的擴(kuò)展蔓延速度迅速，在廣東香蕉主要產(chǎn)區(qū)及海南、廣西、福建等香蕉產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)該病 害的發(fā)生。該病害田間發(fā)病率20%?30%，嚴(yán)重可達(dá)100%以上，并造成整株死亡，已嚴(yán)重 危害香蕉產(chǎn)業(yè)。綜合生化特征、保守基因序列等，該病原菌被鑒定為Dickeya zeae (Zhang et al，2010)〇
[0003] 細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境而吸附著于生物或非生物材料表面會形成膜樣多細(xì)菌復(fù)合 體，即細(xì)菌生物膜（Bacterial biofilm，BBF) (Stoodley et al，2002)。生物膜狀態(tài)的細(xì) 菌比浮游狀態(tài)下的細(xì)菌具有更強(qiáng)的耐藥性、毒力和對抗宿主免疫防御的能力，能在宿主抑 菌成分中生存，細(xì)菌生物膜已成為病原細(xì)菌的重要致病因子（Morris and Monier，2003)， 并在植物與病原物互作的動態(tài)過程中發(fā)揮作用（Danhom and Fuqua, 2007)。細(xì)菌生物 膜是銅綠假單胞菌侵染多種寄主的關(guān)鍵因子，掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)它在寄主植物組織中 形成了細(xì)菌生物膜（Tan et al, 1999);引起葡萄皮爾氏病的苛養(yǎng)木桿菌在木質(zhì)部可形 成細(xì)菌生物膜并阻塞導(dǎo)管，使植物失水和養(yǎng)分運(yùn)輸受阻而表現(xiàn)出癥狀（Guilhabert and Kirkpatrick，2005);同時(shí)，植物保護(hù)同樣面臨細(xì)菌生物膜的抗藥性增加的難題。由于細(xì)菌 生物膜胞外物質(zhì)的屏障作用、細(xì)菌密度以及通過降低細(xì)胞膜的通透性等，減少抑菌藥物進(jìn) 入細(xì)胞內(nèi)及增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的藥物外排，使得細(xì)菌在生物膜狀態(tài)有著比浮游態(tài)高出千百倍的抗 藥性。因此，針對植物病原細(xì)菌，與細(xì)菌生物膜的抑制因子篩選相關(guān)的研宄可為植物保護(hù)技 術(shù)的開發(fā)提供新思路，對于防控細(xì)菌性植物病害也具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供D-氨基酸在 抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌細(xì)菌生物膜中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的D-氨基酸對香蕉細(xì)菌性軟 腐病菌的細(xì)菌生物膜具有顯著的抑制作用。
[0005] 本發(fā)明另一目的在于提供一種用于上述應(yīng)用的D-氨基酸培養(yǎng)基。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細(xì)菌生物膜中的應(yīng)用，所 述的D-氨基酸為D-酪氨酸、D-色氨酸、D-纈氨酸和D-蛋氨酸中的至少一種。
[0008] 為了進(jìn)一步更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，單獨(dú)使用所述D-酪氨酸時(shí)，其有效抑制濃度為 420 μΜοΙ/L ；
[0009] 為了進(jìn)一步更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，單獨(dú)使用所述D-色氨酸時(shí)，其有效抑制濃度為 5mMol/L ；
[0010] 為了進(jìn)一步更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，單獨(dú)使用所述D-纈氨酸時(shí)，其有效抑制濃度為 llmMol/L ；
[0011] 為了進(jìn)一步更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，單獨(dú)使用所述D-蛋氨酸時(shí)，其有效抑制濃度為 15mMol/L〇
[0012] 本發(fā)明優(yōu)選混合使用兩種、三種或四種上述D-氨基酸，混合搭配使用上述D-氨基 酸，相互間具有協(xié)效作用，可有效減少各種D-氨基酸的用量。
[0013] 更優(yōu)選地，所述應(yīng)用中四種D-氨基酸搭配使用時(shí)的用量可為120 μ Mol/L的D-酪 氨酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0014] 或所述應(yīng)用中四種D-氨基酸搭配使用時(shí)的用量可為160 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-繳氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0015] 或所述應(yīng)用中四種D-氨基酸搭配使用時(shí)的用量可為120 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸；
[0016] 或所述應(yīng)用中四種D-氨基酸搭配使用時(shí)的用量可為320 μΜοΙ/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸。
[0017] 上述將D-氨基酸應(yīng)用于抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌細(xì)菌生物膜中，可顯著抑制細(xì) 菌生物膜生長，為開發(fā)細(xì)菌性軟腐病菌的防治新技術(shù)提供新的方法及思路
[0018] 本發(fā)明還提供了一種用于上述D-氨基酸培養(yǎng)基在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌細(xì)菌 生物膜中是應(yīng)用的D-氨基酸培養(yǎng)基，為在本領(lǐng)域常用的液體培養(yǎng)基中添加有D-氨基酸得 到的培養(yǎng)基，如NA液體培養(yǎng)基等。所述的D-氨基酸為D-酪氨酸、D-色氨酸、D-纈氨酸和 D-蛋氨酸中的至少一種。
[0019] 為了進(jìn)一步更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中優(yōu)選添加上述四種 D-氨基酸。
[0020] 更優(yōu)選地，所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中四種D-氨基酸的含量為120 μ Mol/L的D-酪 氨酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0021] 或所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中四種D-氨基酸的含量為160 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-繳氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸；
[0022] 或所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中四種D-氨基酸的含量為120 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸；
[0023] 或所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中四種D-氨基酸的含量為320 μ Mol/L的D-酪氨酸、 3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L的色氨酸。
[0024] 本發(fā)明提供的D-氨基酸培養(yǎng)基可顯著抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌細(xì)菌生物膜的生 長，為開發(fā)香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的防治新技術(shù)提供新的方法及思路；結(jié)合D-氨基酸使用， 提高化學(xué)農(nóng)藥、生物農(nóng)藥等防治方法的使用效果，開發(fā)新型的高效、低毒、環(huán)保農(nóng)藥。
[0025] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：
[0026] 本發(fā)明篩選的D-氨基酸可顯著有效抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的細(xì)菌生物膜的生 長。本發(fā)明通過篩選獲得4種可顯著抑制細(xì)菌性軟腐病菌的細(xì)菌生物膜生長的D-氨基酸， D-酪氨酸、D-纈氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸；并篩選獲得它們各自的最低抑制濃度。同時(shí)， 本發(fā)明也通過結(jié)晶紫染色及激光共聚焦顯微鏡明確D-氨基酸抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的 顯著效果及細(xì)胞學(xué)特征。本發(fā)明還提供了上述4種D-氨基酸的混配配方，大大降低了各種 D-氨基酸的使用濃度，并可同樣顯著抑制細(xì)菌生物膜的生長。本發(fā)明還提供了一種用于上 述應(yīng)用的D-氨基酸培養(yǎng)基?；诒景l(fā)明的內(nèi)容可為開發(fā)細(xì)菌性軟腐病菌的防治新技術(shù)提 供新的方法及思路；結(jié)合D-氨基酸使用，提高化學(xué)農(nóng)藥、生物農(nóng)藥等防治方法的使用效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為Dickeya zeae MSl的細(xì)菌生物膜生物量相對定量，其中，D. zeae biofilms、 D. zeae planktonic分別表示細(xì)菌生物膜及浮游細(xì)菌的相對定量。
[0028] 圖2為Dickeya zeae MSl細(xì)菌生物膜的形態(tài)特征激光共聚焦顯微圖。
[0029] 圖3為D-氨基酸處理后Dickeya zeae MSl細(xì)菌生物膜結(jié)晶紫染色分析圖。
[0030] 圖4為D-纈氨酸抑制Dickeya zeae MSl細(xì)菌生物膜生長的激光共聚焦分析圖。
[0031] 圖5為4種D-氨基酸混配配方抑制Dickeya zeae MSl的細(xì)菌生物膜形成的分析 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[0033] 香蕉細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya zeae MSI)在文獻(xiàn)"Identification of Dickeya zeae as a Causal Agent of Bacterial Soft Rot in Banana in China. Plant Disease, 2014, 98 (4) :436-442. "中公開，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研宄所實(shí)驗(yàn)室提 供；
[0034] D-氨基酸均在Sigma-Aldrich公司購買。
[0035] 實(shí)施例1 :細(xì)菌的培養(yǎng)及細(xì)菌生物膜的培養(yǎng)
[0036] 取甘油凍存（-80 °C )的細(xì)菌菌株 Dickeya zeae MSI (Identif ication of Dickeya zeae as a Causal Agent of Bacterial Soft Rot in Banana in China. Plant Disease, 2014, 98 (4) :436-442.)分別接種到NA固體培養(yǎng)基（牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨 5g、葡萄糖10g、瓊脂18g，水定容至lOOOmL，pH為7. 2?7. 4)平板上，劃線培養(yǎng)；挑取單菌 落于液體NA培養(yǎng)基（牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水定容至1000mL，pH為 7. 2 ?7. 4)中培養(yǎng)，180rpm，32°C培養(yǎng)。
[0037] 培養(yǎng)Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;NA液體培養(yǎng)基稀釋菌液至1:1000。取2mL 稀釋的菌液加入聚苯乙烯24微孔板中，每樣品3個(gè)重復(fù)，32°C靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時(shí)間后 作下一步檢測。培養(yǎng)6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、96h、144h、216h后，先抽取浮游細(xì)菌 于96孔板中，在酶標(biāo)儀測取600nm(0D 6QQ)的吸光度值（Multiskan Spectrum，Thermo Lab Systems);下一步將余下浮游細(xì)菌和細(xì)菌生物膜混勾，再次測取600nm(0D6CICI)的吸光度值。 計(jì)算混勻后的細(xì)菌OD值減去浮游細(xì)菌OD值，即為細(xì)菌生物膜生物量的相對定量。
[0038] 培養(yǎng)Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;NA培養(yǎng)基稀釋菌液至1:1000。加入5mL稀 釋的菌液于聚苯乙烯6孔板中，使用聚苯乙烯的光學(xué)玻片浸泡入細(xì)菌培養(yǎng)基中，與細(xì)菌共 同培養(yǎng)6h、24h。使用PBS緩沖液清洗去除浮游細(xì)菌，粘附基質(zhì)玻片的細(xì)菌細(xì)胞使用5%的 戊二醛進(jìn)行固定lh，再用PBS緩沖液清洗；PI用于DNA染色，Alexa-Fluor Concanavalin A(ConA)用于結(jié)合胞外多糖，染料的分別結(jié)合用于分析Dickeya zeae MSl細(xì)菌生物膜在 不同時(shí)間段形成的特征。使用以下的氬激光激發(fā)、接收波長參數(shù)：PI 630-633nm激發(fā)和 650-800nm接收，ConA 346nm激發(fā)和442nm接收，激光共聚焦顯微鏡觀察。
[0039] 結(jié)果見圖1及圖2。由圖可見，0?12h，浮游菌生長量大于細(xì)菌生物膜；至24h達(dá)到 動態(tài)平衡，生長速度一致；48h后，浮游菌衰亡而細(xì)菌生物膜不變；表明Dickeya zeae MSl 離體培養(yǎng)后24h即可形成穩(wěn)定的細(xì)菌生物膜。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果類似，在6h時(shí)形 成的細(xì)菌生物膜較稀薄，到24h時(shí)，細(xì)菌已形成完整、密集的細(xì)菌生物膜。
[0040] 實(shí)施例2 :不同D-氨基酸抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌的效果分析
[0041 ] 配制D-纈氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-蘇氨酸、D-精氨酸、D-脯氨酸、D-亮氨 酸、D-絲氨酸、D-組氨酸、D-天冬氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-苯丙氨酸、D-丙氨酸 等的IOOmMoVL的儲存液；配制D-酪氨酸的IOmMoVL的儲存液，其中D-酪氨酸儲存液含 0. IMol/L的HCl。按照不同濃度配比，配制系列D-氨基酸濃度的NA液體培養(yǎng)基；分別配置 200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480 及 500 μΜοΙ/L(簡寫 μΜ)濃度的D-酪氨酸的NA液體培養(yǎng)基（牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、葡萄糖10g，水 定容至 lOOOmL，pH 為 7. 2 ?7. 4);分別配置 1、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17· 5 及 20mMol/L(簡寫mM)的其他D-氨基酸的NA培養(yǎng)基（牛肉膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、葡萄 糖l〇g，水定容至lOOOmL，pH為7. 2?7. 4)。
[0042] 取甘油凍存（_80°C )的細(xì)菌菌株Dickeya zeae MSl接種到NA固體培養(yǎng)基（牛肉 膏3g、酵母膏l(xiāng)g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、瓊脂18g，水定容至lOOOmL，pH為7. 2?7. 4)平 板上，劃線培養(yǎng)；挑取單菌落于NA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，180rpm，32°C培養(yǎng)。
[0043] 培養(yǎng)Dickeya zeae MSl至108CFU/mL ;利用不同濃度D-氨基酸的NA培養(yǎng)基稀釋 菌液至1:1000,設(shè)置無 D-氨基酸菌液對照（CK)，及無菌NA液體培養(yǎng)基對照（NA)。取2mL 稀釋的菌液加入聚苯乙烯24微孔板中，32°C靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，先抽取浮游細(xì)菌于96 孔板中，每樣品3個(gè)重復(fù)，在酶標(biāo)儀測取600nm(0D_)的吸光度值（Multiskan Spectrum， Thermo Lab Systems);下一步將余下浮游細(xì)菌和細(xì)菌生物膜混勾，再次測取600nm(0D_) 的吸光度值。計(jì)算混勻后的細(xì)菌OD值減去浮游細(xì)菌OD值，即為細(xì)菌生物膜生物量的相對 定量，結(jié)果見表1?2。
[0044]

【權(quán)利要求】
1. D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細(xì)菌生物膜中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細(xì)菌 生物膜中的應(yīng)用，其特征在于：所述的D-氨基酸為D-酪氨酸、D-色氨酸、D-纈氨酸和D-蛋 氨酸中的至少一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細(xì)菌 生物膜中的應(yīng)用，其特征在于：所述D-酪氨酸的有效抑制濃度為420 y Mol/L ;所述D-色氨 酸的有效抑制濃度為5mMol/L ;所述D-纈氨酸的有效抑制濃度為llmMol/L ;所述D-蛋氨酸 的有效抑制濃度為15mMol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌（Dickeya zeae)細(xì)菌 生物膜中的應(yīng)用，其特征在于：所述D-氨基酸搭配使用時(shí)的用量為120 y Mol/L的D-酪氨 酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸； 或?yàn)?60 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、0. 5mMol/ L的色氨酸； 或?yàn)?20 yMol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L 的色氨酸； 或?yàn)?20 yMol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋氨酸、3mMol/L 的色氨酸。
5. -種用于權(quán)利要求1?4任一項(xiàng)所述的D-氨基酸在抑制香蕉細(xì)菌性軟腐病菌 (Dickeya zeae)細(xì)菌生物膜中的應(yīng)用中的D-氨基酸培養(yǎng)基，其特征在于：通過在液體培養(yǎng) 基中添加有D-氨基酸得到。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的D-氨基酸培養(yǎng)基，其特征在于：其中添加有D-酪氨酸、D-色 氨酸、D-纈氨酸和D-蛋氨酸中的至少一種。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的D-氨基酸培養(yǎng)基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中 四種D-氨基酸的含量為120 y Mol/L的D-酪氨酸、5mMol/L的D-纈氨酸、7mMol/L的D-蛋 氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的D-氨基酸培養(yǎng)基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中 四種D-氨基酸的含量為160 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋 氨酸、0. 5mMol/L的色氨酸。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的D-氨基酸培養(yǎng)基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中 四種D-氨基酸的含量為120 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、5mMol/L的D-蛋 氨酸、3mMol/L的色氨酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的D-氨基酸培養(yǎng)基，其特征在于：所述的D-氨基酸培養(yǎng)基中 四種D-氨基酸的含量為320 y Mol/L的D-酪氨酸、3mMol/L的D-纈氨酸、3mMol/L的D-蛋 氨酸、3mMol/L的色氨酸。
【文檔編號】C12R1/01GK104498395SQ201410715110
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】張景欣, 林壁潤, 黃寧, 沈會芳, 蒲小明, 潘群英 申請人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所