一種抑制香蕉枯萎病菌生長的化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物的新用途，闡明藥物化學結構與細菌的生物活性之間的關系， 更具體的說，是探索化合物對香蕉枯萎病菌的抑菌和殺菌活性。
【背景技術】
[0002] 香蕉是中國華南地區(qū)四大佳果之一，也是世界著名的熱帶、亞熱帶水果。除食用 外，有些品種具有很好的園藝觀賞價值。中國是世界香蕉的主產(chǎn)國之一，產(chǎn)量居世界第四 位，主要產(chǎn)區(qū)分布于廣東、廣西、海南、云南和福建等地。近年來，香蕉枯萎病在我國香蕉產(chǎn) 區(qū)嚴重發(fā)生，威脅著我國香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003] 香蕉枯萎病又稱巴拿馬病、黃葉病，是由半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目鐮刀菌屬尖 鐮孢菌古巴?；鸵鸬囊环N維管束病害，是香蕉的一種毀滅性病害。2007年5月我國將 香蕉枯萎病列入進境植物檢疫性有害生物名錄。
[0004] 1874年Jos印hBancroft在澳大利亞首先報道了該病的發(fā)生，1904年該病在美國 的夏威夷首次發(fā)現(xiàn)，1910年ErimF.Smith在古巴的香蕉病組織中分離得到病原菌，1919年 Brandes首次確證了病原菌的致病性。1935~1939年香蕉枯萎病在巴拿馬、哥斯達黎加、洪 都拉斯、哥倫比亞等國大面積暴發(fā)流行，導致90%以上的優(yōu)質大蜜哈發(fā)病，約4萬hm2香蕉 園遭毀。目前，香蕉枯萎病廣泛分布于亞洲、非洲、澳大利亞、南太平洋及熱帶美洲的香蕉產(chǎn) 區(qū)。《科學時報》2003年報道，香蕉枯萎病4號小種目前己侵害了國際香蕉改良網(wǎng)絡所收集 的全世界1100多種香蕉種質資源中的各種香蕉，使全球第二大香蕉生產(chǎn)國烏干達香蕉產(chǎn) 量下降40%，香蕉主產(chǎn)國之一的巴西香蕉產(chǎn)量降低70%。
[0005] 我國臺灣于1967年首次發(fā)現(xiàn)和鑒定香蕉枯萎病菌4號小種，幾年內(nèi)有1200hm2香 蕉園發(fā)病，并以每年毀滅500hm2蕉園的速度發(fā)展，不到10年時間該病幾乎摧毀了臺灣的香 蕉產(chǎn)業(yè)，雖經(jīng)多年治理，至今每年因枯萎病造成香蕉產(chǎn)量損失仍達20%以上。我國大陸于 1960年首次在廣西的芭蕉上發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病，20世紀70年代末在廣東、福建、海南、云南 等省區(qū)陸續(xù)發(fā)生，主要為害粉蕉、越南蕉等品種。1996年香蕉枯萎病菌4號小種傳入廣東 省，香蕉枯萎病發(fā)生面積逐年擴大，2000年廣州市香蕉發(fā)病面積97. 33hm2、2001年發(fā)病面積 377. 33hm2、2002 年發(fā)病面積 1266. 67hm2、2003 年發(fā)病面積達 3555. 93hm2。
[0006] 香蕉枯萎病的侵染來源主要是帶菌的球莖、吸芽、病株殘體及帶菌土壤。病原菌從 寄主根部傷口侵入寄主，通過寄主維管束向假莖上部及葉部蔓延，堵塞木質部導管，導致植 株枯萎死亡。枯萎病的潛育期很長：田間植株自苗期感染到發(fā)病需要3~5個月或更長，采用 芽苗進行接種需要1~2個月時間。香蕉枯萎病菌隨病株殘體、帶菌土壤、耕作工具、病區(qū)灌 溉水、雨水、線蟲等導致近距離傳播蔓延，帶菌的吸芽、土壤、二級苗及地表水成為遠距離傳 播方式。
[0007] 病害在香蕉成株期和抽蕾結實期癥狀明顯，病株先從下部葉片邊緣變黃并逐漸擴 展至主脈，病葉葉柄在靠近葉鞘處折曲、下垂和迅速干枯，病株葉片由下而上逐漸枯黃，凋 萎倒掛，由黃變褐。外圍葉鞘近地處開裂，逐漸向內(nèi)發(fā)展，層層開裂，裂口褐色，植株最后干 枯而死?？v剖病株假莖、球莖和根內(nèi)部維管束球莖均可見壞死變黃褐或紫紅色，橫切和縱切 可見斑點狀和線條狀病變。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明采用體外抗菌試驗，研究化合物對香蕉枯萎病菌的生物活性。
[0009] 本發(fā)明的具體技術方案如下： 本發(fā)明的創(chuàng)新點是發(fā)現(xiàn)化合物對香蕉枯萎病菌有良好的抑菌和殺菌活性，并測量得到 其最小抑菌濃度MIC值和最小殺菌濃度MBC值，屬于首次公開。
[0010] 所述化合物結構特征如下式所示： 【具體實施方式】
[0011] 下面結合具體實施實例，進一步詳細地說明本發(fā)明。應理解下面實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0012] 實施實例1 測量最小抑菌濃度MIC值。
[0013] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0014] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0015] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。
[0016] (4)菌液配制及計數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數(shù)法進行計數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。培養(yǎng)后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。
[0017] 計算公式為：菌液濃度=nX20X100cfu/mL (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0018] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小抑菌濃度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC為最小抑菌濃度，即藥物 與一定濃度的菌液作用后，能夠抑制可見菌生長的最低濃度。
[0019] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同濃度的藥液和100yL 菌液，使最終菌液濃度為1~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照，第 12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物最 低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC，每個實驗重復三次。
[0020] 測得最小抑菌濃度MIC值為8yg/mL。
[0021] 實施實例2 測量最小殺菌濃度MBC值。
[0022] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0023] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0024] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。
[0025] (4)菌液配制及計數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數(shù)法進行計數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50yL，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。培養(yǎng)后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)；計算公式為：菌液濃 度=nX20X100cfu/mL。
[0026] (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0027] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小殺菌濃度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基礎上，從每管吸取 10yL溶液，點于固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)按MIC培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，以完全殺滅細菌的最低濃度 為最小殺菌濃度(菌落數(shù)小于等于5)。
[0028] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同濃度的藥液和100yL 菌液，使最終菌液濃度為l~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照， 第12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物 最低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC。將上述未見生長細菌的各孔中的肉湯取 10yL接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，做好標記，于28°C培養(yǎng)24h，以仍無細菌生長的管內(nèi)藥物濃 度記為該藥的MBC，每個實驗重復三次。
[0029] 測得最小殺菌濃度MBC值為32yg/mL。
【主權項】
1. 一種抑制香蕉枯萎病菌生長的化合物，其特征在于： (1) 結構特征如下式所示：(2) 其可作為香蕉枯萎病菌的抑制劑和殺菌劑； (3) 其對香蕉枯萎病菌的最小抑菌濃度MIC值為8 μ g/mL ; (4) 其對香蕉枯萎病菌的最小殺菌濃度MBC值為32 μ g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對香蕉枯萎病菌具有抑菌和殺菌活性的化合物。其香蕉枯萎病菌的最小抑菌濃度MIC值為8μg/mL，最小殺菌濃度MBC值為32μg/mL。
【IPC分類】A01N43/86, A01P3/00, A01P1/00
【公開號】CN105165848
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】許自協(xié)
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年11月2日