專利名稱：玉米內(nèi)州萎蔫病菌的pcr檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)和植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種玉米內(nèi)州萎蔫病菌的檢測(cè)方法，尤其涉及一種玉米內(nèi)州萎蔫病菌的PCR檢測(cè)方法。此外，本發(fā)明還涉及檢測(cè)玉米內(nèi)州萎蔫病菌的引物。
背景技術(shù)：
棒形桿菌屬Clavibacter僅包含一種植物病原菌Clavibactermichiganensis(Cm),根據(jù)其寄主?；缘牟煌?，分為5個(gè)亞種，包括玉米內(nèi)州萎蔫病菌C. m. subsp. nebraskensis (Cmn)、畨爺細(xì)菌性潰場(chǎng)病菌 C. m. subsp. Michiganenis (Cmm),馬鈴薯環(huán)腐病菌 C. m. subsp. sepedonicus (Cms),苜猜萎蔫病菌C. m. subsp. insidiouss (Cmi),玉米內(nèi)州萎蔫病菌Cmn和小麥花葉病菌C. m. subsp. tessellarius (Cmt) (Eichenlaub etal. 2006)。它們均可引起重要的植物病害，EPPO將Cmm、Cms和Cmi列為檢疫性有害生物， 而我國(guó)將Cmn、Cmm、Cms和Cmi同時(shí)列入檢疫性有害生物名錄。玉米內(nèi)州萎蔫病菌Cmn又名密執(zhí)安棒形桿菌內(nèi)布拉斯加亞種，隸屬于厚壁菌門Firmicutes,厚壁菌綱Firmibacteria,棒型桿菌屬Clavibacter。1969年，美國(guó)內(nèi)布拉斯カロ州首次發(fā)現(xiàn)該病菌引起的玉米內(nèi)州萎蔫病(Goss’s bacterial wilt and leaf blightof corn) (Vidaver and Mandel, 1974)。至1972年,該病害已擴(kuò)展至鄰近5個(gè)州。近年來隨著轉(zhuǎn)基因品種的推廣，病害蔓延至美國(guó)中西部各玉米種植區(qū)，包括內(nèi)布拉斯加州、堪薩斯州、南達(dá)科他州、科羅拉多州、懷俄明州、密歇根州、威斯康幸州、愛荷華州、伊利諾斯州、印第安那州(Ruhl et al. 2009)、明尼蘇達(dá)州(Malvick et al. 2010)、德科薩斯州(Korus etal. 2011)及加拿大安大略省、曼尼托巴省(Agarkova et al. 2011),成為北美地區(qū)玉米生產(chǎn)上的嚴(yán)重病害。玉米內(nèi)州萎蔫病菌Cmn可危害馬齒玉米、甜玉米、硬粒玉米、爆玉米、狗尾草、稗草和甘鹿。Cmn可隨種子傳播(Biddle et al. 1990),而且我國(guó)大部分玉米種植區(qū)適合病害發(fā)生(陳宴等.2009)。病菌一旦傳入定殖，容易暴發(fā)造成病害流行，且病害防治難度大。我國(guó)玉米產(chǎn)量和種植面積均居世界第二，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。2011年，僅飼用玉米我國(guó)每年進(jìn)ロ量已達(dá)數(shù)百萬(wàn)噸。因此，病菌傳入我國(guó)并擴(kuò)散傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)巨大。目前，國(guó)內(nèi)尚未見進(jìn)境玉米樣品中Cmn檢測(cè)的報(bào)道，準(zhǔn)確快速實(shí)用的微量病菌檢測(cè)方法具有十分重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種玉米內(nèi)州萎蔫病菌的PCR檢測(cè)方法；為此，本發(fā)明還提供用于上述方法的檢測(cè)引物。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)在本發(fā)明的一方面，提供一種玉米內(nèi)州萎蔫病菌的PCR檢測(cè)方法，包括如下步驟(I)設(shè)計(jì)引物，該引物的序列為
PSM I :5，-cctttccgtcgtcctttc-3’ (SEQ ID NO. I)或其互補(bǔ)鏈；CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3，(SEQ ID NO. 2)或其互補(bǔ)鏈;(2)玉米樣品(或玉米種子樣品)中細(xì)菌DNA提??；(3)采用步驟(I)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。步驟(2)中，所述玉米樣品中細(xì)菌DNA提取具體為玉米樣品混勻后放入PBS緩沖液(PH7. 2)中，4°C浸泡過夜；過濾，濾液離心棄上清，沉淀用試劑盒提取DNA。步驟(3)中，所述PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25yL，包括2. 5 μ L
10X PCRbufTer(Mg2+Plus)，2. 5μ L dNTP(各 250 μ M)，步驟(I)上下游引物各 I μ L(IOOpM),2μ L模板DNA、I. 5U Taq聚合酶(5U/μ L)，加水補(bǔ)至25 μし 步驟(3)中，所述PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ;然后以94°C 30s，63°C 30s, 72°C 30s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)玉米內(nèi)州萎蔫病菌的引物，其序列為PSMl :5，-cctttccgtcgtcctttc-3J (SEQ ID NO. I)或其互補(bǔ)鏈；CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3，(SEQ ID NO. 2)或其互補(bǔ)鏈。為了針對(duì)性檢測(cè)玉米樣品中Cmn,本發(fā)明根據(jù)GenBank中Cmn及其相關(guān)種間16S-23S序列差異，設(shè)計(jì)引物PSM1/CM3特異性檢測(cè)玉米樣品中Cmn，建立了 Cmn的PCR檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，引物PSM1/CM3可特異性檢測(cè)Cmn，且檢測(cè)的靈敏度很高，該引物能擴(kuò)增供試的4株Cmn菌株獲得208bp的預(yù)期產(chǎn)物，供試的36株相關(guān)菌株都不能擴(kuò)增出預(yù)期條帶。對(duì)不同系列稀釋度Cmn的DNA和菌懸液進(jìn)行PCR檢測(cè)靈敏度測(cè)試，結(jié)果表明引物PSMl/CM3的檢測(cè)靈敏度為4pg的DNA或680CFU目標(biāo)細(xì)菌；玉米樣品的檢測(cè)試驗(yàn)表明這種PCR方法可用于進(jìn)境玉米樣品中Cmn的快速檢測(cè)。


圖I是本發(fā)明實(shí)施例中PCR的檢測(cè)靈敏度結(jié)果示意圖；其中，圖IA是玉米內(nèi)州萎焉病菌菌懸液檢測(cè)靈敏度電泳圖，圖IB是玉米內(nèi)州萎焉病菌DNA檢測(cè)靈敏度電泳圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中引物PSM1/CM3檢測(cè)玉米樣品的PCR檢測(cè)電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，或按制造廠商建議的條件。I材料方法I. I供試玉米樣品和菌株供試玉米樣品為美國(guó)進(jìn)ロ飼用玉米，編號(hào)1058，進(jìn)境時(shí)間為2011年7月。供試菌株共計(jì)40株,包括4株Cmn,菌株除來源于ATCC (American type culturecollection,美國(guó)典型菌種保藏中心)和 NCPPB (The national collection of plantpathogenic bacteria,英國(guó)植物病原細(xì)菌保藏中心)タト，寧波、甘肅和天津出入境檢驗(yàn)檢疫局、云南農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院和山西省農(nóng)科院等単位提供部分試驗(yàn)菌株，另有10株從進(jìn)境飼用玉米樣品上分離的革蘭氏陽(yáng)性菌菌株。供試菌株及其來源詳見表I。 表I供試菌株和PCR檢測(cè)結(jié)果
Table I Isolates used in the test and the result of PCR reaction
Isoi it、Collection no.PCR reaetion
ATCC27822+
ATCC27794 + Ciavibacier michmanemis subsp. nebraskense--；-
ATCC27795a+
NCPPB2578h+
ATCC44501'-
Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis ATCCl 1456c—
NCPPB297911—
ATCC!0253C_
Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus ----
INCPPB83b—
CM20C — Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus ----—-
,ATCC33566—
Clavibacter michiganense subsp. tessellarius ----
INCPPB366511一
ATCC29231—
Pantoea stewartu subsp. stewartiiATCC8199—
ATCC 謂)-
ATCC51785—
Pantoea. stewartii subsp. indoloQenes--
ATCC35396—
權(quán)利要求
1.一種玉米內(nèi)州萎蔫病菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟 (1)設(shè)計(jì)引物，該引物的序列為 PSMl :5，-cctttccgtcgtcctttc-3’ (SEQ ID NO. I)或其互補(bǔ)鏈； CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3，(SEQ ID NO. 2)或其互補(bǔ)鏈； (2)玉米樣品中細(xì)菌DNA提取； (3)采用步驟(I)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求I所述的玉米內(nèi)州萎蔫病菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于， 步驟(2)中，所述玉米樣品中細(xì)菌DNA提取具體為玉米樣品混勻后放入PBS緩沖液中,4°C浸泡過夜；過濾,濾液離心棄上清,沉淀用試劑盒提取DNA。
3.如權(quán)利要求I所述的玉米內(nèi)州萎蔫病菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述PCR檢測(cè)的反應(yīng)體系為25μ L，包括2. 5μ L IOXPCR buffer，2. 5 μ LdNTP，步驟(I)上下游引物各luL、2yL模板DNA、1.5U Taq聚合酶，加水補(bǔ)至25 μ L。
4.如權(quán)利要求I或3所述的玉米內(nèi)州萎蔫病菌的PCR檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中，所述PCR檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ;然后以94°C 30s, 63°C 30s, 72°C 30s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min。
5.一種用于檢測(cè)玉米內(nèi)州萎蔫病菌的引物，其特征在于，其序列為 PSMl :5，-cctttccgtcgtcctttc-3J (SEQ ID NO. I)或其互補(bǔ)鏈； CM3 :5，-gcatccaccgtttgctct-3J (SEQ ID NO. 2)或其互補(bǔ)鏈。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種玉米內(nèi)州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(Cmn)的PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物，根據(jù)Cmn不同亞種間16S-23S序列差異，設(shè)計(jì)特異性引物PSM1(5’-cctttccgtcgtcctttc-3’)/CM3(5’-gcatccaccgtttgctct-3’)，建立了Cmn的PCR檢測(cè)方法。該方法的檢測(cè)靈敏度為4pg菌體DNA或680CFU目標(biāo)細(xì)菌，進(jìn)境玉米樣品的檢測(cè)試驗(yàn)表明這種PCR方法可用于進(jìn)境玉米樣品中Cmn的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816835SQ20121013780
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者易建平, 葉露飛, 周國(guó)梁, 楊賽軍 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局