專利名稱：香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及植物保護和生物技術領域，尤其涉及香蕉枯萎病菌4 號小種的快速檢測方法。
背景技術：
香蕉鐮刀菌枯萎病又稱香蕉巴拿馬病、黃葉病，是由鐮刀菌侵 染引起維管束壞死的土傳性病害，病原菌為尖孢鐮刀菌古巴?；?br>
(尸〃sarj.〃邁oY75/ arLffl7 f. sp. c〃Z e/ se)。病原菌從受傷的根莖侵入， 通過寄主維管束向莖上發(fā)展，并進一步向葉部蔓延。當植株枯死后， 病原菌隨殘體遺留在土壤中，隨著水流或帶菌的農具在蕉園內再進 行自然傳播，其厚垣孢子可在土壤中存活8 — 10年。由于該菌存活 期長，傳播迅速，尚未有防治該病的特效藥物，因此容易大面積爆 發(fā)而造成重大損失。
尖孢鐮刀菌古巴?；陀?個生理小種，1號小種(F0C1)感 染香蕉的栽培種"大蜜哈"[Grosmichel (AM)]及龍牙蕉
(MusaAAB)，矮香蕉[Dwarfcavendish (AAA)]較抗病，該小種呈世 界分布，在中國大陸已有記錄；2號小種(F0C2)在中美洲，僅感 染三倍體雜種梭香蕉[Bluggoe (MB)]，不侵染"大蜜哈"；3號 小種(F0C3)感染野生的羯尾蕉屬(Heliconia); 4號小種(F0C4) 能感染幾乎所有的香蕉種類，如Cevendish、"大蜜哈"、矮香蕉、 野蕉(BB)和梭指蕉，毀滅性最大。目前，尚未培育出有效的香蕉
抗4號小種品種。
目前，對香蕉枯萎病菌4號小種仍采用傳統的生物學和致病性 檢驗檢測技術鑒定，需要較長的時間才能區(qū)別4號小種和1號小種。 即使采用病原菌分離和結合VCG或者Koinada改良培養(yǎng)基上的性狀來 確定4號小種，也需要較長時間， 一般需要30天甚至更多的時間鑒 定確診，不利于香蕉枯萎病的及時防控。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是克服現有技術的不足，提供一種香蕉枯萎病菌4 號小種的快速檢測方法，利用香蕉枯萎病菌4號小種的引物進行香 蕉植株的DNA進行PCR擴增和循環(huán)以后進行電泳檢測。
本發(fā)明的技術方案是提供一種香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢 測方法，包括以下步驟
(1) 抽提香蕉植株的DNA;
(2) 電泳檢測(1)的模板DNA;
(3) PCR擴增DNA擴增；
(4) PCR循環(huán)；
(5) 電泳檢測。
步驟(2)所述電泳檢測模板DNA是取5化(1)步驟提取的香蕉 植株DNA樣品與載樣緩沖液混合，用1%的瓊脂糖凝膠電泳40min， 5v/cm，于凝膠成像系統下觀察有無DNA條帶。所述載樣緩沖液為 TAKARA公司出品的6 X loading buf f er。
步驟(3)所述PCR擴增DNA的擴增反應體系如下模板DNA 1叱；
10XPCR Buffer 2. 5 ML;
Mg2+ (25函L/L) 2. 5叱；
dNTPs (25mmoL/L) 2叱；
引物RF4-1 (lOWnoL/L) 1叱；
引物RF4-2 (10MmoL/L) 1叱；
Taq酶(5U/WJ 0.2叱； 滅菌(1朋20 至總體積25叱。
所述引物為
RF4-1: 5， -TGCGGGTCCTATTAGTAC-3，； RF4-2: 5， -GGTCCTCACACTCCAATC-3，。 步驟(4)所述PCR循環(huán)為94。C預變性5min; 94。C變性30s， 52 。C退火30s， 72。C延伸45s， 35個循環(huán)；72。C延伸10min。
步驟(5)所述電泳檢測是取出步驟(4)反應混合液5PL與載樣 緩沖液混合，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物903bp特異條帶。電 泳凝膠為1%的瓊脂糖凝膠，配方為lg瓊脂糖，100mL0.5XTBE 電泳緩沖液，5化溴化乙錠(EB)，其中，0. 5 XTBE電泳緩沖液由5 XTBE (54g Tris，27. 5g硼酸，20ml 0. 5mol/L EDTA(pH8. 0)，定容至1000ml) 稀釋十倍再使用。
本發(fā)明與現有技術相比，其有益效果表現在 (1)本發(fā)明提供了一個快速的檢測方法，應用該方法可在6小 時之內對香蕉枯萎病菌4號小種進行快速、準確檢測。
(2)本發(fā)明提供的引物和方法，無需對樣品中的病原菌進行分 離和純化，步驟簡單，容易操作，無需復雜、精密儀器，有利于快 速、便捷開展植物檢疫工作。
(3) 本發(fā)明的監(jiān)測方法具有針對香蕉枯萎病菌4號小種的特異 性和準確性。
(4) 本發(fā)明能夠靈敏檢測到低菌量的香蕉枯萎病菌4號小種。
圖1采用本發(fā)明方法在23個菌株中進行PCR檢測的特異性電 泳圖檢測F0C4的結果(903bp特異條帶)
圖2本發(fā)明方法進行PCR檢測不同濃度病原菌F0C4 DNA的靈敏 度電泳圖檢測結果(903bp特異條帶)
圖3不同來源香蕉擬似枯萎病樣本檢測F0C4的結果(903bp特 異條帶) 具體實施例
下面結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細地說明。 實施例1本發(fā)明方法特異、準確性實驗
應用本發(fā)明方法在23個菌株中進行PCR檢測的特異性電泳圖檢測。
1. 抽提植株的DNA:按常規(guī)CTAB法進行。
2. 電泳檢測模板DNA:取5化所提取的DNA樣品與載樣緩沖液混合， 用ly。的瓊脂糖凝膠電泳40min， 5v/cm，于凝膠成像系統下觀察，若 有DNA條帶，則DNA抽提成功，可以繼續(xù)使用，若無DNA條帶，則 需重新抽提。3. PCR擴增DNA擴增反應體系如下
模板DNA 1 A
10XPCR Buffer 2. 5叱
Mg2+ (25,L/L) 2. 5 I^L
dNTPs (25訓L/L) 2叱
引物RF4-1 (10MmoL/L) 1叱
引物RF4-1 (10WnoL/L) Taq酶(5L但) 滅菌ddH20
1叱
0.2叱
至總體積25叱
4. PCR循環(huán)
94 'C預變性 94 °C變性 52 aC退火 72 。C延伸 72 。C延伸
5 min 30 s
30 s 卜 35 Cycles 45 s > 10 min
5.電泳檢測取出反應混合液5叱與載樣緩沖液混合，1%瓊脂 糖凝膠電泳檢測擴增產物，觀察有無903bp特異條帶出現，有則為 陽性擴增。
應用本發(fā)明方法對以下病菌作檢測香蕉枯萎病菌4號小種 。jf7"S^or咖f. sp. c由775"e race4 (F0C4)禾口香蕉枯萎病菌1號小種 77. ay7s/7arw777 f. sp. cwZ7e/7se racel ( FOCI )， 番茄枯萎病菌 ,.cur7s/ az7/57f. sp. Jj5copor5"/c/(F0L)，西瓜枯萎病菌尸'oz/5/7arLffl7
f. sp. z j'p^/z (F0N)， 苦瓜枯萎病菌尸.cur/"57 or咖f. sp.邁o衡Jj'cae (F0M)，菜豆枯萎病菌F. 。^spora/z7 f. sp. pAaseoJi (FOP)，棉花
枯萎病菌尸-a 75p027i/z f. sp. KasjV /ec^w邁(F0V)， d、麥赤霉病菌
,,^ra/z7i/7eari//z7(FG)，膠孢炭疽菌CaZJeto^rz'c力iz/z7^7。e。spari。iGfes (CG)，檢測的結果如附圖1所示，僅香蕉枯萎病菌4號小種在903bp
處產生特異性條帶。附圖1中，M: DL2000 Marker; 1 15: F0C4;
16: F0C1; 17:番茄枯萎病菌；18:西瓜枯萎病菌；19:苦瓜枯萎 病菌；20:菜豆枯萎病菌；21:棉花枯萎病菌；22:小麥赤霉病菌； 23:膠孢炭疽菌；24:清水對照。
實施例2用PCR方法來檢測不同濃度病原菌DNA
實驗步驟同實施例l，用PCR來檢測不同濃度病原菌DNA，其靈 敏度電泳結果見附圖2，其中，M: DL2000 Marker; 1 7: F0C4總 DNA稀釋梯度(10°—10—6); 8:清水對照。附圖2表明DNA抽提液 在稀釋104倍后仍能夠擴增出903 bp的特異條帶，即能夠檢測出相 當于2ng的新鮮菌絲，說明本發(fā)明方法的靈敏性。 實施例3
(1)抽提香蕉植株DNA
按常規(guī)CTAB法進行，將待檢香蕉組織100 200mg用液氮研磨 成粉狀，加入600 n L試劑CTAB和12y L2-巰基乙醇，研磨液轉入 1.5mL離心管中，65。C水浴30分鐘，加入600 u L酚\氯仿混合液， 于室溫、12000rpm條件下離心5分鐘，取上清液置于新的離心管中。 加入1/10體積3mol/L、 pH5. 2的NaAc和2倍體積冷無水乙醇，置
-20。C沉淀20分鐘；4°C、 12000rpm條件下離心10分鐘，分別用70% 乙醇淋洗DNA沉淀，室溫下風干；溶于50 ii L滅菌雙蒸水中得到DNA 溶液。
(2)電泳檢測模板DNA
取5化所提取的DNA樣品與載樣緩沖液混合，用1%的瓊脂糖凝 膠電泳40min， 5v/cm，于凝膠成像系統下觀察，若有DNA條帶，則 DNA抽提成功，可以繼續(xù)使用，若無DNA條帶，則需重新抽提。所述 載樣緩沖液為TAKARA公司出品的6X loading buffer。
(3) PCR擴增用全自動DNA合成儀進行合成。DNA擴增反應 體系如下
模板DNA 10XPCR Buffer Mg2+ 25畫L/L dNTPs 25畫1/L 引物RF4-1 10Pmol/L 引物RF4-2 10陶ol/L Taq酶 5U/叱 滅菌ddH20
肌 2. 5PL 2. 5叱
2PL l叱 肌 0. 2叱
適量加入至反應體系 總體積25化
(4) PCR循環(huán)
94。C預變性5min; 94。C變性30s， 52。C退火30s， 72。C延 伸45s， 35個循環(huán)；72t:延伸10min。列表表示如下
94 。C預變性 5 min
94 °C變性 30 s
52 °C退火
35 Cycles
72 。C延伸 45 s
72 。C延伸 10 min
(5)電泳檢測取出反應混合液5化與載樣緩沖液混合，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，檢測結果見附圖3，其中，M: DL2000
Marker; 1:廉江市香蕉樣品；2 10:高州市香蕉樣品；11 16:徐 聞縣香蕉樣品；17 21:汕頭市香蕉樣品；22 23:中山市香蕉樣品； 24 29:揭陽市香蕉樣品；30:珠海市香蕉樣品；31:清水對照；32:
健康植株對照，檢測結果與病菌分離鑒定方法結果一致。若有903bp 特異條帶，則為陽性擴增，有香蕉枯萎病菌4號小種；若無903bp 特異條帶，則為陰性，沒有香蕉枯萎病菌4號小種。
權利要求
1、一種香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)抽提香蕉植株的DNA；(2)電泳檢測(1)的模板DNA；(3)PCR擴增DNA擴增；(4)PCR循環(huán)；(5)電泳檢測。
2、 根據權利要求1所述香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢測方法， 其特征在于步驟(3)所述PCR擴增DNA的擴增反應體系如下模板DNA 1ML;10XPCR Buffer 2. 5PL;Mg2+ 25mmoL/L， 2. 5叱；dNTPs 25,L/L， 2pL;引物RF4-1 10MmoL/L， l叱；引物RF4-2 10MmoL/L， 1ML;Taq酶 5U/PL， 0. 2叱；滅菌ddH20 適量加入至反應體系總體積25叱。
3、根據權利要求2所述香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢測方法， 其特征在于所述引物分別為引物RF4-1: 5， -TGCGGGTCCTATTAGTAC-3，； 引物RF4-2: 5' -GGTCCTCACACTCCAATC—3'。
4、 根據權利要求1所述香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢測方法， 其特征在于步驟(4)所述PCR循環(huán)為94C預變性5min; 94匸變性 30s， 52。C退火30s， 72。C延伸45s， 35個循環(huán)；72。C延伸10min。
5、 根據權利要求1所述香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢測方法， 其特征在于步驟(5)所述電泳檢測是取出步驟(4)反應混合液5PL 與載樣緩沖液混合，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物903bp特異條 市。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種香蕉枯萎病菌4號小種的快速檢測方法，包括抽提香蕉植株的DNA、電泳檢測模板DNA、PCR擴增DNA擴增、PCR循環(huán)和電泳檢測步驟，利用香蕉枯萎病菌4號小種的引物進行香蕉植株的DNA進行PCR擴增和循環(huán)以后進行電泳檢測，整個檢測過程耗時6小時之內，大大提高了檢測效率，無需對樣品中的病原菌進行分離和純化，步驟簡單，容易操作，無需復雜、精密儀器，更加準確靈敏，有利于快速、便捷開展植物檢疫工作。
文檔編號G01N27/447GK101178379SQ200710032118
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月5日 優(yōu)先權日2007年12月5日
發(fā)明者廖林鳳, 王振中, 紀春艷, 董章勇 申請人:華南農業(yè)大學