一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，該方法步驟為：對(duì)被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取被檢樣品的DNA；特異性引物的制備；熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)RealAmp反應(yīng)；RealAmp標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建；結(jié)果判斷。本發(fā)明的一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法克服以往基因擴(kuò)增方法的不足，具有高特異性，靈敏度高、定量檢測(cè)下限為4.3×10-4ng/μl，易操作，用時(shí)短、只需2-3h，不易受污染物的影響且能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)土壤樣品，也不需要昂貴而精密的溫度循環(huán)裝置、只需能達(dá)63℃的恒溫裝置，分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物的方法極為簡(jiǎn)單，只需肉眼觀察即可，又能定量地判別土壤中香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的含量，適宜于廣泛地推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]香蕉為芭蕉科芭蕉屬植物，是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物。香蕉枯萎病是香蕉產(chǎn)業(yè)的毀滅性病害，嚴(yán)重制約著我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。
[0003]香蕉枯萎病病原菌為Fusarium oxysporum Schlevht.f.sp.cubense (E.F.Smith)Snyd.&Hans.,曾用名Fusarium cubense E.F.Smith,屬于半知菌類,瘤座菌目，鐮孢菌屬，中文名稱為尖孢鐮孢菌古巴專化型。該菌分為3個(gè)小種。在我國(guó)，主要為I號(hào)小種和4號(hào)小種。I號(hào)小種發(fā)生歷史悠久，可以通過改種Cavendish類香蕉來解決I號(hào)小種的危害。4號(hào)小種于1996年傳入我國(guó)，嚴(yán)重危害我國(guó)香蕉產(chǎn)業(yè)的安全。4號(hào)小種又細(xì)分為亞熱帶4號(hào)小種和熱帶4號(hào)小種，在我國(guó)主要是熱帶4號(hào)小種。
[0004]香蕉枯萎病的傳播危害分遠(yuǎn)距離傳播和近距離傳播，遠(yuǎn)距離以病原菌隨香蕉組培苗二級(jí)苗的調(diào)運(yùn)為主，近距離傳播是病原菌在蕉園內(nèi)隨土壤傳播蔓延。生產(chǎn)中，迫切需要土壤病原菌快速檢測(cè)技術(shù)，用來檢測(cè)組培苗二級(jí)苗土壤、新開辟蕉園土壤是否帶菌以及疑似病株的快速診斷。因此，建立一套香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種快速、穩(wěn)定的檢測(cè)方法是我國(guó)香蕉安全生產(chǎn)的重要保證。
[0005] 近年來，有報(bào)道證實(shí)基于PCR的方法已經(jīng)成功用于檢測(cè)香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種，PCR方法在操作時(shí)間上以及檢測(cè)的特異性和靈敏度方面較常規(guī)方法有較大提高，但是，PCR方法必須有精密的溫度循環(huán)裝置，而且它的檢測(cè)時(shí)間也還是比較長(zhǎng)(2~3小時(shí))，并且反應(yīng)過程很容易受污染物的影響，從而使得這種方法不能滿足實(shí)際檢測(cè)的需要。因此，需要開發(fā)一種靈敏度高并且反應(yīng)迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR的檢測(cè)方法，而且，普通的PCR方法只能定性檢測(cè)病原菌的有或無，不能定量檢測(cè)病原菌的多少，更不能明確土壤中有多少病原菌？因此，將生物技術(shù)發(fā)展的最新成果應(yīng)用于香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種檢測(cè)，具有重要意義。
[0006]日本學(xué)者Notomi等于2000年首次開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),該技術(shù)依賴六條特異引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下快速、高效、高特異、高靈敏地?cái)U(kuò)增靶序列，該技術(shù)先利用兩條內(nèi)引物和兩條外引物，通過鏈置換作用形成莖環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)，然后在內(nèi)引物的作用下通過環(huán)介導(dǎo)的自動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)大量擴(kuò)增靶序列，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)突光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(real-time fluorescenceloop-mediated isothermal amplification assay,簡(jiǎn)稱 RealAmp)是將新一代的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)，可以定量檢測(cè)病原物，具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。此外，SYBR Green I是目前LAMP產(chǎn)物最靈敏的檢測(cè)方法之一，但是在RealAmp中SYBR Green I的加入可能會(huì)抑制LAMP的反應(yīng)效率，因此，在實(shí)際操作中普遍采用SYT0-9熒光染料進(jìn)行RealAmp反應(yīng)，而把SYBR Green I染色顏色判斷結(jié)果作為定量檢測(cè)的一種輔助判斷措施。
[0007]該方法通常是按如下步驟進(jìn)行:步驟一、對(duì)被檢標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，快速提取被檢標(biāo)本的DNA ;步驟二、特異性引物的制備:確定待測(cè)標(biāo)本的靶基因后，取得特異性引物2對(duì)，內(nèi)引物和外引物各一對(duì)；步驟三、實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增(RealAmp)反應(yīng):將經(jīng)前處理的樣品、引物、反應(yīng)緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63°C保溫1.5小時(shí)進(jìn)行循環(huán)鏈置換反應(yīng)；步驟四、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:標(biāo)準(zhǔn)曲線是根據(jù)不同稀釋的模板濃度與相應(yīng)的Tt值之間的關(guān)系而構(gòu)建的，X軸表示起始模板濃度的對(duì)數(shù)值，Y軸表示不同濃度模板擴(kuò)增達(dá)到閾值所用的時(shí)間(Tt)。步驟五、分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果。
[0008]Dita等人通過分析香蕉枯萎病病原菌20個(gè)不同營(yíng)養(yǎng)親和型的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)之間的差異，設(shè)計(jì)了熱帶4號(hào)小種的PCR擴(kuò)增的特異性引物對(duì)FocTR4-F(5' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3' )/FocTR4_R (5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3')，擴(kuò)增片段大小為463bPt)Dita等人所開展的研究?jī)?nèi)容，僅通過PCR的方法定性地檢測(cè)香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種，并非是定量地從土壤中檢測(cè)。Li等人通過SCAR的方法使用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)在中國(guó)檢測(cè)了香蕉枯萎病菌4號(hào)小種(Fusarium oxysporiumf.sp.cubense race4),但并未從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種。
[0009]使用Dita等人建立的PCR檢測(cè)技術(shù)，需要提取較高純度的樣品基因組DNA、用時(shí)較長(zhǎng)，也不能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)土壤樣品，更不能定量地從土壤中檢測(cè)病原菌，且需要昂貴而精密的溫度循環(huán)裝置，必須借助電泳儀才能對(duì)判別擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性或陰性，成本高，不易操作，需要具有一定技術(shù)水平的專業(yè)人員才能開展檢測(cè)工作。Li等人通過環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測(cè)了中國(guó)的香蕉枯萎病菌4號(hào)小種，而未從土壤中檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種，也沒有定量地檢測(cè)土壤中的病原菌含量，并不能明確土壤中病原菌的含量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，旨在解決傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)需要提取較高純度的樣品基因組DNA、用時(shí)較長(zhǎng)，不能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)土壤樣品，不能定量地從土壤中檢測(cè)病原菌，且需要昂貴而精密的溫度循環(huán)裝置，成本高，不易操作的問題。
[0011]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，該從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法包括以下步驟:
[0012]步驟一、對(duì)被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取被檢樣品的DNA ；
[0013]步驟二、特異性引物的制備；
[0014]步驟三、熒光 核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)RealAmp反應(yīng)；
[0015]步驟四、RealAmp標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建；
[0016]步驟五、結(jié)果判斷。
[0017]進(jìn)一步，對(duì)被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取被檢樣品的DNA的具體方法如下:
[0018]被檢樣品的DNA核酸提取:向0.1g待檢測(cè)樣品中加入300 ill DNA提取液，研磨成糊狀后，在95 °C恒溫水浴IOmin后，25°C、1000Orpm下離心2分鐘，取50iU上清液作為檢測(cè)模板DNA ；[0019]DNA 提取液包含:100mM Tris_HClpH7.4、1M KClUOmM EDTA 和 2%w/vPVPP。
[0020]進(jìn)一步，特異性引物的制備參考Dita設(shè)計(jì)的香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種特異性檢測(cè)引物所獲得的463bp片段設(shè)計(jì)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的LAMP檢測(cè)引物，取得RealAmp特異性引物2對(duì)，內(nèi)引物和外引物各一對(duì)；
[0021]由兩對(duì)引物構(gòu)成的引物混合液，兩對(duì)引物分別為:外引物FocTR4-F3 即 5 ' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3 '、外引物 FocTR4_B3 即5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，內(nèi)引物 FocTR4_FIP 即 5' -ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3'、內(nèi)引物 FocTR4_BIP 即 5' -GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3'，所述外引物FocTR4_F3和所述外引物FocTR4_B3的濃度分別為5pmol/μ I ;所述內(nèi)引物FocTR4_FIP和所述內(nèi)引物FocTR4_BIP的濃度均為40ρπιο1/μ I。
[0022]進(jìn)一步，步驟三熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(RealAmp)反應(yīng)具體如下:
[0023]將經(jīng)前處理的樣品、引物、反應(yīng)緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63°C保溫90min進(jìn)行循環(huán)鏈置換反應(yīng)；
[0024]RealAmp25 μ L反應(yīng)體系:I μ L抽提的核酸DNA作為模板，2.5 μ LlO X Bst DNApolymerse buffer、1.4mM dNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mM MgS04、0.2 μ M 的外引物、1.6 μ M 的內(nèi)引物、I μ L Bst DNA polymerase, 0.2 μ M SYT0-9熒光染料，補(bǔ)水至25 μ L，然后再加入等體
系的石臘油覆蓋整個(gè)反應(yīng)液；
[0025]RealAmp 反應(yīng)在 ESE-Quant Tube Scanner 上進(jìn)行，63°C 反應(yīng) 90min 后 80°C 反應(yīng)IOmin終止反應(yīng)；
[0026]RealAmp反應(yīng)前在反應(yīng)管內(nèi)蓋上加如I μ L1: 10倍稀釋的SYBR Green I熒光染料，待反應(yīng)結(jié)束后瞬時(shí)離心將SYBR Green I加入LAMP反應(yīng)液中進(jìn)行顯色觀察；設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用感染HLB的柑橘基因組總DNA代替；設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用IOOmM Tris-HClPH8.0與50mM EDTA代替，將含有配制好的反應(yīng)溶液的反應(yīng)管置于63°C反應(yīng)90min ;反應(yīng)結(jié)束后顯示屏上顯示擴(kuò)增曲線，X軸表示擴(kuò)增時(shí)間，Y軸顯示熒光值。
[0027]進(jìn)一步,其特征在于,步驟四RealAmp標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建方法如下:
[0028]采用Dita設(shè)計(jì)的香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種Fusarium oxysporium f.sp.cubense Tripical race4，F(xiàn)ocTR4 特異性檢測(cè)引物 FocTR4_F5' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3/ /FOCTR4-R5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，擴(kuò)增片段大小為 463bp ;克隆該序列到pMD18-T載體測(cè)序正確后的質(zhì)粒，命名為PMD18-T-TR4，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0029]進(jìn)一步，香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的PCR檢測(cè)反應(yīng)體系方法如下:
[0030]2.5 μ LlOXPCR buffer,2y L dNTPs,0.25 μ L Taq 聚合酶，引物 FocTR4_F/FocTR4-R 各 I μ L，I μ L DNA,補(bǔ)水至 25 μ L ；
[0031]PCR反應(yīng)的條件:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s、57°C退火30s、72°C延長(zhǎng)60s、進(jìn)行35次循環(huán)；72°C延長(zhǎng)7min ；
[0032]反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色觀察結(jié)果；
[0033]PCR擴(kuò)增條帶切膠回收連接pMD-18-T載體后測(cè)序正確后，將該質(zhì)粒命名為PMD18-T-TR4，10倍梯度稀釋后作為模板用于評(píng)估RealAmp的檢測(cè)靈敏度并由此構(gòu)建香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的RealAmp的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0034]進(jìn)一步，結(jié)果判斷采用兩種方法判斷結(jié)果，一種是定量檢測(cè)結(jié)果的判斷，直接在ESE-Quant Tube Scanner反應(yīng)結(jié)束后,儀器自動(dòng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示定量結(jié)果；另外，反應(yīng)結(jié)束后離心將反應(yīng)管內(nèi)蓋上的SYBR Green I混入到反應(yīng)液中，采用不開蓋顯色來判斷結(jié)果，如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽(yáng)性。
[0035]本發(fā)明的實(shí)時(shí)突光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(Real-time fluorescenceloop-meidated isothermal amplification assay,簡(jiǎn)稱 RealAmp)是將新一代的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測(cè)技術(shù)，可以定量檢測(cè)病原物，克服以往第一代LAMP檢測(cè)方法的不足，具有高靈敏度、高特異性、低污染、反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，采用不開蓋(closed-tube detection technique)不易受污染物的影響且能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)土壤樣品，分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物的方法極為簡(jiǎn)單，適宜于廣泛地推廣應(yīng)用。
[0036]本發(fā)明的一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法克服以往基因擴(kuò)增方法的不足，具有高特異性，靈敏度高、定量檢測(cè)下限為4.3 X 10-4ng/ μ 1，易操作，用時(shí)短、只需2-3h，不易受污染物的影響且能現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)土壤樣品，也不需要昂貴而精密的溫度循環(huán)裝置、只需能達(dá)63°C的恒溫裝置，分析判斷反應(yīng)產(chǎn)物的方法極為簡(jiǎn)單，只需肉眼觀察即可，又能定量地判別土壤中香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的含量，適宜于廣泛地推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1是本發(fā)明提供的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法流程圖。
[0038]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種LAMP檢測(cè)引物設(shè)計(jì)示意圖。[0039]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種RealAmp檢測(cè)的特異性分析；
[0040](A)以香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense (Foc) ) I 號(hào)小種(racel)、亞熱帶 4 號(hào)小種(Subtropical Race4, ST4)、熱帶 4 號(hào)小種(Tropical Race4,TR4)、甜瓜蔓枯病菌(Mycosphaerella melonis)、黃瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)的 DNA 以及土壤、水為對(duì)照用來測(cè)試LAMP的特異性(分別對(duì)應(yīng)編號(hào)的1-8)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各個(gè)PCR管的產(chǎn)物，僅模板是FocTR4基因組DNA顯示有梯度條帶，其余均無梯度條帶；“M”MarkerDL5000 ；
[0041](B)使用香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種的特異性PCR檢測(cè)引物，擴(kuò)增“A”中的1-8，僅模板是FocTR4基因組DNA顯示有單一條帶，其余均無條帶；“M”MarkerDL2000 ；
[0042](C)RealAmp檢測(cè)的顯色反應(yīng)表明，僅模板是FocTR4基因組DNA的顯色為綠色(陽(yáng)性)，其余均為橙色(陰性)；
[0043](D)ESE-Quant Tube Scanner儀器進(jìn)行RealAmp擴(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增曲線僅有I條，相應(yīng)編號(hào)對(duì)應(yīng)的是以FocTR4基因組DNA為模板的PCR管。
[0044]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種RealAmp檢測(cè)的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0045](A)以包含RealAmp擴(kuò)增區(qū)間的pMD-18-T_TR4質(zhì)粒DNA為模板，按照10倍梯度系列稀釋法將？皿0-18-1'-丁1?4質(zhì)粒0嫩從4.3\101叩/^1依次稀釋至4.3X l(T5ng/μ 1，以無菌水為陰性對(duì)照(分別對(duì)應(yīng)編號(hào)的1_8)，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)各個(gè)PCR管的產(chǎn)物，PMD-18-T-TR4質(zhì)粒DNA濃度為4.3 X IO1ng/U I~4.3X10_4ng/u I的顯示有梯度條帶，濃度為4.3 X 10^4ng/U I的梯度條帶較弱，其余均無梯度條帶“M” Marker DL2000 ；
[0046](B)RealAmp檢測(cè)的顯色反應(yīng)表明，以pMD_18-T_TR4質(zhì)粒DNA濃度為4.3 X IO1ng/Ul~4.3 X 10-4ng/U I的顯示為綠色(陽(yáng)性)，其余均為橙色(陰性)；
[0047](C) ESE-Quant Tube Scanner儀器進(jìn)行RealAmp擴(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增曲線有6條，相應(yīng)編號(hào)對(duì)應(yīng)的是以PMD-18-T-TR4質(zhì)粒DNA濃度為4.3 X IO1ng/ yl~4.3 X l(T4ng/ U I的PCR 管；
[0048](D )以不同濃度的起始模板DNA與相應(yīng)的Tt值之間存在線性關(guān)系而構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0049]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種RealAmp檢測(cè)的田間應(yīng)用；
[0050](A) ESE-Quant Tube Scanner儀器進(jìn)行RealAmp擴(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增曲線，以濃度為8.6 X 10_4ng質(zhì)粒DNA為正對(duì)照，無菌水為負(fù)對(duì)照；
[0051](B)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所計(jì)算出的每克土壤中的香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的含量?！揪唧w實(shí)施方式】
[0052] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0053]圖1示出了本發(fā)明提供的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法流程。為了便于說明，僅僅示出了與本發(fā)明相關(guān)的部分。
[0054]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0055]步驟一、對(duì)被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，快速提取被檢樣品的DNA:
[0056]被檢樣品的DNA核酸提取:向0.1g待檢測(cè)樣品中加入300 ill DNA提取液，研磨成糊狀后，在95 °C恒溫水浴IOmin后，25°C、1000Orpm下離心2分鐘，取50iU上清液作為檢測(cè)模板DNA。
[0057]DNA 提取液包含:IOOmM Tris-HCl (pH7.4)、IMKCl、IOmM EDTA 和 2% (w/v) PVPP0
[0058]步驟二、特異性引物的制備:參考Dita等人設(shè)計(jì)的香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種(Fusarium oxysporium f.sp.cubense Tripical race4, FocTR4)特異性檢測(cè)引物所獲得的463bp片段設(shè)計(jì)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的LAMP檢測(cè)引物,取得RealAmp特異性引物
2對(duì)，內(nèi)引物和外引物各一對(duì)。特異性的463bp的片段包含了整個(gè)RealAmp的序列。
[0059]由兩對(duì)引物構(gòu)成的引物混合液，兩對(duì)引物分別為:外引物FocTR4-F3 (5 ' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3 ')、外引物 FocTR4_B3(5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3')，內(nèi)引物 FocTIM-FIPG' -ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3')、內(nèi)引物FocTR4_BIP( 5' -GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3')，所述外引物FocTR4_F3和所述外引物FocTR4_B3的濃度分別為5pmol/U I ;所述內(nèi)引物FocTR4-FIP和所述內(nèi)引物FocTR4-BIP的濃度均為40pmol/iil。
[0060]表1香蕉枯萎病病原菌熱帶4號(hào)小種的特異性檢測(cè)引物[0061]
【權(quán)利要求】
1.一種從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，其特征在于，該從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法包括以下步驟: 步驟一、對(duì)被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取被檢樣品的DNA ； 步驟二、特異性引物的制備； 步驟三、熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)RealAmp反應(yīng)； 步驟四、RealAmp標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建； 步驟五、結(jié)果判斷。
2.如權(quán)利要求1所述的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，其特征在于，對(duì)被檢樣品進(jìn)行預(yù)處理，提取被檢樣品的DNA的具體方法如下: 被檢樣品的DNA核酸提取:向0.1g待檢測(cè)樣品中加入300 u I DNA提取液，研磨成糊狀后，在95°C恒溫水浴IOmin后，25°C、1000Orpm下離心2分鐘，取50iU上清液作為檢測(cè)模板 DNA ；
DNA 提取液包含:IOOmM Tris_HClpH7.4、IMKCl、IOmM EDTA 和 2%w/vPVPP。
3.如權(quán)利要求1所述的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，其特征在于，特異性引物的制備參考Dita設(shè)計(jì)的香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種特異性檢測(cè)引物所獲得的463bp片段設(shè)計(jì)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的LAMP檢測(cè)引物，取得RealAmp特異性引物2對(duì)，內(nèi)引物和外引物各一對(duì)； 由兩對(duì)引物構(gòu)成的引物混合液，兩對(duì)引物分別為:外引物FocTR4-F3即5' -CACGTTTMGGTGCCATGAGAG-3'、外引物 FocTR4_B3 即 5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，內(nèi)引物 FocTR4-FIP 即 5 ' -ATTCAAGCCGGATTGACGGATTGGATATGTAGAGAATGTGGTGG-3 '、內(nèi)引物FocTR4-BIP 即 5 ' -GGGAGCCAAGAAGAAGCAGGACCTTCGATTCTTGTATC-3 '，所述外引物 FocTR4_F3和所述外引物FocTR4-B3的濃度分別為5pmol/ii I ;所述內(nèi)引物FocTR4_FIP和所述內(nèi)引物FocTR4-BIP 的濃度均為 40pmol/ii I。
4.如權(quán)利要求1所述的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，其特征在于，步驟三熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)反應(yīng)具體如下: 將經(jīng)前處理的樣品、引物、反應(yīng)緩沖液與BstDNA聚合酶混合，在63 °C保溫90min進(jìn)行循環(huán)鏈置換反應(yīng)； RealAmp25 U L反應(yīng)體系:I y L抽提的核酸DNA作為模板，2.5 y LlOXBst DNApolymerse buffer、1.4mM dNTPs、0.8mM 甜菜喊、8mM MgS04、0.2 u M 的外引物、1.6 u M 的內(nèi)引物、Iy L BstDNA polymerase, 0.2u M SYT0-9熒光染料，補(bǔ)水至25 y L，然后再加入等體系的石臘油覆蓋整個(gè)反應(yīng)液； RealAmp 反應(yīng)在 ESE-Quant Tube Scanner 上進(jìn)行，63°C 反應(yīng) 90min 后 80°C 反應(yīng)10min終止反應(yīng)； RealAmp反應(yīng)前在反應(yīng)管內(nèi)蓋上加如Iii L1: 10倍稀釋的SYBR Green I熒光染料，待反應(yīng)結(jié)束后瞬時(shí)離心將SYBR Green I加入LAMP反應(yīng)液中進(jìn)行顯色觀察；設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用感染HLB的柑橘基因組總DNA代替；設(shè)置陰性對(duì)照反應(yīng)時(shí)，用IOOmM Tris-HCl pH8.0與50mM EDTA代替，將含有配制好的反應(yīng)溶液的反應(yīng)管置于63°C反應(yīng)90min ;反應(yīng)結(jié)束后顯示屏上顯示擴(kuò)增曲線，X軸表示擴(kuò)增時(shí)間，Y軸顯示熒光值。
5.如權(quán)利要求1所述的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，其特征在于，步驟四RealAmp標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建方法如下: 采用Dita設(shè)計(jì)的香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種Fusarium oxysporium f.sp.cubenseTripicalrace4, FocTR4 特異性檢測(cè)引物 FocTR4_F5 ' -CACGTTTAAGGTGCCATGAGAG-3/ /FOCTR4-R5' -CGCACGCCAGGACTGCCTCGTGA-3'，擴(kuò)增片段大小為 463bp ;克隆序列到PMD18-T載體測(cè)序正確后的質(zhì)粒，命名為PMD18-T-TR4，用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6.如權(quán)利要求1所述的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，其特征在于，香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的PCR檢測(cè)反應(yīng)體系方法如下:
2.5 μ LlOXPCR buffer,2uL dNTPs,0.25 μ L Taq聚合酶，引物FocTR4_F/FocTR4-R各IyL, IuL DNA，補(bǔ)水至 25yL ; PCR反應(yīng)的條件:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30s、57°C退火30s、72°C延長(zhǎng)60s、進(jìn)行35次循環(huán)；72°C延長(zhǎng)7min ； 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ L反應(yīng)產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳后EB染色觀察結(jié)果； PCR擴(kuò)增條帶切膠回收連接pMD-18-T載體后測(cè)序正確后，將質(zhì)粒命名為PMD18-T-TR4，10倍梯度稀釋后作為模板用于評(píng)估RealAmp的檢測(cè)靈敏度并由此構(gòu)建香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的RealAmp的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7.如權(quán)利要求1所述的從土壤中定量檢測(cè)香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)小種的方法，其特征在于，結(jié)果判斷采用兩種方法判斷結(jié)果，一種是定量檢測(cè)結(jié)果的判斷，直接在ESE-QuantTube Scanner反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動(dòng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示定量結(jié)果；另外，反應(yīng)結(jié)束后離心將反應(yīng)管內(nèi)蓋上的SYBR Green I混入到反應(yīng)液中，采用不開蓋顯色來判斷結(jié)果,如反應(yīng)液顏色為橙色，表示結(jié)果為陰性，如反應(yīng)液顏色為綠色，表示結(jié)果為陽(yáng)性。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103740806SQ201310545700
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年11月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月6日
【發(fā)明者】蒲金基, 張賀, 張欣, 彭軍, 漆艷香, 謝藝賢, 喻群芳, 張輝強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所